Alguns tópicos de solução de problemas de LC nunca estão desatualizados, pois há problemas na prática de LC, mesmo que a tecnologia dos instrumentos melhore com o tempo. Há muitas maneiras pelas quais os problemas podem surgir em um sistema LC e terminar em um formato de pico ruim. Quando surgem problemas relacionados ao formato de pico, uma pequena lista de possíveis causas para esses resultados ajuda a simplificar nossa experiência de solução de problemas.
Foi divertido escrever esta coluna “Solução de problemas de LC” e pensar sobre tópicos a cada mês, porque alguns tópicos nunca saem de moda. Enquanto no campo da pesquisa em cromatografia certos tópicos ou ideias se tornam obsoletos à medida que são substituídos por ideias mais novas e melhores, no campo da solução de problemas, desde que o primeiro artigo de solução de problemas apareceu neste periódico (o LC Journal na época) já que alguns tópicos ainda são relevantes) em 1983 (1). Nos últimos anos, concentrei várias seções de solução de problemas de LC em tendências contemporâneas que afetam a cromatografia líquida (LC) (por exemplo, a comparação relativa de nossa compreensão do efeito da pressão na retenção [2] Novos avanços) Nossa interpretação dos resultados de LC e como solucionar problemas com instrumentos de LC modernos. Na edição deste mês, estou continuando minha série (3), que começou em dezembro de 2021, que se concentrou em alguns dos tópicos de “vida ou morte” da solução de problemas de LC — elementos que são ótimos para qualquer solucionador de problemas são essenciais, não importa a idade do sistema que estamos usando. O tópico principal desta série é altamente relevante para o famoso quadro de parede “Guia de solução de problemas de LC” do LCGC (4) pendurado em muitos laboratórios. Para a terceira parte desta série, optei por focar em problemas relacionados ao formato do pico ou às características do pico. Incrivelmente, o quadro de parede lista 44 causas potenciais diferentes para o formato do pico ruim! Não podemos considerar todos esses problemas em detalhes em um artigo, então nesta primeira parte sobre o tópico, vou me concentrar em alguns dos que vejo com mais frequência. Espero que usuários jovens e antigos do LC encontrem algumas dicas e lembretes úteis sobre este tópico importante.
Cada vez mais me pego respondendo a perguntas de solução de problemas com "tudo é possível". Essa resposta pode parecer fácil quando consideramos observações difíceis de interpretar, mas geralmente a acho apropriada. Com muitas causas possíveis para um formato de pico ruim, é importante manter a mente aberta ao considerar qual pode ser o problema e ser capaz de priorizar as causas potenciais para iniciar nossos esforços de solução de problemas, concentrando-nos nas possibilidades mais comuns. Esse ponto é muito importante.
Um passo fundamental em qualquer exercício de solução de problemas — mas que considero subestimado — é reconhecer que existe um problema que precisa ser resolvido. Reconhecer que existe um problema geralmente significa reconhecer que o que acontece com a ferramenta é diferente das nossas expectativas, que são moldadas pela teoria, conhecimento empírico e experiência (5). O "formato do pico" mencionado aqui, na verdade, refere-se não apenas ao formato do pico (simétrico, assimétrico, suave, macio, borda de ataque, cauda, ​​etc.), mas também à largura. Nossas expectativas para o formato real do pico são simples. A teoria (6) corrobora bem a expectativa do livro didático de que, na maioria dos casos, os picos cromatográficos devem ser simétricos e se conformar ao formato de uma distribuição gaussiana, conforme mostrado na Figura 1a. O que esperamos das larguras dos picos é uma questão mais complexa, e discutiremos esse tópico em um artigo futuro. Os outros formatos de pico na Figura 1 mostram algumas das outras possibilidades que podem ser observadas — em outras palavras, algumas das maneiras pelas quais as coisas podem dar errado. No restante desta edição, dedicaremos algum tempo à discussão de alguns exemplos específicos. de situações que podem levar a esses tipos de formas.
Às vezes, os picos não são observados no cromatograma onde se espera que sejam eluídos. O gráfico de parede acima indica que a ausência de um pico (assumindo que a amostra realmente contém o analito alvo em uma concentração que deve tornar a resposta do detector suficiente para vê-lo acima do ruído) geralmente está relacionada a algum problema no instrumento ou condições incorretas da fase móvel (se observadas). picos, geralmente muito "fracos"). Uma pequena lista de problemas e soluções potenciais nesta categoria pode ser encontrada na Tabela I.
