Ang ubang mga topiko sa pag-troubleshoot sa LC dili gyud karaan, tungod kay adunay mga isyu sa praktis sa LC, bisan pa nga ang teknolohiya sa instrumento mouswag sa paglabay sa panahon. Daghang mga paagi diin ang mga problema mahimong motumaw sa usa ka sistema sa LC ug matapos sa dili maayo nga porma sa peak. Kung motumaw ang mga isyu nga may kalabotan sa porma sa peak, ang usa ka mubo nga lista sa posible nga mga hinungdan alang niini nga mga resulta makatabang sa pagpasimple sa among kasinatian sa pag-troubleshoot.
Lingaw kaayo ang pagsulat niining kolum nga "LC Troubleshooting" ug paghunahuna bahin sa mga hilisgutan matag bulan, tungod kay ang ubang mga hilisgutan dili gyud mawala sa uso. Samtang naa sa natad sa panukiduki sa chromatography, ang pipila ka mga hilisgutan o ideya mahimong karaan na tungod kay kini gipulihan sa mas bag-o ug mas maayo nga mga ideya, sa natad sa pag-troubleshoot, sukad ang unang artikulo sa pag-troubleshoot migawas niini nga journal (ang LC Journal niadtong panahona) tungod kay ang ubang mga hilisgutan may kalabutan pa) niadtong 1983 (1). Sa miaging pipila ka tuig, akong gipunting ang daghang mga seksyon sa LC Troubleshooting sa mga kontemporaryong uso nga nakaapekto sa liquid chromatography (LC) (pananglitan, ang relatibong pagtandi sa atong pagsabot sa epekto sa pressure sa retention [2] New Advances) Ang among interpretasyon sa mga resulta sa LC ug kung giunsa ang pag-troubleshoot gamit ang mga modernong instrumento sa LC. Sa installment karong bulana, gipadayon nako ang akong serye (3), nga nagsugod kaniadtong Disyembre 2021, nga nagpunting sa pipila sa mga hilisgutan nga "kinabuhi ug kamatayon" sa pag-troubleshoot sa LC — ang mga elemento nga maayo alang sa bisan kinsa nga troubleshooter hinungdanon, bisan unsa pa ang edad sa sistema nga among gigamit. Ang kinauyokan nga hilisgutan niini nga serye adunay kalabotan sa bantog nga LCGC “LC Troubleshooting Guide” wall chart (4) nga nagbitay sa daghang mga laboratoryo. Alang sa ikatulong bahin niini nga serye, gipili nako nga mag-focus sa mga isyu nga may kalabotan sa porma sa taluktok o mga kinaiya sa taluktok. Talagsaon, ang wall chart naglista sa 44 nga lainlaing mga potensyal nga hinungdan sa dili maayo nga porma sa taluktok! Dili nato makonsiderar kining tanan nga mga isyu sa detalyado sa usa ka artikulo, busa niining unang bahin sa hilisgutan, mag-focus ako sa pipila sa mga kanunay nakong makita. Nanghinaut ko nga ang mga batan-on ug tigulang nga mga tiggamit sa LC makakita og pipila ka mapuslanon nga mga tip ug mga pahinumdom niining importante nga hilisgutan.
Nagkadaghan ang akong natubag nga mga pangutana sa pag-troubleshoot gamit ang "bisan unsa posible". Kini nga tubag daw sayon ​​ra kon hunahunaon ang mga obserbasyon nga lisod sabton, apan kanunay nakong nakita nga kini angay. Uban sa daghang posibleng mga hinungdan sa dili maayo nga porma sa taluktok, importante nga magpabiling bukas ang hunahuna kon hunahunaon kung unsa ang problema, ug aron ma-prioritize ang posibleng mga hinungdan aron masugdan ang atong mga paningkamot sa pag-troubleshoot, nga nag-focus sa labing komon nga mga posibilidad, kini nga punto importante kaayo.
Usa ka importanteng lakang sa bisan unsang ehersisyo sa pag-troubleshoot — apan usa nga sa akong hunahuna wala kaayo gihatagan og bili — mao ang pag-ila nga adunay problema nga kinahanglan sulbaron. Ang pag-ila nga adunay problema kanunay nagpasabut sa pag-ila nga ang nahitabo sa himan lahi sa atong gilauman, nga gihulma sa teorya, empirikal nga kahibalo, ug kasinatian (5). Ang "porma sa kinatumyan" nga gihisgutan dinhi sa tinuud nagtumong dili lamang sa porma sa kinatumyan (simetriko, asimetriko, hamis, fluffy, leading edge, tailing, ug uban pa), apan usab sa gilapdon. Ang atong mga gilauman alang sa tinuud nga porma sa kinatumyan yano ra. Ang teorya (6) nagsuporta sa gilauman sa libro nga, sa kadaghanan nga mga kaso, ang mga chromatographic peak kinahanglan nga simetriko ug nahiuyon sa porma sa usa ka Gaussian distribution, sama sa gipakita sa Figure 1a. Ang atong gilauman gikan sa gilapdon sa kinatumyan usa ka mas komplikado nga isyu, ug atong hisgutan kini nga hilisgutan sa umaabot nga artikulo. Ang ubang mga porma sa kinatumyan sa Figure 1 nagpakita sa pipila sa ubang mga posibilidad nga mahimong maobserbahan — sa laing pagkasulti, ang pipila sa mga paagi nga ang mga butang mahimong sayup. Sa nahabilin niini nga installment, mogahin kita og panahon sa paghisgot sa pipila ka piho nga mga pananglitan sa mga sitwasyon nga mahimong mosangpot sa kini nga mga tipo sa porma.
