Ang ilang paksa sa pag-troubleshoot ng LC ay hindi kailanman luma, dahil may mga isyu sa pagsasagawa ng LC, kahit na ang teknolohiya ng instrumento ay bumubuti sa paglipas ng panahon. Maraming mga paraan kung saan maaaring lumitaw ang mga problema sa isang LC system at nauuwi sa mahinang hugis ng peak. Kapag lumitaw ang mga isyu na may kaugnayan sa hugis ng peak, ang isang maikling listahan ng mga posibleng sanhi para sa mga resultang ito ay nakakatulong na gawing simple ang aming karanasan sa pag-troubleshoot.
Nakakatuwang isulat ang kolum na ito na "LC Troubleshooting" at pag-iisip tungkol sa mga paksa bawat buwan, dahil ang ilang mga paksa ay hindi nawawalan ng uso. Habang nasa larangan ng pananaliksik sa chromatography, ang ilang mga paksa o ideya ay nagiging lipas na dahil napapalitan ang mga ito ng mas bago at mas mahusay na mga ideya, sa larangan ng pag-troubleshoot, simula nang lumabas ang unang artikulo sa pag-troubleshoot sa journal na ito (ang LC Journal noong panahong iyon) dahil ang ilang mga paksa ay may kaugnayan pa rin) noong 1983(1). Sa nakalipas na ilang taon, itinuon ko ang ilang mga seksyon ng LC Troubleshooting sa mga kontemporaryong uso na nakakaapekto sa liquid chromatography (LC) (halimbawa, ang relatibong paghahambing ng ating pag-unawa sa epekto ng pressure sa retention [2] New Advances) Ang aming interpretasyon ng mga resulta ng LC at kung paano mag-troubleshoot gamit ang mga modernong instrumento ng LC. Sa yugto ngayong buwan, ipagpapatuloy ko ang aking serye (3), na nagsimula noong Disyembre 2021, na nakatuon sa ilan sa mga paksang "buhay at kamatayan" ng pag-troubleshoot ng LC — ang mga elementong mahusay para sa sinumang troubleshooter ay mahalaga, anuman ang edad ng sistemang ginagamit natin. Ang pangunahing paksa ng seryeng ito ay lubos na may kaugnayan sa sikat na LCGC “Gabay sa Pag-troubleshoot ng LC” wall chart (4) na nakasabit sa maraming laboratoryo. Para sa ikatlong bahagi ng seryeng ito, pinili kong tumuon sa mga isyung may kaugnayan sa hugis ng tuktok o mga katangian ng tuktok. Hindi kapani-paniwala, ang wall chart ay naglilista ng 44 na iba't ibang potensyal na sanhi ng mahinang hugis ng tuktok! Hindi natin maaaring isaalang-alang nang detalyado ang lahat ng mga isyung ito sa isang artikulo, kaya sa unang yugtong ito sa paksa, tututuon ako sa ilan sa mga madalas kong makita. Umaasa ako na ang mga bata at matatandang gumagamit ng LC ay makakahanap ng ilang kapaki-pakinabang na tip at paalala sa mahalagang paksang ito.
Nakikita ko ang aking sarili na lalong sumasagot sa mga tanong sa pag-troubleshoot gamit ang "lahat ay posible". Ang sagot na ito ay maaaring mukhang madali kapag isinasaalang-alang ang mga obserbasyon na mahirap bigyang-kahulugan, ngunit madalas kong nakikita itong angkop. Dahil sa maraming posibleng sanhi ng mahinang hugis ng tuktok, mahalagang manatiling bukas ang isipan kapag isinasaalang-alang kung ano ang maaaring problema, at upang ma-prioritize ang mga potensyal na sanhi upang simulan ang ating mga pagsisikap sa pag-troubleshoot, na nakatuon sa mga pinakakaraniwang posibilidad, ang puntong ito ay napakahalaga.