Como mencionado acima, a questão de quanto alargamento de pico deve ser tolerado antes de prestar atenção e tentar corrigi-lo é um tópico complexo que discutirei em um artigo futuro. Minha experiência é que o alargamento significativo do pico é frequentemente acompanhado por uma mudança significativa no formato do pico, e a cauda do pico é mais comum do que o pré-pico ou a divisão. No entanto, os picos nominalmente simétricos também são alargados, o que pode ser causado por alguns motivos diferentes:
Cada um desses problemas foi discutido em detalhes em edições anteriores do Troubleshooting LC, e leitores interessados ​​nesses tópicos podem consultar esses artigos anteriores para obter informações sobre as causas raiz e possíveis soluções para esses problemas. Mais detalhes.
Cauda de pico, frente de pico e divisão podem ser causados ​​por fenômenos químicos ou físicos, e a lista de possíveis soluções para esses problemas varia muito, dependendo se estamos lidando com um problema químico ou físico. Muitas vezes, ao comparar os diferentes picos em um cromatograma, você pode encontrar pistas importantes sobre qual é o culpado. Se todos os picos em um cromatograma exibirem formas semelhantes, a causa provavelmente não é física. Se apenas um ou alguns picos forem afetados, mas o resto parecer normal, a causa provavelmente é química.
As causas químicas da distorção de pico são muito complexas para serem discutidas brevemente aqui. O leitor interessado pode consultar a edição recente de “Solução de problemas de LC” para uma discussão mais aprofundada (10). No entanto, uma coisa fácil de tentar é reduzir a massa do analito injetado e ver se o formato do pico melhora. Se sim, então esta é uma boa pista de que o problema é “sobrecarga de massa”. Neste caso, o método deve ser limitado à injeção de pequenas massas de analito, ou as condições cromatográficas devem ser alteradas para que bons formatos de pico possam ser obtidos mesmo com massas maiores injetadas.
Há também muitas razões físicas potenciais para o pico de cauda. Leitores interessados ​​em uma discussão detalhada das possibilidades são encaminhados para outra edição recente de “LC Troubleshooting” (11). Uma das causas físicas mais comuns do pico de cauda é uma conexão ruim em um ponto entre o injetor e o detector (12). Um exemplo extremo é mostrado na Figura 1d, obtido em meu laboratório algumas semanas atrás. Neste caso, construímos um sistema com uma nova válvula de injeção que não tínhamos usado antes e instalamos um circuito de injeção de pequeno volume com uma virola que havia sido moldada em um capilar de aço inoxidável. Após alguns experimentos iniciais de solução de problemas, percebemos que a profundidade da porta no estator da válvula de injeção era muito mais profunda do que estávamos acostumados, resultando em um grande volume morto na parte inferior da porta. Este problema é facilmente resolvido substituindo o circuito de injeção por outro tubo, podemos ajustar a virola para a posição adequada para eliminar o volume morto na parte inferior da porta.
Frentes de pico como as mostradas na Figura 1e também podem ser causadas por problemas físicos ou químicos. Uma causa física comum para a borda de ataque é que o leito de partículas da coluna não está bem compactado ou que as partículas se reorganizaram ao longo do tempo. Assim como ocorre com a formação de caudas nos picos causada por esse fenômeno físico, a melhor maneira de corrigir isso é substituir a coluna e continuar. Fundamentalmente, os formatos de pico da borda de ataque com origem química frequentemente surgem do que chamamos de condições de retenção "não lineares". Em condições ideais (lineares), a quantidade de analito retido pela fase estacionária (portanto, o fator de retenção) está linearmente relacionada à concentração do analito na coluna. Cromatograficamente, isso significa que, à medida que a massa do analito injetado na coluna aumenta, o pico se torna mais alto, mas não mais largo. Essa relação é quebrada quando o comportamento de retenção é não linear, e os picos não apenas se tornam mais altos, mas também mais largos à medida que mais massa é injetada. Além disso, os formatos não lineares determinam o formato dos picos cromatográficos, resultando em picos à esquerda ou à direita. bordas. Assim como ocorre com a sobrecarga de massa que causa a formação de cauda no pico (10), o pico líder causado pela retenção não linear também pode ser diagnosticado pela redução da massa do analito injetado. Se o formato do pico melhorar, o método deve ser modificado para não exceder a qualidade da injeção que causa a borda de ataque, ou as condições cromatográficas devem ser alteradas para minimizar esse comportamento.
Às vezes, observamos o que parece ser um pico "dividido", como mostrado na Figura 1f. O primeiro passo para resolver esse problema é determinar se o formato do pico é devido à coeluição parcial (ou seja, a presença de dois compostos distintos, mas eluindo de forma próxima). Se houver, na verdade, dois analitos diferentes eluindo próximos um do outro, então é uma questão de melhorar sua resolução (por exemplo, aumentando a seletividade, retenção ou contagem de placas), e os picos "divididos" aparentes estão relacionados ao desempenho físico. Não tem nada a ver com a coluna em si. Muitas vezes, a pista mais importante para essa decisão é se todos os picos no cromatograma exibem formatos divididos, ou apenas um ou dois. Se for apenas um ou dois, provavelmente é um problema de coeluição; se todos os picos estiverem divididos, provavelmente é um problema físico, provavelmente relacionado à coluna em si.
