कुछ LC समस्या निवारण विषय कभी पुराने नहीं होते, क्योंकि समय के साथ उपकरण प्रौद्योगिकी में सुधार होने के बावजूद LC अभ्यास में समस्याएं आती रहती हैं। LC प्रणाली में कई तरह से समस्याएं उत्पन्न हो सकती हैं और परिणामस्वरूप पीक का आकार खराब हो सकता है। पीक के आकार से संबंधित समस्याएं उत्पन्न होने पर, इन परिणामों के संभावित कारणों की एक संक्षिप्त सूची समस्या निवारण प्रक्रिया को सरल बनाने में सहायक होती है।
“एलसी ट्रबलशूटिंग” कॉलम लिखना और हर महीने विषयों पर विचार करना मजेदार रहा है, क्योंकि कुछ विषय कभी पुराने नहीं होते। क्रोमैटोग्राफी अनुसंधान के क्षेत्र में कुछ विषय या विचार नए और बेहतर विचारों के आने से अप्रचलित हो जाते हैं, लेकिन ट्रबलशूटिंग के क्षेत्र में, इस पत्रिका (उस समय एलसी जर्नल) में 1983 में पहला ट्रबलशूटिंग लेख प्रकाशित होने के बाद से (1), कुछ विषय आज भी प्रासंगिक हैं। पिछले कुछ वर्षों में, मैंने एलसी ट्रबलशूटिंग के कई अनुभागों को लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एलसी) को प्रभावित करने वाले समकालीन रुझानों पर केंद्रित किया है (उदाहरण के लिए, प्रतिधारण पर दबाव के प्रभाव की हमारी समझ की तुलना [2], एलसी परिणामों की हमारी व्याख्या और आधुनिक एलसी उपकरणों के साथ ट्रबलशूटिंग कैसे करें)। इस महीने के अंक में, मैं अपनी श्रृंखला (3) को जारी रख रहा हूँ, जो दिसंबर 2021 में शुरू हुई थी और एलसी ट्रबलशूटिंग के कुछ “जीवन और मृत्यु” जैसे विषयों पर केंद्रित थी — ऐसे तत्व जो किसी भी ट्रबलशूटर के लिए आवश्यक हैं, चाहे हम जिस भी सिस्टम का उपयोग कर रहे हों, उसकी उम्र कुछ भी हो। इस श्रृंखला का मुख्य विषय LCGC के प्रसिद्ध "LC समस्या निवारण गाइड" वॉल चार्ट (4) से अत्यधिक संबंधित है, जो कई प्रयोगशालाओं में लगा हुआ है। इस श्रृंखला के तीसरे भाग के लिए, मैंने पीक आकार या पीक विशेषताओं से संबंधित मुद्दों पर ध्यान केंद्रित करने का निर्णय लिया है। आश्चर्यजनक रूप से, वॉल चार्ट में खराब पीक आकार के 44 विभिन्न संभावित कारण सूचीबद्ध हैं! हम एक लेख में इन सभी मुद्दों पर विस्तार से विचार नहीं कर सकते, इसलिए इस विषय पर इस पहले भाग में, मैं उन कुछ मुद्दों पर ध्यान केंद्रित करूंगा जो मुझे अक्सर देखने को मिलते हैं। मुझे आशा है कि युवा और अनुभवी LC उपयोगकर्ता इस महत्वपूर्ण विषय पर कुछ उपयोगी सुझाव और अनुस्मारक पाएंगे।
समस्या निवारण संबंधी प्रश्नों का उत्तर देते समय मैं अक्सर कहता हूँ, "कुछ भी संभव है"। यह प्रतिक्रिया उन अवलोकनों के संदर्भ में आसान लग सकती है जिनकी व्याख्या करना कठिन है, लेकिन मुझे यह अक्सर उपयुक्त लगती है। पीक शेप में खराबी के कई संभावित कारणों को देखते हुए, समस्या क्या हो सकती है, इस पर विचार करते समय खुले दिमाग से सोचना महत्वपूर्ण है, और समस्या निवारण प्रयासों को शुरू करने के लिए संभावित कारणों को प्राथमिकता देना, सबसे आम संभावनाओं पर ध्यान केंद्रित करना, यह बिंदु बहुत महत्वपूर्ण है।
