برخی از مباحث عیب‌یابی LC هرگز قدیمی نمی‌شوند، زیرا حتی با وجود پیشرفت فناوری ابزار دقیق در طول زمان، مشکلاتی در عملکرد LC وجود دارد. راه‌های زیادی وجود دارد که مشکلات می‌توانند در یک سیستم LC ایجاد شوند و در نهایت به شکل پیک ضعیف منجر شوند. هنگامی که مسائلی مربوط به شکل پیک ایجاد می‌شود، فهرست کوتاهی از علل احتمالی این نتایج به ساده‌سازی تجربه عیب‌یابی ما کمک می‌کند.
نوشتن این ستون «عیب‌یابی کروماتوگرافی» و فکر کردن به موضوعات هر ماه لذت‌بخش بوده است، زیرا برخی از موضوعات هرگز از مد نمی‌افتند. در حالی که در زمینه تحقیقات کروماتوگرافی، موضوعات یا ایده‌های خاصی منسوخ می‌شوند زیرا با ایده‌های جدیدتر و بهتر جایگزین می‌شوند، در زمینه عیب‌یابی، از زمان انتشار اولین مقاله عیب‌یابی در این مجله (مجله LC در آن زمان) (از آنجایی که برخی از موضوعات هنوز مرتبط هستند) در سال 1983 (1). در طول چند سال گذشته، چندین بخش عیب‌یابی کروماتوگرافی مایع را بر روندهای معاصر مؤثر بر کروماتوگرافی مایع (LC) متمرکز کرده‌ام (به عنوان مثال، مقایسه نسبی درک ما از تأثیر فشار بر احتباس [2] پیشرفت‌های جدید)، تفسیر ما از نتایج LC و نحوه عیب‌یابی با دستگاه‌های مدرن LC. در بخش این ماه، مجموعه مقالات (3) را که از دسامبر 2021 آغاز شده بود، ادامه می‌دهم که بر برخی از مباحث «مرگ و زندگی» عیب‌یابی کروماتوگرافی مایع متمرکز بود - عناصری که برای هر عیب‌یابی عالی هستند، صرف نظر از سن سیستمی که استفاده می‌کنیم، ضروری هستند. موضوع اصلی این مجموعه بسیار مرتبط با ... نمودار دیواری معروف «راهنمای عیب‌یابی LC» شرکت LCGC (4) که در بسیاری از آزمایشگاه‌ها آویزان است. برای بخش سوم این مجموعه، تصمیم گرفتم بر روی مسائل مربوط به شکل پیک یا ویژگی‌های پیک تمرکز کنم. به طرز باورنکردنی، نمودار دیواری 44 علت بالقوه مختلف برای شکل پیک ضعیف را فهرست می‌کند! ما نمی‌توانیم همه این مسائل را به طور مفصل در یک مقاله بررسی کنیم، بنابراین در این بخش اول در مورد این موضوع، بر روی برخی از مواردی که بیشتر اوقات می‌بینم تمرکز خواهم کرد. امیدوارم کاربران جوان و پیر LC نکات و یادآوری‌های مفیدی در مورد این موضوع مهم پیدا کنند.
من متوجه می‌شوم که به طور فزاینده‌ای به سوالات عیب‌یابی با عبارت «هر چیزی ممکن است» پاسخ می‌دهم. این پاسخ ممکن است هنگام بررسی مشاهداتی که تفسیر آنها دشوار است، آسان به نظر برسد، اما من اغلب آن را مناسب می‌دانم. با توجه به علل احتمالی زیاد برای شکل نامناسب قله، مهم است که هنگام بررسی مشکل، ذهن خود را باز نگه داریم و بتوانیم علل بالقوه را برای شروع تلاش‌های عیب‌یابی خود اولویت‌بندی کنیم و روی رایج‌ترین احتمالات تمرکز کنیم. این نکته بسیار مهم است.