Picos de divisão relacionados às propriedades físicas da própria coluna geralmente são causados ​​por fritas de entrada ou saída parcialmente bloqueadas ou reorganização de partículas na coluna, permitindo que a fase móvel flua mais rápido do que a fase móvel em certas áreas da formação do canal da coluna em outras regiões (11). Às vezes, fritas parcialmente obstruídas podem ser removidas invertendo o fluxo pela coluna; no entanto, na minha experiência, essa geralmente é uma solução de curto prazo, e não de longo prazo. Isso costuma ser fatal com colunas modernas se as partículas se recombinarem dentro da coluna. Nesse ponto, é melhor substituir a coluna e continuar.
O pico na Figura 1g, também de um exemplo recente em meu próprio laboratório, geralmente indica que o sinal está tão alto que atingiu o limite superior da faixa de resposta. Para detectores de absorbância óptica (UV-vis neste caso), quando a concentração do analito é muito alta, o analito absorve a maior parte da luz que passa pela célula de fluxo do detector, deixando muito pouca luz para ser detectada. Nessas condições, o sinal elétrico do fotodetector é fortemente influenciado por várias fontes de ruído, como luz difusa e "corrente escura", tornando o sinal muito "difuso" na aparência e independente da concentração do analito. Quando isso acontece, o problema pode ser facilmente resolvido reduzindo o volume de injeção do analito — reduzindo o volume de injeção, diluindo a amostra ou ambos.
Na escola de cromatografia, usamos o sinal do detector (ou seja, o eixo y no cromatograma) como um indicador da concentração do analito na amostra. Portanto, parece estranho ver um cromatograma com um sinal abaixo de zero, pois a interpretação simples é que isso indica uma concentração negativa do analito, o que obviamente não é fisicamente possível. Na minha experiência, picos negativos são mais frequentemente observados ao usar detectores de absorbância óptica (por exemplo, UV-vis).
Neste caso, um pico negativo significa simplesmente que as moléculas eluídas da coluna absorvem menos luz do que a própria fase móvel imediatamente antes e depois do pico. Isso pode ocorrer, por exemplo, ao usar comprimentos de onda de detecção relativamente baixos (<230 nm) e aditivos de fase móvel que absorvem a maior parte da luz nesses comprimentos de onda. Esses aditivos podem ser componentes de solvente de fase móvel, como metanol, ou componentes de tampão, como acetato ou formato. Na verdade, pode-se usar picos negativos para preparar uma curva de calibração e obter informações quantitativas precisas, portanto, não há razão fundamental para evitá-los por si só (este método às vezes é chamado de "detecção UV indireta") (13). No entanto, se realmente quisermos evitar picos negativos completamente, no caso da detecção de absorbância, a melhor solução é usar um comprimento de onda de detecção diferente para que o analito absorva mais do que a fase móvel ou alterar a composição da fase móvel para que eles absorvam menos luz do que os analitos.
Picos negativos também podem aparecer ao usar a detecção de índice de refração (IR) quando o índice de refração de componentes diferentes do analito na amostra, como a matriz do solvente, é diferente do índice de refração da fase móvel. Isso também acontece com a detecção UV-vis, mas esse efeito tende a ser atenuado em relação à detecção de IR. Em ambos os casos, os picos negativos podem ser minimizados ao combinar mais de perto a composição da matriz da amostra com a da fase móvel.
Na parte três sobre o tópico básico de solução de problemas de LC, discuti situações em que o formato do pico observado difere do formato de pico esperado ou normal. A solução de problemas eficaz desses problemas começa com o conhecimento dos formatos de pico esperados (com base na teoria ou experiência anterior com métodos existentes), portanto, desvios dessas expectativas são óbvios. Problemas de formato de pico têm muitas causas potenciais diferentes (muito largo, cauda, ​​borda de ataque, etc.). Nesta edição, discuto em detalhes alguns dos motivos que vejo com mais frequência. Conhecer esses detalhes fornece um bom lugar para começar a solução de problemas, mas não captura todas as possibilidades. Leitores interessados ​​em uma lista mais detalhada de causas e soluções podem consultar o quadro de parede "Guia de solução de problemas de LC" do LCGC.
(4) Quadro de parede “Guia de solução de problemas de LCGC”. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Análise de dados e processamento de sinais em cromatografia (Elsevier, Nova York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF e Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.