Certains sujets de dépannage LC ne sont jamais obsolètes, car il existe des problèmes dans la pratique LC, même si la technologie des instruments s'améliore au fil du temps. Il existe de nombreuses façons dont des problèmes peuvent survenir dans un système LC et aboutir à une mauvaise forme de pic. Lorsque des problèmes liés à la forme de pic surviennent, une courte liste de causes possibles de ces résultats permet de simplifier notre expérience de dépannage.
C'est un plaisir d'écrire cette chronique « Dépannage LC » et de réfléchir à des sujets chaque mois, car certains sujets ne se démodent jamais. Alors que dans le domaine de la recherche en chromatographie, certains sujets ou idées deviennent obsolètes car ils sont remplacés par des idées plus récentes et meilleures, dans le domaine du dépannage, depuis le premier article de dépannage paru dans cette revue (le LC Journal à l'époque), certains sujets sont toujours d'actualité) en 1983(1). Au cours des dernières années, j'ai consacré plusieurs sections de dépannage LC aux tendances contemporaines affectant la chromatographie liquide (LC) (par exemple, la comparaison relative de notre compréhension de l'effet de la pression sur la rétention [2], les nouvelles avancées), notre interprétation des résultats LC et la façon de résoudre les problèmes avec les instruments LC modernes. Dans l'épisode de ce mois-ci, je poursuis ma série (3), commencée en décembre 2021, qui se concentrait sur certains des sujets « de vie ou de mort » du dépannage LC ; les éléments qui sont excellents pour tout dépanneur sont essentiels, quel que soit l'âge du système que nous utilisons. Le sujet principal de cette série est très pertinent pour le célèbre tableau mural « Guide de dépannage LC » du LCGC (4) accroché dans de nombreux laboratoires. Pour la troisième partie de cette série, j'ai choisi de me concentrer sur les problèmes liés à la forme des pics ou aux caractéristiques des pics. Incroyablement, le tableau mural répertorie 44 causes potentielles différentes d'une mauvaise forme de pic ! Nous ne pouvons pas examiner tous ces problèmes en détail dans un seul article, donc dans ce premier volet sur le sujet, je me concentrerai sur certains de ceux que je vois le plus souvent. J'espère que les utilisateurs de LC, jeunes et moins jeunes, trouveront quelques conseils et rappels utiles sur ce sujet important.
Je me retrouve de plus en plus à répondre aux questions de dépannage par « tout est possible ». Cette réponse peut sembler facile lorsque l'on considère des observations difficiles à interpréter, mais je la trouve souvent appropriée. Avec de nombreuses causes possibles de mauvaise forme de pic, il est important de garder l'esprit ouvert lorsque l'on considère quel pourrait être le problème, et de pouvoir hiérarchiser les causes potentielles pour commencer nos efforts de dépannage, en se concentrant sur les possibilités les plus courantes, ce point est très important.
Une étape clé de tout exercice de dépannage, mais que je trouve sous-estimée, consiste à reconnaître l'existence d'un problème à résoudre. Reconnaître l'existence d'un problème revient souvent à reconnaître que le comportement de l'outil diffère de nos attentes, lesquelles sont façonnées par la théorie, les connaissances empiriques et l'expérience (5). La « forme du pic » évoquée ici désigne non seulement la forme du pic (symétrique, asymétrique, lisse, aplatie, bord d'attaque, traînée, etc.), mais aussi sa largeur. Nos attentes concernant la forme réelle du pic sont simples. La théorie (6) corrobore bien l'hypothèse classique selon laquelle, dans la plupart des cas, les pics chromatographiques doivent être symétriques et conformes à la forme d'une distribution gaussienne, comme illustré à la figure 1a. Ce que nous attendons des largeurs de pics est une question plus complexe, et nous aborderons ce sujet dans un prochain article. Les autres formes de pics de la figure 1 illustrent d'autres possibilités observables, autrement dit, certaines des façons dont les choses pourraient mal tourner. Dans la suite de cet article, nous passerons du temps à discuter de quelques exemples spécifiques de situations pouvant conduire à ces types de formes.
Parfois, les pics ne sont pas observés du tout dans le chromatogramme où ils sont censés être élués. Le tableau mural ci-dessus indique que l'absence de pic (en supposant que l'échantillon contienne réellement l'analyte cible à une concentration qui devrait rendre la réponse du détecteur suffisante pour le voir au-dessus du bruit) est généralement liée à un problème d'instrument ou à des conditions de phase mobile incorrectes (si elles sont observées). pics, généralement trop « faibles »). Une courte liste de problèmes potentiels et de solutions dans cette catégorie se trouve dans le tableau I.
