Nid yw rhai pynciau datrys problemau LC byth yn hen ffasiwn, gan fod problemau mewn ymarfer LC, hyd yn oed wrth i dechnoleg offerynnau wella dros amser. Mae yna lawer o ffyrdd y gall problemau godi mewn system LC a diweddu mewn siâp brig gwael. Pan fydd problemau sy'n gysylltiedig â siâp brig yn codi, mae rhestr fer o achosion posibl ar gyfer y canlyniadau hyn yn helpu i symleiddio ein profiad datrys problemau.
Mae wedi bod yn hwyl ysgrifennu'r golofn "Datrys Problemau LC" hon a meddwl am bynciau bob mis, oherwydd nid yw rhai pynciau byth yn mynd allan o ffasiwn. Er bod rhai pynciau neu syniadau yn mynd yn hen ffasiwn ym maes ymchwil cromatograffaeth wrth iddynt gael eu disodli gan syniadau newydd a gwell, ym maes datrys problemau, ers i'r erthygl datrys problemau gyntaf ymddangos yn y cyfnodolyn hwn (y Cyfnodolyn LC ar y pryd) gan fod rhai pynciau'n dal yn berthnasol) ym 1983(1). Dros yr ychydig flynyddoedd diwethaf, rwyf wedi canolbwyntio sawl adran Datrys Problemau LC ar dueddiadau cyfoes sy'n effeithio ar gromatograffaeth hylif (LC) (er enghraifft, y gymhariaeth gymharol o'n dealltwriaeth o effaith pwysau ar gadw [2] Datblygiadau Newydd) Ein dehongliad o ganlyniadau LC a sut i ddatrys problemau gydag offerynnau LC modern. Yn rhandaliad y mis hwn, rwy'n parhau â'm cyfres (3), a ddechreuodd ym mis Rhagfyr 2021, a oedd yn canolbwyntio ar rai o bynciau "bywyd a marwolaeth" datrys problemau LC - mae elfennau sy'n wych i unrhyw ddatryswr problemau yn hanfodol, ni waeth beth yw oedran y system yr ydym yn ei defnyddio. Mae pwnc craidd y gyfres hon yn berthnasol iawn i siart wal enwog "Canllaw Datrys Problemau LC" yr LCGC (4) sy'n hongian yn llawer o labordai. Ar gyfer trydydd rhan y gyfres hon, dewisais ganolbwyntio ar faterion sy'n ymwneud â siâp brig neu nodweddion brig. Yn anhygoel, mae'r siart wal yn rhestru 44 o achosion posibl gwahanol o siâp brig gwael! Ni allwn ystyried yr holl faterion hyn yn fanwl mewn un erthygl, felly yn y rhandaliad cyntaf hwn ar y pwnc, byddaf yn canolbwyntio ar rai o'r rhai rwy'n eu gweld amlaf. Rwy'n gobeithio y bydd defnyddwyr LC ifanc a hen yn dod o hyd i rai awgrymiadau ac atgoffa defnyddiol ar y pwnc pwysig hwn.
Rwy'n canfod fy hun yn ateb cwestiynau datrys problemau fwyfwy gyda "mae unrhyw beth yn bosibl". Gall yr ymateb hwn ymddangos yn hawdd wrth ystyried arsylwadau sy'n anodd eu dehongli, ond rwy'n ei chael yn aml yn briodol. Gyda llawer o achosion posibl o siâp gwael ar y brig, mae'n bwysig cadw meddwl agored wrth ystyried beth allai'r broblem fod, a gallu blaenoriaethu achosion posibl i ddechrau ein hymdrechion datrys problemau, gan ganolbwyntio ar y posibiliadau mwyaf cyffredin hynny, mae'r pwynt hwn yn bwysig iawn.
