Jotkut LC-vianmäärityksen aiheet eivät ole koskaan vanhentuneita, sillä LC-käytännössä on ongelmia, vaikka laiteteknologia kehittyykin ajan myötä. LC-järjestelmässä voi ilmetä ongelmia, jotka johtavat huonoon huippumuotoon, monella eri tavalla. Kun huippumuotoon liittyviä ongelmia ilmenee, lyhyt luettelo näiden tulosten mahdollisista syistä auttaa yksinkertaistamaan vianetsintäprosessiamme.
On ollut hauskaa kirjoittaa tätä ”LC-vianmääritys”-palstaa ja miettiä aiheita joka kuukausi, koska jotkut aiheet eivät koskaan mene pois muodista. Kromatografiatutkimuksen alalla tietyt aiheet tai ideat vanhenevat, kun ne korvautuvat uudemmilla ja paremmilla ideoilla, mutta vianmäärityksen alalla ensimmäinen vianmääritysartikkeli ilmestyi tässä lehdessä (silloin LC Journalissa) vuonna 1983 (1), koska jotkut aiheet ovat edelleen ajankohtaisia. Viime vuosina olen keskittynyt useissa LC-vianmääritysosioissa nestekromatografiaan (LC) vaikuttaviin nykytrendeihin (esimerkiksi paineen vaikutuksesta retentioon liittyvän ymmärryksemme suhteellinen vertailu [2] New Advances), LC-tulosten tulkintaan ja vianmääritykseen nykyaikaisilla LC-laitteilla. Tämän kuun osassa jatkan joulukuussa 2021 alkanutta sarjaani (3), joka keskittyi joihinkin LC-vianmäärityksen ”elämän ja kuoleman” aiheisiin – elementit, jotka ovat hyviä mille tahansa vianmäärittäjälle, ovat olennaisia ​​riippumatta käyttämämme järjestelmän iästä. Tämän sarjan ydinaihe on erittäin relevantti LCGC:n kuuluisalle ”LC-vianmääritysopas” -seinäkartalle (4), joka roikkuu... monissa laboratorioissa. Tämän sarjan kolmannessa osassa päätin keskittyä piikin muotoon tai piikin ominaisuuksiin liittyviin ongelmiin. Uskomatonta kyllä, seinäkaaviossa luetellaan 44 erilaista mahdollista syytä huonoon piikin muotoon! Emme voi käsitellä kaikkia näitä ongelmia yksityiskohtaisesti yhdessä artikkelissa, joten tässä aiheen ensimmäisessä osassa keskityn joihinkin niistä, joita näen useimmin. Toivon, että nuoret ja vanhat LC-käyttäjät löytävät hyödyllisiä vinkkejä ja muistutuksia tästä tärkeästä aiheesta.
Huomaan yhä useammin vastaavani vianmäärityskysymyksiin sanomalla "kaikki on mahdollista". Tämä vastaus saattaa vaikuttaa helpolta, kun tarkastellaan vaikeasti tulkittavia havaintoja, mutta mielestäni se on usein sopiva. Koska huonon huippumuodon mahdollisia syitä on monia, on tärkeää pitää mieli avoimena ongelman syytä pohdittaessa ja pystyä priorisoimaan mahdolliset syyt vianmäärityksen aloittamiseksi keskittyen yleisimpiin mahdollisuuksiin. Tämä seikka on erittäin tärkeä.
Keskeinen vaihe missä tahansa vianetsintätehtävässä – mutta mielestäni aliarvostettu – on sen tunnistaminen, että on olemassa ongelma, joka on ratkaistava. Ongelman tunnistaminen tarkoittaa usein sen tunnistamista, että työkalulle tapahtuu toisin kuin odotuksemme, jotka muokkaavat teoria, empiirinen tieto ja kokemus (5). Tässä viitattu "huipun muoto" viittaa itse asiassa paitsi huipun muotoon (symmetrinen, epäsymmetrinen, sileä, pörröinen, etureuna, häntä jne.), myös leveyteen. Odotuksemme todelliselle huipun muodolle ovat yksinkertaisia. Teoria (6) tukee hyvin oppikirjan odotusta, että useimmissa tapauksissa kromatografisten piikkien tulisi olla symmetrisiä ja noudattaa Gaussin jakauman muotoa, kuten kuvassa 1a on esitetty. Odotamme huipun leveyksiltä monimutkaisempaa asiaa, ja käsittelemme tätä aihetta tulevassa artikkelissa. Kuvan 1 muut huipun muodot osoittavat joitakin muita mahdollisuuksia, joita voitaisiin havaita – toisin sanoen joitakin tapoja, joilla asiat voisivat mennä pieleen. Tämän osan loppuosassa keskustelemme joistakin erityisistä esimerkeistä tilanteista, jotka voivat johtaa näihin muotoihin. tyypit.