Comme mentionné ci-dessus, la question de savoir dans quelle mesure l'élargissement du pic doit être toléré avant d'y prêter attention et d'essayer de le corriger est un sujet complexe que j'aborderai dans un prochain article. Mon expérience est qu'un élargissement significatif du pic s'accompagne souvent d'un changement significatif de la forme du pic, et que l'atténuation du pic est plus courante que le pré-pic ou le fractionnement. Cependant, les pics nominalement symétriques sont également élargis, ce qui peut être causé par plusieurs raisons différentes :
Chacun de ces problèmes a été abordé en détail dans les numéros précédents de Troubleshooting LC. Les lecteurs intéressés par ces sujets peuvent se référer à ces articles pour en savoir plus sur les causes profondes et les solutions potentielles. Plus de détails.
La traînée de pic, le front de pic et la division peuvent tous être causés par des phénomènes chimiques ou physiques, et la liste des solutions potentielles à ces problèmes varie considérablement, selon que nous avons affaire à un problème chimique ou physique. Souvent, en comparant les différents pics d'un chromatogramme, vous pouvez trouver des indices importants sur lequel est le coupable. Si tous les pics d'un chromatogramme présentent des formes similaires, la cause n'est probablement pas physique. Si seulement un ou quelques pics sont affectés, mais que les autres semblent corrects, la cause est probablement chimique.
Les causes chimiques de la traînée de pic sont trop complexes pour être brièvement discutées ici. Le lecteur intéressé est renvoyé au numéro récent de « LC Troubleshooting » pour une discussion plus approfondie (10). Cependant, une chose facile à essayer est de réduire la masse de l'analyte injecté et de voir si la forme du pic s'améliore. Si c'est le cas, c'est un bon indice que le problème est une « surcharge de masse ». Dans ce cas, la méthode doit être limitée à l'injection de petites masses d'analyte, ou les conditions chromatographiques doivent être modifiées afin que de bonnes formes de pic puissent être obtenues même avec des masses plus importantes injectées.
Français Il existe également de nombreuses raisons physiques potentielles pour les traînées de pic. Les lecteurs intéressés par une discussion détaillée des possibilités sont renvoyés à un autre numéro récent de « LC Troubleshooting » (11). L'une des causes physiques les plus courantes de traînées de pic est une mauvaise connexion à un point entre l'injecteur et le détecteur (12). Un exemple extrême est illustré dans la figure 1d, obtenue dans mon laboratoire il y a quelques semaines. Dans ce cas, nous avons construit un système avec une nouvelle vanne d'injection que nous n'avions jamais utilisée auparavant et avons installé une boucle d'injection de petit volume avec une virole qui avait été moulée sur un capillaire en acier inoxydable. Après quelques expériences de dépannage initiales, nous avons réalisé que la profondeur de l'orifice dans le stator de la vanne d'injection était beaucoup plus profonde que ce à quoi nous étions habitués, ce qui entraînait un volume mort important au fond de l'orifice. Ce problème est facilement résolu en remplaçant la boucle d'injection par un autre tube, nous pouvons ajuster la virole à la bonne position pour éliminer le volume mort au fond de l'orifice.
Les fronts de pics, comme ceux illustrés à la figure 1e, peuvent également être causés par des problèmes physiques ou chimiques. Une cause physique courante du bord d'attaque est un lit de particules de la colonne mal compacté ou une réorganisation des particules au fil du temps. Comme pour la traînée de pics causée par ce phénomène physique, la meilleure façon de résoudre ce problème est de remplacer la colonne et de continuer. Fondamentalement, les formes de pics du bord d'attaque d'origine chimique proviennent souvent de ce que nous appelons des conditions de rétention « non linéaires ». Dans des conditions idéales (linéaires), la quantité d'analyte retenue par la phase stationnaire (d'où le facteur de rétention) est linéairement liée à la concentration de l'analyte dans la colonne. Chromatographiquement, cela signifie que lorsque la masse d'analyte injectée dans la colonne augmente, le pic devient plus haut, mais pas plus large. Cette relation est rompue lorsque le comportement de rétention est non linéaire, et les pics deviennent non seulement plus hauts, mais aussi plus larges à mesure que la masse injectée augmente. De plus, les formes non linéaires déterminent la forme des pics chromatographiques, ce qui donne lieu à des bords d'attaque ou de fuite. avec une surcharge de masse qui provoque un pic de queue (10), le pic de pointe causé par une rétention non linéaire peut également être diagnostiqué en réduisant la masse d'analyte injectée. Si la forme du pic s'améliore, la méthode doit être modifiée pour ne pas dépasser la qualité d'injection qui provoque le bord d'attaque, ou les conditions chromatographiques doivent être modifiées pour minimiser ce comportement.
Parfois, nous observons ce qui semble être un pic « divisé », comme le montre la figure 1f. La première étape pour résoudre ce problème est de déterminer si la forme du pic est due à une coélution partielle (c'est-à-dire la présence de deux composés distincts mais à élution proche). S'il y a en fait deux analytes différents éluant à proximité l'un de l'autre, il s'agit alors d'améliorer leur résolution (par exemple, en augmentant la sélectivité, la rétention ou le nombre de plaques), et les pics « divisés » apparents sont liés à des performances physiques. Les performances n'ont rien à voir avec la colonne elle-même. Souvent, l'indice le plus important pour cette décision est de savoir si tous les pics du chromatogramme présentent des formes divisées, ou seulement un ou deux. S'il n'y en a qu'un ou deux, il s'agit probablement d'un problème de coélution ; si tous les pics sont divisés, il s'agit probablement d'un problème physique, très probablement lié à la colonne elle-même.