Cam allweddol mewn unrhyw ymarfer datrys problemau — ond un sydd heb ei werthfawrogi'n ddigonol yn fy marn i — yw cydnabod bod problem y mae angen ei datrys. Mae cydnabod bod problem yn aml yn golygu cydnabod bod yr hyn sy'n digwydd i'r offeryn yn wahanol i'n disgwyliadau, sy'n cael eu llunio gan theori, gwybodaeth empirig, a phrofiad (5). Mae'r "siâp brig" y cyfeirir ato yma mewn gwirionedd yn cyfeirio nid yn unig at siâp y brig (cymesur, anghymesur, llyfn, blewog, ymyl flaenllaw, cynffonog, ac ati), ond hefyd at y lled. Mae ein disgwyliadau ar gyfer siâp brig gwirioneddol yn syml. Mae theori (6) yn cefnogi'n dda'r disgwyliad mewn gwerslyfr, yn y rhan fwyaf o achosion, y dylai'r copaon cromatograffig fod yn gymesur a chydymffurfio â siâp dosraniad Gaussaidd, fel y dangosir yn Ffigur 1a. Mae'r hyn a ddisgwyliwn o led brig yn fater mwy cymhleth, a byddwn yn trafod y pwnc hwn mewn erthygl yn y dyfodol. Mae'r siapiau brig eraill yn Ffigur 1 yn dangos rhai o'r posibiliadau eraill y gellid eu harsylwi — mewn geiriau eraill, rhai o'r ffyrdd y gallai pethau fynd o chwith. Yng ngweddill y rhandaliad hwn, byddwn yn treulio amser yn trafod rhai enghreifftiau penodol o sefyllfaoedd a all arwain at y mathau siapiau hyn.
Weithiau ni welir copaon o gwbl yn y cromatogram lle disgwylir iddynt gael eu heludio. Mae'r siart wal uchod yn dangos bod absenoldeb copa (gan dybio bod y sampl mewn gwirionedd yn cynnwys yr analyt targed ar grynodiad a ddylai wneud ymateb y synhwyrydd yn ddigonol i'w weld uwchlaw'r sŵn) fel arfer yn gysylltiedig â rhyw broblem offeryn neu amodau cam symudol anghywir (os cânt eu gweld o gwbl). Mae copaon, fel arfer yn rhy "wan"). Gellir gweld rhestr fer o broblemau ac atebion posibl yn y categori hwn yn Nhabl I.
Fel y soniwyd uchod, mae'r cwestiwn o faint o ehangu brig y dylid ei oddef cyn rhoi sylw a cheisio ei drwsio yn bwnc cymhleth y byddaf yn ei drafod mewn erthygl yn y dyfodol. Fy mhrofiad i yw bod ehangu brig sylweddol yn aml yn cyd-fynd â newid sylweddol yn siâp y brig, ac mae cynffon brig yn fwy cyffredin na chyn-brig neu hollti. Fodd bynnag, mae'r copaon cymesur enwol hefyd yn cael eu lledu, a all gael ei achosi gan ychydig o resymau gwahanol:
Mae pob un o'r materion hyn wedi cael eu trafod yn fanwl mewn rhifynnau blaenorol o Troubleshooting LC, a gall darllenwyr sydd â diddordeb yn y pynciau hyn gyfeirio at yr erthyglau blaenorol hyn i gael gwybodaeth am yr achosion sylfaenol a'r atebion posibl i'r problemau hyn. Mwy o fanylion.
Gall ffenomenau cemegol neu ffisegol achosi cynffon brig, blaen brig, a hollti, ac mae'r rhestr o atebion posibl i'r problemau hyn yn amrywio'n fawr, yn dibynnu a ydym yn delio â phroblem gemegol neu ffisegol. Yn aml, trwy gymharu'r gwahanol gopaon mewn cromatogram, gallwch ddod o hyd i gliwiau pwysig ynghylch pa un yw'r troseddwr. Os yw pob copa mewn cromatogram yn arddangos siapiau tebyg, mae'n fwyaf tebygol nad yw'r achos yn ffisegol. Os mai dim ond un neu ychydig o gopaon sy'n cael eu heffeithio, ond bod y gweddill yn edrych yn iawn, mae'n fwyaf tebygol mai cemegol yw'r achos.