یک گام کلیدی در هر تمرین عیب‌یابی - اما گامی که به نظر من دست کم گرفته شده است - تشخیص این است که مشکلی وجود دارد که باید حل شود. تشخیص وجود مشکل اغلب به معنای تشخیص این است که آنچه برای ابزار اتفاق می‌افتد با انتظارات ما که توسط تئوری، دانش تجربی و تجربه شکل می‌گیرند، متفاوت است (5). «شکل پیک» که در اینجا به آن اشاره شده است، در واقع نه تنها به شکل پیک (متقارن، نامتقارن، صاف، کرکی، لبه جلویی، دنباله و غیره) اشاره دارد، بلکه به عرض آن نیز اشاره دارد. انتظارات ما برای شکل واقعی پیک ساده است. نظریه (6) به خوبی از انتظار کتاب درسی پشتیبانی می‌کند که در بیشتر موارد، پیک‌های کروماتوگرافی باید متقارن باشند و با شکل توزیع گاوسی مطابقت داشته باشند، همانطور که در شکل 1a نشان داده شده است. آنچه از پهنای پیک‌ها انتظار داریم، مسئله پیچیده‌تری است و ما در مقاله بعدی در مورد این موضوع بحث خواهیم کرد. شکل‌های دیگر پیک در شکل 1 برخی از احتمالات دیگری را که می‌توان مشاهده کرد نشان می‌دهد - به عبارت دیگر، برخی از راه‌هایی که ممکن است کارها اشتباه پیش بروند. در ادامه این بخش، ما زمانی را صرف بحث در مورد برخی از مثال‌های خاص از موقعیت‌هایی خواهیم کرد که می‌توانند منجر به این نوع شکل‌ها می‌شود.
گاهی اوقات پیک‌ها اصلاً در کروماتوگرام مشاهده نمی‌شوند، جایی که انتظار می‌رود شسته شوند. نمودار دیواری بالا نشان می‌دهد که عدم وجود پیک (با فرض اینکه نمونه واقعاً حاوی آنالیت هدف در غلظتی باشد که باید پاسخ آشکارساز را برای دیدن آن بالاتر از نویز کافی کند) معمولاً مربوط به برخی مشکلات دستگاه یا شرایط نادرست فاز متحرک است (در صورت مشاهده). پیک‌ها، معمولاً بسیار "ضعیف" هستند. لیست کوتاهی از مشکلات و راه‌حل‌های بالقوه در این دسته را می‌توانید در جدول 1 بیابید.
همانطور که در بالا ذکر شد، این سوال که قبل از توجه و تلاش برای رفع آن، چه میزان پهن شدن پیک باید تحمل شود، موضوع پیچیده‌ای است که در مقاله‌ای در آینده به آن خواهم پرداخت. تجربه من این است که پهن شدن قابل توجه پیک اغلب با تغییر قابل توجه در شکل پیک همراه است و دنباله‌دار شدن پیک شایع‌تر از پیش از پیک یا شکافتن آن است. با این حال، پیک‌های اسمی متقارن نیز پهن می‌شوند که می‌تواند به دلایل مختلفی ایجاد شود:
هر یک از این مسائل به تفصیل در شماره‌های قبلی عیب‌یابی LC مورد بحث قرار گرفته است و خوانندگان علاقه‌مند به این مباحث می‌توانند برای کسب اطلاعات در مورد علل ریشه‌ای و راه‌حل‌های بالقوه برای این مسائل به این مقالات قبلی مراجعه کنند. جزئیات بیشتر.
دنباله‌دار شدن پیک‌ها، جلو بودن پیک‌ها و شکافتگی، همگی می‌توانند ناشی از پدیده‌های شیمیایی یا فیزیکی باشند و فهرست راه‌حل‌های بالقوه برای این مشکلات، بسته به اینکه با یک مشکل شیمیایی یا فیزیکی سروکار داریم، بسیار متفاوت است. اغلب، با مقایسه پیک‌های مختلف در یک کروماتوگرام، می‌توانید سرنخ‌های مهمی در مورد اینکه کدام یک مقصر است، پیدا کنید. اگر همه پیک‌ها در یک کروماتوگرام شکل‌های مشابهی نشان دهند، علت به احتمال زیاد فیزیکی نیست. اگر فقط یک یا چند پیک تحت تأثیر قرار گرفته باشند، اما بقیه خوب به نظر برسند، علت به احتمال زیاد شیمیایی است.