Usahay ang mga peak dili gyud maobserbahan sa chromatogram diin kini gilauman nga ma-elute. Ang tsart sa ibabaw nagpakita nga ang pagkawala sa usa ka peak (kung ang sample aktuwal nga adunay target analyte sa usa ka konsentrasyon nga kinahanglan nga makahimo sa tubag sa detector nga igo aron makita kini labaw sa kasaba) kasagaran may kalabutan sa pipila ka isyu sa instrumento o dili husto nga mga kondisyon sa mobile phase (kung naobserbahan man). mga peak, kasagaran sobra ka "luya"). Ang usa ka mubo nga lista sa mga potensyal nga problema ug solusyon niini nga kategorya makita sa Talaan I.
Sama sa nahisgotan na, ang pangutana kon unsa kadaghan ang peak broadening ang angay itugot sa dili pa hatagan og pagtagad ug sulayan nga ayohon kini usa ka komplikado nga hilisgutan nga akong hisgutan sa umaabot nga artikulo. Ang akong kasinatian mao nga ang dakong peak broadening kanunay nga giubanan sa usa ka dakong pagbag-o sa porma sa peak, ug ang peak tailing mas komon kaysa sa pre-peak o splitting. Bisan pa, ang nominally symmetric peaks gipalapad usab, nga mahimong hinungdan sa pipila ka lainlaing mga hinungdan:
Ang matag usa niini nga mga isyu nahisgutan na sa detalye sa miaging mga isyu sa Troubleshooting LC, ug ang mga magbabasa nga interesado niini nga mga hilisgutan mahimong motan-aw niining miaging mga artikulo alang sa impormasyon bahin sa mga hinungdan ug potensyal nga mga solusyon niini nga mga isyu. Dugang mga detalye.
Ang peak tailing, peak fronting, ug splitting mahimong tungod sa kemikal o pisikal nga mga panghitabo, ug ang lista sa mga potensyal nga solusyon niini nga mga problema managlahi, depende kung kita nag-atubang og kemikal o pisikal nga problema. Kasagaran, pinaagi sa pagtandi sa lain-laing mga peak sa usa ka chromatogram, makit-an nimo ang mga importanteng timailhan kung kinsa ang hinungdan. Kung ang tanan nga mga peak sa usa ka chromatogram nagpakita og parehas nga mga porma, ang hinungdan lagmit dili pisikal. Kung usa o pipila lang ka mga peak ang apektado, apan ang uban maayo tan-awon, ang hinungdan lagmit kemikal.
Ang mga kemikal nga hinungdan sa peak tailing komplikado kaayo aron hisgutan sa mubo dinhi. Ang interesado nga magbabasa gipunting sa bag-o nga isyu sa "LC Troubleshooting" alang sa mas lawom nga diskusyon (10). Bisan pa, ang usa ka dali nga sulayan mao ang pagpakunhod sa masa sa gi-inject nga analyte ug tan-awa kung ang porma sa peak molambo. Kung mao, nan kini usa ka maayong timaan nga ang problema mao ang "mass overload". Sa kini nga kaso, ang pamaagi kinahanglan nga limitado sa pag-inject sa gagmay nga mga masa sa analyte, o ang mga kondisyon sa chromatographic kinahanglan nga usbon aron ang maayo nga mga porma sa peak makuha bisan sa mas dagkong mga masa nga gi-inject.
