Certains sujets de dépannage des circuits LC restent toujours d'actualité, car des problèmes persistent dans la pratique, même si la technologie des instruments s'améliore avec le temps. De nombreux problèmes peuvent survenir dans un système LC et entraîner une mauvaise forme des pics. Lorsqu'un problème de forme de pic se présente, une liste restreinte des causes possibles facilite le dépannage.
Rédiger cette chronique « Dépannage LC » et réfléchir à de nouveaux sujets chaque mois a été un réel plaisir, car certains restent d'actualité. Si, dans le domaine de la recherche en chromatographie, certains sujets ou idées deviennent obsolètes, supplantés par des idées plus récentes et plus performantes, dans le domaine du dépannage, certains sujets demeurent pertinents depuis la parution du premier article sur le sujet dans cette revue (alors le LC Journal) en 1983 (1). Ces dernières années, j'ai consacré plusieurs sections de la rubrique « Dépannage LC » aux tendances actuelles qui affectent la chromatographie liquide (LC) (par exemple, la comparaison de notre compréhension de l'effet de la pression sur la rétention [2] New Advances), à l'interprétation des résultats LC et au dépannage des instruments LC modernes. Dans ce numéro, je poursuis ma série (3), commencée en décembre 2021, qui portait sur certains aspects cruciaux du dépannage LC : des éléments essentiels pour tout dépanneur, quel que soit l'âge du système utilisé. Le sujet principal de Cette série est étroitement liée au célèbre guide de dépannage LC (4) du LCGC, présent dans de nombreux laboratoires. Dans ce troisième volet, j'ai choisi d'aborder les problèmes de forme et de caractéristiques des pics. Ce guide recense pas moins de 44 causes potentielles de pics de mauvaise qualité ! Impossible de toutes les traiter en détail dans un seul article ; aussi, dans ce premier volet, je me concentrerai sur les plus fréquentes. J'espère que les utilisateurs de LC, débutants ou confirmés, y trouveront des conseils et des rappels utiles sur ce sujet important.
Je me surprends à répondre de plus en plus souvent aux questions de dépannage par « tout est possible ». Cette réponse peut sembler facile face à des observations difficiles à interpréter, mais je la trouve souvent appropriée. Compte tenu des nombreuses causes possibles d'une mauvaise forme de pic, il est important de rester ouvert d'esprit lorsqu'on envisage le problème et de pouvoir prioriser les causes potentielles pour commencer nos efforts de dépannage, en se concentrant sur les possibilités les plus courantes. Ce point est très important.
Une étape clé de tout exercice de dépannage — et pourtant souvent sous-estimée — consiste à identifier le problème à résoudre. Identifier un problème signifie souvent reconnaître que le comportement de l'outil diffère de nos attentes, lesquelles sont façonnées par la théorie, les connaissances empiriques et l'expérience (5). La « forme du pic » dont il est question ici ne se réfère pas seulement à sa forme (symétrique, asymétrique, lisse, irrégulière, avec un front raide, une traînée, etc.), mais aussi à sa largeur. Nos attentes concernant la forme réelle du pic sont simples. La théorie (6) confirme l'idée classique que, dans la plupart des cas, les pics chromatographiques doivent être symétriques et suivre une distribution gaussienne, comme illustré sur la figure 1a. La question de la largeur des pics est plus complexe et sera abordée dans un prochain article. Les autres formes de pics de la figure 1 illustrent d'autres possibilités — autrement dit, d'autres dysfonctionnements possibles. Dans la suite de cet article, nous… Consacrez du temps à discuter de quelques exemples précis de situations pouvant mener à ces types de formes.
Il arrive que certains pics ne soient pas observés sur le chromatogramme, alors qu'ils devraient être élués. Le graphique ci-dessus indique que l'absence d'un pic (en supposant que l'échantillon contienne bien l'analyte cible à une concentration suffisante pour que le détecteur puisse le détecter au-dessus du bruit de fond) est généralement liée à un problème d'instrumentation ou à des conditions de phase mobile incorrectes (si le pic est observé). Les pics sont généralement trop faibles. Un bref aperçu des problèmes potentiels et de leurs solutions est présenté dans le tableau I.
Comme mentionné précédemment, la question de savoir quel degré d'élargissement des pics est tolérable avant d'y prêter attention et de tenter de le corriger est un sujet complexe que j'aborderai dans un prochain article. Mon expérience montre qu'un élargissement important des pics s'accompagne souvent d'une modification significative de leur forme, et que la formation d'une queue de pic est plus fréquente que la présence d'un pré-pic ou d'un dédoublement. Cependant, même les pics nominalement symétriques peuvent s'élargir, ce qui peut être dû à plusieurs raisons :
Chacun de ces points a été abordé en détail dans les numéros précédents de Troubleshooting LC. Les lecteurs intéressés peuvent consulter ces articles pour obtenir des informations sur les causes profondes et les solutions potentielles. Plus de détails.
