بعض مواضيع استكشاف أخطاء أجهزة كروماتوغرافيا السائل (LC) لا تفقد أهميتها أبدًا، إذ لا تزال هناك مشكلات في استخدامها، حتى مع تطور تقنية الأجهزة بمرور الوقت. تتعدد الأسباب التي قد تؤدي إلى ظهور مشكلات في نظام كروماتوغرافيا السائل، مما ينتج عنه شكل قمة غير دقيق. عند ظهور مشكلات متعلقة بشكل القمة، فإن قائمة مختصرة بالأسباب المحتملة لهذه النتائج تُسهّل عملية استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
لقد استمتعتُ بكتابة عمود "استكشاف أخطاء كروماتوغرافيا السائل وإصلاحها" والتفكير في المواضيع كل شهر، لأن بعض المواضيع لا تفقد أهميتها أبدًا. فبينما تصبح بعض المواضيع أو الأفكار قديمة في مجال أبحاث الكروماتوغرافيا مع ظهور أفكار أحدث وأفضل، فإن بعض المواضيع في مجال استكشاف الأخطاء وإصلاحها لا تزال ذات صلة منذ ظهور أول مقال عن استكشاف الأخطاء وإصلاحها في هذه المجلة (مجلة كروماتوغرافيا السائل آنذاك) عام 1983 (1). على مدى السنوات القليلة الماضية، ركزتُ في عدة أقسام من عمود "استكشاف أخطاء كروماتوغرافيا السائل وإصلاحها" على الاتجاهات المعاصرة التي تؤثر على كروماتوغرافيا السائل (على سبيل المثال، المقارنة النسبية لفهمنا لتأثير الضغط على الاحتفاظ [2] والتطورات الجديدة)، وتفسيرنا لنتائج كروماتوغرافيا السائل، وكيفية استكشاف الأخطاء وإصلاحها باستخدام أجهزة كروماتوغرافيا السائل الحديثة. في عدد هذا الشهر، أواصل سلسلتي (3)، التي بدأت في ديسمبر 2021، والتي ركزت على بعض المواضيع "الحيوية" في استكشاف أخطاء كروماتوغرافيا السائل وإصلاحها - وهي عناصر أساسية لأي خبير في استكشاف الأخطاء وإصلاحها، بغض النظر عن عمر الجهاز. النظام الذي نستخدمه. يرتبط الموضوع الرئيسي لهذه السلسلة ارتباطًا وثيقًا بدليل استكشاف أخطاء LC الشهير (4) الخاص بـ LCGC، والمعلق في العديد من المختبرات. في الجزء الثالث من هذه السلسلة، اخترت التركيز على المشكلات المتعلقة بشكل الذروة أو خصائصها. من المثير للدهشة أن الدليل يسرد 44 سببًا محتملاً مختلفًا لضعف شكل الذروة! لا يمكننا تناول جميع هذه المشكلات بالتفصيل في مقال واحد، لذلك سأركز في هذا الجزء الأول على بعض المشكلات التي ألاحظها بشكل متكرر. آمل أن يجد مستخدمو LC، من جميع الأعمار، بعض النصائح والتذكيرات المفيدة حول هذا الموضوع المهم.
أجد نفسي أجيب بشكل متزايد على أسئلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها بعبارة "كل شيء ممكن". قد تبدو هذه الإجابة سهلة عند النظر إلى ملاحظات يصعب تفسيرها، لكنني أجدها مناسبة في كثير من الأحيان. مع وجود العديد من الأسباب المحتملة لشكل الذروة غير الجيد، من المهم أن نتحلى بعقلية منفتحة عند التفكير في ماهية المشكلة، وأن نكون قادرين على تحديد أولويات الأسباب المحتملة لبدء جهودنا في استكشاف الأخطاء وإصلاحها، مع التركيز على الاحتمالات الأكثر شيوعًا، وهذه النقطة مهمة للغاية.
