Ba'zi LC muammolarini bartaraf etish mavzulari hech qachon eskirmaydi, chunki LC amaliyotida muammolar mavjud, hatto asboblar texnologiyasi vaqt o'tishi bilan yaxshilansa ham. LC tizimida muammolar paydo bo'lishi va yomon cho'qqi shaklida bo'lishining ko'plab usullari mavjud. Cho'qqi shakli bilan bog'liq muammolar paydo bo'lganda, ushbu natijalarning mumkin bo'lgan sabablarining qisqacha ro'yxati muammolarni bartaraf etish tajribamizni soddalashtirishga yordam beradi.
Ushbu "LC muammolarini bartaraf etish" ruknini yozish va har oy mavzular haqida o'ylash qiziqarli bo'ldi, chunki ba'zi mavzular hech qachon uslubdan chiqmaydi. Xromatografiya tadqiqotlari sohasida ba'zi mavzular yoki g'oyalar eskiradi, chunki ular yangi va yaxshiroq g'oyalar bilan almashtiriladi, muammolarni bartaraf etish sohasida, birinchi muammolarni bartaraf etish maqolasi ushbu jurnalda (o'sha paytdagi LC jurnali) 1983-yilda paydo bo'lganidan beri (1). So'nggi bir necha yil ichida men bir nechta LC muammolarini bartaraf etish bo'limlarini suyuq xromatografiyaga (LC) ta'sir qiluvchi zamonaviy tendentsiyalarga (masalan, bosimning ushlab turishga ta'sirini tushunishimizning nisbiy taqqoslashi [2] Yangi yutuqlar) qaratdim. LC natijalarini talqin qilishimiz va zamonaviy LC asboblari bilan muammolarni qanday bartaraf etishimiz. Ushbu oylik maqolamda men 2021-yil dekabr oyida boshlangan seriyamni (3) davom ettirmoqdaman, u LC muammolarini bartaraf etishning ba'zi "hayot va o'lim" mavzulariga qaratilgan edi - har qanday muammolarni bartaraf etish uchun juda yaxshi elementlar, biz foydalanayotgan tizimning yoshidan qat'i nazar, muhimdir. Ushbu seriyaning asosiy mavzusi juda dolzarbdir. LCGC ning mashhur "LC muammolarini bartaraf etish bo'yicha qo'llanma" devoriy jadvali (4) ko'plab laboratoriyalarda osilgan. Ushbu seriyaning uchinchi qismi uchun men cho'qqi shakli yoki cho'qqi xususiyatlari bilan bog'liq masalalarga e'tibor qaratishni tanladim. Ajablanarlisi shundaki, devoriy jadvalda cho'qqi shaklining yomonligining 44 xil mumkin bo'lgan sabablari keltirilgan! Biz bu muammolarning barchasini bitta maqolada batafsil ko'rib chiqa olmaymiz, shuning uchun mavzu bo'yicha ushbu birinchi qismda men eng ko'p ko'radigan ba'zilariga e'tibor qarataman. Umid qilamanki, yosh va keksa LC foydalanuvchilari ushbu muhim mavzu bo'yicha foydali maslahatlar va eslatmalar topadilar.
Men muammolarni bartaraf etish bo'yicha savollarga tobora ko'proq "hamma narsa mumkin" deb javob berayotganimni sezmoqdaman. Bu javob talqin qilish qiyin bo'lgan kuzatuvlarni ko'rib chiqishda oson tuyulishi mumkin, ammo men buni ko'pincha o'rinli deb bilaman. Cho'qqilar shaklining yomonligining ko'plab mumkin bo'lgan sabablari bilan, muammo nimada bo'lishi mumkinligini ko'rib chiqayotganda ochiq fikrda bo'lish va muammolarni bartaraf etish ishlarini boshlash uchun eng keng tarqalgan imkoniyatlarga e'tibor qaratish uchun potentsial sabablarni ustuvorlashtirish muhimdir, bu juda muhimdir.