L'étalement, le front et le dédoublement des pics peuvent être causés par des phénomènes chimiques ou physiques, et la liste des solutions potentielles à ces problèmes varie considérablement selon qu'il s'agit d'un problème chimique ou physique. Souvent, la comparaison des différents pics d'un chromatogramme permet de trouver des indices importants sur l'origine du problème. Si tous les pics d'un chromatogramme présentent des formes similaires, la cause est très probablement non physique. Si seulement un ou quelques pics sont affectés, tandis que les autres semblent normaux, la cause est très probablement chimique.
Les causes chimiques de l'étalement des pics sont trop complexes pour être abordées brièvement ici. Le lecteur intéressé pourra se référer au dernier numéro de « LC Troubleshooting » pour une discussion plus approfondie (10). Cependant, une solution simple consiste à réduire la masse d'analyte injectée et à vérifier si la forme du pic s'améliore. Si tel est le cas, cela indique fortement que le problème est une surcharge de masse. Dans ce cas, la méthode doit être limitée à l'injection de faibles masses d'analyte, ou les conditions chromatographiques doivent être modifiées afin d'obtenir des pics de bonne forme même avec des masses injectées plus importantes.
Il existe également de nombreuses causes physiques potentielles à l'étalement des pics. Les lecteurs intéressés par une discussion détaillée de ces possibilités sont invités à consulter un autre numéro récent de « LC Troubleshooting » (11). L'une des causes physiques les plus courantes de cet étalement est une mauvaise connexion entre l'injecteur et le détecteur (12). Un exemple extrême est présenté sur la figure 1d, obtenu dans mon laboratoire il y a quelques semaines. Dans ce cas, nous avons construit un système avec une nouvelle vanne d'injection que nous n'avions jamais utilisée auparavant et installé une boucle d'injection de petit volume avec une virole moulée sur un capillaire en acier inoxydable. Après quelques essais de dépannage initiaux, nous avons constaté que la profondeur de l'orifice dans le stator de la vanne d'injection était bien supérieure à celle à laquelle nous étions habitués, ce qui entraînait un volume mort important au fond de l'orifice. Ce problème se résout facilement en remplaçant la boucle d'injection par un autre tube ; nous pouvons alors ajuster la virole à la position adéquate pour éliminer le volume mort au fond de l'orifice.
Les fronts de pics comme ceux illustrés sur la figure 1e peuvent également être causés par des problèmes physiques ou chimiques. Une cause physique fréquente de ce front est un tassement insuffisant du lit de particules de la colonne, ou une réorganisation des particules au fil du temps. Comme pour l'étalement des pics dû à ce phénomène physique, la meilleure solution consiste à remplacer la colonne et à poursuivre l'analyse. Fondamentalement, les formes de fronts de pics d'origine chimique résultent souvent de conditions de rétention non linéaires. Dans des conditions idéales (linéaires), la quantité d'analyte retenue par la phase stationnaire (donc le facteur de rétention) est linéairement proportionnelle à la concentration de l'analyte dans la colonne. En chromatographie, cela signifie que lorsque la masse d'analyte injectée dans la colonne augmente, le pic devient plus haut, mais pas plus large. Cette relation est rompue lorsque le comportement de rétention est non linéaire : les pics deviennent alors non seulement plus hauts, mais aussi plus larges à mesure que la masse injectée augmente. De plus, les formes non linéaires déterminent la forme des pics chromatographiques, donnant lieu à des fronts de montée ou de descente. Comme pour la surcharge de masse qui provoque un étalement du pic (10), le pic en tête causé par une rétention non linéaire peut également être diagnostiqué en réduisant la masse d'analyte injectée. Si la forme du pic s'améliore, la méthode doit être modifiée pour ne pas dépasser la qualité d'injection qui provoque le front de montée, ou les conditions chromatographiques doivent être modifiées pour minimiser ce comportement.
Il arrive que l'on observe un pic apparemment dédoublé, comme illustré sur la figure 1f. La première étape pour résoudre ce problème consiste à déterminer si la forme du pic est due à une co-élution partielle (c'est-à-dire la présence de deux composés distincts mais élués très proches). S'il s'agit effectivement de deux analytes différents élués à proximité l'un de l'autre, il s'agit alors d'améliorer leur résolution (par exemple, en augmentant la sélectivité, la rétention ou le nombre de plateaux théoriques), et les pics apparemment dédoublés sont liés à des facteurs physiques. Les performances de la colonne n'ont rien à voir avec la colonne elle-même. Souvent, l'indice le plus important pour trancher est de savoir si tous les pics du chromatogramme présentent une forme dédoublée, ou seulement un ou deux. Si c'est le cas pour un ou deux pics seulement, il s'agit probablement d'un problème de co-élution ; si tous les pics sont dédoublés, il s'agit probablement d'un problème physique, très probablement lié à la colonne elle-même.
