Kai kurios LC trikčių šalinimo temos niekada nepasensta, nes LC praktikoje kyla problemų, net ir tobulėjant prietaisų technologijoms laikui bėgant. Yra daug būdų, kaip LC sistemoje gali kilti problemų ir dėl to gali būti prasta smailės forma. Kilus problemų, susijusių su smailės forma, trumpas galimų šių rezultatų priežasčių sąrašas padeda supaprastinti trikčių šalinimo procesą.
Buvo smagu rašyti šią skiltį „LC trikčių šalinimas“ ir kiekvieną mėnesį galvoti apie temas, nes kai kurios temos niekada neišeina iš mados. Nors chromatografijos tyrimų srityje tam tikros temos ar idėjos pasensta, nes jas pakeičia naujesnės ir geresnės idėjos, trikčių šalinimo srityje nuo tada, kai pirmasis trikčių šalinimo straipsnis pasirodė šiame žurnale (tuo metu LC žurnale) 1983 m. (1). Per pastaruosius kelerius metus keletą LC trikčių šalinimo skyrių sutelkiau į šiuolaikines tendencijas, turinčias įtakos skysčių chromatografijai (LC) (pavyzdžiui, santykinis mūsų supratimo apie slėgio poveikį sulaikymui palyginimas [2] „New Advances“), mūsų LC rezultatų interpretacija ir kaip šalinti triktis naudojant šiuolaikinius LC prietaisus. Šio mėnesio dalyje tęsiu savo seriją (3), kuri prasidėjo 2021 m. gruodžio mėn. ir kurioje daugiausia dėmesio skirta kai kurioms LC trikčių šalinimo „gyvybės ir mirties“ temoms – elementai, kurie puikiai tinka bet kuriam trikčių šalinimo įrankiui, yra būtini, nepriklausomai nuo naudojamos sistemos amžiaus. Pagrindinė šios serijos tema yra labai aktuali garsiajai LCGC „LC trikčių šalinimo vadovo“ sieninei diagramai (4), kabančiai... daugelyje laboratorijų. Trečiojoje šios serijos dalyje nusprendžiau sutelkti dėmesį į problemas, susijusias su smailės forma arba smailės charakteristikomis. Neįtikėtina, bet sieninėje lentelėje išvardytos 44 skirtingos galimos prastos smailės formos priežastys! Negalime visų šių problemų išsamiai aptarti viename straipsnyje, todėl šioje pirmojoje temos dalyje sutelksiu dėmesį į kai kurias iš tų, kurias matau dažniausiai. Tikiuosi, kad jauni ir seni LC vartotojai ras naudingų patarimų ir priminimų šia svarbia tema.
Vis dažniau į trikčių šalinimo klausimus atsakau sakydamas „viskas įmanoma“. Šis atsakymas gali atrodyti lengvas, kai svarstomi sunkiai interpretuojami stebėjimai, bet man jis dažnai tinka. Esant daugeliui galimų prastos smailės formos priežasčių, svarbu neatsilikti nuo įvairių priežasčių svarstant, kokia galėtų būti problema, ir sugebėti nustatyti galimų priežasčių prioritetus, kad galėtume pradėti trikčių šalinimo darbus, sutelkdami dėmesį į dažniausiai pasitaikančias galimybes. Šis punktas yra labai svarbus.
Svarbus bet kokio trikčių šalinimo žingsnis – tačiau, manau, nepakankamai įvertintas – yra pripažinti, kad yra problema, kurią reikia išspręsti. Pripažinti, kad yra problema, dažnai reiškia pripažinti, kad tai, kas vyksta su įrankiu, skiriasi nuo mūsų lūkesčių, kuriuos formuoja teorija, empirinės žinios ir patirtis (5). Čia minima „piko forma“ iš tikrųjų reiškia ne tik piko formą (simetriška, asimetrinė, lygi, puri, su priekiniu kraštu, uodega ir pan.), bet ir plotį. Mūsų lūkesčiai dėl tikrosios piko formos yra paprasti. Teorija (6) gerai patvirtina vadovėlyje pateiktą lūkestį, kad daugeliu atvejų chromatografinės smailės turėtų būti simetriškos ir atitikti Gauso skirstinio formą, kaip parodyta 1a paveiksle. Tai, ko tikimės iš piko pločių, yra sudėtingesnis klausimas, ir šią temą aptarsime būsimame straipsnyje. Kitos 1 paveiksle pateiktos piko formos rodo kai kurias kitas galimybes, kurias galima pastebėti, kitaip tariant, kai kuriuos būdus, kaip viskas gali pakrypti neteisinga linkme. Likusioje šios dalies dalyje aptarsime konkrečius situacijų, kurios gali lemti šias formas, pavyzdžius. tipai.