Har qanday muammoni bartaraf etish mashqida asosiy qadam - lekin menimcha, yetarlicha baholanmagan qadam - bu hal qilinishi kerak bo'lgan muammo borligini tan olishdir. Muammo borligini tan olish ko'pincha asbob bilan sodir bo'ladigan narsa bizning nazariya, empirik bilim va tajriba (5) bilan shakllanadigan kutganlarimizdan farq qilishini tan olishni anglatadi. Bu yerda tilga olingan "cho'qqi shakli" aslida nafaqat cho'qqining shakliga (simmetrik, assimetrik, silliq, yumshoq, oldingi chekka, dum va boshqalar), balki kenglikka ham tegishli. Haqiqiy cho'qqi shakliga bo'lgan kutganlarimiz oddiy. Nazariya (6) ko'p hollarda xromatografik cho'qqilar simmetrik bo'lishi va 1a-rasmda ko'rsatilgandek Gauss taqsimoti shakliga mos kelishi kerakligi haqidagi darslikdagi kutganlarni yaxshi qo'llab-quvvatlaydi. Cho'qqi kengliklaridan nimani kutayotganimiz murakkabroq masala va biz bu mavzuni kelajakdagi maqolada muhokama qilamiz. 1-rasmdagi boshqa cho'qqi shakllari kuzatilishi mumkin bo'lgan ba'zi boshqa imkoniyatlarni ko'rsatadi - boshqacha aytganda, narsalar noto'g'ri ketishi mumkin bo'lgan ba'zi usullar. Ushbu qismning qolgan qismida biz mumkin bo'lgan ba'zi aniq vaziyatlarni muhokama qilishga vaqt ajratamiz. ushbu shakl turlariga olib keladi.
Ba'zan xromatogrammada cho'qqilar umuman kuzatilmaydi, bu yerda ular elyutatsiya qilinishi kutilmoqda. Yuqoridagi devor diagrammasi shuni ko'rsatadiki, cho'qqining yo'qligi (namunada aslida detektorning shovqin ustida ko'rish uchun yetarli bo'lgan konsentratsiyada nishon analit mavjud deb faraz qilsak) odatda biron bir asbob bilan bog'liq muammo yoki noto'g'ri mobil faza sharoitlari (agar umuman kuzatilsa) bilan bog'liq. cho'qqilar, odatda juda "kuchsiz"). Ushbu toifadagi potentsial muammolar va yechimlarning qisqa ro'yxatini I jadvalda topish mumkin.
Yuqorida aytib o'tilganidek, e'tibor berishdan va uni tuzatishga urinishdan oldin cho'qqilarning qanchalik kengayishiga yo'l qo'yilishi kerakligi masalasi - bu men keyingi maqolada muhokama qiladigan murakkab mavzu. Mening tajribam shuni ko'rsatadiki, cho'qqilarning sezilarli darajada kengayishi ko'pincha cho'qqilar shaklidagi sezilarli o'zgarish bilan birga keladi va cho'qqilarning quyruqlanishi cho'qqidan oldingi yoki bo'linishdan ko'ra ko'proq uchraydi. Biroq, nominal simmetrik cho'qqilar ham kengayadi, bu bir nechta turli sabablarga ko'ra yuzaga kelishi mumkin:
Ushbu masalalarning har biri LC muammolarini bartaraf etishning oldingi sonlarida batafsil muhokama qilingan va ushbu mavzularga qiziqqan o'quvchilar ushbu muammolarning asosiy sabablari va ularning yechimlari haqida ma'lumot olish uchun ushbu avvalgi maqolalarga murojaat qilishlari mumkin. Batafsil ma'lumot.
Cho'qqilarning quyruqlanishi, cho'qqilarning frontlanishi va bo'linish kimyoviy yoki fizik hodisalar tufayli yuzaga kelishi mumkin va bu muammolarga potentsial yechimlar ro'yxati biz kimyoviy yoki fizik muammo bilan shug'ullanayotganimizga qarab juda katta farq qiladi. Ko'pincha, xromatogrammadagi turli cho'qqilarni taqqoslash orqali siz aybdor kim ekanligi haqida muhim ma'lumotlarni topishingiz mumkin. Agar xromatogrammadagi barcha cho'qqilar o'xshash shakllarni namoyon qilsa, sabab, ehtimol, jismoniy emas. Agar faqat bitta yoki bir nechta cho'qqilar ta'sirlangan bo'lsa, lekin qolganlari yaxshi ko'rinsa, sabab, ehtimol, kimyoviydir.