تُعدّ خطوة أساسية في أي عملية استكشاف أخطاء وإصلاحها - وهي خطوة أرى أنها تُستهان بها - هي إدراك وجود مشكلة تحتاج إلى حل. غالبًا ما يعني إدراك وجود مشكلة إدراك أن ما يحدث للأداة يختلف عن توقعاتنا، التي تتشكل بناءً على النظرية والمعرفة التجريبية والخبرة (5). لا يشير "شكل الذروة" المشار إليه هنا إلى شكل الذروة فحسب (متناظر، غير متناظر، أملس، منفوش، حافة أمامية، ذيل، إلخ)، بل يشير أيضًا إلى عرضها. توقعاتنا لشكل الذروة الفعلي بسيطة. تدعم النظرية (6) جيدًا التوقع الوارد في الكتب الدراسية بأن ذروات الكروماتوغرافيا، في معظم الحالات، يجب أن تكون متناظرة وتتوافق مع شكل التوزيع الغاوسي، كما هو موضح في الشكل 1أ. أما ما نتوقعه من عرض الذروة فهو مسألة أكثر تعقيدًا، وسنناقش هذا الموضوع في مقال لاحق. تُظهر أشكال الذروة الأخرى في الشكل 1 بعض الاحتمالات الأخرى التي يمكن ملاحظتها - بعبارة أخرى، بعض الطرق التي قد تسوء بها الأمور. في ما تبقى في هذا الجزء، سنقضي بعض الوقت في مناقشة بعض الأمثلة المحددة للمواقف التي يمكن أن تؤدي إلى هذه الأنواع من الأشكال.
أحيانًا لا تُلاحظ القمم على الإطلاق في مخطط الكروماتوغرافيا حيث يُتوقع ظهورها. يُشير المخطط الجداري أعلاه إلى أن غياب القمة (بافتراض أن العينة تحتوي بالفعل على المادة التحليلية المستهدفة بتركيز كافٍ لجعل استجابة الكاشف كافية لرؤيتها فوق مستوى الضوضاء) يرتبط عادةً بمشكلة في الجهاز أو بظروف طور متحرك غير صحيحة (إن لوحظت أصلًا). عادةً ما تكون القمم "ضعيفة" جدًا. يمكن الاطلاع على قائمة مختصرة بالمشاكل والحلول المحتملة في هذه الفئة في الجدول الأول.
كما ذكرتُ سابقاً، فإن مسألة تحديد مقدار اتساع الذروة المسموح به قبل الانتباه إليه ومحاولة إصلاحه موضوع معقد سأتناوله في مقال لاحق. وتشير تجربتي إلى أن اتساع الذروة الكبير غالباً ما يصاحبه تغير ملحوظ في شكلها، وأن ذيل الذروة أكثر شيوعاً من ظهور الذروة السابقة أو انقسامها. ومع ذلك، فإن الذروات المتناظرة اسمياً تتسع أيضاً، وقد يعود ذلك إلى عدة أسباب مختلفة.
تمت مناقشة كل من هذه المشكلات بالتفصيل في أعداد سابقة من مجلة "استكشاف أخطاء LC وإصلاحها"، ويمكن للقراء المهتمين بهذه المواضيع الرجوع إلى تلك المقالات السابقة للاطلاع على معلومات حول الأسباب الجذرية والحلول المحتملة لهذه المشكلات. للمزيد من التفاصيل.
قد ينتج تذييل القمم، وظهور قمم جديدة في المقدمة، وانقسامها عن ظواهر كيميائية أو فيزيائية، وتختلف قائمة الحلول المحتملة لهذه المشاكل اختلافًا كبيرًا، اعتمادًا على ما إذا كانت المشكلة كيميائية أم فيزيائية. غالبًا، من خلال مقارنة القمم المختلفة في مخطط الكروماتوغرافيا، يمكن العثور على أدلة مهمة حول السبب. إذا كانت جميع القمم في مخطط الكروماتوغرافيا متشابهة في الشكل، فمن المرجح أن السبب ليس فيزيائيًا. أما إذا تأثرت قمة واحدة أو بضع قمم فقط، بينما تبدو بقية القمم سليمة، فمن المرجح أن يكون السبب كيميائيًا.