किसी भी समस्या निवारण अभ्यास में एक महत्वपूर्ण कदम — लेकिन जिसे मैं कम महत्व देता हूँ — यह पहचानना है कि एक समस्या है जिसे हल करने की आवश्यकता है। समस्या को पहचानने का अक्सर मतलब यह पहचानना होता है कि उपकरण के साथ जो होता है वह हमारी अपेक्षाओं से अलग है, जो सिद्धांत, अनुभवजन्य ज्ञान और अनुभव (5) द्वारा आकार लेती हैं। यहाँ संदर्भित "पीक आकार" वास्तव में न केवल पीक के आकार (सममित, असममित, चिकना, फूला हुआ, अग्रणी किनारा, पूंछ आदि) को संदर्भित करता है, बल्कि चौड़ाई को भी संदर्भित करता है। वास्तविक पीक आकार के लिए हमारी अपेक्षाएँ सरल हैं। सिद्धांत (6) पाठ्यपुस्तक की अपेक्षा का अच्छी तरह से समर्थन करता है कि, अधिकांश मामलों में, क्रोमैटोग्राफिक पीक सममित होने चाहिए और गॉसियन वितरण के आकार के अनुरूप होने चाहिए, जैसा कि चित्र 1a में दिखाया गया है। पीक चौड़ाई से हमारी अपेक्षा एक अधिक जटिल मुद्दा है, और हम इस विषय पर भविष्य के लेख में चर्चा करेंगे। चित्र 1 में अन्य पीक आकार कुछ अन्य संभावनाओं को दर्शाते हैं जिन्हें देखा जा सकता है — दूसरे शब्दों में, कुछ ऐसे तरीके जिनसे चीजें गलत हो सकती हैं। इस भाग के शेष भाग में, हम कुछ अन्य पीक आकारों पर चर्चा करने में समय व्यतीत करेंगे। ऐसी स्थितियों के विशिष्ट उदाहरण जो इन आकृतियों के निर्माण का कारण बन सकती हैं।
कभी-कभी क्रोमैटोग्राम में अपेक्षित स्थान पर शिखर दिखाई ही नहीं देते। ऊपर दिया गया वॉल चार्ट दर्शाता है कि शिखर का न दिखना (यह मानते हुए कि नमूने में लक्ष्य विश्लेष्य वास्तव में इतनी सांद्रता में मौजूद है कि डिटेक्टर की प्रतिक्रिया शोर से ऊपर शिखर को देखने के लिए पर्याप्त होनी चाहिए) आमतौर पर उपकरण की किसी समस्या या गलत मोबाइल चरण स्थितियों (यदि दिखाई भी दे) से संबंधित होता है। इस श्रेणी में संभावित समस्याओं और उनके समाधानों की एक संक्षिप्त सूची तालिका I में पाई जा सकती है।
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, पीक के फैलाव को कितना सहन किया जाना चाहिए, इस पर ध्यान देने और इसे ठीक करने का प्रयास करने से पहले, यह एक जटिल विषय है जिस पर मैं भविष्य के लेख में चर्चा करूंगा। मेरा अनुभव यह है कि पीक के महत्वपूर्ण फैलाव के साथ अक्सर पीक के आकार में भी महत्वपूर्ण परिवर्तन होता है, और पीक टेलिंग, प्री-पीक या स्प्लिटिंग की तुलना में अधिक आम है। हालांकि, नाममात्र सममित पीक भी चौड़े हो जाते हैं, जो कई अलग-अलग कारणों से हो सकते हैं:
इनमें से प्रत्येक समस्या पर ट्रबलशूटिंग एलसी के पिछले अंकों में विस्तार से चर्चा की गई है, और इन विषयों में रुचि रखने वाले पाठक इन समस्याओं के मूल कारणों और संभावित समाधानों की जानकारी के लिए पिछले लेखों का संदर्भ ले सकते हैं। अधिक जानकारी।
पीक टेलिंग, पीक फ्रंटिंग और स्प्लिटिंग रासायनिक या भौतिक घटनाओं के कारण हो सकते हैं, और इन समस्याओं के संभावित समाधानों की सूची रासायनिक या भौतिक समस्या के आधार पर व्यापक रूप से भिन्न होती है। अक्सर, क्रोमैटोग्राम में विभिन्न पीक की तुलना करके, आप इस समस्या के मूल कारण का पता लगा सकते हैं। यदि क्रोमैटोग्राम में सभी पीक समान आकार प्रदर्शित करते हैं, तो कारण संभवतः भौतिक नहीं है। यदि केवल एक या कुछ पीक प्रभावित हैं, लेकिन बाकी ठीक दिखते हैं, तो कारण संभवतः रासायनिक है।