Ang isang mahalagang hakbang sa anumang pagsasanay sa pag-troubleshoot — ngunit isa na sa tingin ko ay minamaliit — ay ang pagkilala na mayroong problema na kailangang lutasin. Ang pagkilala na mayroong problema ay kadalasang nangangahulugan ng pagkilala na ang nangyayari sa tool ay naiiba sa ating mga inaasahan, na hinuhubog ng teorya, empirikal na kaalaman, at karanasan (5). Ang "hugis ng rurok" na tinutukoy dito ay hindi lamang tumutukoy sa hugis ng rurok (simetriko, asimetriko, makinis, malambot, nangungunang gilid, tailing, atbp.), kundi pati na rin sa lapad. Ang ating mga inaasahan para sa aktwal na hugis ng rurok ay simple. Ang teorya (6) ay mahusay na sumusuporta sa inaasahan ng aklat-aralin na, sa karamihan ng mga kaso, ang mga chromatographic peak ay dapat na simetriko at umayon sa hugis ng isang Gaussian distribution, tulad ng ipinapakita sa Figure 1a. Ang inaasahan natin mula sa mga lapad ng rurok ay isang mas kumplikadong isyu, at tatalakayin natin ang paksang ito sa isang artikulo sa hinaharap. Ang iba pang mga hugis ng rurok sa Figure 1 ay nagpapakita ng ilan sa iba pang mga posibilidad na maaaring maobserbahan—sa madaling salita, ang ilan sa mga paraan kung paano maaaring magkamali ang mga bagay. Sa natitirang bahagi ng yugtong ito, gugugulin natin ang oras sa pagtalakay sa ilang partikular na halimbawa ng mga sitwasyon na maaaring humantong sa mga ganitong uri ng hugis.
Kung minsan, ang mga peak ay hindi talaga naoobserbahan sa chromatogram kung saan inaasahang mai-elute ang mga ito. Ipinapahiwatig ng tsart sa itaas na ang kawalan ng isang peak (kung ang sample ay talagang naglalaman ng target analyte sa isang konsentrasyon na dapat magbigay ng sapat na tugon ng detector upang makita ito sa itaas ng ingay) ay karaniwang nauugnay sa ilang isyu sa instrumento o maling mga kondisyon ng mobile phase (kung naobserbahan man). mga peak, kadalasang masyadong "mahina"). Ang isang maikling listahan ng mga potensyal na problema at solusyon sa kategoryang ito ay matatagpuan sa Talahanayan I.
Gaya ng nabanggit sa itaas, ang tanong kung gaano kalaking pagpapalawak ng peak ang dapat tiisin bago bigyang-pansin at subukang ayusin ito ay isang masalimuot na paksa na tatalakayin ko sa susunod na artikulo. Ang aking karanasan ay ang makabuluhang pagpapalawak ng peak ay kadalasang sinasamahan ng isang makabuluhang pagbabago sa hugis ng peak, at ang peak tailing ay mas karaniwan kaysa sa pre-peak o splitting. Gayunpaman, ang mga nominally symmetric peak ay lumalawak din, na maaaring sanhi ng ilang iba't ibang dahilan:
Ang bawat isa sa mga isyung ito ay tinalakay nang detalyado sa mga nakaraang isyu ng Troubleshooting LC, at ang mga mambabasang interesado sa mga paksang ito ay maaaring sumangguni sa mga nakaraang artikulong ito para sa impormasyon tungkol sa mga ugat na sanhi at mga potensyal na solusyon sa mga isyung ito. Higit pang mga detalye.
Ang peak tailing, peak fronting, at splitting ay maaaring sanhi ng kemikal o pisikal na penomena, at ang listahan ng mga potensyal na solusyon sa mga problemang ito ay lubhang nag-iiba, depende sa kung ang ating kinakaharap ay isang kemikal o pisikal na problema. Kadalasan, sa pamamagitan ng paghahambing ng iba't ibang peak sa isang chromatogram, makakahanap ka ng mahahalagang pahiwatig kung alin ang salarin. Kung ang lahat ng peak sa isang chromatogram ay nagpapakita ng magkakatulad na hugis, ang sanhi ay malamang na hindi pisikal. Kung isa o ilang peak lamang ang apektado, ngunit ang iba ay mukhang maayos, ang sanhi ay malamang na kemikal.