Daghan usab nga posibleng pisikal nga mga hinungdan sa peak tailing. Ang mga magbabasa nga interesado sa detalyado nga diskusyon sa mga posibilidad gipunting sa laing bag-o nga isyu sa "LC Troubleshooting" (11). Usa sa mas komon nga pisikal nga mga hinungdan sa peak tailing mao ang dili maayo nga koneksyon sa usa ka punto tali sa injector ug detector (12). Usa ka grabe nga pananglitan ang gipakita sa Figure 1d, nga nakuha sa akong lab pipila ka semana ang milabay. Niini nga kaso, nagtukod kami usa ka sistema nga adunay bag-ong injection valve nga wala pa namo magamit kaniadto, ug nag-instalar usa ka gamay nga volume injection loop nga adunay ferrule nga gihulma sa usa ka stainless steel capillary. Pagkahuman sa pipila ka inisyal nga mga eksperimento sa pag-troubleshoot, among naamgohan nga ang giladmon sa port sa injection valve stator mas lawom kaysa sa among naandan, nga miresulta sa usa ka dako nga dead volume sa ilawom sa port. Kini nga problema dali nga masulbad pinaagi sa pag-ilis sa injection loop sa laing tubo, mahimo namon nga i-adjust ang ferrule sa husto nga posisyon aron matangtang ang dead volume sa ilawom sa port.
Ang mga peak front sama sa gipakita sa Figure 1e mahimo usab nga hinungdan sa mga problema sa pisikal o kemikal. Usa ka komon nga pisikal nga hinungdan sa leading edge mao nga ang particle bed sa column dili maayo nga naputos, o nga ang mga particle na-reorganisa sa paglabay sa panahon. Sama sa peak tailing nga gipahinabo niining pisikal nga panghitabo, ang labing maayong paagi aron ayohon kini mao ang pag-ilis sa column ug pagpadayon. Sa panguna, ang mga porma sa leading edge peak nga adunay kemikal nga gigikanan kanunay nga motumaw gikan sa gitawag nato nga "non-linear" nga mga kondisyon sa pagpabilin. Ubos sa sulundon (linear) nga mga kondisyon, ang gidaghanon sa analyte nga gipabilin sa stationary phase (busa, ang retention factor) linear nga may kalabutan sa konsentrasyon sa analyte sa column. Sa chromatographically, kini nagpasabut nga samtang ang masa sa analyte nga gi-inject sa column modaghan, ang peak mahimong mas taas, apan dili mas lapad. Kini nga relasyon mabungkag kung ang retention behavior dili linear, ug ang mga peak dili lamang mahimong mas taas apan mas lapad usab samtang daghang masa ang gi-inject. Dugang pa, ang mga nonlinear nga porma nagtino sa porma sa chromatographic peaks, nga moresulta sa leading o trailing edges. Sama sa mass overload nga hinungdan sa peak tailing (10), Ang peak leading nga gipahinabo sa nonlinear retention mahimo usab nga madayagnos pinaagi sa pagpakunhod sa gi-inject nga analyte mass. Kung molambo ang porma sa peak, ang pamaagi kinahanglan nga usbon aron dili molapas sa kalidad sa injection nga hinungdan sa leading edge, o ang mga kondisyon sa chromatographic kinahanglan nga usbon aron maminusan kini nga pamatasan.
Usahay makakita kita og daw "split" peak, sama sa gipakita sa Figure 1f. Ang unang lakang sa pagsulbad niini nga problema mao ang pagtino kung ang porma sa peak tungod ba sa partial co-elution (ie, ang presensya sa duha ka managlahi apan hapit nga nag-elute sa mga compound). Kung adunay duha ka lainlaing analyte nga nag-elute nga duol sa usag usa, nan kinahanglan nga pauswagon ang ilang resolusyon (pananglitan, pinaagi sa pagdugang sa selectivity, retention, o plate count), ug ang dayag nga "split" peaks adunay kalabotan sa pisikal nga performance. Ang performance walay kalabotan sa column mismo. Kasagaran, ang labing hinungdanon nga timailhan niini nga desisyon mao kung ang tanan nga mga peak sa chromatogram nagpakita ba og mga split shapes, o usa o duha lang. Kung usa o duha lang, lagmit kini usa ka isyu sa co-elution; kung ang tanan nga mga peak nabahin, lagmit kini usa ka pisikal nga isyu, lagmit nga may kalabotan sa column mismo.
Ang mga split peak nga may kalabutan sa pisikal nga mga kabtangan sa kolum mismo kasagaran tungod sa partially blocked inlet o outlet frits, o reorganisasyon sa mga partikulo sa kolum, nga nagtugot sa mobile phase nga moagos nga mas paspas kaysa mobile phase sa pipila ka mga lugar sa column channel formation. sa ubang mga rehiyon (11). Ang partially blocked frit usahay malimpyohan pinaagi sa pag-usab sa agos agi sa kolum; bisan pa, sa akong kasinatian, kini kasagaran usa ka mubo nga termino kaysa usa ka dugay nga termino nga solusyon. Kini kanunay nga makamatay sa mga modernong kolum kung ang mga partikulo maghiusa pag-usab sulod sa kolum. Niini nga punto, labing maayo nga ilisan ang kolum ug ipadayon.
