Alguns tópicos de solução de problemas em LC nunca ficam obsoletos, pois sempre há problemas na prática de LC, mesmo com a melhoria da tecnologia dos instrumentos ao longo do tempo. Existem muitas maneiras pelas quais problemas podem surgir em um sistema de LC e resultar em picos com formato inadequado. Quando surgem problemas relacionados ao formato do pico, uma breve lista de possíveis causas para esses resultados ajuda a simplificar nossa experiência de solução de problemas.
Tem sido divertido escrever esta coluna “Solução de Problemas em CL” e pensar em tópicos a cada mês, porque alguns tópicos nunca saem de moda. Enquanto no campo da pesquisa em cromatografia certos tópicos ou ideias se tornam obsoletos à medida que são substituídos por ideias mais novas e melhores, no campo da solução de problemas, desde que o primeiro artigo sobre solução de problemas apareceu nesta revista (a LC Journal na época), alguns tópicos ainda são relevantes em 1983 (1). Nos últimos anos, concentrei várias seções de Solução de Problemas em CL em tendências contemporâneas que afetam a cromatografia líquida (CL) (por exemplo, a comparação relativa de nossa compreensão do efeito da pressão na retenção [2] Novos Avanços), nossa interpretação dos resultados de CL e como solucionar problemas com instrumentos de CL modernos. Nesta edição do mês, estou continuando minha série (3), que começou em dezembro de 2021, que se concentrou em alguns dos tópicos “de vida ou morte” da solução de problemas em CL — elementos que são ótimos para qualquer solucionador de problemas são essenciais, independentemente da idade do sistema que estamos usando. O tema central desta série é altamente relevante para o famoso pôster "Guia de Solução de Problemas de LC" da LCGC (4), presente em muitos laboratórios. Para a terceira parte desta série, optei por focar em questões relacionadas ao formato ou às características dos picos. Incrivelmente, o pôster lista 44 causas potenciais diferentes para um formato de pico inadequado! Não podemos abordar todas essas questões em detalhes em um único artigo, portanto, nesta primeira parte sobre o tema, focarei em algumas das que observo com mais frequência. Espero que usuários de LC, tanto iniciantes quanto experientes, encontrem dicas e lembretes úteis sobre este importante tópico.
Tenho me visto cada vez mais respondendo a perguntas sobre solução de problemas com "tudo é possível". Essa resposta pode parecer fácil ao considerar observações difíceis de interpretar, mas, na minha experiência, costuma ser apropriada. Com tantas causas possíveis para um formato de pico ruim, é importante manter a mente aberta ao considerar qual pode ser o problema e ser capaz de priorizar as causas potenciais para iniciar nossos esforços de solução de problemas, concentrando-nos nas possibilidades mais comuns. Este ponto é muito importante.
Uma etapa fundamental em qualquer exercício de resolução de problemas — mas que considero subestimada — é reconhecer que existe um problema a ser resolvido. Reconhecer que existe um problema muitas vezes significa reconhecer que o que acontece com a ferramenta é diferente das nossas expectativas, que são moldadas pela teoria, conhecimento empírico e experiência (5). O “formato do pico” aqui mencionado refere-se, na verdade, não apenas ao formato do pico (simétrico, assimétrico, suave, difuso, com borda de ataque, cauda, ​​etc.), mas também à sua largura. Nossas expectativas quanto ao formato real do pico são simples. A teoria (6) corrobora a expectativa encontrada nos livros didáticos de que, na maioria dos casos, os picos cromatográficos devem ser simétricos e seguir o formato de uma distribuição gaussiana, como mostrado na Figura 1a. O que esperamos das larguras dos picos é uma questão mais complexa, e discutiremos esse tópico em um artigo futuro. Os outros formatos de pico na Figura 1 mostram algumas das outras possibilidades que podem ser observadas — em outras palavras, algumas das maneiras pelas quais as coisas podem dar errado. No restante desta parte, dedicaremos um tempo para discutir alguns exemplos específicos de situações que pode levar a esses tipos de formato.
Às vezes, os picos não são observados no cromatograma, mesmo quando deveriam ser eluídos. O gráfico acima indica que a ausência de um pico (assumindo que a amostra realmente contenha o analito alvo em uma concentração que torne a resposta do detector suficiente para visualizá-lo acima do ruído) geralmente está relacionada a algum problema no instrumento ou a condições incorretas da fase móvel (se observadas). Uma breve lista de problemas e soluções potenciais nessa categoria pode ser encontrada na Tabela I.