पीक टेलिंग के रासायनिक कारण इतने जटिल हैं कि यहाँ संक्षेप में चर्चा करना संभव नहीं है। अधिक गहन चर्चा के लिए इच्छुक पाठक "एलसी ट्रबलशूटिंग" के हालिया अंक को देख सकते हैं (10)। हालाँकि, एक आसान तरीका यह है कि इंजेक्ट किए गए एनालाइट की मात्रा को कम करके देखें कि क्या पीक का आकार सुधरता है। यदि ऐसा होता है, तो यह एक अच्छा संकेत है कि समस्या "मास ओवरलोड" है। इस स्थिति में, विधि को कम मात्रा में एनालाइट इंजेक्ट करने तक सीमित करना होगा, या क्रोमैटोग्राफिक स्थितियों को इस प्रकार बदलना होगा कि अधिक मात्रा में इंजेक्ट करने पर भी अच्छे पीक आकार प्राप्त किए जा सकें।
पीक टेलिंग के कई संभावित भौतिक कारण भी हैं। संभावनाओं की विस्तृत चर्चा में रुचि रखने वाले पाठक "एलसी ट्रबलशूटिंग" (11) के एक अन्य हालिया अंक को देख सकते हैं। पीक टेलिंग के अधिक सामान्य भौतिक कारणों में से एक इंजेक्टर और डिटेक्टर के बीच किसी बिंदु पर खराब कनेक्शन है (12)। इसका एक चरम उदाहरण चित्र 1डी में दिखाया गया है, जो कुछ सप्ताह पहले मेरी प्रयोगशाला में प्राप्त किया गया था। इस मामले में, हमने एक नए इंजेक्शन वाल्व के साथ एक सिस्टम बनाया जिसका हमने पहले कभी उपयोग नहीं किया था, और एक स्टेनलेस स्टील केशिका पर ढाले गए फेरूल के साथ एक छोटे वॉल्यूम इंजेक्शन लूप को स्थापित किया। कुछ प्रारंभिक समस्या निवारण प्रयोगों के बाद, हमने महसूस किया कि इंजेक्शन वाल्व स्टेटर में पोर्ट की गहराई हमारी अपेक्षा से कहीं अधिक थी, जिसके परिणामस्वरूप पोर्ट के निचले भाग में एक बड़ा डेड वॉल्यूम बन गया। इस समस्या को इंजेक्शन लूप को दूसरी ट्यूब से बदलकर आसानी से हल किया जा सकता है, हम पोर्ट के निचले भाग में डेड वॉल्यूम को समाप्त करने के लिए फेरूल को उचित स्थिति में समायोजित कर सकते हैं।
चित्र 1e में दिखाए गए पीक फ्रंट भौतिक या रासायनिक समस्याओं के कारण भी हो सकते हैं। अग्रणी किनारे का एक सामान्य भौतिक कारण यह है कि कॉलम का कण बिस्तर अच्छी तरह से पैक नहीं है, या समय के साथ कणों का पुनर्गठन हो गया है। इस भौतिक घटना के कारण होने वाले पीक टेलिंग की तरह, इसे ठीक करने का सबसे अच्छा तरीका कॉलम को बदलना और काम जारी रखना है। मूल रूप से, रासायनिक उत्पत्ति वाले अग्रणी किनारे के पीक आकार अक्सर उन स्थितियों से उत्पन्न होते हैं जिन्हें हम "गैर-रैखिक" प्रतिधारण स्थितियां कहते हैं। आदर्श (रैखिक) स्थितियों के तहत, स्थिर चरण द्वारा बनाए गए विश्लेषक की मात्रा (इसलिए, प्रतिधारण कारक) कॉलम में विश्लेषक की सांद्रता से रैखिक रूप से संबंधित होती है। क्रोमैटोग्राफिक रूप से, इसका मतलब है कि जैसे-जैसे कॉलम में इंजेक्ट किए गए विश्लेषक का द्रव्यमान बढ़ता है, पीक लंबा होता जाता है, लेकिन चौड़ा नहीं होता। यह संबंध तब टूट जाता है जब प्रतिधारण व्यवहार गैर-रैखिक होता है, और अधिक द्रव्यमान इंजेक्ट करने पर पीक न केवल लंबे होते जाते हैं बल्कि चौड़े भी होते जाते हैं। इसके अलावा, गैर-रैखिक आकार क्रोमैटोग्राफिक पीक के आकार को निर्धारित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अग्रणी या अनुगामी किनारे बनते हैं। द्रव्यमान अधिभार के साथ जो पीक टेलिंग (10) का कारण बनता है, गैर-रेखीय प्रतिधारण के कारण पीक लीडिंग का निदान इंजेक्ट किए गए विश्लेषक द्रव्यमान को कम करके भी किया जा सकता है। यदि पीक आकार में सुधार होता है, तो विधि को इस तरह से संशोधित किया जाना चाहिए कि इंजेक्शन की गुणवत्ता लीडिंग एज का कारण बनने वाली मात्रा से अधिक न हो, या इस व्यवहार को कम करने के लिए क्रोमैटोग्राफिक स्थितियों को बदला जाना चाहिए।