Joskus piikkejä ei havaita lainkaan kromatogrammissa, jossa niiden odotetaan eluoituvan. Yllä oleva seinäkaavio osoittaa, että piikin puuttuminen (olettaen, että näyte todella sisältää kohdeanalyytin pitoisuudella, joka tekee detektorin vasteesta riittävän sen havaitsemiseksi kohinan yläpuolella) liittyy yleensä johonkin laiteongelmaan tai virheellisiin liikkuvan faasin olosuhteisiin (jos niitä lainkaan havaitaan). Piikit ovat yleensä liian "heikkoja"). Lyhyt luettelo mahdollisista ongelmista ja ratkaisuista tässä kategoriassa löytyy taulukosta I.
Kuten edellä mainittiin, kysymys siitä, kuinka paljon huippujen levenemistä tulisi sietää ennen kuin siihen kiinnitetään huomiota ja yritetään korjata, on monimutkainen aihe, jota käsittelen tulevassa artikkelissa. Kokemukseni mukaan merkittävään huippujen levenemiseen liittyy usein merkittävä muutos huippujen muodossa, ja huippujen hännättyminen on yleisempää kuin huippua edeltävä huippu tai niiden jakautuminen. Myös nimellisesti symmetriset piikit levenevät kuitenkin, mikä voi johtua muutamista eri syistä:
Kutakin näistä ongelmista on käsitelty yksityiskohtaisesti Troubleshooting LC:n aiemmissa numeroissa, ja näistä aiheista kiinnostuneet lukijat voivat tutustua näihin aiempiin artikkeleihin saadaksesi tietoa näiden ongelmien perimmäisistä syistä ja mahdollisista ratkaisuista. Lisätietoja.
Huippujen hännät ja etureunat sekä jakautuminen voivat kaikki johtua kemiallisista tai fysikaalisista ilmiöistä, ja näiden ongelmien mahdollisten ratkaisujen luettelo vaihtelee suuresti riippuen siitä, onko kyseessä kemiallinen vai fysikaalinen ongelma. Usein vertaamalla kromatogrammin eri piikkejä voidaan löytää tärkeitä vihjeitä siitä, mikä on syyllinen. Jos kaikki kromatogrammin piikit ovat samanmuotoisia, syy ei todennäköisesti ole fysikaalinen. Jos vain yksi tai muutama huippu on vaurioitunut, mutta loput näyttävät hyviltä, ​​syy on todennäköisesti kemiallinen.
Huippujen hännättävien kemiallisten syiden selitykset ovat liian monimutkaisia, jotta niitä voitaisiin käsitellä lyhyesti tässä. Kiinnostunutta lukijaa kehotetaan tutustumaan tuoreeseen "LC Troubleshooting" -lehden numeroon saadaksesi perusteellisemman keskustelun (10). Helppo tapa on kuitenkin pienentää injektoidun analyytin massaa ja katsoa, ​​paraneeko huipun muoto. Jos paranee, tämä on hyvä vihje siitä, että ongelma on "massan ylikuormitus". Tässä tapauksessa menetelmän on rajoituttava pienten analyyttimassojen injektoimiseen tai kromatografisia olosuhteita on muutettava siten, että hyvät huipun muodot saadaan myös suuremmilla injektoiduilla massoilla.
Huippujen hännälle on myös monia mahdollisia fysikaalisia syitä. Lukijoita, jotka ovat kiinnostuneita yksityiskohtaisesta keskustelusta mahdollisuuksista, kehotetaan tutustumaan toiseen tuoreeseen "LC Troubleshooting" -lehden numeroon (11). Yksi yleisimmistä huippujen hännälle jäämisen fysikaalisista syistä on huono liitos injektorin ja detektorin välillä (12). Äärimmäinen esimerkki on esitetty kuvassa 1d, joka saatiin laboratoriossani muutama viikko sitten. Tässä tapauksessa rakensimme järjestelmän uudella injektioventtiilillä, jota emme olleet aiemmin käyttäneet, ja asensimme pienitilavuuksisen injektiosilmukan, jossa oli ruostumattomasta teräksestä valmistettuun kapillaariin valettu holkki. Muutaman alustavan vianetsintäkokeilun jälkeen huomasimme, että injektioventtiilin staattorin portin syvyys oli paljon suurempi kuin mihin olimme tottuneet, mikä johti suureen kuolleeseen tilavuuteen portin pohjalla. Tämä ongelma ratkaistaan ​​helposti korvaamalla injektiosilmukka toisella putkella. Voimme säätää holkin oikeaan asentoon kuolleen tilavuuden poistamiseksi portin pohjalla.