Como mencionado acima, a questão de quanta dilatação do pico deve ser tolerada antes de se prestar atenção e tentar corrigi-la é um tópico complexo que abordarei em um artigo futuro. Minha experiência é que uma dilatação significativa do pico geralmente é acompanhada por uma mudança significativa na forma do pico, e o prolongamento da cauda do pico é mais comum do que o pré-pico ou o desdobramento. No entanto, os picos nominalmente simétricos também apresentam dilatação, o que pode ser causado por diversos motivos:
Cada um desses problemas foi discutido detalhadamente em edições anteriores do Troubleshooting LC, e os leitores interessados ​​nesses tópicos podem consultar esses artigos anteriores para obter informações sobre as causas principais e as possíveis soluções para esses problemas. Mais detalhes.
O prolongamento da cauda, ​​o alargamento da frente dos picos e o desdobramento dos picos podem ser causados ​​por fenômenos químicos ou físicos, e a lista de possíveis soluções para esses problemas varia bastante, dependendo se estamos lidando com um problema químico ou físico. Muitas vezes, comparando os diferentes picos em um cromatograma, é possível encontrar pistas importantes sobre qual é o culpado. Se todos os picos em um cromatograma apresentarem formatos semelhantes, a causa provavelmente não é física. Se apenas um ou alguns picos forem afetados, mas os demais parecerem normais, a causa provavelmente é química.
As causas químicas do caudamento dos picos são complexas demais para serem discutidas brevemente aqui. O leitor interessado pode consultar a edição recente da revista “LC Troubleshooting” para uma discussão mais aprofundada (10). No entanto, uma medida simples a ser testada é reduzir a massa do analito injetado e verificar se o formato do pico melhora. Caso isso ocorra, é um bom indício de que o problema é “sobrecarga de massa”. Nesse caso, o método deve ser limitado à injeção de pequenas massas de analito, ou as condições cromatográficas devem ser alteradas para que se obtenham bons formatos de pico mesmo com a injeção de massas maiores.
Existem também muitas razões físicas potenciais para o prolongamento da cauda do pico. Os leitores interessados ​​em uma discussão detalhada das possibilidades podem consultar outra edição recente de “LC Troubleshooting” (11). Uma das causas físicas mais comuns do prolongamento da cauda do pico é uma conexão deficiente em um ponto entre o injetor e o detector (12). Um exemplo extremo é mostrado na Figura 1d, obtido em meu laboratório algumas semanas atrás. Nesse caso, construímos um sistema com uma nova válvula de injeção que não havíamos usado antes e instalamos um pequeno laço de injeção com uma ponteira moldada em um capilar de aço inoxidável. Após alguns experimentos iniciais de solução de problemas, percebemos que a profundidade da porta no estator da válvula de injeção era muito maior do que estávamos acostumados, resultando em um grande volume morto na parte inferior da porta. Esse problema é facilmente resolvido substituindo o laço de injeção por outro tubo; podemos ajustar a ponteira para a posição adequada para eliminar o volume morto na parte inferior da porta.
Picos com frentes alongadas, como os mostrados na Figura 1e, também podem ser causados ​​por problemas físicos ou químicos. Uma causa física comum para o pico com frentes alongadas é o empacotamento inadequado do leito de partículas da coluna ou a reorganização das partículas ao longo do tempo. Assim como no caso do cauda do pico causado por esse fenômeno físico, a melhor maneira de corrigir isso é substituir a coluna e continuar a análise. Fundamentalmente, formatos de pico com frentes alongadas de origem química frequentemente surgem do que chamamos de condições de retenção “não lineares”. Em condições ideais (lineares), a quantidade de analito retida pela fase estacionária (portanto, o fator de retenção) é linearmente relacionada à concentração do analito na coluna. Cromatograficamente, isso significa que, à medida que a massa de analito injetada na coluna aumenta, o pico se torna mais alto, mas não mais largo. Essa relação é quebrada quando o comportamento de retenção é não linear, e os picos não apenas se tornam mais altos, mas também mais largos à medida que mais massa é injetada. Além disso, formatos não lineares determinam o formato dos picos cromatográficos, resultando em frentes alongadas ou caudas alongadas. A sobrecarga de massa que causa cauda no pico (10), o pico inicial causado pela retenção não linear também pode ser diagnosticado reduzindo a massa do analito injetado. Se a forma do pico melhorar, o método deve ser modificado para não exceder a qualidade de injeção que causa a borda inicial, ou as condições cromatográficas devem ser alteradas para minimizar esse comportamento.
Às vezes, observamos o que parece ser um pico "dividido", como mostrado na Figura 1f. O primeiro passo para resolver esse problema é determinar se o formato do pico se deve à coeluição parcial (ou seja, a presença de dois compostos distintos, mas com eluição próxima). Se, na verdade, houver dois analitos diferentes eluindo próximos um do outro, trata-se de melhorar a resolução entre eles (por exemplo, aumentando a seletividade, a retenção ou o número de pratos teóricos), e os picos aparentemente "divididos" estão relacionados a um problema físico. O desempenho não tem nada a ver com a coluna em si. Muitas vezes, a pista mais importante para essa decisão é se todos os picos no cromatograma apresentam formatos divididos ou apenas um ou dois. Se apenas um ou dois apresentarem, provavelmente é um problema de coeluição; se todos os picos estiverem divididos, provavelmente é um problema físico, muito provavelmente relacionado à própria coluna.