علل شیمیایی دنباله‌دار شدن پیک‌ها بسیار پیچیده‌تر از آن است که بتوان در اینجا به طور خلاصه در مورد آنها بحث کرد. خواننده علاقه‌مند برای بحث عمیق‌تر به شماره اخیر «عیب‌یابی LC» (10) ارجاع داده می‌شود. با این حال، یک راه آسان برای امتحان کردن، کاهش جرم آنالیت تزریق شده و بررسی بهبود شکل پیک است. اگر چنین است، این سرنخ خوبی است که مشکل «اضافه‌بار جرم» است. در این حالت، روش باید به تزریق توده‌های کوچک آنالیت محدود شود، یا شرایط کروماتوگرافی باید تغییر کند تا حتی با تزریق توده‌های بزرگتر، شکل‌های پیک خوبی حاصل شود.
همچنین دلایل فیزیکی بالقوه زیادی برای پیک تالی وجود دارد. خوانندگانی که علاقه‌مند به بحث مفصل در مورد احتمالات هستند، به شماره اخیر دیگری از «عیب‌یابی LC» (11) ارجاع داده می‌شوند. یکی از شایع‌ترین علل فیزیکی پیک تالی، اتصال ضعیف در نقطه‌ای بین انژکتور و آشکارساز است (12). یک مثال بارز در شکل 1d که چند هفته پیش در آزمایشگاه من به دست آمده است، نشان داده شده است. در این مورد، ما سیستمی با یک شیر تزریق جدید که قبلاً از آن استفاده نکرده بودیم، ساختیم و یک حلقه تزریق با حجم کم با یک فرول که روی یک لوله مویین از جنس استیل ضد زنگ قالب‌گیری شده بود، نصب کردیم. پس از انجام برخی آزمایش‌های اولیه عیب‌یابی، متوجه شدیم که عمق دهانه در استاتور شیر تزریق بسیار عمیق‌تر از آن چیزی است که به آن عادت داشتیم و منجر به حجم مرده زیادی در پایین دهانه می‌شود. این مشکل به راحتی با تعویض حلقه تزریق با یک لوله دیگر حل می‌شود، می‌توانیم فرول را در موقعیت مناسب تنظیم کنیم تا حجم مرده در پایین دهانه از بین برود.
جبهه‌های پیک مانند آنچه در شکل 1e نشان داده شده است، می‌توانند ناشی از مشکلات فیزیکی یا شیمیایی نیز باشند. یک علت فیزیکی رایج برای لبه جلویی این است که بستر ذرات ستون به خوبی فشرده نشده باشد، یا اینکه ذرات با گذشت زمان سازماندهی مجدد شده باشند. مانند دنباله پیک ناشی از این پدیده فیزیکی، بهترین راه برای رفع این مشکل، تعویض ستون و ادامه کار است. اساساً، شکل‌های پیک لبه جلویی با منشأ شیمیایی اغلب از چیزی ناشی می‌شوند که ما آن را شرایط نگهداری "غیرخطی" می‌نامیم. در شرایط ایده‌آل (خطی)، مقدار آنالیت نگهداری شده توسط فاز ثابت (از این رو، ضریب نگهداری) به صورت خطی با غلظت آنالیت در ستون مرتبط است. از نظر کروماتوگرافی، این بدان معناست که با افزایش جرم آنالیت تزریق شده به ستون، پیک بلندتر می‌شود، اما پهن‌تر نمی‌شود. این رابطه زمانی که رفتار نگهداری غیرخطی باشد، شکسته می‌شود و پیک‌ها نه تنها بلندتر می‌شوند، بلکه با تزریق جرم بیشتر، پهن‌تر نیز می‌شوند. علاوه بر این، اشکال غیرخطی، شکل پیک‌های کروماتوگرافی را تعیین می‌کنند و منجر به لبه‌های جلویی یا پشتی می‌شوند. مانند اضافه بار جرمی که باعث دنباله‌دار شدن پیک می‌شود (10)، و پیشروی پیک ناشی از احتباس غیرخطی نیز می‌توانند با کاهش جرم آنالیت تزریق شده تشخیص داده شوند. اگر شکل پیک بهبود یابد، روش باید اصلاح شود تا از کیفیت تزریق که باعث لبه پیشرو می‌شود، تجاوز نکند، یا شرایط کروماتوگرافی باید تغییر کند تا این رفتار به حداقل برسد.
