Vissa felsökningsämnen för LC är aldrig föråldrade, eftersom det finns problem i LC-praktiken, även när instrumenttekniken förbättras med tiden. Det finns många sätt på vilka problem kan uppstå i ett LC-system och sluta i dåligt toppform. När problem relaterade till toppformen uppstår, hjälper en kort lista över möjliga orsaker till dessa resultat till att förenkla vår felsökningsupplevelse.
Det har varit roligt att skriva den här kolumnen "LC Felsökning" och fundera på olika ämnen varje månad, eftersom vissa ämnen aldrig går ur tiden. Medan vissa ämnen eller idéer inom kromatografiforskning blir föråldrade när de ersätts av nyare och bättre idéer, inom felsökning sedan den första felsökningsartikeln dök upp i denna tidskrift (LC Journal vid den tiden) eftersom vissa ämnen fortfarande är relevanta) 1983 (1). Under de senaste åren har jag fokuserat flera avsnitt om LC Felsökning på samtida trender som påverkar vätskekromatografi (LC) (till exempel den relativa jämförelsen av vår förståelse av effekten av tryck på retention [2] Nya framsteg) Vår tolkning av LC-resultat och hur man felsöker med moderna LC-instrument. I den här månadens del fortsätter jag min serie (3), som startade i december 2021, som fokuserade på några av "liv och död"-ämnena inom LC felsökning - element som är bra för alla felsökare är viktiga, oavsett systemets ålder. Kärnämnet i den här serien är mycket relevant för LCGC:s berömda väggplansch "LC Felsökningsguide" (4) som hänger i många laboratorier. För den tredje delen av den här serien valde jag att fokusera på problem relaterade till toppform eller toppegenskaper. Otroligt nog listar väggdiagrammet 44 olika potentiella orsaker till dålig toppform! Vi kan inte behandla alla dessa problem i detalj i en artikel, så i den här första delen om ämnet kommer jag att fokusera på några av de jag ser oftast. Jag hoppas att unga och gamla LC-användare kommer att hitta några användbara tips och påminnelser om detta viktiga ämne.
Jag märker att jag allt oftare svarar på felsökningsfrågor med "allt är möjligt". Det här svaret kan verka enkelt när man beaktar observationer som är svåra att tolka, men jag tycker att det ofta är lämpligt. Med tanke på att det finns många möjliga orsaker till dålig toppform är det viktigt att ha ett öppet sinne när man funderar över vad problemet kan vara, och att kunna prioritera potentiella orsaker för att påbörja våra felsökningsarbeten, med fokus på de vanligaste möjligheterna. Denna punkt är mycket viktig.
Ett viktigt steg i all felsökningsövning – men ett som jag tycker är underskattat – är att inse att det finns ett problem som behöver lösas. Att inse att det finns ett problem innebär ofta att inse att det som händer med verktyget skiljer sig från våra förväntningar, vilka formas av teori, empirisk kunskap och erfarenhet (5). Den "toppform" som avses här hänvisar faktiskt inte bara till toppens form (symmetrisk, asymmetrisk, slät, fluffig, framkant, svans, etc.), utan också till bredden. Våra förväntningar på den faktiska toppformen är enkla. Teori (6) stöder väl lärobokens förväntning att de kromatografiska topparna i de flesta fall ska vara symmetriska och överensstämma med formen av en Gaussisk fördelning, som visas i figur 1a. Vad vi förväntar oss av toppbredder är en mer komplex fråga, och vi kommer att diskutera detta ämne i en framtida artikel. De andra toppformerna i figur 1 visar några av de andra möjligheter som kan observeras – med andra ord, några av de sätt som saker kan gå fel på. I resten av denna del kommer vi att ägna tid åt att diskutera några specifika exempel på situationer som kan leda till dessa formtyper.
Ibland observeras toppar inte alls i kromatogrammet där de förväntas elueras. Väggdiagrammet ovan indikerar att avsaknaden av en topp (förutsatt att provet faktiskt innehåller målanalyten i en koncentration som borde göra detektorresponsen tillräcklig för att se den ovanför bruset) vanligtvis är relaterad till något instrumentproblem eller felaktiga mobila fasförhållanden (om de observeras alls). Toppar, vanligtvis för "svaga"). En kort lista över potentiella problem och lösningar i denna kategori finns i tabell I.
Som nämnts ovan är frågan om hur mycket toppbreddning som bör tolereras innan man uppmärksammar och försöker åtgärda den ett komplext ämne som jag kommer att diskutera i en framtida artikel. Min erfarenhet är att betydande toppbreddning ofta åtföljs av en betydande förändring i toppens form, och toppsvansning är vanligare än pre-peak eller splittring. De nominellt symmetriska topparna är dock också breddade, vilket kan orsakas av några olika anledningar:
Var och en av dessa problem har diskuterats i detalj i tidigare nummer av Troubleshooting LC, och läsare som är intresserade av dessa ämnen kan hänvisa till dessa tidigare artiklar för information om grundorsakerna och potentiella lösningar på dessa problem. Mer information.