Cho'qqilarning kimyoviy sabablari bu yerda qisqacha muhokama qilish uchun juda murakkab. Qiziqqan o'quvchi chuqurroq muhokama uchun yaqinda nashr etilgan "LC muammolarini bartaraf etish" soniga murojaat qiladi (10). Biroq, sinab ko'rish oson bo'lgan narsa - yuborilgan analit massasini kamaytirish va cho'qqi shakli yaxshilanishini ko'rish. Agar shunday bo'lsa, unda bu muammo "massaning haddan tashqari ko'pligi" ekanligiga yaxshi ishora. Bu holda, usul kichik analit massalarini yuborish bilan cheklanishi yoki xromatografik sharoitlarni o'zgartirish kerak, shunda katta massalar yuborilganda ham yaxshi cho'qqi shakllarini olish mumkin.
Cho'qqi qulashining ko'plab potentsial jismoniy sabablari ham mavjud. Imkoniyatlarni batafsil muhokama qilishdan manfaatdor bo'lgan o'quvchilar "LC muammolarini bartaraf etish" (11) jurnalining yana bir so'nggi soniga murojaat qilishadi. Cho'qqi qulashining eng keng tarqalgan jismoniy sabablaridan biri injektor va detektor o'rtasidagi nuqtada yomon ulanishdir (12). Bunga bir necha hafta oldin mening laboratoriyamda olingan 1d-rasmda misol keltirilgan. Bu holda, biz ilgari foydalanmagan yangi in'ektsiya klapani bilan tizim qurdik va zanglamaydigan po'lat kapillyarga quyilgan ferrulali kichik hajmli in'ektsiya halqasini o'rnatdik. Dastlabki muammolarni bartaraf etish tajribalaridan so'ng, biz in'ektsiya klapani statoridagi port chuqurligi biz odatdagidan ancha chuqurroq ekanligini va natijada portning pastki qismida katta o'lik hajm paydo bo'lishini angladik. Bu muammo in'ektsiya halqasini boshqa naycha bilan almashtirish orqali osongina hal qilinadi, biz portning pastki qismidagi o'lik hajmni yo'q qilish uchun ferrulani kerakli holatga keltirishimiz mumkin.
1e-rasmda ko'rsatilgandek cho'qqilar ham fizik yoki kimyoviy muammolar tufayli yuzaga kelishi mumkin. Yetakchi qirraning keng tarqalgan fizik sababi shundaki, ustunning zarrachalar qatlami yaxshi joylashmagan yoki zarrachalar vaqt o'tishi bilan qayta tashkil etilgan. Ushbu fizik hodisa tufayli cho'qqilar quyruqida bo'lgani kabi, buni tuzatishning eng yaxshi usuli ustunni almashtirish va davom etishdir. Asosan, kimyoviy kelib chiqishi bo'lgan yetakchi qirra cho'qqilari shakllari ko'pincha biz "chiziqli bo'lmagan" ushlab turish sharoitlari deb ataydigan narsadan kelib chiqadi. Ideal (chiziqli) sharoitlarda, statsionar faza tomonidan ushlab turilgan analit miqdori (shuning uchun ushlab turish koeffitsienti) ustundagi analit konsentratsiyasiga chiziqli bog'liqdir. Xromatografik jihatdan, bu ustunga yuborilgan analit massasi oshgani sayin cho'qqi balandroq bo'lishini, lekin kengroq bo'lmasligini anglatadi. Bu bog'liqlik ushlab turish xatti-harakati chiziqli bo'lmaganda buziladi va cho'qqilar nafaqat balandroq, balki ko'proq massa yuborilganda kengroq bo'ladi. Bundan tashqari, chiziqli bo'lmagan shakllar xromatografik cho'qqilarning shaklini belgilaydi, natijada yetakchi yoki orqadagi qirralar paydo bo'ladi. Cho'qqilar quyruqiga olib keladigan massa haddan tashqari yuklanishida bo'lgani kabi (10), cho'qqi Nochiziqli ushlab turish natijasida kelib chiqadigan qo'rg'oshinni AOK qilingan analit massasini kamaytirish orqali ham tashxislash mumkin. Agar cho'qqi shakli yaxshilansa, usulni qo'rg'oshin chekkasini keltirib chiqaradigan in'ektsiya sifatidan oshmasligi uchun o'zgartirish kerak yoki bu xatti-harakatni minimallashtirish uchun xromatografik sharoitlarni o'zgartirish kerak.