Kartais chromatogramoje, kur tikimasi, eliuavimo vietoje smailės visai nepastebimos. Aukščiau pateiktoje sieninėje diagramoje nurodoma, kad smailės nebuvimas (darant prielaidą, kad mėginyje iš tikrųjų yra tikslinės analitės koncentracija, dėl kurios detektoriaus atsakas turėtų būti pakankamas, kad ją būtų galima matyti virš triukšmo) paprastai yra susijęs su kokia nors prietaiso problema arba netinkamomis mobiliosios fazės sąlygomis (jei jos iš viso stebimos). Paprastai smailės yra per „silpnos“). Trumpą galimų šios kategorijos problemų ir sprendimų sąrašą galite rasti I lentelėje.
Kaip minėta pirmiau, klausimas, kiek piko išplatėjimo reikėtų toleruoti prieš atkreipiant į tai dėmesį ir bandant jį ištaisyti, yra sudėtinga tema, kurią aptarsiu būsimame straipsnyje. Mano patirtis rodo, kad reikšmingą piko išplatėjimą dažnai lydi reikšmingas piko formos pokytis, o piko „uodegos“ yra dažnesnės nei prieš piką ar skilimas. Tačiau nominaliai simetriškos piko dalys taip pat išplatėja, o tai gali lemti kelios skirtingos priežastys:
Kiekviena iš šių problemų buvo išsamiai aptarta ankstesniuose „Troubleshooting LC“ numeriuose, o skaitytojai, besidomintys šiomis temomis, gali kreiptis į šiuos ankstesnius straipsnius, kuriuose pateikiama informacija apie pagrindines šių problemų priežastis ir galimus sprendimus. Daugiau informacijos.
Piko „uodegos“, piko priekio išlinkimas ir skilimas gali būti cheminių arba fizikinių reiškinių pasekmė, o galimų šių problemų sprendimų sąrašas labai skiriasi priklausomai nuo to, ar susiduriame su chemine, ar fizikine problema. Dažnai lyginant skirtingas chromatogramos smailes, galima rasti svarbių užuominų apie tai, kuri yra kaltininkė. Jei visos chromatogramos smailės yra panašios formos, priežastis greičiausiai nėra fizinė. Jei paveikta tik viena ar kelios smailės, o likusios atrodo gerai, priežastis greičiausiai yra cheminė.
Cheminės smailės „uodegos“ priežastys yra pernelyg sudėtingos, kad būtų galima jas čia trumpai aptarti. Susidomėjęs skaitytojas gali susipažinti su naujausiu žurnalo „LC Troubleshooting“ numeriu, kuriame pateikiama išsamesnė diskusija (10). Tačiau galima lengvai pabandyti sumažinti įpurškiamos analitės masę ir pažiūrėti, ar pagerėja smailės forma. Jei taip, tai geras požymis, kad problema yra „masės perkrova“. Šiuo atveju metodas turi būti apribotas mažų analitės masių įpurškimu arba reikia pakeisti chromatografines sąlygas taip, kad net ir įpurškus didesnes mases būtų galima gauti geras smailės formas.
Taip pat yra daug galimų fizinių priežasčių, dėl kurių susidaro didžiausios „uodegos“ formos. Skaitytojai, norintys išsamiai aptarti šias galimybes, gali susipažinti su kitu neseniai išleistu „LC Troubleshooting“ numeriu (11). Viena iš dažniausių fizinių priežasčių, dėl kurių susidaro didžiausios „uodegos“ formos, yra prastas sujungimas tam tikroje vietoje tarp injektoriaus ir detektoriaus (12). Kraštutinis pavyzdys parodytas 1d paveiksle, gautame mano laboratorijoje prieš kelias savaites. Šiuo atveju sukūrėme sistemą su nauju įpurškimo vožtuvu, kurio anksčiau nenaudojome, ir įrengėme mažo tūrio įpurškimo kilpą su antgaliu, kuris buvo išlietas ant nerūdijančio plieno kapiliaro. Atlikę keletą pradinių trikčių šalinimo eksperimentų, supratome, kad įpurškimo vožtuvo statoriaus angos gylis buvo daug didesnis nei buvome įpratę, todėl angos apačioje susidarė didelis negyvas tūris. Šią problemą lengva išspręsti pakeičiant įpurškimo kilpą kitu vamzdeliu. Galime sureguliuoti antgalį į tinkamą padėtį, kad pašalintume negyvą tūrį angos apačioje.