Kuvassa 1e esitettyjen kaltaiset huippurintamat voivat johtua myös fysikaalisista tai kemiallisista ongelmista. Yleinen fysikaalinen syy etureunaan on se, että kolonnin hiukkaskerros ei ole hyvin pakattu tai että hiukkaset ovat järjestäytyneet uudelleen ajan myötä. Kuten tämän fysikaalisen ilmiön aiheuttaman piikkien hännättömyyden tapauksessa, paras tapa korjata tämä on vaihtaa kolonni ja jatkaa prosessia. Pohjimmiltaan kemiallista alkuperää olevat etureunan piikkien muodot johtuvat usein niin sanotuista "epälineaarisista" retentio-olosuhteista. Ideaalisissa (lineaarisissa) olosuhteissa stationäärifaasin pidättämän analyytin määrä (eli retentiokerroin) on lineaarisessa suhteessa analyytin pitoisuuteen kolonnissa. Kromatografisesti tämä tarkoittaa, että kolonniin injektoidun analyytin massan kasvaessa piikki kasvaa, mutta ei levene. Tämä suhde katkeaa, kun retentiokäyttäytyminen on epälineaarista, ja piikit eivät ainoastaan ​​​​pikene, vaan myös levenevät, kun injektoidaan enemmän massaa. Lisäksi epälineaariset muodot määräävät kromatografisten piikkien muodon, mikä johtaa etureunoihin tai takareunoihin. Kuten massan ylikuormituksen tapauksessa, joka aiheuttaa piikkien hännättömyyttä (10), epälineaarisen retention aiheuttama piikkien eteneminen voi voidaan diagnosoida myös vähentämällä injektoidun analyytin massaa. Jos piikin muoto paranee, menetelmää on muutettava, jotta se ei ylitä etureunan aiheuttavaa injektointilaatua, tai kromatografisia olosuhteita on muutettava tämän käyttäytymisen minimoimiseksi.
Joskus havaitsemme näennäisesti "jakautuneen" piikin, kuten kuvassa 1f on esitetty. Ensimmäinen askel tämän ongelman ratkaisemisessa on määrittää, johtuuko piikin muoto osittaisesta yhteiseluoinnista (eli kahden erillisen, mutta lähekkäin eluoituvan yhdisteen läsnäolosta). Jos kaksi eri analyyttiä eluoituu lähekkäin, on kyse niiden erottelukyvyn parantamisesta (esimerkiksi lisäämällä selektiivisyyttä, retentiota tai levymäärää), ja näennäiset "jakautuneet" piikit liittyvät fysikaalisiin ominaisuuksiin. Suorituskyvyllä ei ole mitään tekemistä itse kolonnin kanssa. Usein tärkein vihje tähän päätökseen on, onko kaikilla kromatogrammin piikeillä jaettu muoto vai vain yhdellä tai kahdella. Jos niitä on vain yksi tai kaksi, kyseessä on todennäköisesti yhteiseluoinnista johtuva ongelma; jos kaikki piikit ovat jakautuneet, kyseessä on todennäköisesti fysikaalinen ongelma, joka todennäköisesti liittyy itse kolonniin.
Kolonnin fysikaalisiin ominaisuuksiin liittyvät jakautuneet piikit johtuvat yleensä osittain tukkeutuneista sisään- tai ulostulofriteistä tai kolonnin hiukkasten uudelleenjärjestäytymisestä, jolloin liikkuva faasi virtaa nopeammin kuin liikkuva faasi tietyillä kolonnin kanavamuodostelman alueilla, toisilla alueilla (11). Osittain tukkeutunut fritti voidaan joskus poistaa kääntämällä virtaus kolonnin läpi; kokemukseni mukaan tämä on kuitenkin yleensä lyhytaikainen eikä pitkäaikainen ratkaisu. Nykyaikaisissa kolonneissa tämä on usein kohtalokasta, jos hiukkaset yhdistyvät uudelleen kolonnin sisällä. Tässä vaiheessa on parasta vaihtaa kolonni ja jatkaa.