Picos divididos relacionados às propriedades físicas da própria coluna geralmente são devidos a fritas de entrada ou saída parcialmente bloqueadas, ou à reorganização de partículas na coluna, permitindo que a fase móvel flua mais rápido em certas áreas da formação do canal da coluna do que em outras regiões (11). Fritas parcialmente obstruídas podem, às vezes, ser desobstruídas invertendo o fluxo através da coluna; no entanto, em minha experiência, essa geralmente é uma solução de curto prazo, e não de longo prazo. Isso costuma ser fatal com colunas modernas se as partículas se recombinarem dentro da coluna. Nesse ponto, é melhor substituir a coluna e continuar.
O pico na Figura 1g, também de um caso recente em meu próprio laboratório, geralmente indica que o sinal é tão alto que atingiu o limite superior da faixa de resposta. Para detectores de absorbância óptica (UV-Vis neste caso), quando a concentração do analito é muito alta, o analito absorve a maior parte da luz que passa pela célula de fluxo do detector, deixando muito pouca luz para ser detectada. Nessas condições, o sinal elétrico do fotodetector é fortemente influenciado por várias fontes de ruído, como luz espúria e “corrente escura”, tornando o sinal muito “impreciso” em aparência e independente da concentração do analito. Quando isso acontece, o problema geralmente pode ser facilmente resolvido reduzindo o volume de injeção do analito — reduzindo o volume de injeção, diluindo a amostra ou ambos.
Na escola de cromatografia, usamos o sinal do detector (ou seja, o eixo y no cromatograma) como um indicador da concentração do analito na amostra. Portanto, parece estranho ver um cromatograma com um sinal abaixo de zero, já que a interpretação simples é que isso indica uma concentração negativa do analito – o que, obviamente, não é fisicamente possível. Na minha experiência, picos negativos são observados com mais frequência quando se utilizam detectores de absorbância óptica (por exemplo, UV-Vis).
Neste caso, um pico negativo significa simplesmente que as moléculas eluídas da coluna absorvem menos luz do que a própria fase móvel imediatamente antes e depois do pico. Isso pode ocorrer, por exemplo, ao usar comprimentos de onda de detecção relativamente baixos (<230 nm) e aditivos da fase móvel que absorvem a maior parte da luz nesses comprimentos de onda. Tais aditivos podem ser componentes do solvente da fase móvel, como metanol, ou componentes do tampão, como acetato ou formiato. Pode-se, inclusive, usar picos negativos para preparar uma curva de calibração e obter informações quantitativas precisas, portanto, não há razão fundamental para evitá-los em si (esse método às vezes é chamado de “detecção UV indireta”) (13). No entanto, se realmente quisermos evitar picos negativos por completo, no caso da detecção por absorbância, a melhor solução é usar um comprimento de onda de detecção diferente, de modo que o analito absorva mais luz do que a fase móvel, ou alterar a composição da fase móvel para que ela absorva menos luz do que os analitos.
Picos negativos também podem aparecer ao usar a detecção por índice de refração (IR) quando o índice de refração de componentes da amostra que não sejam o analito, como a matriz do solvente, é diferente do índice de refração da fase móvel. Isso também ocorre com a detecção UV-Vis, mas esse efeito tende a ser atenuado em comparação com a detecção por IR. Em ambos os casos, os picos negativos podem ser minimizados ajustando-se a composição da matriz da amostra para que seja mais semelhante à da fase móvel.
Na terceira parte sobre o tópico básico de solução de problemas em LC, discuti situações em que o formato do pico observado difere do formato esperado ou normal. A solução eficaz desses problemas começa com o conhecimento dos formatos de pico esperados (com base na teoria ou na experiência prévia com métodos existentes), para que os desvios dessas expectativas sejam óbvios. Problemas com o formato do pico têm muitas causas potenciais diferentes (pico muito largo, cauda, ​​borda de ataque, etc.). Nesta parte, discuto em detalhes alguns dos motivos que observo com mais frequência. Conhecer esses detalhes é um bom ponto de partida para a solução de problemas, mas não abrange todas as possibilidades. Os leitores interessados ​​em uma lista mais detalhada de causas e soluções podem consultar o pôster do Guia de Solução de Problemas em LC do LCGC.
(4) Quadro de parede do Guia de Solução de Problemas de LC da LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Análise de dados e processamento de sinais em cromatografia (Elsevier, Nova York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF e Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.