Les pics dédoublés liés aux propriétés physiques de la colonne sont généralement dus à des frittes d'entrée ou de sortie partiellement obstruées, ou à une réorganisation des particules dans la colonne, permettant à la phase mobile de s'écouler plus rapidement dans certaines zones des canaux de la colonne que dans d'autres (11). Il est parfois possible de déboucher une fritte partiellement obstruée en inversant le sens d'écoulement dans la colonne ; cependant, d'après mon expérience, il s'agit généralement d'une solution temporaire. Ce problème est souvent fatal avec les colonnes modernes si les particules se recombinent à l'intérieur de la colonne. Dans ce cas, il est préférable de remplacer la colonne et de poursuivre l'analyse.
Le pic observé sur la figure 1g, également issu d'un cas récent dans mon laboratoire, indique généralement que le signal est si élevé qu'il a atteint la limite supérieure de la plage de réponse. Pour les détecteurs d'absorbance optique (UV-visible dans ce cas), lorsque la concentration de l'analyte est très élevée, celui-ci absorbe la majeure partie de la lumière traversant la cellule d'écoulement du détecteur, ne laissant que très peu de lumière détectable. Dans ces conditions, le signal électrique du photodétecteur est fortement influencé par diverses sources de bruit, telles que la lumière parasite et le courant d'obscurité, ce qui rend le signal très flou et indépendant de la concentration de l'analyte. Lorsque cela se produit, le problème peut souvent être facilement résolu en réduisant le volume d'injection de l'analyte : en diminuant le volume d'injection, en diluant l'échantillon, ou les deux.
En chromatographie, on utilise le signal du détecteur (c'est-à-dire l'axe des ordonnées du chromatogramme) comme indicateur de la concentration de l'analyte dans l'échantillon. Il peut donc paraître étrange d'observer un chromatogramme avec un signal négatif, car on pourrait facilement l'interpréter comme une concentration d'analyte négative, ce qui est physiquement impossible. D'après mon expérience, les pics négatifs sont le plus souvent observés avec des détecteurs d'absorbance optique (par exemple, UV-visible).
Dans ce cas, un pic négatif signifie simplement que les molécules éluées de la colonne absorbent moins de lumière que la phase mobile elle-même, juste avant et après le pic. Cela peut se produire, par exemple, lors de l'utilisation de longueurs d'onde de détection relativement basses (< 230 nm) et d'additifs à la phase mobile qui absorbent la majeure partie de la lumière à ces longueurs d'onde. Ces additifs peuvent être des composants du solvant de la phase mobile, tels que le méthanol, ou des composants du tampon, tels que l'acétate ou le formiate. On peut en fait utiliser les pics négatifs pour préparer une courbe d'étalonnage et obtenir des informations quantitatives précises ; il n'y a donc pas de raison fondamentale de les éviter (cette méthode est parfois appelée « détection UV indirecte ») (13). Cependant, si l'on souhaite vraiment éviter les pics négatifs, dans le cas de la détection par absorbance, la meilleure solution consiste à utiliser une longueur d'onde de détection différente afin que l'analyte absorbe davantage que la phase mobile, ou à modifier la composition de la phase mobile afin que les molécules absorbent moins de lumière que les analytes.
Des pics négatifs peuvent également apparaître lors de l'utilisation de la détection par indice de réfraction (IR) lorsque l'indice de réfraction de composants autres que l'analyte dans l'échantillon, tels que la matrice du solvant, est différent de celui de la phase mobile. Ce phénomène se produit également avec la détection UV-visible, mais cet effet tend à être atténué par rapport à la détection par IR. Dans les deux cas, les pics négatifs peuvent être minimisés en optimisant la composition de la matrice de l'échantillon par rapport à celle de la phase mobile.
Dans la troisième partie consacrée aux bases du dépannage des circuits intégrés à cristaux liquides (LC), j'ai abordé les situations où la forme du pic observé diffère de la forme attendue ou normale. Un dépannage efficace de ces problèmes repose sur la connaissance des formes de pic attendues (basée sur la théorie ou l'expérience acquise avec les méthodes existantes), ce qui permet d'identifier facilement les écarts. Les problèmes de forme de pic peuvent avoir de nombreuses causes (pic trop large, traînée, front d'attaque, etc.). Dans cette partie, je détaille certaines des causes les plus fréquentes. Ces informations constituent un bon point de départ pour le dépannage, mais ne permettent pas d'envisager toutes les possibilités. Les lecteurs souhaitant une liste plus exhaustive des causes et des solutions peuvent consulter le guide mural « LC Troubleshooting Guide » du LCGC.
(4) Tableau mural LCGC « Guide de dépannage LC ».https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analyse des données et traitement du signal en chromatographie (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF et Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.