Ang mga kemikal na sanhi ng peak tailing ay masyadong kumplikado para talakayin nang maikli dito. Ang interesadong mambabasa ay tinutukoy ang kamakailang isyu ng "LC Troubleshooting" para sa mas malalim na talakayan (10). Gayunpaman, ang isang madaling subukan ay ang pagbabawas ng masa ng iniksyon na analyte at tingnan kung bumubuti ang hugis ng peak. Kung gayon, ito ay isang magandang palatandaan na ang problema ay "mass overload". Sa kasong ito, ang pamamaraan ay dapat limitado sa pag-iniksyon ng maliliit na masa ng analyte, o ang mga kondisyon ng chromatographic ay dapat baguhin upang ang magagandang hugis ng peak ay makuha kahit na may mas malalaking masa na iniksyon.
Marami ring potensyal na pisikal na dahilan para sa peak tailing. Ang mga mambabasang interesado sa isang detalyadong talakayan ng mga posibilidad ay tinutukoy ang isa pang kamakailang isyu ng "LC Troubleshooting" (11). Isa sa mga mas karaniwang pisikal na sanhi ng peak tailing ay ang mahinang koneksyon sa isang punto sa pagitan ng injector at detector (12). Ang isang matinding halimbawa ay ipinapakita sa Figure 1d, na nakuha sa aking lab ilang linggo na ang nakalilipas. Sa kasong ito, bumuo kami ng isang sistema na may bagong injection valve na hindi pa namin nagamit noon, at nag-install ng isang maliit na volume injection loop na may ferrule na hinulma sa isang stainless steel capillary. Pagkatapos ng ilang paunang eksperimento sa pag-troubleshoot, napagtanto namin na ang lalim ng port sa injection valve stator ay mas malalim kaysa sa nakasanayan namin, na nagreresulta sa isang malaking dead volume sa ilalim ng port. Ang problemang ito ay madaling malutas sa pamamagitan ng pagpapalit ng injection loop ng isa pang tubo, maaari naming ayusin ang ferrule sa tamang posisyon upang maalis ang dead volume sa ilalim ng port.
Ang mga peak front tulad ng ipinapakita sa Figure 1e ay maaari ring sanhi ng mga problemang pisikal o kemikal. Ang isang karaniwang pisikal na sanhi ng leading edge ay ang hindi maayos na pagkakaimpake ng particle bed ng column, o ang mga particle ay muling naayos sa paglipas ng panahon. Tulad ng peak tailing na dulot ng pisikal na phenomenon na ito, ang pinakamahusay na paraan upang ayusin ito ay ang palitan ang column at magpatuloy. Sa panimula, ang mga hugis ng peak ng leading edge na may kemikal na pinagmulan ay kadalasang nagmumula sa tinatawag nating "non-linear" na mga kondisyon ng pagpapanatili. Sa ilalim ng mga ideal (linear) na kondisyon, ang dami ng analyte na pinapanatili ng stationary phase (samakatuwid, ang retention factor) ay linear na nauugnay sa konsentrasyon ng analyte sa column. Sa chromatographic, nangangahulugan ito na habang tumataas ang masa ng analyte na iniksyon sa column, ang peak ay tumataas, ngunit hindi mas malapad. Ang ugnayang ito ay nasisira kapag ang retention behavior ay non-linear, at ang mga peak ay hindi lamang tumataas kundi mas malapad din habang mas maraming masa ang iniksyon. Bilang karagdagan, ang mga nonlinear na hugis ang tumutukoy sa hugis ng mga chromatographic peak, na nagreresulta sa mga leading o trailing edge. Tulad ng mass overload na nagdudulot ng peak tailing (10), Ang peak leading na dulot ng nonlinear retention ay maaari ring masuri sa pamamagitan ng pagbabawas ng iniksiyong analyte mass. Kung bumuti ang hugis ng peak, dapat baguhin ang pamamaraan upang hindi lumampas sa kalidad ng iniksiyon na nagdudulot ng leading edge, o dapat baguhin ang mga kondisyon ng chromatographic upang mabawasan ang ganitong pag-uugali.