گاهی اوقات، همانطور که در شکل 1f نشان داده شده است، چیزی را مشاهده می‌کنیم که به نظر می‌رسد یک پیک «شکافته» است. اولین قدم در حل این مشکل، تعیین این است که آیا شکل پیک به دلیل هم‌شویشی جزئی (یعنی وجود دو ترکیب متمایز اما نزدیک به هم) است یا خیر. اگر در واقع دو آنالیت مختلف نزدیک به هم در حال شستشو هستند، مسئله بهبود وضوح آنها (به عنوان مثال، با افزایش گزینش‌پذیری، بازداری یا تعداد پلیت) مطرح می‌شود و پیک‌های «شکافته» ظاهری مربوط به مسائل فیزیکی هستند. عملکرد هیچ ارتباطی با خود ستون ندارد. اغلب، مهمترین سرنخ برای این تصمیم این است که آیا همه پیک‌های موجود در کروماتوگرام شکل‌های شکافته نشان می‌دهند یا فقط یک یا دو تا. اگر فقط یک یا دو تا باشد، احتمالاً مشکل هم‌شویشی است. اگر همه پیک‌ها شکافته باشند، احتمالاً یک مسئله فیزیکی است که به احتمال زیاد مربوط به خود ستون است.
پیک‌های شکافته مربوط به خواص فیزیکی خود ستون معمولاً به دلیل مسدود شدن نسبی ورودی یا خروجی فریت‌ها یا سازماندهی مجدد ذرات در ستون است که به فاز متحرک اجازه می‌دهد در نواحی خاصی از تشکیل کانال ستون، سریع‌تر از فاز متحرک جریان یابد. در سایر نواحی (11). فریت‌های تا حدی مسدود شده را گاهی اوقات می‌توان با معکوس کردن جریان در ستون برطرف کرد. با این حال، طبق تجربه من، این معمولاً یک راه حل کوتاه مدت است نه بلند مدت. این اغلب در ستون‌های مدرن کشنده است اگر ذرات در داخل ستون دوباره ترکیب شوند. در این مرحله، بهتر است ستون را تعویض کرده و ادامه دهید.
پیک موجود در شکل 1g، که آن هم از یک نمونه اخیر در آزمایشگاه خودم است، معمولاً نشان می‌دهد که سیگنال آنقدر بالاست که به انتهای بالای محدوده پاسخ رسیده است. برای آشکارسازهای جذب نوری (در این مورد UV-vis)، هنگامی که غلظت آنالیت بسیار بالا باشد، آنالیت بیشتر نور عبوری از سلول جریان آشکارساز را جذب می‌کند و نور بسیار کمی برای شناسایی باقی می‌گذارد. در این شرایط، سیگنال الکتریکی از آشکارساز نوری به شدت تحت تأثیر منابع مختلف نویز، مانند نور سرگردان و "جریان تاریک" قرار می‌گیرد و باعث می‌شود سیگنال از نظر ظاهری بسیار "فازی" و مستقل از غلظت آنالیت باشد. وقتی این اتفاق می‌افتد، اغلب می‌توان با کاهش حجم تزریق آنالیت - کاهش حجم تزریق، رقیق کردن نمونه یا هر دو - به راحتی مشکل را حل کرد.
در مدرسه کروماتوگرافی، ما از سیگنال آشکارساز (یعنی محور y در کروماتوگرام) به عنوان شاخصی از غلظت آنالیت در نمونه استفاده می‌کنیم. بنابراین دیدن کروماتوگرامی با سیگنال زیر صفر عجیب به نظر می‌رسد، زیرا تفسیر ساده این است که این نشان دهنده غلظت منفی آنالیت است - که البته از نظر فیزیکی امکان‌پذیر نیست. طبق تجربه من، پیک‌های منفی اغلب هنگام استفاده از آشکارسازهای جذب نوری (مثلاً UV-vis) مشاهده می‌شوند.
