Algunos temas de resolución de problemas en cromatografía líquida (LC) nunca pasan de moda, ya que persisten problemas en la práctica de la LC, incluso a medida que la tecnología de los instrumentos mejora con el tiempo. Existen muchas maneras en que pueden surgir problemas en un sistema de LC y resultar en una forma de pico deficiente. Cuando surgen problemas relacionados con la forma del pico, una breve lista de posibles causas de estos resultados ayuda a simplificar nuestra experiencia de resolución de problemas.
Ha sido divertido escribir esta columna de "Solución de problemas de LC" y pensar en los temas cada mes, porque algunos temas nunca pasan de moda. Mientras que en el campo de la investigación cromatográfica ciertos temas o ideas se vuelven obsoletos al ser reemplazados por ideas más nuevas y mejores, en el campo de la resolución de problemas, desde que apareció el primer artículo sobre resolución de problemas en esta revista (LC Journal en ese momento), algunos temas siguen siendo relevantes en 1983 (1). En los últimos años, he centrado varias secciones de "Solución de problemas de LC" en las tendencias contemporáneas que afectan a la cromatografía líquida (LC) (por ejemplo, la comparación relativa de nuestra comprensión del efecto de la presión en la retención [2] Nuevos avances), nuestra interpretación de los resultados de LC y cómo solucionar problemas con instrumentos de LC modernos. En la entrega de este mes, continúo con mi serie (3), que comenzó en diciembre de 2021, que se centró en algunos de los temas "de vida o muerte" de la resolución de problemas de LC: elementos que son excelentes para cualquier solucionador de problemas, pero que son esenciales, sin importar la antigüedad del sistema. Estamos utilizando. El tema central de esta serie es muy relevante para el famoso cartel mural "Guía de solución de problemas de LC" (4) de LCGC que cuelga en muchos laboratorios. Para la tercera parte de esta serie, elegí centrarme en los problemas relacionados con la forma o las características de los picos. ¡Increíblemente, el cartel mural enumera 44 causas potenciales diferentes de una mala forma de pico! No podemos considerar todos estos problemas en detalle en un solo artículo, así que en esta primera entrega sobre el tema, me centraré en algunos de los que veo con más frecuencia. Espero que los usuarios de LC jóvenes y mayores encuentren algunos consejos y recordatorios útiles sobre este importante tema.
Cada vez respondo más a las preguntas sobre solución de problemas con "todo es posible". Esta respuesta puede parecer fácil al considerar observaciones difíciles de interpretar, pero a menudo la encuentro apropiada. Con muchas posibles causas de una mala forma del pico, es importante mantener una mente abierta al considerar cuál podría ser el problema y poder priorizar las posibles causas para comenzar nuestros esfuerzos de solución de problemas, centrándonos en las posibilidades más comunes; este punto es muy importante.
Un paso clave en cualquier ejercicio de resolución de problemas —pero que creo que está subestimado— es reconocer que hay un problema que necesita ser resuelto. Reconocer que hay un problema a menudo significa reconocer que lo que le sucede a la herramienta es diferente de nuestras expectativas, que están moldeadas por la teoría, el conocimiento empírico y la experiencia (5). La “forma del pico” a la que se hace referencia aquí en realidad se refiere no solo a la forma del pico (simétrico, asimétrico, suave, difuso, borde de ataque, cola, etc.), sino también al ancho. Nuestras expectativas para la forma real del pico son simples. La teoría (6) respalda bien la expectativa del libro de texto de que, en la mayoría de los casos, los picos cromatográficos deben ser simétricos y ajustarse a la forma de una distribución gaussiana, como se muestra en la Figura 1a. Lo que esperamos de los anchos de los picos es un asunto más complejo, y discutiremos este tema en un artículo futuro. Las otras formas de pico en la Figura 1 muestran algunas de las otras posibilidades que podrían observarse; en otras palabras, algunas de las formas en que las cosas podrían salir mal. En el resto de esta entrega, dedicaremos tiempo a discutir Algunos ejemplos específicos de situaciones que pueden dar lugar a estos tipos de formas.
A veces no se observan picos en absoluto en el cromatograma donde se espera que se eluyan. El gráfico de pared anterior indica que la ausencia de un pico (suponiendo que la muestra realmente contiene el analito objetivo en una concentración que debería hacer que la respuesta del detector sea suficiente para verlo por encima del ruido) generalmente está relacionada con algún problema del instrumento o condiciones incorrectas de la fase móvil (si es que se observan). picos, generalmente demasiado “débiles”). Una breve lista de posibles problemas y soluciones en esta categoría se puede encontrar en la Tabla I.
