Baadhi ya mada za utatuzi wa matatizo ya LC huwa hazipitwi na wakati, kwani kuna matatizo katika utendaji wa LC, hata kama teknolojia ya vifaa inaboresha baada ya muda. Kuna njia nyingi ambazo matatizo yanaweza kutokea katika mfumo wa LC na kuishia katika hali mbaya ya kilele. Wakati masuala yanayohusiana na umbo la kilele yanapotokea, orodha fupi ya sababu zinazowezekana za matokeo haya husaidia kurahisisha uzoefu wetu wa utatuzi wa matatizo.
Imekuwa furaha kuandika safu hii ya "LC Troubleshooting" na kufikiria kuhusu mada kila mwezi, kwa sababu baadhi ya mada huwa hazipitwi na mtindo. Wakati nikiwa katika uwanja wa chromatografia, tafiti kuhusu mada au mawazo fulani huwa ya kizamani kwani yanabadilishwa na mawazo mapya na bora zaidi, katika uwanja wa troubleshooting, tangu makala ya kwanza ya troubleshooting ilipoonekana katika jarida hili (Jarida la LC wakati huo) kwani baadhi ya mada bado zinafaa) mwaka wa 1983(1). Katika miaka michache iliyopita, nimezingatia sehemu kadhaa za LC Troubleshooting kuhusu mitindo ya kisasa inayoathiri chromatografia ya kioevu (LC) (kwa mfano, kulinganisha kwa uelewa wetu wa athari za shinikizo kwenye uhifadhi [2] Maendeleo Mapya) Tafsiri yetu ya matokeo ya LC na jinsi ya kutatua matatizo kwa kutumia vifaa vya kisasa vya LC. Katika awamu ya mwezi huu, ninaendelea na mfululizo wangu (3), ambao ulianza Desemba 2021, ambao ulilenga baadhi ya mada za "maisha na kifo" za LC troubleshooting - vipengele ambavyo ni vizuri kwa mtatuzi yeyote ni muhimu, bila kujali umri wa mfumo tunaotumia. Mada kuu ya mfululizo huu inafaa sana kwa LCGC maarufu. Chati ya ukutani ya "Mwongozo wa Utatuzi wa Matatizo ya LC" (4) inayoning'inia katika maabara nyingi. Kwa sehemu ya tatu ya mfululizo huu, nilichagua kuzingatia masuala yanayohusiana na umbo la kilele au sifa za kilele. Cha kushangaza, chati ya ukutani inaorodhesha sababu 44 tofauti zinazoweza kusababisha umbo duni la kilele! Hatuwezi kuzingatia masuala haya yote kwa undani katika makala moja, kwa hivyo katika sehemu hii ya kwanza kuhusu mada hii, nitazingatia baadhi ya yale ninayoyaona mara nyingi. Natumai watumiaji wa LC wachanga na wazee watapata vidokezo na vikumbusho muhimu kuhusu mada hii muhimu.
Ninajikuta nikijibu maswali ya utatuzi kwa kuongeza "chochote kinawezekana". Jibu hili linaweza kuonekana rahisi ninapozingatia uchunguzi ambao ni vigumu kuutafsiri, lakini mara nyingi naona linafaa. Kwa sababu nyingi zinazowezekana za umbo duni la kilele, ni muhimu kuwa na akili wazi wakati wa kuzingatia tatizo, na kuweza kuweka kipaumbele sababu zinazowezekana ili kuanza juhudi zetu za utatuzi, tukizingatia uwezekano huo wa kawaida, jambo hili ni muhimu sana. Inawezekana.
Hatua muhimu katika zoezi lolote la utatuzi wa matatizo — lakini ambalo nadhani halijapewa kipaumbele — ni kutambua kwamba kuna tatizo linalohitaji kutatuliwa. Kutambua kwamba kuna tatizo mara nyingi kunamaanisha kutambua kwamba kinachotokea kwa kifaa ni tofauti na matarajio yetu, ambayo yameundwa na nadharia, maarifa ya majaribio, na uzoefu (5). "Umbo la kilele" linalorejelewa hapa kwa kweli halirejelei tu umbo la kilele (ulinganifu, usio na ulinganifu, laini, laini, ukingo wa mbele, mkia, n.k.), lakini pia kwa upana. Matarajio yetu kwa umbo halisi la kilele ni rahisi. Nadharia (6) inaunga mkono vyema matarajio ya kitabu cha kiada kwamba, katika hali nyingi, vilele vya kromatografia vinapaswa kuwa vya ulinganifu na kuendana na umbo la usambazaji wa Gaussian, kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 1a. Tunachotarajia kutoka kwa upana wa kilele ni suala gumu zaidi, na tutajadili mada hii katika makala ijayo. Maumbo mengine ya kilele katika Mchoro 1 yanaonyesha baadhi ya uwezekano mwingine ambao unaweza kuzingatiwa—kwa maneno mengine, baadhi ya njia ambazo mambo yanaweza kwenda vibaya. Katika sehemu iliyobaki ya awamu hii, tutatumia muda kujadili mifano maalum ya hali ambazo inaweza kusababisha aina hizi za maumbo.