Mae achosion cemegol cynffon brig yn rhy gymhleth i'w trafod yn fyr yma. Cyfeirir y darllenydd sydd â diddordeb at y rhifyn diweddar o “LC Troubleshooting” am drafodaeth fanylach (10). Fodd bynnag, peth hawdd i'w geisio yw lleihau màs y dadansoddi a chwistrellir a gweld a yw siâp y brig yn gwella. Os felly, yna mae hwn yn gliw da mai “gorlwytho màs” yw'r broblem. Yn yr achos hwn, rhaid cyfyngu'r dull i chwistrellu masau dadansoddi bach, neu rhaid newid yr amodau cromatograffig fel y gellir cael siapiau brig da hyd yn oed gyda masau mwy a chwistrellir.
Mae yna hefyd lawer o resymau ffisegol posibl dros gynffon brig. Cyfeirir darllenwyr sydd â diddordeb mewn trafodaeth fanwl o'r posibiliadau at rifyn diweddar arall o “LC Troubleshooting” (11). Un o achosion ffisegol mwy cyffredin cynffon brig yw cysylltiad gwael mewn pwynt rhwng y chwistrellwr a'r synhwyrydd (12). Dangosir enghraifft eithafol yn Ffigur 1d, a gafwyd yn fy labordy ychydig wythnosau yn ôl. Yn yr achos hwn, fe wnaethom adeiladu system gyda falf chwistrellu newydd nad oeddem wedi'i defnyddio o'r blaen, a gosod dolen chwistrellu cyfaint fach gyda ferrule a oedd wedi'i fowldio ar gapilari dur di-staen. Ar ôl rhai arbrofion datrys problemau cychwynnol, sylweddolom fod dyfnder y porthladd yn stator y falf chwistrellu yn llawer dyfnach nag yr oeddem wedi arfer ag ef, gan arwain at gyfaint marw mawr ar waelod y porthladd. Mae'r broblem hon yn hawdd ei datrys trwy ddisodli'r ddolen chwistrellu â thiwb arall, gallwn addasu'r ferrule i'r safle cywir i ddileu'r gyfaint marw ar waelod y porthladd.
Gall blaenau brig fel y rhai a ddangosir yn Ffigur 1e hefyd gael eu hachosi gan broblemau ffisegol neu gemegol. Achos ffisegol cyffredin o'r ymyl flaenllaw yw nad yw gwely gronynnau'r golofn wedi'i bacio'n dda, neu fod y gronynnau wedi aildrefnu dros amser. Fel gyda chynffon brig a achosir gan y ffenomen ffisegol hon, y ffordd orau i drwsio hyn yw disodli'r golofn a pharhau i fynd. Yn y bôn, mae siapiau brig ymyl flaenllaw gyda tharddiad cemegol yn aml yn codi o'r hyn a alwn yn amodau cadw "anlinellol". O dan amodau delfrydol (llinol), mae faint o ddadansoddyn a gedwir gan y cyfnod llonydd (felly, y ffactor cadw) yn gysylltiedig yn llinol â chrynodiad yr ddadansoddyn yn y golofn. Yn gromatograffig, mae hyn yn golygu, wrth i fàs yr ddadansoddyn a chwistrellir i'r golofn gynyddu, fod y brig yn dod yn dalach, ond nid yn lletach. Mae'r berthynas hon yn cael ei thorri pan fydd yr ymddygiad cadw yn anlinellol, ac nid yn unig y mae'r copaon yn dod yn dalach ond hefyd yn lletach wrth i fwy o fàs gael ei chwistrellu. Yn ogystal, mae siapiau anlinellol yn pennu siâp copaon cromatograffig, gan arwain at ymylon blaenllaw neu ddilynol. Fel gyda gorlwytho màs sy'n achosi cynffon brig (10), mae arwain brig yn cael ei achosi gellir diagnosio cadw anlinellol hefyd drwy leihau màs y dadansoddiad a chwistrellir. Os bydd siâp y brig yn gwella, rhaid addasu'r dull i beidio â rhagori ar yr ansawdd chwistrellu sy'n achosi'r ymyl flaenllaw, neu rhaid newid yr amodau cromatograffig i leihau'r ymddygiad hwn.