Ba'zan biz 1f-rasmda ko'rsatilgandek, "bo'lingan" cho'qqiga o'xshagan narsani kuzatamiz. Bu muammoni hal qilishning birinchi bosqichi cho'qqi shakli qisman qo'shma elyutsiya (ya'ni, ikkita alohida, ammo yaqin elyutsiyalanuvchi birikmalarning mavjudligi) tufayli ekanligini aniqlashdir. Agar aslida bir-biriga yaqin elyutsiyalanuvchi ikkita turli analit bo'lsa, unda ularning aniqligini oshirish masalasi (masalan, selektivlikni, ushlab turishni yoki plastinkalar sonini oshirish orqali) va ko'rinadigan "bo'lingan" cho'qqilar jismoniy holat bilan bog'liq. Ishlash ustunning o'zi bilan hech qanday aloqasi yo'q. Ko'pincha, bu qarorning eng muhim kaliti xromatogrammadagi barcha cho'qqilar bo'lingan shakllarni ko'rsatadimi yoki faqat bitta yoki ikkitami. Agar u faqat bitta yoki ikkita bo'lsa, bu ehtimol qo'shma elyutsiya muammosi; agar barcha cho'qqilar bo'lingan bo'lsa, bu ehtimol jismoniy muammo, ehtimol ustunning o'zi bilan bog'liq.
Ustunning o'zining fizik xususiyatlari bilan bog'liq bo'linish cho'qqilari odatda qisman bloklangan kirish yoki chiqish fritlari yoki ustundagi zarrachalarning qayta tashkil etilishi natijasida yuzaga keladi, bu esa ustun kanalining shakllanishining ayrim sohalarida mobil fazaning mobil fazaga qaraganda tezroq oqishiga imkon beradi (boshqa mintaqalarda (11). Qisman tiqilib qolgan fritni ba'zan ustun orqali oqimni teskari yo'naltirish orqali tozalash mumkin; ammo, mening tajribamga ko'ra, bu odatda uzoq muddatli emas, balki qisqa muddatli yechimdir. Agar zarrachalar ustun ichida qayta birlashsa, bu ko'pincha zamonaviy ustunlarda halokatli bo'ladi. Bu nuqtada ustunni almashtirish va davom ettirish yaxshidir.
1g-rasmdagi cho'qqi, shuningdek, mening o'z laboratoriyamda yaqinda olingan misolda, odatda signal shunchalik yuqori bo'lganki, u javob diapazonining yuqori chegarasiga yetganligini ko'rsatadi. Optik yutilish detektorlari uchun (bu holda UV-vis), analit konsentratsiyasi juda yuqori bo'lganda, analit detektor oqim kamerasidan o'tadigan yorug'likning ko'p qismini yutadi va aniqlanadigan yorug'lik juda kam qoladi. Bunday sharoitlarda fotodetektordan keladigan elektr signaliga turli xil shovqin manbalari, masalan, adashgan yorug'lik va "qorong'u oqim" kuchli ta'sir qiladi, bu esa signalni tashqi ko'rinishida juda "xira" qiladi va analit konsentratsiyasidan mustaqil bo'ladi. Bu sodir bo'lganda, muammo ko'pincha analitning in'ektsiya hajmini kamaytirish - in'ektsiya hajmini kamaytirish, namunani suyultirish yoki ikkalasi ham orqali osongina hal qilinishi mumkin.