Piko frontai, panašūs į parodytus 1e paveiksle, taip pat gali atsirasti dėl fizinių arba cheminių problemų. Dažna fizinė priekinio krašto priežastis yra ta, kad kolonėlės dalelių sluoksnis nėra gerai supakuotas arba kad dalelės laikui bėgant reorganizavosi. Kaip ir šio fizinio reiškinio sukelto piko „uodegos“ atveju, geriausias būdas tai ištaisyti yra pakeisti kolonėlę ir tęsti darbą. Iš esmės cheminės kilmės priekinio krašto piko formos dažnai atsiranda dėl to, ką vadiname „netiesinėmis“ sulaikymo sąlygomis. Idealiomis (tiesinėmis) sąlygomis stacionariosios fazės sulaikytas analitės kiekis (taigi ir sulaikymo koeficientas) yra tiesiškai proporcingas analitės koncentracijai kolonėlėje. Chromatografiškai tai reiškia, kad didėjant į kolonėlę įpurškiamos analitės masei, pikas tampa aukštesnis, bet ne platesnis. Šis ryšys nutrūksta, kai sulaikymo elgsena yra netiesinė, o pikai ne tik tampa aukštesni, bet ir platesni, įpurškiant daugiau masės. Be to, netiesinės formos lemia chromatografinių pikų formą, todėl susidaro priekiniai arba galiniai kraštai. Kaip ir masės perkrovos, kuri sukelia piko „uodegos“ atsiradimą (10), netiesinio sulaikymo sukeltas piko „uodegos“ gali... taip pat galima diagnozuoti sumažinant įpurškiamos analitės masę. Jei smailės forma pagerėja, metodą reikia modifikuoti, kad nebūtų viršyta įpurškimo kokybė, sukelianti priekinį kraštą, arba reikia pakeisti chromatografijos sąlygas, kad šis elgesys būtų kuo mažesnis.
Kartais stebime tai, kas atrodo kaip „suskilusi“ smailė, kaip parodyta 1f paveiksle. Pirmas žingsnis sprendžiant šią problemą yra nustatyti, ar smailės forma atsiranda dėl dalinės bendros eliucijos (t. y. dviejų skirtingų, bet glaudžiai eliuojančių junginių buvimo). Jei iš tikrųjų yra dvi skirtingos analitės, eliuojančios arti viena kitos, reikia pagerinti jų skiriamąją gebą (pavyzdžiui, padidinant selektyvumą, sulaikymą arba plokštelių skaičių), o tariamos „suskilusios“ smailės yra susijusios su fizinėmis savybėmis. Našumas neturi nieko bendra su pačia kolonėle. Dažnai svarbiausias šio sprendimo kriterijus yra tai, ar visos chromatogramos smailės turi suskilusias formas, ar tik viena ar dvi. Jei tai tik viena ar dvi, tai greičiausiai bendros eliucijos problema; jei visos smailės yra suskilę, tai greičiausiai fizinė problema, greičiausiai susijusi su pačia kolonėle.
Su pačios kolonėlės fizinėmis savybėmis susiję padalyti pikai paprastai atsiranda dėl iš dalies užsikimšusių įleidimo arba išleidimo angų frito arba dalelių reorganizacijos kolonėlėje, dėl kurios mobilioji fazė tam tikrose kolonėlės kanalo formavimosi vietose, kituose regionuose, tekėja greičiau nei mobilioji fazė (11). Iš dalies užsikimšusį fritą kartais galima pašalinti pakeičiant srautą kolonėlėje; tačiau, mano patirtimi, tai dažniausiai yra trumpalaikis, o ne ilgalaikis sprendimas. Šiuolaikinėse kolonėlėse tai dažnai būna lemtinga, jei dalelės kolonėlėje vėl susijungia. Šiuo metu geriausia pakeisti kolonėlę ir tęsti darbą.