Minsan ay nakakakita tayo ng tila isang "split" peak, gaya ng ipinapakita sa Figure 1f. Ang unang hakbang sa paglutas ng problemang ito ay ang pagtukoy kung ang hugis ng peak ay dahil sa partial co-elution (ibig sabihin, ang pagkakaroon ng dalawang magkaibang ngunit malapit na naglalabas ng mga compound). Kung mayroong dalawang magkaibang analyte na naglalabas ng magkalapit na bahagi, kailangan nating pagbutihin ang kanilang resolution (halimbawa, sa pamamagitan ng pagtaas ng selectivity, retention, o plate count), at ang maliwanag na "split" peak ay may kaugnayan sa pisikal na aspeto. Ang performance ay walang kinalaman sa mismong column. Kadalasan, ang pinakamahalagang palatandaan sa desisyong ito ay kung ang lahat ng peak sa chromatogram ay nagpapakita ng mga hugis na split, o isa o dalawa lamang. Kung isa o dalawa lamang ito, malamang na ito ay isang isyu ng co-elution; kung ang lahat ng peak ay nahati, malamang na ito ay isang pisikal na isyu, malamang na may kaugnayan sa mismong column.
Ang mga split peak na may kaugnayan sa mga pisikal na katangian ng mismong column ay karaniwang dahil sa bahagyang nabara na inlet o outlet frits, o muling pagsasaayos ng mga particle sa column, na nagpapahintulot sa mobile phase na dumaloy nang mas mabilis kaysa sa mobile phase sa ilang mga lugar ng pagbuo ng column channel sa ibang mga rehiyon (11). Ang bahagyang nabara na frit ay maaaring minsan ay maalis sa pamamagitan ng pagbaligtad ng daloy sa column; gayunpaman, sa aking karanasan, ito ay karaniwang isang panandaliang solusyon sa halip na isang pangmatagalang solusyon. Ito ay kadalasang nakamamatay sa mga modernong column kung ang mga particle ay muling magsasama-sama sa loob ng column. Sa puntong ito, pinakamahusay na palitan ang column at magpatuloy.
Ang rurok sa Figure 1g, mula rin sa isang kamakailang halimbawa sa sarili kong laboratoryo, ay karaniwang nagpapahiwatig na ang signal ay napakataas na kaya't naabot na nito ang pinakamataas na dulo ng saklaw ng tugon. Para sa mga optical absorbance detector (UV-vis sa kasong ito), kapag ang konsentrasyon ng analyte ay napakataas, sinisipsip ng analyte ang karamihan sa liwanag na dumadaan sa detector flow cell, na nag-iiwan ng napakakaunting liwanag na made-detect. Sa ilalim ng mga kondisyong ito, ang electrical signal mula sa photodetector ay lubhang naiimpluwensyahan ng iba't ibang pinagmumulan ng ingay, tulad ng stray light at "dark current", na ginagawang napaka-"malabo" ng signal ang hitsura at hindi nakadepende sa konsentrasyon ng analyte. Kapag nangyari ito, ang problema ay kadalasang madaling malutas sa pamamagitan ng pagbabawas ng injection volume ng analyte—pagbabawas ng injection volume, pagpapalabnaw ng sample, o pareho.