در این حالت، یک پیک منفی به این معنی است که مولکول‌های خارج شده از ستون، نور کمتری نسبت به خود فاز متحرک، بلافاصله قبل و بعد از پیک، جذب می‌کنند. این اتفاق می‌تواند رخ دهد، به عنوان مثال، هنگام استفاده از طول موج‌های آشکارسازی نسبتاً پایین (<230 نانومتر) و افزودنی‌های فاز متحرک که بیشتر نور را در این طول موج‌ها جذب می‌کنند. چنین افزودنی‌هایی می‌توانند اجزای حلال فاز متحرک مانند متانول یا اجزای بافر مانند استات یا فرمات باشند. در واقع می‌توان از پیک‌های منفی برای تهیه منحنی کالیبراسیون و به دست آوردن اطلاعات کمی دقیق استفاده کرد، بنابراین هیچ دلیل اساسی برای اجتناب از آنها به خودی خود وجود ندارد (این روش گاهی اوقات به عنوان "تشخیص غیرمستقیم UV" نامیده می‌شود) (13). با این حال، اگر واقعاً می‌خواهیم از پیک‌های منفی به طور کلی اجتناب کنیم، در مورد تشخیص جذب، بهترین راه حل استفاده از طول موج آشکارسازی متفاوت است به طوری که آنالیت بیشتر از فاز متحرک جذب کند، یا ترکیب فاز متحرک را تغییر دهیم تا نور کمتری نسبت به آنالیت‌ها جذب کنند.
پیک‌های منفی همچنین می‌توانند هنگام استفاده از تشخیص ضریب شکست (RI) ظاهر شوند، زمانی که ضریب شکست اجزایی غیر از آنالیت در نمونه، مانند ماتریس حلال، با ضریب شکست فاز متحرک متفاوت باشد. این اتفاق در تشخیص UV-vis نیز رخ می‌دهد، اما این اثر نسبت به تشخیص RI تمایل به کاهش دارد. در هر دو مورد، پیک‌های منفی را می‌توان با تطبیق بیشتر ترکیب ماتریس نمونه با ترکیب فاز متحرک به حداقل رساند.
در بخش سوم، در مورد موضوع اساسی عیب‌یابی LC، موقعیت‌هایی را مورد بحث قرار دادم که در آن‌ها شکل پیک مشاهده‌شده با شکل پیک مورد انتظار یا عادی متفاوت است. عیب‌یابی مؤثر چنین مشکلاتی با آگاهی از شکل‌های پیک مورد انتظار (بر اساس تئوری یا تجربه قبلی با روش‌های موجود) آغاز می‌شود، بنابراین انحراف از این انتظارات آشکار است. مشکلات شکل پیک علل بالقوه مختلفی دارند (بیش از حد پهن، دنباله‌دار، لبه حمله و غیره). در این بخش، برخی از دلایلی را که اغلب می‌بینم، به تفصیل مورد بحث قرار می‌دهم. دانستن این جزئیات، نقطه خوبی برای شروع عیب‌یابی فراهم می‌کند، اما همه احتمالات را در بر نمی‌گیرد. خوانندگانی که علاقه‌مند به فهرست عمیق‌تری از علل و راه‌حل‌ها هستند، می‌توانند به نمودار دیواری «راهنمای عیب‌یابی LC» LCGC مراجعه کنند.
(4) نمودار دیواری «راهنمای عیب‌یابی LC» LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) ای. فلینگر، تحلیل داده‌ها و پردازش سیگنال در کروماتوگرافی (الزویر، نیویورک، نیویورک، 1998)، صفحات 43-96.
(8) وهاب ام. اف.، داسگوپتا پی. کی.، کاجو ای. اف. و آرمسترانگ دی. دبلیو.، مجله آنال.چیم. نسخه 907، 31-44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.