Beberapa topik pemecahan masalah LC tidak pernah ketinggalan zaman, karena ada masalah dalam praktik LC, bahkan ketika teknologi instrumen terus meningkat dari waktu ke waktu. Ada banyak cara masalah dapat muncul dalam sistem LC dan berakhir dengan bentuk puncak yang buruk. Ketika masalah yang berkaitan dengan bentuk puncak muncul, daftar singkat kemungkinan penyebab hasil ini membantu menyederhanakan pengalaman pemecahan masalah kita.
Menulis kolom “LC Troubleshooting” ini sangat menyenangkan dan saya memikirkan topik setiap bulannya, karena beberapa topik tidak pernah ketinggalan zaman. Sementara di bidang penelitian kromatografi, topik atau ide tertentu menjadi usang karena digantikan oleh ide-ide yang lebih baru dan lebih baik, di bidang pemecahan masalah, sejak artikel pemecahan masalah pertama muncul di jurnal ini (LC Journal pada saat itu), beberapa topik masih relevan pada tahun 1983 (1). Selama beberapa tahun terakhir, saya telah memfokuskan beberapa bagian LC Troubleshooting pada tren kontemporer yang memengaruhi kromatografi cair (LC) (misalnya, perbandingan relatif pemahaman kita tentang pengaruh tekanan pada retensi [2] Kemajuan Baru) Interpretasi kita terhadap hasil LC dan cara memecahkan masalah dengan instrumen LC modern. Pada edisi bulan ini, saya melanjutkan seri saya (3), yang dimulai pada Desember 2021, yang berfokus pada beberapa topik “hidup dan mati” dalam pemecahan masalah LC — elemen-elemen yang sangat penting bagi setiap pemecah masalah, tidak peduli usia sistem yang kita gunakan. Topik inti dari seri ini sangat relevan dengan bagan dinding “Panduan Pemecahan Masalah LC” (4) terkenal milik LCGC yang tergantung di banyak laboratorium. Untuk bagian ketiga dari seri ini, saya memilih untuk fokus pada masalah yang berkaitan dengan bentuk puncak atau karakteristik puncak. Luar biasanya, bagan dinding tersebut mencantumkan 44 penyebab potensial yang berbeda dari bentuk puncak yang buruk! Kita tidak dapat mempertimbangkan semua masalah ini secara detail dalam satu artikel, jadi dalam bagian pertama tentang topik ini, saya akan fokus pada beberapa yang paling sering saya temui. Saya harap pengguna LC muda dan tua akan menemukan beberapa kiat dan pengingat yang bermanfaat tentang topik penting ini.
Saya semakin sering menjawab pertanyaan pemecahan masalah dengan "apa pun mungkin terjadi". Jawaban ini mungkin tampak mudah ketika mempertimbangkan pengamatan yang sulit diinterpretasikan, tetapi saya sering kali merasa itu tepat. Dengan banyaknya kemungkinan penyebab bentuk puncak yang buruk, penting untuk tetap berpikiran terbuka ketika mempertimbangkan apa masalahnya, dan untuk dapat memprioritaskan penyebab potensial untuk memulai upaya pemecahan masalah kita, dengan fokus pada kemungkinan yang paling umum.
Langkah kunci dalam setiap latihan pemecahan masalah — tetapi menurut saya langkah ini sering diremehkan — adalah mengenali bahwa ada masalah yang perlu dipecahkan. Mengenali adanya masalah seringkali berarti mengenali bahwa apa yang terjadi pada alat tersebut berbeda dari harapan kita, yang dibentuk oleh teori, pengetahuan empiris, dan pengalaman (5). “Bentuk puncak” yang dimaksud di sini sebenarnya tidak hanya mengacu pada bentuk puncak (simetris, asimetris, halus, berbulu, tepi depan, ekor, dll.), tetapi juga pada lebarnya. Harapan kita terhadap bentuk puncak sebenarnya sederhana. Teori (6) mendukung harapan dalam buku teks bahwa, dalam kebanyakan kasus, puncak kromatografi harus simetris dan sesuai dengan bentuk distribusi Gaussian, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1a. Apa yang kita harapkan dari lebar puncak adalah masalah yang lebih kompleks, dan kita akan membahas topik ini dalam artikel mendatang. Bentuk puncak lainnya pada Gambar 1 menunjukkan beberapa kemungkinan lain yang dapat diamati — dengan kata lain, beberapa cara yang dapat menyebabkan kesalahan. Pada bagian selanjutnya dari artikel ini, kita akan membahas membahas beberapa contoh spesifik situasi yang dapat menyebabkan terbentuknya tipe bentuk ini.