Kuvassa 1g oleva piikki, joka on myös peräisin omasta laboratoriostani hiljattain tehdystä esimerkistä, osoittaa yleensä, että signaali on niin korkea, että se on saavuttanut vastealueen ylärajan. Optisissa absorbanssidetektoreissa (tässä tapauksessa UV-Vis), kun analyyttipitoisuus on erittäin korkea, analyytti absorboi suurimman osan detektorin virtauskammion läpi kulkevasta valosta, jolloin havaittavaksi jää hyvin vähän valoa. Näissä olosuhteissa valodetektorin sähköiseen signaaliin vaikuttavat voimakkaasti erilaiset kohinalähteet, kuten hajavalo ja "pimeä virta", mikä tekee signaalista ulkonäöltään hyvin "sumean" ja riippumattoman analyyttipitoisuudesta. Kun näin tapahtuu, ongelma voidaan usein helposti ratkaista vähentämällä analyytin injektiotilavuutta – vähentämällä injektiotilavuutta, laimentamalla näytettä tai molemmilla tavoilla.
Kromatografiakoulussa käytämme detektorisignaalia (eli kromatogrammin y-akselia) näytteen analyyttipitoisuuden indikaattorina. Siksi on oudolta nähdä kromatogrammi, jonka signaali on alle nollan, koska yksinkertainen tulkinta on, että tämä osoittaa negatiivista analyyttipitoisuutta – mikä ei tietenkään ole fyysisesti mahdollista. Kokemukseni mukaan negatiivisia piikkejä havaitaan useimmiten käytettäessä optisia absorbanssidetektoreita (esim. UV-vis).
Tässä tapauksessa negatiivinen piikki tarkoittaa yksinkertaisesti sitä, että kolonnista eluoituvat molekyylit absorboivat vähemmän valoa kuin itse liikkuva faasi välittömästi ennen piikkiä ja sen jälkeen. Näin voi käydä esimerkiksi käytettäessä suhteellisen matalia detektioaallonpituuksia (<230 nm) ja liikkuvan faasin lisäaineita, jotka absorboivat suurimman osan valosta näillä aallonpituuksilla. Tällaisia ​​lisäaineita voivat olla liikkuvan faasin liuotinkomponentit, kuten metanoli, tai puskurikomponentit, kuten asetaatti tai formiaatti. Negatiivisia piikkejä voidaan itse asiassa käyttää kalibrointikäyrän laatimiseen ja tarkan kvantitatiivisen tiedon saamiseen, joten ei ole mitään perustavanlaatuista syytä välttää niitä sinänsä (tätä menetelmää kutsutaan joskus "epäsuoraksi UV-detektioksi") (13). Jos kuitenkin haluamme todella välttää negatiivisia piikkejä kokonaan, absorbanssidetektion tapauksessa paras ratkaisu on käyttää eri detektioaallonpituutta, jotta analyytti absorboi enemmän kuin liikkuva faasi, tai muuttaa liikkuvan faasin koostumusta siten, että ne absorboivat vähemmän valoa kuin analyytit.
Negatiivisia piikkejä voi esiintyä myös taitekertoimen (RI) avulla tapahtuvassa havaitsemisessa, kun muiden näytteen komponenttien kuin analyytin, kuten liuotinmatriisin, taitekerroin on eri kuin liikkuvan faasin taitekerroin. Näin tapahtuu myös UV-Vis-havaitsemisessa, mutta tämä vaikutus on yleensä heikompi kuin RI-havaitsemisessa. Molemmissa tapauksissa negatiivisia piikkejä voidaan minimoida sovittamalla näytematriisin koostumus tarkemmin liikkuvan faasin koostumukseen.
Kolmannessa osassa, joka käsitteli LC-vianmäärityksen perusteita, käsittelin tilanteita, joissa havaittu piikin muoto poikkeaa odotetusta tai normaalista piikin muodosta. Tällaisten ongelmien tehokas vianmääritys alkaa odotettujen huippumuotojen tuntemuksella (teorian tai aiempien kokemusten perusteella olemassa olevista menetelmistä), joten poikkeamat näistä odotuksista ovat ilmeisiä. Huipun muoto-ongelmilla on monia erilaisia ​​mahdollisia syitä (liian leveä, häntä, etureuna jne.). Tässä osassa käsittelen yksityiskohtaisesti joitakin useimmin näkemiäni syitä. Näiden yksityiskohtien tunteminen tarjoaa hyvän lähtökohdan vianmäärityksen aloittamiseen, mutta se ei kata kaikkia mahdollisuuksia. Lukijat, jotka ovat kiinnostuneita perusteellisemmasta luettelosta syistä ja ratkaisuista, voivat tutustua LCGC:n "LC-vianmääritysoppaaseen" seinäkarttaan.
(4) LCGC:n ”LC-vianmääritysopas” -seinäkartta. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), s. 43–96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF ja Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.