Sa paaralan ng chromatography, ginagamit namin ang signal ng detector (ibig sabihin, ang y-axis sa chromatogram) bilang tagapagpahiwatig ng konsentrasyon ng analyte sa sample. Kaya tila kakaiba na makakita ng isang chromatogram na may signal na mas mababa sa zero, dahil ang simpleng interpretasyon ay nagpapahiwatig ito ng negatibong konsentrasyon ng analyte – na siyempre ay hindi pisikal na posible. Sa aking karanasan, ang mga negatibong peak ay kadalasang naoobserbahan kapag gumagamit ng mga optical absorbance detector (hal., UV-vis).
Sa kasong ito, ang negatibong peak ay nangangahulugan lamang na ang mga molekulang lumalabas mula sa column ay sumisipsip ng mas kaunting liwanag kaysa sa mobile phase mismo bago at pagkatapos ng peak. Maaari itong mangyari, halimbawa, kapag gumagamit ng medyo mababang detection wavelengths (<230 nm) at mga mobile phase additives na sumisipsip ng karamihan sa liwanag sa mga wavelength na ito. Ang mga naturang additives ay maaaring mga mobile phase solvent components tulad ng methanol o mga buffer components tulad ng acetate o formate. Maaari talagang gamitin ang mga negatibong peak upang maghanda ng calibration curve at makakuha ng tumpak na quantitative na impormasyon, kaya walang pangunahing dahilan upang maiwasan ang mga ito mismo (ang pamamaraang ito ay minsan tinutukoy bilang "indirect UV detection") (13). Gayunpaman, kung talagang gusto nating maiwasan ang mga negatibong peak nang buo, sa kaso ng absorbance detection, ang pinakamahusay na solusyon ay ang paggamit ng ibang detection wavelength upang ang analyte ay sumisipsip ng higit pa kaysa sa mobile phase, o baguhin ang komposisyon ng mobile phase upang ang mga ito ay sumisipsip ng mas kaunting liwanag kaysa sa mga analyte.
Maaari ring lumitaw ang mga negatibong peak kapag ginagamit ang refractive index (RI) detection kapag ang refractive index ng mga bahagi maliban sa analyte sa sample, tulad ng solvent matrix, ay iba sa refractive index ng mobile phase. Nangyayari rin ito sa UV-vis detection, ngunit ang epektong ito ay may posibilidad na humina kumpara sa RI detection. Sa parehong kaso, ang mga negatibong peak ay maaaring mabawasan sa pamamagitan ng mas malapit na pagtutugma ng komposisyon ng sample matrix sa komposisyon ng mobile phase.
Sa ikatlong bahagi tungkol sa pangunahing paksa ng pag-troubleshoot ng LC, tinalakay ko ang mga sitwasyon kung saan ang naobserbahang hugis ng rurok ay naiiba sa inaasahan o normal na hugis ng rurok. Ang epektibong pag-troubleshoot ng mga naturang problema ay nagsisimula sa kaalaman sa inaasahang mga hugis ng rurok (batay sa teorya o naunang karanasan sa mga umiiral na pamamaraan), kaya ang mga paglihis mula sa mga inaasahan na ito ay halata. Ang mga problema sa hugis ng rurok ay may maraming iba't ibang potensyal na sanhi (masyadong malapad, buntot, nangungunang gilid, atbp.). Sa yugtong ito, tatalakayin ko nang detalyado ang ilan sa mga dahilan na madalas kong nakikita. Ang pag-alam sa mga detalyeng ito ay nagbibigay ng isang magandang lugar upang simulan ang pag-troubleshoot, ngunit hindi nakukuha ang lahat ng posibilidad. Ang mga mambabasang interesado sa mas malalim na listahan ng mga sanhi at solusyon ay maaaring sumangguni sa wall chart ng LCGC na "LC Troubleshooting Guide".
(4) Tsart sa dingding ng LCGC na “Gabay sa Pag-troubleshoot ng LC”. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Pagsusuri ng Datos at Pagproseso ng Signal sa Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF at Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.