Terkadang puncak sama sekali tidak teramati dalam kromatogram di mana seharusnya puncak tersebut terelusi. Bagan di atas menunjukkan bahwa tidak adanya puncak (dengan asumsi sampel benar-benar mengandung analit target pada konsentrasi yang seharusnya membuat respons detektor cukup untuk melihatnya di atas noise) biasanya terkait dengan beberapa masalah instrumen atau kondisi fase gerak yang salah (jika teramati sama sekali). Puncak, biasanya terlalu "lemah"). Daftar singkat masalah dan solusi potensial dalam kategori ini dapat ditemukan di Tabel I.
Seperti yang disebutkan di atas, pertanyaan tentang seberapa besar pelebaran puncak yang harus ditoleransi sebelum memperhatikan dan mencoba memperbaikinya adalah topik kompleks yang akan saya bahas dalam artikel mendatang. Pengalaman saya menunjukkan bahwa pelebaran puncak yang signifikan sering disertai dengan perubahan bentuk puncak yang signifikan, dan pembentukan ekor puncak lebih umum daripada puncak awal atau pemisahan. Namun, puncak yang secara nominal simetris juga melebar, yang dapat disebabkan oleh beberapa alasan berbeda:
Masing-masing masalah ini telah dibahas secara detail dalam edisi-edisi sebelumnya dari Troubleshooting LC, dan pembaca yang tertarik dengan topik-topik ini dapat merujuk ke artikel-artikel sebelumnya untuk informasi tentang akar penyebab dan solusi potensial untuk masalah-masalah ini. Detail selengkapnya.
Pembentukan ekor puncak, pembentukan bagian depan puncak, dan pemisahan puncak semuanya dapat disebabkan oleh fenomena kimia atau fisik, dan daftar solusi potensial untuk masalah ini sangat bervariasi, tergantung pada apakah kita berurusan dengan masalah kimia atau fisik. Seringkali, dengan membandingkan puncak-puncak yang berbeda dalam kromatogram, Anda dapat menemukan petunjuk penting tentang mana yang menjadi penyebabnya. Jika semua puncak dalam kromatogram menunjukkan bentuk yang serupa, penyebabnya kemungkinan besar bukan fisik. Jika hanya satu atau beberapa puncak yang terpengaruh, tetapi yang lainnya tampak baik-baik saja, penyebabnya kemungkinan besar adalah kimia.
Penyebab kimiawi dari pembentukan ekor puncak terlalu kompleks untuk dibahas secara singkat di sini. Pembaca yang tertarik dapat merujuk ke edisi terbaru “LC Troubleshooting” untuk pembahasan yang lebih mendalam (10). Namun, hal mudah yang dapat dicoba adalah mengurangi massa analit yang diinjeksikan dan melihat apakah bentuk puncak membaik. Jika demikian, maka ini merupakan petunjuk yang baik bahwa masalahnya adalah “kelebihan massa”. Dalam hal ini, metode harus dibatasi untuk menginjeksikan massa analit yang kecil, atau kondisi kromatografi harus diubah sehingga bentuk puncak yang baik dapat diperoleh bahkan dengan massa yang lebih besar yang diinjeksikan.
Ada juga banyak alasan fisik potensial untuk terjadinya peak tailing. Pembaca yang tertarik dengan diskusi rinci tentang kemungkinan-kemungkinan tersebut dapat merujuk ke edisi terbaru lain dari “LC Troubleshooting” (11). Salah satu penyebab fisik yang lebih umum dari peak tailing adalah koneksi yang buruk pada suatu titik antara injektor dan detektor (12). Contoh ekstrem ditunjukkan pada Gambar 1d, yang diperoleh di laboratorium saya beberapa minggu yang lalu. Dalam kasus ini, kami membangun sistem dengan katup injeksi baru yang belum pernah kami gunakan sebelumnya, dan memasang loop injeksi volume kecil dengan ferrule yang telah dicetak pada kapiler baja tahan karat. Setelah beberapa percobaan pemecahan masalah awal, kami menyadari bahwa kedalaman port pada stator katup injeksi jauh lebih dalam daripada yang biasa kami gunakan, sehingga menghasilkan volume mati yang besar di bagian bawah port. Masalah ini mudah diatasi dengan mengganti loop injeksi dengan tabung lain, kita dapat menyesuaikan ferrule ke posisi yang tepat untuk menghilangkan volume mati di bagian bawah port.