Como se mencionó anteriormente, la cuestión de cuánto ensanchamiento de picos se debe tolerar antes de prestarle atención e intentar corregirlo es un tema complejo que abordaré en un artículo futuro. Mi experiencia indica que un ensanchamiento significativo de los picos suele ir acompañado de un cambio significativo en la forma del pico, y la aparición de colas en los picos es más común que la aparición de pre-picos o la división. Sin embargo, los picos nominalmente simétricos también se ensanchan, lo que puede deberse a varias razones diferentes:
Cada uno de estos temas se ha tratado en detalle en números anteriores de Troubleshooting LC, y los lectores interesados ​​pueden consultar dichos artículos para obtener información sobre las causas fundamentales y las posibles soluciones. Más detalles.
El ensanchamiento, el desdoblamiento y la división de los picos pueden ser causados ​​por fenómenos químicos o físicos, y la lista de posibles soluciones a estos problemas varía ampliamente, dependiendo de si se trata de un problema químico o físico. A menudo, al comparar los diferentes picos en un cromatograma, se pueden encontrar pistas importantes sobre cuál es el culpable. Si todos los picos en un cromatograma presentan formas similares, lo más probable es que la causa no sea física. Si solo uno o unos pocos picos se ven afectados, pero el resto se ven bien, lo más probable es que la causa sea química.
Las causas químicas del ensanchamiento de los picos son demasiado complejas para tratarlas brevemente aquí. Para un análisis más detallado, se remite al lector interesado al número reciente de "LC Troubleshooting" (10). Sin embargo, una solución sencilla consiste en reducir la masa del analito inyectado y observar si mejora la forma del pico. Si es así, esto indica que el problema se debe a una "sobrecarga de masa". En este caso, el método debe limitarse a inyectar pequeñas cantidades de analito o bien deben modificarse las condiciones cromatográficas para obtener picos con buena forma incluso con mayores cantidades inyectadas.
También hay muchas razones físicas potenciales para la cola del pico. Los lectores interesados ​​en una discusión detallada de las posibilidades pueden consultar otro número reciente de “LC Troubleshooting” (11). Una de las causas físicas más comunes de la cola del pico es una mala conexión en un punto entre el inyector y el detector (12). Un ejemplo extremo se muestra en la Figura 1d, obtenida en mi laboratorio hace unas semanas. En este caso, construimos un sistema con una nueva válvula de inyección que no habíamos usado antes e instalamos un bucle de inyección de pequeño volumen con una férula que había sido moldeada sobre un capilar de acero inoxidable. Después de algunos experimentos iniciales de resolución de problemas, nos dimos cuenta de que la profundidad del puerto en el estator de la válvula de inyección era mucho más profunda de lo que estábamos acostumbrados, lo que resultaba en un gran volumen muerto en el fondo del puerto. Este problema se resuelve fácilmente reemplazando el bucle de inyección con otro tubo, podemos ajustar la férula a la posición adecuada para eliminar el volumen muerto en el fondo del puerto.
Los frentes de pico como los que se muestran en la Figura 1e también pueden ser causados ​​por problemas físicos o químicos. Una causa física común del borde de ataque es que el lecho de partículas de la columna no está bien compactado o que las partículas se han reorganizado con el tiempo. Al igual que con el ensanchamiento del pico causado por este fenómeno físico, la mejor manera de solucionarlo es reemplazar la columna y continuar. Fundamentalmente, las formas de pico del borde de ataque con origen químico a menudo surgen de lo que llamamos condiciones de retención "no lineales". En condiciones ideales (lineales), la cantidad de analito retenida por la fase estacionaria (por lo tanto, el factor de retención) está relacionada linealmente con la concentración del analito en la columna. Cromatográficamente, esto significa que a medida que aumenta la masa de analito inyectada en la columna, el pico se vuelve más alto, pero no más ancho. Esta relación se rompe cuando el comportamiento de retención es no lineal, y los picos no solo se vuelven más altos sino también más anchos a medida que se inyecta más masa. Además, las formas no lineales determinan la forma de los picos cromatográficos, lo que da como resultado bordes de ataque o de salida. Al igual que con la sobrecarga de masa que causa pico El efecto de cola (10), el inicio del pico causado por la retención no lineal también se puede diagnosticar reduciendo la masa del analito inyectado. Si la forma del pico mejora, el método debe modificarse para no exceder la calidad de inyección que causa el borde inicial, o las condiciones cromatográficas deben cambiarse para minimizar este comportamiento.
A veces observamos lo que parece ser un pico "dividido", como se muestra en la Figura 1f. El primer paso para resolver este problema es determinar si la forma del pico se debe a una coelución parcial (es decir, la presencia de dos compuestos distintos pero que eluyen muy cerca). Si realmente hay dos analitos diferentes que eluyen cerca, entonces se trata de mejorar su resolución (por ejemplo, aumentando la selectividad, la retención o el número de platos), y los picos "divididos" aparentes están relacionados con el rendimiento físico que no tiene nada que ver con la columna en sí. A menudo, la pista más importante para esta decisión es si todos los picos en el cromatograma exhiben formas divididas, o solo uno o dos. Si es solo uno o dos, probablemente sea un problema de coelución; si todos los picos están divididos, probablemente sea un problema físico, muy probablemente relacionado con la columna en sí.