Wakati mwingine vilele havionekani kabisa kwenye kromatogramu ambapo vinatarajiwa kutoonekana. Chati ya ukuta hapo juu inaonyesha kwamba kutokuwepo kwa kilele (ikiwa sampuli ina mchambuzi lengwa katika mkusanyiko ambao unapaswa kufanya mwitikio wa kigunduzi utoshe kuiona juu ya kelele) kwa kawaida huhusiana na tatizo fulani la kifaa au hali isiyo sahihi ya awamu ya simu (ikiwa imeonekana kabisa). vilele, kwa kawaida ni "dhaifu sana"). Orodha fupi ya matatizo na suluhisho zinazowezekana katika kategoria hii zinaweza kupatikana katika Jedwali I.
Kama ilivyotajwa hapo juu, swali la ni kiasi gani cha upanuzi wa kilele kinapaswa kuvumiliwa kabla ya kuzingatia na kujaribu kurekebisha ni mada tata ambayo nitaijadili katika makala ijayo. Uzoefu wangu ni kwamba upanuzi mkubwa wa kilele mara nyingi huambatana na mabadiliko makubwa katika umbo la kilele, na mkia wa kilele ni wa kawaida zaidi kuliko kabla ya kilele au mgawanyiko. Hata hivyo, vilele vilivyo na ulinganifu pia hupanuliwa, ambayo inaweza kusababishwa na sababu chache tofauti:
Kila moja ya masuala haya yamejadiliwa kwa undani katika matoleo ya awali ya Utatuzi wa Matatizo ya LC, na wasomaji wanaopenda mada hizi wanaweza kurejelea makala hizi zilizopita kwa taarifa kuhusu sababu kuu na suluhisho zinazowezekana za masuala haya. Maelezo zaidi.
Kupasuka kwa kilele, kutangulia kilele, na kugawanyika vyote vinaweza kusababishwa na matukio ya kemikali au ya kimwili, na orodha ya suluhisho zinazowezekana kwa matatizo haya hutofautiana sana, kulingana na kama tunashughulika na tatizo la kemikali au la kimwili. Mara nyingi, kwa kulinganisha vilele tofauti katika kromatogramu, unaweza kupata vidokezo muhimu kuhusu ni nani aliyesababisha. Ikiwa vilele vyote katika kromatogramu vinaonyesha maumbo sawa, chanzo kina uwezekano mkubwa si cha kimwili. Ikiwa kilele kimoja au vichache tu vimeathiriwa, lakini vingine vinaonekana sawa, chanzo kina uwezekano mkubwa ni kemikali.
Sababu za kikemikali za kilele cha mkia ni ngumu sana kujadili kwa ufupi hapa. Msomaji anayevutiwa anaelekezwa kwenye toleo la hivi karibuni la "LC Troubleshooting" kwa majadiliano ya kina zaidi (10). Hata hivyo, jambo rahisi kujaribu ni kupunguza uzito wa mchambuzi aliyedungwa na kuona kama umbo la kilele linaboresha. Ikiwa ndivyo, basi hii ni ishara nzuri kwamba tatizo ni "mzigo mwingi". Katika hali hii, mbinu lazima iwe mdogo kwa kuingiza massa madogo ya mchambuzi, au hali ya kromatografia lazima ibadilishwe ili maumbo mazuri ya kilele yaweze kupatikana hata kwa massa makubwa yaliyodungwa.
Pia kuna sababu nyingi za kimwili zinazowezekana za kukwama kwa kasi. Wasomaji wanaopenda majadiliano ya kina kuhusu uwezekano huo wanarejelewa kwenye toleo jingine la hivi karibuni la "LC Troubleshooting" (11). Mojawapo ya sababu za kawaida za kukwama kwa kasi ni muunganisho duni katika sehemu kati ya sindano na kigunduzi (12). Mfano uliokithiri unaonyeshwa kwenye Mchoro 1d, uliopatikana katika maabara yangu wiki chache zilizopita. Katika hali hii, tulijenga mfumo wenye vali mpya ya sindano ambayo hatukuwa tumetumia hapo awali, na tukaweka kitanzi kidogo cha sindano chenye feri ambacho kilikuwa kimeumbwa kwenye kapilari ya chuma cha pua. Baada ya majaribio ya awali ya utatuzi wa matatizo, tuligundua kuwa kina cha lango katika stata ya vali ya sindano kilikuwa kirefu zaidi kuliko tulivyokuwa tumezoea, na kusababisha ujazo mkubwa uliokufa chini ya lango. Tatizo hili linatatuliwa kwa urahisi kwa kubadilisha kitanzi cha sindano na mrija mwingine, tunaweza kurekebisha feri kwenye nafasi inayofaa ili kuondoa ujazo uliokufa chini ya lango.