إن الأسباب الكيميائية لظهور ذيول الذروة معقدة للغاية بحيث لا يمكن مناقشتها بإيجاز هنا. يُرجى من القارئ المهتم الرجوع إلى العدد الأخير من مجلة "استكشاف أخطاء كروماتوغرافيا السائل وإصلاحها" (10) لمزيد من التفاصيل. مع ذلك، يُمكن تجربة تقليل كتلة المادة المُحللة المحقونة وملاحظة ما إذا كان شكل الذروة يتحسن. إذا تحسن، فهذا مؤشر جيد على أن المشكلة تكمن في "زيادة الكتلة". في هذه الحالة، يجب تقييد الطريقة بحقن كتل صغيرة من المادة المُحللة، أو تغيير ظروف الفصل الكروماتوغرافي للحصول على أشكال ذروة جيدة حتى مع حقن كتل أكبر.
هناك أيضًا العديد من الأسباب الفيزيائية المحتملة لظاهرة ذيل الذروة. يُرجى من القراء المهتمين بمناقشة تفصيلية لهذه الاحتمالات الرجوع إلى عدد حديث من مجلة "استكشاف أخطاء كروماتوغرافيا السائل وإصلاحها" (11). أحد الأسباب الفيزيائية الأكثر شيوعًا لظاهرة ذيل الذروة هو ضعف التوصيل عند نقطة ما بين الحاقن والكاشف (12). يوضح الشكل 1د مثالًا متطرفًا، تم الحصول عليه في مختبري قبل بضعة أسابيع. في هذه الحالة، قمنا ببناء نظام باستخدام صمام حقن جديد لم نستخدمه من قبل، وقمنا بتركيب حلقة حقن صغيرة الحجم مزودة بحلقة معدنية مصبوبة على أنبوب شعري من الفولاذ المقاوم للصدأ. بعد بعض تجارب استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأولية، أدركنا أن عمق المنفذ في الجزء الثابت لصمام الحقن كان أكبر بكثير مما اعتدنا عليه، مما أدى إلى وجود حجم ميت كبير في قاع المنفذ. يمكن حل هذه المشكلة بسهولة عن طريق استبدال حلقة الحقن بأنبوب آخر، حيث يمكننا ضبط الحلقة المعدنية في الموضع الصحيح للتخلص من الحجم الميت في قاع المنفذ.
يمكن أن تنتج قمم الذروة، كما هو موضح في الشكل 1هـ، عن مشاكل فيزيائية أو كيميائية. من الأسباب الفيزيائية الشائعة للحافة الأمامية عدم تماسك طبقة الجسيمات في العمود، أو إعادة تنظيم الجسيمات بمرور الوقت. وكما هو الحال مع ذيل الذروة الناتج عن هذه الظاهرة الفيزيائية، فإن أفضل طريقة لإصلاح ذلك هي استبدال العمود ومواصلة التحليل. في الأساس، غالبًا ما تنشأ أشكال قمم الحافة الأمامية ذات الأصل الكيميائي مما نسميه ظروف الاحتفاظ "غير الخطية". في ظل الظروف المثالية (الخطية)، ترتبط كمية المادة المراد تحليلها المحتجزة بواسطة الطور الثابت (وبالتالي، عامل الاحتفاظ) خطيًا بتركيز المادة المراد تحليلها في العمود. كروماتوغرافيًا، يعني هذا أنه مع زيادة كتلة المادة المراد تحليلها المحقونة في العمود، تصبح الذروة أطول، ولكن ليس أعرض. تنكسر هذه العلاقة عندما يكون سلوك الاحتفاظ غير خطي، ولا تصبح الذروات أطول فحسب، بل أعرض أيضًا مع زيادة الكتلة المحقونة. بالإضافة إلى ذلك، تحدد الأشكال غير الخطية شكل الذروات الكروماتوغرافية، مما يؤدي إلى ظهور حواف أمامية أو خلفية. الحواف الخلفية. كما هو الحال مع زيادة الكتلة التي تسبب تذييل الذروة (10)، يمكن أيضًا تشخيص تقدم الذروة الناتج عن الاحتفاظ غير الخطي عن طريق تقليل كتلة المادة المُحللة المحقونة. إذا تحسن شكل الذروة، فيجب تعديل الطريقة بحيث لا تتجاوز جودة الحقن التي تسبب الحافة الأمامية، أو يجب تغيير ظروف الفصل الكروماتوغرافي لتقليل هذا السلوك.
