Некоторые темы, касающиеся устранения неполадок в жидкостной хроматографии, никогда не устаревают, поскольку в практике жидкостной хроматографии возникают проблемы, даже несмотря на совершенствование приборных технологий. Существует множество способов возникновения проблем в системе жидкостной хроматографии, которые могут привести к ухудшению формы пиков. Когда возникают проблемы, связанные с формой пиков, краткий список возможных причин этих результатов помогает упростить процесс устранения неполадок.
Мне доставляет удовольствие писать эту колонку «Устранение неполадок в жидкостной хроматографии» и каждый месяц размышлять над новыми темами, потому что некоторые темы никогда не выходят из моды. В то время как в области исследований хроматографии некоторые темы или идеи устаревают, поскольку их заменяют более новые и лучшие идеи, в области устранения неполадок, с момента появления первой статьи об устранении неполадок в этом журнале (в то время это был LC Journal) с 1983 года (1), некоторые темы по-прежнему актуальны. В последние несколько лет я посвятил несколько разделов «Устранение неполадок в жидкостной хроматографии» современным тенденциям, влияющим на жидкостную хроматографию (ЖХ) (например, сравнительное изучение нашего понимания влияния давления на удерживание [2] Новые достижения), нашей интерпретации результатов ЖХ и способам устранения неполадок в современных приборах ЖХ. В этом месяце я продолжаю свою серию (3), начатую в декабре 2021 года, которая была посвящена некоторым «жизненно важным» темам устранения неполадок в ЖХ — элементам, которые полезны для любого специалиста по устранению неполадок, независимо от возраста используемой системы. Основная тема этой серии статей очень актуальна для знаменитой настенной таблицы «Руководство по устранению неполадок в жидкостной хроматографии» (4), которая висит во многих лабораториях. Для третьей части этой серии я решил сосредоточиться на проблемах, связанных с формой пика или характеристиками пика. Невероятно, но на настенной таблице перечислены 44 различных потенциальных причины плохой формы пика! Мы не можем подробно рассмотреть все эти проблемы в одной статье, поэтому в этой первой части я сосредоточусь на некоторых из тех, с которыми я сталкиваюсь чаще всего. Я надеюсь, что молодые и пожилые пользователи жидкостной хроматографии найдут здесь полезные советы и напоминания по этой важной теме.
Я все чаще отвечаю на вопросы по устранению неполадок фразой «все возможно». Этот ответ может показаться простым, когда речь идет о наблюдениях, которые трудно интерпретировать, но я часто нахожу его уместным. Учитывая множество возможных причин плохой формы пика, важно сохранять непредвзятость при рассмотрении того, в чем может заключаться проблема, и уметь расставлять приоритеты для начала поиска и устранения неисправностей, сосредоточившись на наиболее распространенных вариантах. Этот момент очень важен.
Ключевой шаг в любом процессе устранения неполадок — но, на мой взгляд, недооцененный — это признание наличия проблемы, которую необходимо решить. Признание наличия проблемы часто означает признание того, что то, что происходит с инструментом, отличается от наших ожиданий, которые формируются теорией, эмпирическими знаниями и опытом (5). «Форма пика», о которой здесь говорится, на самом деле относится не только к форме пика (симметричная, асимметричная, гладкая, пушистая, передний край, хвост и т. д.), но и к его ширине. Наши ожидания относительно фактической формы пика просты. Теория (6) хорошо подтверждает общепринятое в учебниках предположение, что в большинстве случаев хроматографические пики должны быть симметричными и соответствовать форме гауссова распределения, как показано на рисунке 1а. То, чего мы ожидаем от ширины пиков, — более сложный вопрос, и мы обсудим эту тему в будущей статье. Другие формы пиков на рисунке 1 показывают некоторые из других возможных вариантов, которые могут наблюдаться — другими словами, некоторые способы, которыми что-то может пойти не так. В оставшейся части В этой части мы уделим время обсуждению конкретных примеров ситуаций, которые могут привести к появлению таких типов фигур.
Иногда пики вообще не наблюдаются на хроматограмме в тех местах, где они должны элюироваться. Приведенная выше диаграмма показывает, что отсутствие пика (при условии, что образец действительно содержит целевой аналит в концентрации, которая должна обеспечить достаточный отклик детектора для его обнаружения на фоне шума) обычно связано с какой-либо проблемой прибора или неправильными условиями подвижной фазы (если пик вообще наблюдается). Краткий список потенциальных проблем и решений в этой категории можно найти в таблице I.