Weithiau rydym yn arsylwi'r hyn sy'n ymddangos fel brig "hollt", fel y dangosir yn Ffigur 1f. Y cam cyntaf wrth ddatrys y broblem hon yw pennu a yw siâp y brig oherwydd cyd-elwiad rhannol (h.y., presenoldeb dau gyfansoddyn gwahanol ond agos at ei gilydd). Os oes dau ddadansoddyn gwahanol yn elwiad yn agos at ei gilydd mewn gwirionedd, yna mae'n fater o wella eu datrysiad (er enghraifft, trwy gynyddu detholusrwydd, cadw, neu gyfrif platiau), ac mae'r brig "hollt" ymddangosiadol yn gysylltiedig â ffisegol. Nid oes gan berfformiad ddim i'w wneud â'r golofn ei hun. Yn aml, y cliw pwysicaf i'r penderfyniad hwn yw a yw pob brig yn y cromatogram yn arddangos siapiau hollt, neu ddim ond un neu ddau. Os mai dim ond un neu ddau ydyw, mae'n debyg ei fod yn broblem cyd-elwiad; os yw pob brig wedi'i hollti, mae'n debyg ei fod yn broblem ffisegol, yn fwyaf tebygol o fod yn gysylltiedig â'r golofn ei hun.
Mae copaon hollt sy'n gysylltiedig â phriodweddau ffisegol y golofn ei hun fel arfer oherwydd ffritiau mewnfa neu allfa sydd wedi'u blocio'n rhannol, neu ad-drefnu gronynnau yn y golofn, gan ganiatáu i'r cyfnod symudol lifo'n gyflymach na'r cyfnod symudol mewn rhai ardaloedd o ffurfiant sianel y golofn mewn rhanbarthau eraill (11). Weithiau gellir clirio ffrit sydd wedi'i flocio'n rhannol trwy wrthdroi'r llif trwy'r golofn; fodd bynnag, yn fy mhrofiad i, mae hwn fel arfer yn ateb tymor byr yn hytrach na hirdymor. Mae hyn yn aml yn angheuol gyda cholofnau modern os yw'r gronynnau'n ailgyfuno o fewn y golofn. Ar y pwynt hwn, mae'n well disodli'r golofn a pharhau.
Mae'r brig yn Ffigur 1g, hefyd o achos diweddar yn fy labordy fy hun, fel arfer yn dangos bod y signal mor uchel fel ei fod wedi cyrraedd pen uchel yr ystod ymateb. Ar gyfer synwyryddion amsugnedd optegol (UV-vis yn yr achos hwn), pan fydd crynodiad y dadansoddyn yn uchel iawn, mae'r dadansoddyn yn amsugno'r rhan fwyaf o'r golau sy'n mynd trwy gell llif y synhwyrydd, gan adael ychydig iawn o olau i'w ganfod. O dan yr amodau hyn, mae'r signal trydanol o'r ffotosynhwyrydd yn cael ei ddylanwadu'n fawr gan wahanol ffynonellau sŵn, fel golau crwydr a "cherrynt tywyll", gan wneud y signal yn "aneglur" iawn o ran golwg ac yn annibynnol ar grynodiad y dadansoddyn. Pan fydd hyn yn digwydd, gellir datrys y broblem yn hawdd yn aml trwy leihau cyfaint chwistrelliad y dadansoddyn—lleihau cyfaint y chwistrelliad, gwanhau'r sampl, neu'r ddau.