أحيانًا نلاحظ ما يبدو أنه قمة "منقسمة"، كما هو موضح في الشكل 1f. الخطوة الأولى لحل هذه المشكلة هي تحديد ما إذا كان شكل القمة ناتجًا عن تداخل جزئي في الاستخلاص (أي وجود مركبين مختلفين ولكنهما متقاربان في الاستخلاص). إذا كان هناك بالفعل مادتان تحليليتان مختلفتان تستخلصان معًا، فإن الأمر يتعلق بتحسين فصلهما (على سبيل المثال، عن طريق زيادة الانتقائية أو الاحتفاظ أو عدد الصفائح)، وتكون القمم "المنقسمة" الظاهرة مرتبطة بخصائص فيزيائية. لا علاقة للأداء بالعمود نفسه. غالبًا ما يكون أهم دليل لاتخاذ هذا القرار هو ما إذا كانت جميع القمم في الكروماتوجرام تظهر أشكالًا منقسمة، أو قمة واحدة أو اثنتين فقط. إذا كانت قمة واحدة أو اثنتين فقط، فمن المحتمل أن تكون المشكلة ناتجة عن تداخل في الاستخلاص؛ أما إذا كانت جميع القمم منقسمة، فمن المحتمل أن تكون المشكلة فيزيائية، وغالبًا ما تكون مرتبطة بالعمود نفسه.
عادةً ما تُعزى قمم الفصل المنفصلة، ​​المرتبطة بالخصائص الفيزيائية للعمود نفسه، إلى انسداد جزئي في فتحات الدخول أو الخروج، أو إلى إعادة تنظيم الجزيئات داخل العمود، مما يسمح للطور المتحرك بالتدفق بسرعة أكبر من سرعة تدفقه في مناطق معينة من العمود (11). يمكن أحيانًا إزالة الانسداد الجزئي للفتحات عن طريق عكس اتجاه التدفق عبر العمود؛ إلا أن هذا الحل، بحسب خبرتي، عادةً ما يكون مؤقتًا وليس طويل الأمد. غالبًا ما يكون هذا الانسداد كارثيًا في الأعمدة الحديثة إذا ما اتحدت الجزيئات داخل العمود. عند هذه النقطة، يُفضل استبدال العمود ومتابعة العمل.
تشير الذروة في الشكل 1g، والتي رُصدت مؤخرًا في مختبري، عادةً إلى أن الإشارة عالية جدًا لدرجة أنها وصلت إلى الحد الأعلى لنطاق الاستجابة. في أجهزة الكشف الضوئي (الأشعة فوق البنفسجية والمرئية في هذه الحالة)، عندما يكون تركيز المادة المراد تحليلها مرتفعًا جدًا، تمتص هذه المادة معظم الضوء المار عبر خلية تدفق الكاشف، فلا يتبقى سوى القليل جدًا من الضوء للكشف عنه. في ظل هذه الظروف، تتأثر الإشارة الكهربائية الصادرة من الكاشف الضوئي بشدة بمصادر ضوضاء مختلفة، مثل الضوء الشارد و"التيار المظلم"، مما يجعل الإشارة ضبابية وغير مرتبطة بتركيز المادة المراد تحليلها. عند حدوث ذلك، يمكن غالبًا حل المشكلة بسهولة عن طريق تقليل حجم حقن المادة المراد تحليلها، وذلك بتقليل حجم الحقن، أو تخفيف العينة، أو كليهما.