Как уже упоминалось выше, вопрос о том, какое расширение пика следует допускать, прежде чем обращать на него внимание и пытаться исправить его, является сложной темой, которую я рассмотрю в будущей статье. Мой опыт показывает, что значительное расширение пика часто сопровождается значительным изменением его формы, а образование хвоста пика встречается чаще, чем предпиковое расширение или расщепление. Однако номинально симметричные пики также расширяются, что может быть вызвано несколькими различными причинами:
Каждая из этих проблем подробно обсуждалась в предыдущих выпусках журнала Troubleshooting LC, и читатели, интересующиеся этими темами, могут обратиться к этим предыдущим статьям за информацией о первопричинах и потенциальных решениях этих проблем. Подробнее.
Смещение пиков в сторону хвостов, пиков в сторону фронтов и расщепление пиков могут быть вызваны химическими или физическими явлениями, и список потенциальных решений этих проблем сильно различается в зависимости от того, имеем ли мы дело с химической или физической проблемой. Часто, сравнивая различные пики на хроматограмме, можно найти важные подсказки о том, какой из них является виновником. Если все пики на хроматограмме имеют схожую форму, причина, скорее всего, не физическая. Если затронут только один или несколько пиков, а остальные выглядят нормально, причина, скорее всего, химическая.
Химические причины образования хвостов пиков слишком сложны, чтобы кратко обсуждать их здесь. Заинтересованному читателю предлагается обратиться к недавнему выпуску «LC Troubleshooting» для более подробного обсуждения (10). Однако простой способ — уменьшить массу вводимого аналита и посмотреть, улучшится ли форма пика. Если да, то это хороший признак того, что проблема заключается в «массовой перегрузке». В этом случае метод должен быть ограничен введением малых масс аналита, или необходимо изменить хроматографические условия таким образом, чтобы можно было получить хорошую форму пика даже при введении больших масс.
Существует также множество потенциальных физических причин образования хвоста пика. Читателям, заинтересованным в подробном обсуждении возможных причин, рекомендуется обратиться к другому недавнему выпуску «Устранение неполадок в жидкостной хроматографии» (11). Одной из наиболее распространенных физических причин образования хвоста пика является плохое соединение в точке между инжектором и детектором (12). Крайний пример показан на рисунке 1d, полученном в моей лаборатории несколько недель назад. В этом случае мы создали систему с новым инжекционным клапаном, который мы раньше не использовали, и установили петлю для впрыска малого объема с наконечником, отлитым на капилляре из нержавеющей стали. После нескольких первоначальных экспериментов по устранению неполадок мы поняли, что глубина отверстия в статоре инжекционного клапана намного больше, чем мы привыкли, что приводит к большому мертвому объему в нижней части отверстия. Эта проблема легко решается заменой инжекционной петли другой трубкой, мы можем отрегулировать наконечник в нужное положение, чтобы устранить мертвый объем в нижней части отверстия.
Фронты пиков, подобные показанным на рисунке 1e, также могут быть вызваны физическими или химическими проблемами. Распространенной физической причиной переднего края является недостаточная плотность слоя частиц в колонке или реорганизация частиц с течением времени. Как и в случае с хвостом пика, вызванным этим физическим явлением, лучший способ исправить это — заменить колонку и продолжить работу. В основе своей формы переднего края пика, имеющие химическое происхождение, часто возникают из-за так называемых «нелинейных» условий удерживания. В идеальных (линейных) условиях количество аналита, удерживаемого стационарной фазой (следовательно, коэффициент удерживания), линейно связано с концентрацией аналита в колонке. Хроматографически это означает, что по мере увеличения массы аналита, вводимого в колонку, пик становится выше, но не шире. Эта зависимость нарушается, когда поведение удерживания нелинейно, и пики становятся не только выше, но и шире по мере увеличения массы вводимого вещества. Кроме того, нелинейные формы определяют форму хроматографических пиков, приводя к переднему или заднему краю. При массовой перегрузке, вызывающей хвост пика (10), опережение пика, вызванное нелинейным удерживанием, также можно диагностировать путем уменьшения массы вводимого аналита. Если форма пика улучшается, метод необходимо модифицировать, чтобы не превышать качество ввода, вызывающее опережение, или изменить хроматографические условия, чтобы минимизировать это явление.
Иногда мы наблюдаем то, что выглядит как «расщепленный» пик, как показано на рисунке 1f. Первым шагом в решении этой проблемы является определение того, обусловлена ​​ли форма пика частичным соэлюированием (т.е. наличием двух различных, но близко элюирующих соединений). Если на самом деле два разных аналита элюируют близко друг к другу, то речь идет об улучшении их разрешения (например, за счет повышения селективности, удерживания или числа теоретических тарелок), а видимые «расщепленные» пики связаны с физическими свойствами. Производительность не имеет ничего общего с самой колонкой. Часто наиболее важным фактором при принятии этого решения является то, имеют ли все пики на хроматограмме расщепленную форму или только один или два. Если только один или два, это, вероятно, проблема соэлюирования; если все пики расщеплены, это, вероятно, физическая проблема, скорее всего, связанная с самой колонкой.