Bentuk puncak seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1e juga dapat disebabkan oleh masalah fisik atau kimia. Penyebab fisik umum dari bentuk puncak yang menonjol adalah bahwa lapisan partikel kolom tidak terisi dengan baik, atau partikel telah mengalami penataan ulang seiring waktu. Seperti halnya dengan pembentukan ekor puncak yang disebabkan oleh fenomena fisik ini, cara terbaik untuk memperbaikinya adalah dengan mengganti kolom dan melanjutkan proses. Pada dasarnya, bentuk puncak yang menonjol dengan asal kimia sering muncul dari apa yang kita sebut kondisi retensi "non-linier". Dalam kondisi ideal (linier), jumlah analit yang ditahan oleh fase diam (oleh karena itu, faktor retensi) berhubungan secara linier dengan konsentrasi analit dalam kolom. Secara kromatografi, ini berarti bahwa seiring bertambahnya massa analit yang disuntikkan ke dalam kolom, puncak menjadi lebih tinggi, tetapi tidak lebih lebar. Hubungan ini terputus ketika perilaku retensi non-linier, dan puncak tidak hanya menjadi lebih tinggi tetapi juga lebih lebar seiring bertambahnya massa yang disuntikkan. Selain itu, bentuk non-linier menentukan bentuk puncak kromatografi, yang menghasilkan bentuk puncak yang menonjol atau tertinggal. Seperti halnya dengan kelebihan massa yang menyebabkan puncak menonjol Ekoran (10), puncak yang mendahului yang disebabkan oleh retensi nonlinier juga dapat didiagnosis dengan mengurangi massa analit yang diinjeksikan. Jika bentuk puncak membaik, metode harus dimodifikasi agar tidak melebihi kualitas injeksi yang menyebabkan tepi yang mendahului, atau kondisi kromatografi harus diubah untuk meminimalkan perilaku ini.
Terkadang kita mengamati apa yang tampak seperti puncak "terpisah", seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1f. Langkah pertama dalam memecahkan masalah ini adalah menentukan apakah bentuk puncak tersebut disebabkan oleh ko-elusi parsial (yaitu, adanya dua senyawa berbeda tetapi terelusi berdekatan). Jika sebenarnya ada dua analit berbeda yang terelusi berdekatan, maka ini adalah masalah peningkatan resolusi (misalnya, dengan meningkatkan selektivitas, retensi, atau jumlah pelat), dan puncak "terpisah" yang tampak tersebut terkait dengan kinerja fisik, yang tidak ada hubungannya dengan kolom itu sendiri. Seringkali, petunjuk terpenting untuk keputusan ini adalah apakah semua puncak dalam kromatogram menunjukkan bentuk terpisah, atau hanya satu atau dua. Jika hanya satu atau dua, kemungkinan itu adalah masalah ko-elusi; jika semua puncak terpisah, kemungkinan itu adalah masalah fisik, kemungkinan besar terkait dengan kolom itu sendiri.
Puncak terpisah yang berkaitan dengan sifat fisik kolom itu sendiri biasanya disebabkan oleh frit masuk atau keluar yang sebagian tersumbat, atau penataan ulang partikel di dalam kolom, yang memungkinkan fase bergerak mengalir lebih cepat daripada fase bergerak di area tertentu dari pembentukan saluran kolom di daerah lain (11). Frit yang sebagian tersumbat terkadang dapat dibersihkan dengan membalikkan aliran melalui kolom; namun, menurut pengalaman saya, ini biasanya merupakan solusi jangka pendek daripada jangka panjang. Hal ini seringkali berakibat fatal pada kolom modern jika partikel bergabung kembali di dalam kolom. Pada titik ini, yang terbaik adalah mengganti kolom dan melanjutkan.