Yn yr ysgol gromatograffaeth, rydym yn defnyddio'r signal synhwyrydd (h.y., yr echelin-y yn y cromatogram) fel dangosydd o grynodiad y dadansoddi yn y sampl. Felly mae'n ymddangos yn rhyfedd gweld cromatogram gyda signal islaw sero, gan mai'r dehongliad syml yw bod hyn yn dynodi crynodiad dadansoddi negyddol - nad yw'n bosibl yn gorfforol wrth gwrs. ​​Yn fy mhrofiad i, mae copaon negyddol yn cael eu gweld amlaf wrth ddefnyddio synwyryddion amsugnedd optegol (e.e., UV-vis).
Yn yr achos hwn, mae brig negatif yn syml yn golygu bod y moleciwlau sy'n echludo o'r golofn yn amsugno llai o olau na'r cyfnod symudol ei hun yn syth cyn ac ar ôl y brig. Gall hyn ddigwydd, er enghraifft, wrth ddefnyddio tonfeddi canfod cymharol isel (<230 nm) ac ychwanegion cyfnod symudol sy'n amsugno'r rhan fwyaf o'r golau ar y tonfeddi hyn. Gall ychwanegion o'r fath fod yn gydrannau toddydd cyfnod symudol fel methanol neu gydrannau byffer fel asetat neu fformad. Mewn gwirionedd, gellir defnyddio copaon negatif i baratoi cromlin calibradu a chael gwybodaeth feintiol gywir, felly nid oes unrhyw reswm sylfaenol i'w hosgoi ynddynt eu hunain (weithiau cyfeirir at y dull hwn fel "canfod UV anuniongyrchol") (13). Fodd bynnag, os ydym wir eisiau osgoi copaon negatif yn gyfan gwbl, yn achos canfod amsugnedd, yr ateb gorau yw defnyddio tonfedd canfod wahanol fel bod yr analyt yn amsugno mwy na'r cyfnod symudol, neu newid cyfansoddiad y cyfnod symudol fel eu bod yn amsugno llai o olau na analytau.
Gall copaon negatif ymddangos hefyd wrth ddefnyddio canfod mynegai plygiannol (RI) pan fydd mynegai plygiannol cydrannau heblaw'r dadansoddyn yn y sampl, fel y matrics toddydd, yn wahanol i fynegai plygiannol y cyfnod symudol. Mae hyn hefyd yn digwydd gyda chanfod UV-vis, ond mae'r effaith hon yn tueddu i gael ei gwanhau o'i gymharu â chanfod RI. Yn y ddau achos, gellir lleihau copaon negatif trwy baru cyfansoddiad matrics y sampl yn agosach â chyfansoddiad y cyfnod symudol.
Yn rhan tri ar bwnc sylfaenol datrys problemau LC, trafodais sefyllfaoedd lle mae siâp y brig a welwyd yn wahanol i siâp y brig disgwyliedig neu arferol. Mae datrys problemau o'r fath yn effeithiol yn dechrau gyda gwybodaeth am siapiau brig disgwyliedig (yn seiliedig ar ddamcaniaeth neu brofiad blaenorol gyda dulliau presennol), felly mae gwyriadau o'r disgwyliadau hyn yn amlwg. Mae gan broblemau siâp brig lawer o achosion posibl gwahanol (rhy lydan, cynffonog, ymyl flaenllaw, ac ati). Yn y rhandaliad hwn, trafodaf yn fanwl rai o'r rhesymau rwy'n eu gweld amlaf. Mae gwybod y manylion hyn yn lle da i ddechrau datrys problemau, ond nid yw'n dal pob posibilrwydd. Gall darllenwyr sydd â diddordeb mewn rhestr fanylach o achosion ac atebion gyfeirio at siart wal "Canllaw Datrys Problemau LC" LCGC.
(4) Siart wal “Canllaw Datrys Problemau LC” LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Dadansoddi Data a Phrosesu Signalau mewn Cromatograffeg (Elsevier, Efrog Newydd, NY, 1998), tt. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF ac Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.