Расщепление пиков, связанное с физическими свойствами самой колонки, обычно происходит из-за частичной закупорки входных или выходных фриттов или реорганизации частиц в колонке, что позволяет подвижной фазе течь быстрее, чем подвижная фаза в определенных областях образования каналов колонки, в других областях (11). Частично забитый фритт иногда можно очистить, изменив направление потока через колонку; однако, по моему опыту, это обычно кратковременное, а не долгосрочное решение. В современных колонках это часто приводит к фатальным последствиям, если частицы рекомбинируют внутри колонки. В этом случае лучше всего заменить колонку и продолжить.
Пик на рисунке 1g, также полученный в ходе недавнего эксперимента в моей лаборатории, обычно указывает на то, что сигнал настолько высок, что достиг верхней границы диапазона отклика. Для оптических абсорбционных детекторов (в данном случае УФ-видимых) при очень высокой концентрации аналита он поглощает большую часть света, проходящего через проточную ячейку детектора, оставляя очень мало света для обнаружения. В этих условиях электрический сигнал от фотодетектора сильно подвержен влиянию различных источников шума, таких как рассеянный свет и «темновой ток», что делает сигнал очень «размытым» и независимым от концентрации аналита. В таких случаях проблему часто можно легко решить, уменьшив объем вводимого аналита — уменьшив объем вводимого образца, разбавив его или и то, и другое.
В школе хроматографии мы используем сигнал детектора (т.е. ось Y на хроматограмме) в качестве индикатора концентрации аналита в образце. Поэтому кажется странным видеть хроматограмму с сигналом ниже нуля, поскольку простая интерпретация заключается в том, что это указывает на отрицательную концентрацию аналита, что, конечно, физически невозможно. По моему опыту, отрицательные пики чаще всего наблюдаются при использовании оптических абсорбционных детекторов (например, УФ-видимых).
В данном случае отрицательный пик просто означает, что молекулы, элюирующие из колонки, поглощают меньше света, чем сама подвижная фаза непосредственно до и после пика. Это может происходить, например, при использовании относительно низких длин волн детектирования (<230 нм) и добавок к подвижной фазе, которые поглощают большую часть света на этих длинах волн. Такими добавками могут быть компоненты растворителя подвижной фазы, такие как метанол, или компоненты буфера, такие как ацетат или формиат. Фактически, отрицательные пики можно использовать для построения калибровочной кривой и получения точной количественной информации, поэтому нет принципиальных причин избегать их как таковых (этот метод иногда называют «непрямым УФ-детектированием») (13). Однако, если мы действительно хотим полностью избежать отрицательных пиков в случае абсорбционного детектирования, лучшим решением является использование другой длины волны детектирования, чтобы аналит поглощал больше света, чем подвижная фаза, или изменение состава подвижной фазы таким образом, чтобы она поглощала меньше света, чем аналиты.
Отрицательные пики также могут появляться при использовании детектирования по показателю преломления (ПП), когда показатель преломления компонентов, отличных от аналита в образце, например, матричного растворителя, отличается от показателя преломления подвижной фазы. Это также происходит при УФ-видимом детектировании, но этот эффект, как правило, ослаблен по сравнению с детектированием по ПП. В обоих случаях отрицательные пики можно минимизировать, более точно подобрав состав матричного образца к составу подвижной фазы.
В третьей части, посвященной основным вопросам поиска и устранения неисправностей в жидкостной хроматографии, я рассмотрел ситуации, когда наблюдаемая форма пика отличается от ожидаемой или нормальной формы пика. Эффективный поиск и устранение таких проблем начинается со знания ожидаемых форм пиков (на основе теории или предыдущего опыта работы с существующими методами), поэтому отклонения от этих ожиданий очевидны. Проблемы с формой пика могут иметь множество различных потенциальных причин (слишком широкий, хвост, передний край и т. д.). В этой части я подробно расскажу о некоторых из причин, которые я вижу чаще всего. Знание этих деталей дает хорошую отправную точку для поиска и устранения неисправностей, но не охватывает все возможные варианты. Читатели, заинтересованные в более подробном списке причин и решений, могут обратиться к настенной таблице «Руководство по поиску и устранению неисправностей в жидкостной хроматографии».
(4) Настенная таблица «Руководство по устранению неполадок LCGC». https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) А. Фелингер, Анализ данных и обработка сигналов в хроматографии (Elsevier, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, 1998), стр. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF and Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.