Toppsvansning, toppfrontning och splittring kan alla orsakas av kemiska eller fysikaliska fenomen, och listan över potentiella lösningar på dessa problem varierar kraftigt, beroende på om vi har att göra med ett kemiskt eller fysikaliskt problem. Genom att jämföra de olika topparna i ett kromatogram kan man ofta hitta viktiga ledtrådar om vilken som är boven i dramat. Om alla toppar i ett kromatogram uppvisar liknande former är orsaken troligtvis inte fysikalisk. Om bara en eller några få toppar påverkas, men resten ser bra ut, är orsaken troligtvis kemisk.
De kemiska orsakerna till toppformning är för komplexa för att diskuteras kortfattat här. Den intresserade läsaren hänvisas till det senaste numret av "LC Troubleshooting" för en mer djupgående diskussion (10). Det är dock enkelt att försöka minska massan av den injicerade analyten och se om toppformen förbättras. Om så är fallet är detta en bra ledtråd till att problemet är "massöverbelastning". I detta fall måste metoden begränsas till att injicera små analytmassor, eller så måste de kromatografiska förhållandena ändras så att goda toppformer kan erhållas även med större injicerade massor.
Det finns också många potentiella fysiska orsaker till toppsvansning. Läsare som är intresserade av en detaljerad diskussion om möjligheterna hänvisas till ett annat nyligen publicerat nummer av "LC Troubleshooting" (11). En av de vanligaste fysiska orsakerna till toppsvansning är en dålig anslutning vid en punkt mellan injektorn och detektorn (12). Ett extremt exempel visas i figur 1d, erhållet i mitt labb för några veckor sedan. I det här fallet byggde vi ett system med en ny injektionsventil som vi inte hade använt tidigare, och installerade en injektionsslinga med liten volym med en hylsa som hade gjutits på en kapillär av rostfritt stål. Efter några inledande felsökningsexperiment insåg vi att portdjupet i injektionsventilens stator var mycket djupare än vi var vana vid, vilket resulterade i en stor dödvolym i botten av porten. Detta problem löses enkelt genom att byta ut injektionsslingan mot ett annat rör, vi kan justera hylsan till rätt position för att eliminera dödvolymen i botten av porten.
Toppfronter som de som visas i figur 1e kan också orsakas av fysikaliska eller kemiska problem. En vanlig fysikalisk orsak till framkanten är att kolonnens partikelbädd inte är välpackad, eller att partiklarna har omorganiserats över tid. Precis som med toppsvansning orsakad av detta fysikaliska fenomen är det bästa sättet att åtgärda detta att byta ut kolonnen och fortsätta. I grund och botten uppstår toppformer med kemiskt ursprung i framkanten ofta från det vi kallar "icke-linjära" retentionsförhållanden. Under ideala (linjära) förhållanden är mängden analyt som kvarhålls av den stationära fasen (därav retentionsfaktorn) linjärt relaterad till koncentrationen av analyten i kolonnen. Kromatografiskt betyder detta att när massan av analyt som injiceras i kolonnen ökar blir toppen högre, men inte bredare. Detta förhållande bryts när retentionsbeteendet är icke-linjärt, och topparna blir inte bara högre utan också bredare när mer massa injiceras. Dessutom bestämmer icke-linjära former formen på kromatografiska toppar, vilket resulterar i fram- eller bakkanter. Precis som med massöverbelastning som orsakar toppsvansning (10), orsakas toppledning genom ickelinjär retention kan också diagnostiseras genom att minska den injicerade analytmassan. Om toppens form förbättras måste metoden modifieras för att inte överskrida den injektionskvalitet som orsakar framkanten, eller så måste de kromatografiska förhållandena ändras för att minimera detta beteende.
Ibland observerar vi vad som verkar vara en "delad" topp, som visas i figur 1f. Det första steget i att lösa detta problem är att avgöra om toppformen beror på partiell sameluering (dvs. närvaron av två distinkta men nära eluerande föreningar). Om det faktiskt finns två olika analyter som eluerar nära varandra, handlar det om att förbättra deras upplösning (till exempel genom att öka selektivitet, retention eller plattantal), och de uppenbara "delade" topparna är relaterade till fysiska egenskaper. Prestanda har ingenting att göra med själva kolonnen. Ofta är den viktigaste ledtråden till detta beslut om alla toppar i kromatogrammet uppvisar delade former, eller bara en eller två. Om det bara är en eller två är det förmodligen ett problem med sameluering; om alla toppar är delade är det förmodligen ett fysiskt problem, troligtvis relaterat till själva kolonnen.