Los picos divididos relacionados con las propiedades físicas de la columna en sí se deben generalmente a fritas de entrada o salida parcialmente bloqueadas, o a la reorganización de partículas en la columna, lo que permite que la fase móvil fluya más rápido que la fase móvil en ciertas áreas de la formación del canal de la columna en otras regiones (11). A veces, una frita parcialmente obstruida puede limpiarse invirtiendo el flujo a través de la columna; sin embargo, en mi experiencia, esta suele ser una solución a corto plazo en lugar de una solución a largo plazo. Esto suele ser fatal con las columnas modernas si las partículas se recombinan dentro de la columna. En este punto, lo mejor es reemplazar la columna y continuar.
El pico en la Figura 1g, también de un caso reciente en mi propio laboratorio, generalmente indica que la señal es tan alta que ha alcanzado el extremo superior del rango de respuesta. Para los detectores de absorbancia óptica (UV-vis en este caso), cuando la concentración del analito es muy alta, el analito absorbe la mayor parte de la luz que pasa a través de la celda de flujo del detector, dejando muy poca luz para ser detectada. En estas condiciones, la señal eléctrica del fotodetector está fuertemente influenciada por varias fuentes de ruido, como luz parásita y "corriente oscura", lo que hace que la señal tenga una apariencia muy "borrosa" e independiente de la concentración del analito. Cuando esto sucede, el problema a menudo se puede resolver fácilmente reduciendo el volumen de inyección del analito, diluyendo la muestra o ambas cosas.
En la escuela de cromatografía, usamos la señal del detector (es decir, el eje y del cromatograma) como indicador de la concentración del analito en la muestra. Por lo tanto, parece extraño ver un cromatograma con una señal por debajo de cero, ya que la interpretación simple es que esto indica una concentración negativa del analito, lo cual, por supuesto, no es físicamente posible. En mi experiencia, los picos negativos se observan con mayor frecuencia cuando se utilizan detectores de absorbancia óptica (por ejemplo, UV-Vis).
En este caso, un pico negativo simplemente significa que las moléculas que eluyen de la columna absorben menos luz que la fase móvil misma inmediatamente antes y después del pico. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se utilizan longitudes de onda de detección relativamente bajas (<230 nm) y aditivos de la fase móvil que absorben la mayor parte de la luz en estas longitudes de onda. Dichos aditivos pueden ser componentes del disolvente de la fase móvil, como el metanol, o componentes del tampón, como el acetato o el formiato. De hecho, se pueden utilizar picos negativos para preparar una curva de calibración y obtener información cuantitativa precisa, por lo que no hay ninguna razón fundamental para evitarlos per se (este método a veces se denomina "detección UV indirecta") (13). Sin embargo, si realmente queremos evitar los picos negativos por completo, en el caso de la detección de absorbancia, la mejor solución es utilizar una longitud de onda de detección diferente para que el analito absorba más que la fase móvil, o cambiar la composición de la fase móvil para que absorba menos luz que los analitos.
También pueden aparecer picos negativos al utilizar la detección por índice de refracción (IR) cuando el índice de refracción de componentes distintos del analito en la muestra, como la matriz del disolvente, es diferente del índice de refracción de la fase móvil. Esto también ocurre con la detección UV-Vis, pero este efecto tiende a atenuarse en comparación con la detección por IR. En ambos casos, los picos negativos pueden minimizarse ajustando mejor la composición de la matriz de la muestra a la de la fase móvil.
En la tercera parte sobre el tema básico de la resolución de problemas de LC, analicé situaciones en las que la forma del pico observado difiere de la forma esperada o normal. La resolución eficaz de estos problemas comienza con el conocimiento de las formas de pico esperadas (basado en la teoría o la experiencia previa con los métodos existentes), por lo que las desviaciones de estas expectativas son obvias. Los problemas con la forma del pico tienen muchas causas potenciales diferentes (demasiado ancho, cola, borde de ataque, etc.). En esta entrega, analizo en detalle algunas de las razones que veo con más frecuencia. Conocer estos detalles proporciona un buen punto de partida para la resolución de problemas, pero no abarca todas las posibilidades. Los lectores interesados ​​en una lista más detallada de causas y soluciones pueden consultar el cuadro mural "Guía de resolución de problemas de LC" de LCGC.
(4) LCGC “Guía de solución de problemas de cromatografía líquida” (LC Troubleshooting Guide) póster mural.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Análisis de datos y procesamiento de señales en cromatografía (Elsevier, Nueva York, NY, 1998), págs. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF y Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.