Les pics fractionnés liés aux propriétés physiques de la colonne elle-même sont généralement dus à des frittés d'entrée ou de sortie partiellement bloqués, ou à une réorganisation des particules dans la colonne, permettant à la phase mobile de s'écouler plus rapidement que la phase mobile dans certaines zones de la formation du canal de la colonne. dans d'autres régions (11). Les frittés partiellement obstrués peuvent parfois être éliminés en inversant le flux à travers la colonne ; cependant, d'après mon expérience, il s'agit généralement d'une solution à court terme plutôt qu'à long terme. Ceci est souvent fatal avec les colonnes modernes si les particules se recombinent dans la colonne. À ce stade, il est préférable de remplacer la colonne et de continuer.
Le pic de la figure 1g, également issu d'un cas récent dans mon laboratoire, indique généralement que le signal est si élevé qu'il a atteint la limite supérieure de la plage de réponse. Pour les détecteurs d'absorbance optique (UV-visible dans ce cas), lorsque la concentration d'analyte est très élevée, l'analyte absorbe la majeure partie de la lumière traversant la cellule à flux du détecteur, laissant très peu de lumière à détecter. Dans ces conditions, le signal électrique du photodétecteur est fortement influencé par diverses sources de bruit, telles que la lumière parasite et le « courant d'obscurité », ce qui rend le signal très flou et indépendant de la concentration d'analyte. Dans ce cas, le problème peut souvent être facilement résolu en réduisant le volume d'injection de l'analyte, en diluant l'échantillon, ou les deux.
À l'école de chromatographie, nous utilisons le signal du détecteur (c'est-à-dire l'axe des y dans le chromatogramme) comme indicateur de la concentration d'analyte dans l'échantillon. Il semble donc étrange de voir un chromatogramme avec un signal inférieur à zéro, car l'interprétation simple est que cela indique une concentration d'analyte négative - ce qui bien sûr n'est pas physiquement possible. D'après mon expérience, les pics négatifs sont le plus souvent observés lors de l'utilisation de détecteurs d'absorbance optique (par exemple, UV-vis).
Français Dans ce cas, un pic négatif signifie simplement que les molécules éluées de la colonne absorbent moins de lumière que la phase mobile elle-même immédiatement avant et après le pic. Cela peut se produire, par exemple, lors de l'utilisation de longueurs d'onde de détection relativement faibles (< 230 nm) et d'additifs de phase mobile qui absorbent la majeure partie de la lumière à ces longueurs d'onde. Ces additifs peuvent être des composants de solvant de phase mobile tels que le méthanol ou des composants tampons tels que l'acétate ou le formiate. On peut en fait utiliser des pics négatifs pour préparer une courbe d'étalonnage et obtenir des informations quantitatives précises, il n'y a donc aucune raison fondamentale de les éviter en soi (cette méthode est parfois appelée « détection UV indirecte ») (13). Cependant, si nous voulons vraiment éviter complètement les pics négatifs, dans le cas de la détection d'absorbance, la meilleure solution est d'utiliser une longueur d'onde de détection différente afin que l'analyte absorbe plus que la phase mobile, ou de modifier la composition de la phase mobile afin qu'elle absorbe moins de lumière que les analytes.
Des pics négatifs peuvent également apparaître lors de l'utilisation de la détection de l'indice de réfraction (IR) lorsque l'indice de réfraction des composants autres que l'analyte dans l'échantillon, comme la matrice du solvant, est différent de l'indice de réfraction de la phase mobile. Cela se produit également avec la détection UV-vis, mais cet effet a tendance à être atténué par rapport à la détection IR. Dans les deux cas, les pics négatifs peuvent être minimisés en faisant correspondre plus étroitement la composition de la matrice de l'échantillon à celle de la phase mobile.
Français Dans la troisième partie sur le sujet de base du dépannage LC, j'ai discuté des situations dans lesquelles la forme de pic observée diffère de la forme de pic attendue ou normale. Un dépannage efficace de tels problèmes commence par la connaissance des formes de pic attendues (basées sur la théorie ou l'expérience antérieure avec les méthodes existantes), de sorte que les écarts par rapport à ces attentes sont évidents. Les problèmes de forme de pic ont de nombreuses causes potentielles différentes (trop large, traînée, bord d'attaque, etc.). Dans cet épisode, je discute en détail de certaines des raisons que je vois le plus souvent. Connaître ces détails fournit un bon point de départ pour le dépannage, mais ne capture pas toutes les possibilités. Les lecteurs intéressés par une liste plus approfondie des causes et des solutions peuvent se référer au tableau mural « Guide de dépannage LC » du LCGC.
(4) Tableau mural « Guide de dépannage LC » LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analyse des données et traitement du signal en chromatographie (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF et Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.