Delade toppar relaterade till själva kolonnens fysikaliska egenskaper beror vanligtvis på delvis blockerade inlopps- eller utloppsfrittor, eller omorganisation av partiklar i kolonnen, vilket gör att den mobila fasen kan flöda snabbare än den mobila fasen i vissa områden av kolonnens kanalbildning i andra regioner (11). Delvis igensatt frita kan ibland åtgärdas genom att reversera flödet genom kolonnen; men enligt min erfarenhet är detta vanligtvis en kortsiktig snarare än en långsiktig lösning. Detta är ofta dödligt med moderna kolonner om partiklarna rekombineras inuti kolonnen. Vid denna tidpunkt är det bäst att byta ut kolonnen och fortsätta.
Toppen i figur 1g, också från ett nyligen genomfört fall i mitt eget laboratorium, indikerar vanligtvis att signalen är så hög att den har nått den övre delen av responsintervallet. För optiska absorbansdetektorer (UV-vis i detta fall), när analytkoncentrationen är mycket hög, absorberar analyten det mesta av ljuset som passerar genom detektorns flödescell, vilket lämnar väldigt lite ljus att detektera. Under dessa förhållanden påverkas den elektriska signalen från fotodetektorn starkt av olika bruskällor, såsom ströljus och "mörkerström", vilket gör signalen mycket "suddig" i utseendet och oberoende av analytkoncentrationen. När detta händer kan problemet ofta enkelt lösas genom att minska analytens injektionsvolym – minska injektionsvolymen, späda ut provet eller båda.
I kromatografiskolan använder vi detektorsignalen (dvs. y-axeln i kromatogrammet) som en indikator på analytkoncentrationen i provet. Så det verkar konstigt att se ett kromatogram med en signal under noll, eftersom den enkla tolkningen är att detta indikerar en negativ analytkoncentration – vilket naturligtvis inte är fysiskt möjligt. Enligt min erfarenhet observeras negativa toppar oftast när man använder optiska absorbansdetektorer (t.ex. UV-vis).
I detta fall betyder en negativ topp helt enkelt att molekylerna som eluerar från kolonnen absorberar mindre ljus än själva den mobila fasen omedelbart före och efter toppen. Detta kan till exempel inträffa när man använder relativt låga detektionsvåglängder (<230 nm) och tillsatser i den mobila fasen som absorberar det mesta av ljuset vid dessa våglängder. Sådana tillsatser kan vara lösningsmedelskomponenter i den mobila fasen, såsom metanol, eller buffertkomponenter såsom acetat eller formiat. Man kan faktiskt använda negativa toppar för att framställa en kalibreringskurva och få fram korrekt kvantitativ information, så det finns ingen grundläggande anledning att undvika dem i sig (denna metod kallas ibland för "indirekt UV-detektion") (13). Men om vi verkligen vill undvika negativa toppar helt och hållet, när det gäller absorbansdetektion, är den bästa lösningen att använda en annan detektionsvåglängd så att analyten absorberar mer än den mobila fasen, eller ändra den mobila fasens sammansättning så att de absorberar mindre ljus än analyter.
Negativa toppar kan också uppstå vid användning av brytningsindex (RI)-detektion när brytningsindexet för andra komponenter än analyten i provet, såsom lösningsmedelsmatrisen, skiljer sig från brytningsindexet för den mobila fasen. Detta händer även med UV-vis-detektion, men denna effekt tenderar att dämpas i förhållande till RI-detektion. I båda fallen kan negativa toppar minimeras genom att provmatrisens sammansättning matchas mer med den mobila fasens.
I del tre om det grundläggande ämnet LC-felsökning diskuterade jag situationer där den observerade toppformen skiljer sig från den förväntade eller normala toppformen. Effektiv felsökning av sådana problem börjar med kunskap om förväntade toppformer (baserat på teori eller tidigare erfarenhet med befintliga metoder), så avvikelser från dessa förväntningar är uppenbara. Problem med toppform har många olika potentiella orsaker (för bred, svans, framkant, etc.). I den här delen diskuterar jag i detalj några av de orsaker jag ser oftast. Att känna till dessa detaljer ger en bra utgångspunkt för felsökning, men fångar inte alla möjligheter. Läsare som är intresserade av en mer djupgående lista över orsaker och lösningar kan hänvisa till LCGC:s väggplansch "LC Troubleshooting Guide".
(4) Väggkarta för LCGC ”LC Felsökningsguide”. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Dataanalys och signalbehandling inom kromatografi (Elsevier, New York, NY, 1998), s. 43–96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF och Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.