في مدرسة الكروماتوغرافيا، نستخدم إشارة الكاشف (أي المحور الصادي في الكروماتوجرام) كمؤشر لتركيز المادة المراد تحليلها في العينة. لذا يبدو غريباً رؤية كروماتوجرام بإشارة أقل من الصفر، إذ يُفسر ذلك ببساطة على أنه يشير إلى تركيز سالب للمادة المراد تحليلها، وهو أمر غير ممكن فيزيائياً. في تجربتي، غالباً ما تُلاحظ القمم السالبة عند استخدام كواشف الامتصاص الضوئي (مثل الأشعة فوق البنفسجية والمرئية).
في هذه الحالة، تعني الذروة السالبة ببساطة أن الجزيئات الخارجة من العمود تمتص ضوءًا أقل من الطور المتحرك نفسه مباشرةً قبل الذروة وبعدها. قد يحدث هذا، على سبيل المثال، عند استخدام أطوال موجية منخفضة نسبيًا للكشف (<230 نانومتر) ومضافات للطور المتحرك تمتص معظم الضوء عند هذه الأطوال الموجية. يمكن أن تكون هذه المضافات مكونات مذيب الطور المتحرك مثل الميثانول أو مكونات المحلول المنظم مثل الأسيتات أو الفورمات. يمكن استخدام الذروات السالبة لإعداد منحنى معايرة والحصول على معلومات كمية دقيقة، لذا لا يوجد سبب جوهري لتجنبها بحد ذاتها (يُشار إلى هذه الطريقة أحيانًا باسم "الكشف غير المباشر بالأشعة فوق البنفسجية") (13). مع ذلك، إذا أردنا حقًا تجنب الذروات السالبة تمامًا، في حالة الكشف عن الامتصاص، فإن الحل الأمثل هو استخدام طول موجي مختلف للكشف بحيث يمتص المُحلَّل ضوءًا أكثر من الطور المتحرك، أو تغيير تركيبة الطور المتحرك بحيث يمتص ضوءًا أقل من المُحلَّل.
قد تظهر قمم سالبة عند استخدام كشف معامل الانكسار (RI) عندما يختلف معامل انكسار مكونات أخرى غير المادة المراد تحليلها في العينة، مثل مصفوفة المذيب، عن معامل انكسار الطور المتحرك. يحدث هذا أيضًا مع كشف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية، ولكن هذا التأثير يميل إلى أن يكون أقل وضوحًا مقارنةً بكشف معامل الانكسار. في كلتا الحالتين، يمكن تقليل القمم السالبة عن طريق مطابقة تركيب مصفوفة العينة مع تركيب الطور المتحرك بشكل أدق.
في الجزء الثالث من سلسلة نقاشاتنا حول موضوع استكشاف أخطاء تقنية كروماتوغرافيا السائل (LC)، ناقشتُ الحالات التي يختلف فيها شكل الذروة المُلاحظ عن شكل الذروة المتوقع أو الطبيعي. يبدأ استكشاف الأخطاء وإصلاحها بفعالية بمعرفة أشكال الذروة المتوقعة (استنادًا إلى النظرية أو الخبرة السابقة مع الطرق الحالية)، لذا فإن أي انحراف عن هذه التوقعات يكون واضحًا. تتعدد الأسباب المحتملة لمشاكل شكل الذروة (مثل الاتساع المفرط، أو التذييل، أو الحافة الأمامية، إلخ). في هذا الجزء، أناقش بالتفصيل بعض الأسباب التي ألاحظها غالبًا. تُعدّ معرفة هذه التفاصيل نقطة انطلاق جيدة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، ولكنها لا تشمل جميع الاحتمالات. يمكن للقراء المهتمين بقائمة أكثر تفصيلًا للأسباب والحلول الرجوع إلى مخطط "دليل استكشاف أخطاء تقنية كروماتوغرافيا السائل" الخاص بـ LCGC.
(4) مخطط حائط "دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في LCGC". https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) أ. فيلينجر، تحليل البيانات ومعالجة الإشارات في الكروماتوغرافيا (إلسيفير، نيويورك، نيويورك، 1998)، ص 43-96.
(8) وهاب إم إف، داسغوبتا بي كيه، كادجو إيه إف، وأرمسترونغ دي دبليو، مجلة التحليل الكيميائي، المجلد 907، الصفحات 31-44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.