Ang kinatas-ang hulagway sa Figure 1g, gikan usab sa usa ka bag-o nga pananglitan sa akong kaugalingong lab, kasagaran nagpakita nga ang signal taas kaayo nga nakaabot na kini sa taas nga tumoy sa response range. Alang sa mga optical absorbance detector (UV-vis sa kini nga kaso), kung ang konsentrasyon sa analyte taas kaayo, ang analyte mosuhop sa kadaghanan sa kahayag nga moagi sa detector flow cell, nga magbilin ug gamay ra kaayo nga kahayag nga ma-detect. Ubos niini nga mga kondisyon, ang electrical signal gikan sa photodetector naimpluwensyahan pag-ayo sa lainlaing mga gigikanan sa kasaba, sama sa stray light ug "dark current", nga naghimo sa signal nga "malabo" kaayo sa hitsura ug independente sa konsentrasyon sa analyte. Kung kini mahitabo, ang problema kanunay nga dali nga masulbad pinaagi sa pagkunhod sa gidaghanon sa injection sa analyte—pagpakunhod sa gidaghanon sa injection, pagtunaw sa sample, o pareho.
Sa eskwelahan sa chromatography, gigamit nato ang signal sa detector (ie, ang y-axis sa chromatogram) isip timailhan sa konsentrasyon sa analyte sa sample. Busa daw katingad-an nga makita ang usa ka chromatogram nga adunay signal nga ubos sa zero, tungod kay ang yano nga interpretasyon mao nga kini nagpakita sa negatibo nga konsentrasyon sa analyte - nga siyempre dili posible sa pisikal. Sa akong kasinatian, ang negatibo nga mga peak kasagarang maobserbahan kung mogamit og optical absorbance detectors (pananglitan, UV-vis).
Sa kini nga kaso, ang negatibo nga peak nagpasabot nga ang mga molekula nga mogawas gikan sa kolum mosuhop og gamay nga kahayag kay sa mobile phase mismo sa wala pa ug pagkahuman sa peak. Mahimo kini mahitabo, pananglitan, kung mogamit og medyo ubos nga detection wavelengths (<230 nm) ug mga mobile phase additives nga mosuhop sa kadaghanan sa kahayag niining mga wavelength. Ang ingon nga mga additives mahimong mga mobile phase solvent components sama sa methanol o mga buffer components sama sa acetate o formate. Mahimo gyud nga gamiton ang negatibo nga mga peak aron maandam ang usa ka calibration curve ug makakuha og tukma nga quantitative nga impormasyon, busa walay sukaranan nga hinungdan aron malikayan kini mismo (kini nga pamaagi usahay gitawag nga "indirect UV detection") (13). Bisan pa, kung gusto gyud naton nga malikayan ang negatibo nga mga peak sa hingpit, sa kaso sa absorbance detection, ang labing kaayo nga solusyon mao ang paggamit og lahi nga detection wavelength aron ang analyte mosuhop og labaw pa sa mobile phase, o usbon ang komposisyon sa mobile phase aron sila mosuhop og gamay nga kahayag kay sa mga analyte.
Mahimo usab nga makita ang mga negatibong peak kon gamiton ang refractive index (RI) detection kon ang refractive index sa mga component gawas sa analyte sa sample, sama sa solvent matrix, lahi sa refractive index sa mobile phase. Mahitabo usab kini sa UV-vis detection, apan kini nga epekto lagmit nga maminusan kon itandi sa RI detection. Sa duha ka kaso, ang mga negatibong peak mahimong maminusan pinaagi sa mas duol nga pagpares sa komposisyon sa sample matrix ngadto sa mobile phase.
Sa ikatulong bahin sa sukaranang hilisgutan sa pag-troubleshoot sa LC, akong gihisgutan ang mga sitwasyon diin ang naobserbahan nga porma sa peak lahi sa gilauman o normal nga porma sa peak. Ang epektibo nga pag-troubleshoot sa ingon nga mga problema magsugod sa kahibalo sa gilauman nga mga porma sa peak (base sa teorya o naunang kasinatian sa kasamtangan nga mga pamaagi), mao nga ang mga pagtipas gikan niini nga mga gilauman klaro. Ang mga problema sa porma sa peak adunay daghang lainlaing potensyal nga mga hinungdan (sobra ka lapad, tailing, leading edge, ug uban pa). Niini nga installment, akong gihisgutan sa detalyado ang pipila sa mga hinungdan nga akong kanunay nga makita. Ang pagkahibalo niini nga mga detalye naghatag usa ka maayong lugar aron magsugod sa pag-troubleshoot, apan wala makuha ang tanan nga mga posibilidad. Ang mga magbabasa nga interesado sa usa ka mas lawom nga lista sa mga hinungdan ug solusyon mahimong magtumong sa wall chart sa LCGC nga "LC Troubleshooting Guide".
(4) Tsart sa bungbong sa LCGC nga “LC Troubleshooting Guide”. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Pag-analisar sa Datos ug Pagproseso sa Signal sa Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF ug Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.