कभी-कभी हमें एक "विभाजित" शिखर दिखाई देता है, जैसा कि चित्र 1f में दिखाया गया है। इस समस्या को हल करने का पहला चरण यह निर्धारित करना है कि क्या शिखर का आकार आंशिक सह-इल्यूशन (अर्थात, दो अलग-अलग लेकिन निकटवर्ती रूप से इल्यूट होने वाले यौगिकों की उपस्थिति) के कारण है। यदि वास्तव में दो अलग-अलग विश्लेषक एक साथ निकटवर्ती रूप से इल्यूट हो रहे हैं, तो यह उनके रिज़ॉल्यूशन को बेहतर बनाने का मामला है (उदाहरण के लिए, चयनात्मकता, प्रतिधारण या प्लेट काउंट बढ़ाकर), और स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले "विभाजित" शिखर भौतिक कारणों से संबंधित हैं। प्रदर्शन का कॉलम से कोई लेना-देना नहीं है। अक्सर, इस निर्णय का सबसे महत्वपूर्ण सुराग यह है कि क्या क्रोमैटोग्राम में सभी शिखर विभाजित आकार प्रदर्शित करते हैं, या केवल एक या दो। यदि यह केवल एक या दो हैं, तो यह संभवतः सह-इल्यूशन की समस्या है; यदि सभी शिखर विभाजित हैं, तो यह संभवतः एक भौतिक समस्या है, जो संभवतः कॉलम से ही संबंधित है।
कॉलम के भौतिक गुणों से संबंधित विभाजित शिखर आमतौर पर आंशिक रूप से अवरुद्ध इनलेट या आउटलेट फ्रिट्स, या कॉलम में कणों के पुनर्गठन के कारण होते हैं, जिससे मोबाइल चरण कॉलम चैनल निर्माण के कुछ क्षेत्रों में मोबाइल चरण की तुलना में अन्य क्षेत्रों में अधिक तेज़ी से प्रवाहित होता है (11)। आंशिक रूप से अवरुद्ध फ्रिट को कभी-कभी कॉलम के माध्यम से प्रवाह को उलट कर साफ किया जा सकता है; हालाँकि, मेरे अनुभव में, यह आमतौर पर एक अल्पकालिक समाधान होता है, दीर्घकालिक नहीं। आधुनिक कॉलमों के साथ यह अक्सर घातक होता है यदि कण कॉलम के भीतर पुनर्संयोजित हो जाते हैं। इस बिंदु पर, कॉलम को बदलना और प्रक्रिया जारी रखना सबसे अच्छा है।
चित्र 1g में दिखाई देने वाला शिखर, जो मेरे अपने प्रयोगशाला में हाल ही में किए गए एक प्रयोग से लिया गया है, आमतौर पर यह दर्शाता है कि सिग्नल इतना अधिक है कि यह प्रतिक्रिया सीमा के उच्च छोर तक पहुँच गया है। ऑप्टिकल अवशोषण डिटेक्टरों (इस मामले में UV-vis) के लिए, जब विश्लेष्य की सांद्रता बहुत अधिक होती है, तो विश्लेष्य डिटेक्टर प्रवाह सेल से गुजरने वाले अधिकांश प्रकाश को अवशोषित कर लेता है, जिससे पता लगाने के लिए बहुत कम प्रकाश बचता है। इन परिस्थितियों में, फोटोडिटेक्टर से प्राप्त विद्युत सिग्नल विभिन्न शोर स्रोतों, जैसे कि आवारा प्रकाश और "अंधेरे करंट" से अत्यधिक प्रभावित होता है, जिससे सिग्नल बहुत "धुंधला" दिखाई देता है और विश्लेष्य की सांद्रता से स्वतंत्र हो जाता है। ऐसा होने पर, विश्लेष्य की इंजेक्शन मात्रा को कम करके, नमूने को पतला करके, या दोनों तरीकों से इस समस्या को अक्सर आसानी से हल किया जा सकता है।
क्रोमैटोग्राफी के पाठ्यक्रम में, हम डिटेक्टर सिग्नल (अर्थात क्रोमैटोग्राम में y-अक्ष) का उपयोग नमूने में विश्लेष्य की सांद्रता के सूचक के रूप में करते हैं। इसलिए शून्य से नीचे सिग्नल वाला क्रोमैटोग्राम देखना अजीब लगता है, क्योंकि इसका सरल अर्थ यह है कि यह ऋणात्मक विश्लेष्य सांद्रता को दर्शाता है – जो कि भौतिक रूप से संभव नहीं है। मेरे अनुभव में, ऋणात्मक शिखर अक्सर ऑप्टिकल अवशोषण डिटेक्टरों (जैसे, यूवी-विज़) का उपयोग करते समय देखे जाते हैं।