Xromatografiya maktabida biz namunadagi analit konsentratsiyasining ko'rsatkichi sifatida detektor signalidan (ya'ni, xromatogrammadagi y o'qidan) foydalanamiz. Shuning uchun signali noldan past bo'lgan xromatogrammani ko'rish g'alati tuyuladi, chunki oddiy talqin shundaki, bu analit konsentratsiyasining salbiy ekanligini ko'rsatadi - bu, albatta, jismonan mumkin emas. Mening tajribamda, optik yutilish detektorlaridan (masalan, UV-vis) foydalanganda salbiy cho'qqilar ko'pincha kuzatiladi.
Bu holda, manfiy cho'qqi shunchaki ustundan chiqib ketayotgan molekulalar cho'qqidan oldin va keyin mobil fazaning o'ziga qaraganda kamroq yorug'likni yutishini anglatadi. Bu, masalan, nisbatan past aniqlash to'lqin uzunliklari (<230 nm) va ushbu to'lqin uzunliklarida yorug'likning ko'p qismini yutib yuboradigan mobil faza qo'shimchalaridan foydalanilganda yuz berishi mumkin. Bunday qo'shimchalar metanol kabi mobil faza erituvchi komponentlari yoki asetat yoki format kabi bufer komponentlari bo'lishi mumkin. Kalibrlash egri chizig'ini tayyorlash va aniq miqdoriy ma'lumotlarni olish uchun aslida manfiy cho'qqilardan foydalanish mumkin, shuning uchun ulardan qochishning o'ziga xos sababi yo'q (bu usul ba'zan "bilvosita UB aniqlash" deb ataladi) (13). Biroq, agar biz chindan ham manfiy cho'qqilardan butunlay qochishni istasak, yutilish aniqlash holatida, eng yaxshi yechim analit mobil fazadan ko'proq yutishi uchun boshqa aniqlash to'lqin uzunligidan foydalanish yoki mobil faza tarkibini o'zgartirishdir, shunda ular analitlarga qaraganda kamroq yorug'likni yutadi.
Namunadagi analitdan tashqari boshqa komponentlarning, masalan, erituvchi matritsasi, sinish ko'rsatkichi mobil fazaning sinish ko'rsatkichidan farq qilganda, sinish ko'rsatkichi (RI) ni aniqlashda ham salbiy cho'qqilar paydo bo'lishi mumkin. Bu UV-vis aniqlashda ham sodir bo'ladi, ammo bu ta'sir RI aniqlashga nisbatan susayadi. Ikkala holatda ham, namunaviy matritsaning tarkibini mobil faza tarkibiga yaqinroq moslashtirish orqali salbiy cho'qqilarni minimallashtirish mumkin.
LC muammolarini bartaraf etishning asosiy mavzusi bo'yicha uchinchi qismda men kuzatilgan cho'qqi shakli kutilgan yoki normal cho'qqi shaklidan farq qiladigan vaziyatlarni muhokama qildim. Bunday muammolarni samarali bartaraf etish kutilgan cho'qqi shakllarini bilishdan boshlanadi (nazariya yoki mavjud usullar bilan oldingi tajribaga asoslanib), shuning uchun bu kutilganlardan chetga chiqishlar aniq. Cho'qqi shakli muammolarining ko'plab turli xil sabablari bor (juda keng, dum, oldingi chekka va boshqalar). Ushbu qismda men eng ko'p ko'radigan ba'zi sabablarni batafsil muhokama qilaman. Ushbu tafsilotlarni bilish muammolarni bartaraf etishni boshlash uchun yaxshi joy beradi, ammo barcha imkoniyatlarni qamrab olmaydi. Sabablar va yechimlarning batafsilroq ro'yxati bilan qiziqqan o'quvchilar LCGC "LC muammolarini bartaraf etish qo'llanmasi" devoriy jadvaliga murojaat qilishlari mumkin.
(4) LCGC “LC muammolarini bartaraf etish bo'yicha qo'llanma” devoriy jadvali. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Xromatografiyada ma'lumotlarni tahlil qilish va signallarni qayta ishlash (Elsevier, Nyu-York, NY, 1998), 43-96-betlar.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF va Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.