1g paveiksle esantis pikas, taip pat iš neseniai mano laboratorijoje užfiksuoto atvejo, paprastai rodo, kad signalas yra toks stiprus, kad pasiekė viršutinę atsako diapazono ribą. Optinių absorbcijos detektorių (šiuo atveju UV-Vis) atveju, kai analitės koncentracija yra labai didelė, analitė sugeria didžiąją dalį šviesos, praeinančios pro detektoriaus srauto elementą, todėl aptinkama labai mažai šviesos. Tokiomis sąlygomis fotodetektoriaus skleidžiamą elektrinį signalą labai veikia įvairūs triukšmo šaltiniai, pvz., klaidžiojanti šviesa ir „tamsioji srovė“, todėl signalas atrodo labai „neryškus“ ir nepriklauso nuo analitės koncentracijos. Kai taip nutinka, problemą dažnai galima lengvai išspręsti sumažinant analitės įpurškimo tūrį – sumažinant įpurškimo tūrį, praskiedžiant mėginį arba abiem būdais.
Chromatografijos mokykloje detektoriaus signalą (t. y. y ašį chromatogramoje) naudojame kaip analitės koncentracijos mėginyje indikatorių. Todėl atrodo keista matyti chromatogramą su signalu, mažesniu už nulį, nes paprasta interpretacija yra ta, kad tai rodo neigiamą analitės koncentraciją, kuri, žinoma, fiziškai neįmanoma. Mano patirtis rodo, kad neigiami pikai dažniausiai stebimi naudojant optinius absorbcijos detektorius (pvz., UV-Vis).
Šiuo atveju neigiama smailė tiesiog reiškia, kad iš kolonėlės eliuojančios molekulės sugeria mažiau šviesos nei pati mobilioji fazė prieš pat smailę ir po jos. Tai gali atsitikti, pavyzdžiui, naudojant santykinai mažus detekcijos bangos ilgius (<230 nm) ir mobiliosios fazės priedus, kurie sugeria didžiąją dalį šviesos šiais bangos ilgiais. Tokie priedai gali būti mobiliosios fazės tirpiklio komponentai, tokie kaip metanolis, arba buferio komponentai, tokie kaip acetatas arba formiatas. Neigiamus smailius galima naudoti kalibravimo kreivei parengti ir gauti tikslią kiekybinę informaciją, todėl nėra jokios esminės priežasties jų vengti (šis metodas kartais vadinamas „netiesioginiu UV detekcija“) (13). Tačiau jei tikrai norime visiškai išvengti neigiamų smailių, absorbcijos detekcijos atveju geriausias sprendimas yra naudoti kitą detekcijos bangos ilgį, kad analitas sugertų daugiau nei mobilioji fazė, arba pakeisti mobiliosios fazės sudėtį taip, kad jie sugertų mažiau šviesos nei analitai.
Neigiami pikai taip pat gali atsirasti naudojant lūžio rodiklio (RI) aptikimą, kai kitų mėginio komponentų, išskyrus analitą, pvz., tirpiklio matricos, lūžio rodiklis skiriasi nuo mobiliosios fazės lūžio rodiklio. Tai taip pat nutinka ir naudojant UV-Vis aptikimą, tačiau šis poveikis paprastai yra silpnesnis, palyginti su RI aptikimu. Abiem atvejais neigiamus pikus galima sumažinti tiksliau suderinant mėginio matricos sudėtį su mobiliosios fazės sudėtimi.
Trečioje dalyje, skirtoje pagrindinei LC trikčių šalinimo temai, aptariau situacijas, kai stebima smailės forma skiriasi nuo laukiamos arba įprastos smailės formos. Efektyvus tokių problemų šalinimas prasideda nuo žinių apie laukiamas smailės formas (remiantis teorija arba ankstesne patirtimi taikant esamus metodus), todėl nukrypimai nuo šių lūkesčių yra akivaizdūs. Smailės formos problemos turi daug skirtingų galimų priežasčių (per plati, per didelė „uodegos“ būsena, priekinis kraštas ir kt.). Šioje dalyje išsamiai aptarsiu kai kurias dažniausiai pasitaikančias priežastis. Šių detalių žinojimas yra gera vieta pradėti trikčių šalinimą, tačiau tai neapima visų galimybių. Skaitytojai, besidomintys išsamesniu priežasčių ir sprendimų sąrašu, gali remtis LCGC „LC trikčių šalinimo vadovu“ sienine diagrama.
(4) LCGC „LC trikčių šalinimo vadovo“ sieninė diagrama. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Duomenų analizė ir signalų apdorojimas chromatografijoje (Elsevier, Niujorkas, NY, 1998), p. 43–96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF ir Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.