इस मामले में, एक नकारात्मक शिखर का सीधा सा मतलब है कि स्तंभ से निकलने वाले अणु शिखर से ठीक पहले और बाद में मोबाइल चरण की तुलना में कम प्रकाश अवशोषित करते हैं। ऐसा तब हो सकता है, उदाहरण के लिए, जब अपेक्षाकृत कम पहचान तरंग दैर्ध्य (<230 एनएम) और मोबाइल चरण योजकों का उपयोग किया जाता है जो इन तरंग दैर्ध्य पर अधिकांश प्रकाश को अवशोषित करते हैं। ऐसे योजक मोबाइल चरण विलायक घटक जैसे मेथनॉल या बफर घटक जैसे एसीटेट या फॉर्मेट हो सकते हैं। वास्तव में, अंशांकन वक्र तैयार करने और सटीक मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए नकारात्मक शिखरों का उपयोग किया जा सकता है, इसलिए उन्हें पूरी तरह से टालने का कोई मूलभूत कारण नहीं है (इस विधि को कभी-कभी "अप्रत्यक्ष यूवी पहचान" कहा जाता है) (13)। हालांकि, यदि हम अवशोषण पहचान के मामले में नकारात्मक शिखरों से पूरी तरह बचना चाहते हैं, तो सबसे अच्छा समाधान एक अलग पहचान तरंग दैर्ध्य का उपयोग करना है ताकि विश्लेष्य मोबाइल चरण की तुलना में अधिक प्रकाश अवशोषित करे, या मोबाइल चरण की संरचना को इस प्रकार बदलना है कि वे विश्लेष्यों की तुलना में कम प्रकाश अवशोषित करें।
अपवर्तनांक (आरआई) विधि का उपयोग करते समय भी नकारात्मक शिखर दिखाई दे सकते हैं, जब नमूने में विश्लेष्य पदार्थ के अलावा अन्य घटकों, जैसे कि विलायक मैट्रिक्स, का अपवर्तनांक गतिशील चरण के अपवर्तनांक से भिन्न होता है। यूवी-विज़ डिटेक्शन में भी ऐसा ही होता है, लेकिन आरआई डिटेक्शन की तुलना में यह प्रभाव कम होता है। दोनों ही मामलों में, नमूना मैट्रिक्स की संरचना को गतिशील चरण की संरचना से अधिक निकटता से मिलाकर नकारात्मक शिखरों को कम किया जा सकता है।
एलसी समस्या निवारण के मूल विषय पर तीसरे भाग में, मैंने उन स्थितियों पर चर्चा की थी जिनमें प्रेक्षित शिखर आकृति अपेक्षित या सामान्य शिखर आकृति से भिन्न होती है। ऐसी समस्याओं का प्रभावी निवारण अपेक्षित शिखर आकृतियों के ज्ञान (सिद्धांत या मौजूदा विधियों के पूर्व अनुभव के आधार पर) से शुरू होता है, ताकि इन अपेक्षाओं से विचलन स्पष्ट हो सकें। शिखर आकृति संबंधी समस्याओं के कई संभावित कारण हो सकते हैं (बहुत चौड़ा, पूंछनुमा, अग्रणी किनारा, आदि)। इस भाग में, मैं उन कुछ कारणों पर विस्तार से चर्चा करूँगा जो मुझे अक्सर दिखाई देते हैं। इन विवरणों को जानने से समस्या निवारण शुरू करने में मदद मिलती है, लेकिन इससे सभी संभावनाएँ स्पष्ट नहीं होतीं। कारणों और समाधानों की अधिक विस्तृत सूची में रुचि रखने वाले पाठक एलसीजीसी के "एलसी समस्या निवारण गाइड" वॉल चार्ट को देख सकते हैं।
(4) एलसीजीसी “एलसी समस्या निवारण गाइड” वॉल चार्ट.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) ए. फेलिंगर, डेटा विश्लेषण और क्रोमैटोग्राफी में सिग्नल प्रोसेसिंग (एल्सवियर, न्यूयॉर्क, एनवाई, 1998), पृ. 43-96.
(8) वहाब एमएफ, दासगुप्ता पीके, कडजो एएफ और आर्मस्ट्रांग डीडब्ल्यू, एनाल.चिम.जर्नल.रेव. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.