Puncak pada Gambar 1g, juga dari kejadian baru-baru ini di laboratorium saya sendiri, biasanya menunjukkan bahwa sinyalnya sangat tinggi sehingga telah mencapai ujung atas rentang respons. Untuk detektor absorbansi optik (UV-vis dalam hal ini), ketika konsentrasi analit sangat tinggi, analit menyerap sebagian besar cahaya yang melewati sel aliran detektor, sehingga hanya sedikit cahaya yang tersisa untuk dideteksi. Dalam kondisi ini, sinyal listrik dari fotodetektor sangat dipengaruhi oleh berbagai sumber kebisingan, seperti cahaya liar dan "arus gelap", membuat sinyal tampak sangat "kabur" dan tidak bergantung pada konsentrasi analit. Ketika ini terjadi, masalah seringkali dapat dengan mudah diatasi dengan mengurangi volume injeksi analit—mengurangi volume injeksi, mengencerkan sampel, atau keduanya.
Di sekolah kromatografi, kita menggunakan sinyal detektor (yaitu, sumbu y dalam kromatogram) sebagai indikator konsentrasi analit dalam sampel. Jadi, tampak aneh melihat kromatogram dengan sinyal di bawah nol, karena interpretasi sederhananya adalah ini menunjukkan konsentrasi analit negatif – yang tentu saja secara fisik tidak mungkin. Menurut pengalaman saya, puncak negatif paling sering diamati saat menggunakan detektor absorbansi optik (misalnya, UV-vis).
Dalam kasus ini, puncak negatif berarti bahwa molekul yang terelusi dari kolom menyerap lebih sedikit cahaya daripada fase gerak itu sendiri tepat sebelum dan sesudah puncak. Hal ini dapat terjadi, misalnya, ketika menggunakan panjang gelombang deteksi yang relatif rendah (<230 nm) dan aditif fase gerak yang menyerap sebagian besar cahaya pada panjang gelombang ini. Aditif tersebut dapat berupa komponen pelarut fase gerak seperti metanol atau komponen buffer seperti asetat atau format. Puncak negatif sebenarnya dapat digunakan untuk menyiapkan kurva kalibrasi dan memperoleh informasi kuantitatif yang akurat, sehingga tidak ada alasan mendasar untuk menghindarinya (metode ini kadang-kadang disebut sebagai "deteksi UV tidak langsung") (13). Namun, jika kita benar-benar ingin menghindari puncak negatif sama sekali, dalam kasus deteksi absorbansi, solusi terbaik adalah menggunakan panjang gelombang deteksi yang berbeda sehingga analit menyerap lebih banyak daripada fase gerak, atau mengubah komposisi fase gerak sehingga menyerap lebih sedikit cahaya daripada analit.
Puncak negatif juga dapat muncul saat menggunakan deteksi indeks bias (RI) ketika indeks bias komponen selain analit dalam sampel, seperti matriks pelarut, berbeda dari indeks bias fase gerak. Hal ini juga terjadi dengan deteksi UV-vis, tetapi efek ini cenderung lebih lemah dibandingkan dengan deteksi RI. Dalam kedua kasus, puncak negatif dapat diminimalkan dengan mencocokkan komposisi matriks sampel dengan komposisi fase gerak secara lebih tepat.
Pada bagian ketiga tentang topik dasar pemecahan masalah LC, saya membahas situasi di mana bentuk puncak yang diamati berbeda dari bentuk puncak yang diharapkan atau normal. Pemecahan masalah yang efektif dimulai dengan pengetahuan tentang bentuk puncak yang diharapkan (berdasarkan teori atau pengalaman sebelumnya dengan metode yang ada), sehingga penyimpangan dari harapan ini akan terlihat jelas. Masalah bentuk puncak memiliki banyak penyebab potensial yang berbeda (terlalu lebar, berekor, tepi depan, dll.). Pada bagian ini, saya membahas secara detail beberapa alasan yang paling sering saya temui. Mengetahui detail ini memberikan titik awal yang baik untuk pemecahan masalah, tetapi tidak mencakup semua kemungkinan. Pembaca yang tertarik dengan daftar penyebab dan solusi yang lebih mendalam dapat merujuk ke bagan dinding "Panduan Pemecahan Masalah LC" LCGC.
(4) Bagan dinding “Panduan Pemecahan Masalah LC” LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analisis Data dan Pemrosesan Sinyal dalam Kromatografi (Elsevier, New York, NY, 1998), hlm. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF dan Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.