Vipande vya mbele kama vile vilivyoonyeshwa kwenye Mchoro 1e vinaweza pia kusababishwa na matatizo ya kimwili au kemikali. Sababu ya kawaida ya kimwili ya ukingo wa mbele ni kwamba kitanda cha chembe cha safu hakijafungamana vizuri, au kwamba chembe zimejipanga upya baada ya muda. Kama ilivyo kwa mkia wa kilele unaosababishwa na jambo hili la kimwili, njia bora ya kurekebisha hili ni kubadilisha safu na kuendelea. Kimsingi, maumbo ya kilele cha ukingo wa mbele yenye asili ya kemikali mara nyingi hutokana na kile tunachokiita hali ya uhifadhi "isiyo ya mstari". Chini ya hali bora (ya mstari), kiasi cha uchanganuzi kinachohifadhiwa na awamu isiyosimama (kwa hivyo, kipengele cha uhifadhi) kinahusiana kwa mstari na mkusanyiko wa uchanganuzi kwenye safu. Kikromatografi, hii ina maana kwamba kadri uzito wa uchanganuzi unaoingizwa kwenye safu unavyoongezeka, kilele huwa kirefu, lakini si kipana. Uhusiano huu huvunjika wakati tabia ya uhifadhi si ya mstari, na vilele si tu vinakuwa virefu bali pia vipana kadri uzito zaidi unavyoingizwa. Kwa kuongezea, maumbo yasiyo ya mstari huamua umbo la vilele vya kromatografi, na kusababisha kingo zinazoongoza au zinazofuata. Kama ilivyo kwa mzigo mkubwa unaosababisha mkia wa kilele (10), kilele Uongozi unaosababishwa na uhifadhi usio wa mstari unaweza pia kugunduliwa kwa kupunguza uzito wa uchanganuzi uliodungwa. Ikiwa umbo la kilele litaboresha, mbinu lazima ibadilishwe ili isizidi ubora wa sindano unaosababisha ukingo wa mbele, au hali za kromatografia lazima zibadilishwe ili kupunguza tabia hii.
Wakati mwingine tunaona kile kinachoonekana kama kilele cha "mgawanyiko", kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 1f. Hatua ya kwanza katika kutatua tatizo hili ni kubaini kama umbo la kilele linatokana na utengano wa sehemu (yaani, uwepo wa misombo miwili tofauti lakini inayotenganisha kwa karibu). Ikiwa kwa kweli kuna wachambuzi wawili tofauti wanaotenganisha kwa karibu, basi ni suala la kuboresha uthabiti wao (kwa mfano, kwa kuongeza uteuzi, uhifadhi, au idadi ya sahani), na vilele vinavyoonekana vya "mgawanyiko" vinahusiana na kimwili. Utendaji hauna uhusiano wowote na safu yenyewe. Mara nyingi, kidokezo muhimu zaidi kwa uamuzi huu ni kama vilele vyote kwenye kromatogramu vinaonyesha maumbo yaliyogawanyika, au moja au mbili tu. Ikiwa ni moja au mbili tu, labda ni suala la utengano; ikiwa vilele vyote vimegawanyika, labda ni suala la kimwili, ambalo linawezekana linahusiana na safu yenyewe.
Vilele vilivyogawanyika vinavyohusiana na sifa za kimwili za safu yenyewe kwa kawaida husababishwa na vijiti vya kuingiza au kutoa vilivyoziba kwa sehemu, au upangaji upya wa chembe kwenye safu, na kuruhusu awamu ya kuhama kutiririka kwa kasi zaidi kuliko awamu ya kuhama katika maeneo fulani ya uundaji wa njia ya safu. Katika maeneo mengine (11). Vijiti vilivyoziba kwa kiasi fulani wakati mwingine vinaweza kusafishwa kwa kugeuza mtiririko kupitia safu; hata hivyo, kwa uzoefu wangu, hii kwa kawaida ni suluhisho la muda mfupi badala ya muda mrefu. Hii mara nyingi huwa mbaya kwa safu za kisasa ikiwa chembe zitaungana tena ndani ya safu. Katika hatua hii, ni bora kubadilisha safu na kuendelea.
Kilele katika Mchoro 1g, pia kutoka kwa mfano wa hivi karibuni katika maabara yangu mwenyewe, kwa kawaida huonyesha kwamba ishara ni ya juu sana kiasi kwamba imefikia kiwango cha juu cha mwitikio. Kwa vigunduzi vya unyonyaji wa macho (mtazamo wa UV katika kesi hii), wakati mkusanyiko wa uchanganuzi ukiwa juu sana, uchanganuzi hunyonya mwanga mwingi unaopita kwenye seli ya mtiririko wa kigunduzi, na kuacha mwanga mdogo sana kugunduliwa. Chini ya hali hizi, ishara ya umeme kutoka kwa kigunduzi cha foto huathiriwa sana na vyanzo mbalimbali vya kelele, kama vile mwanga uliopotea na "mkondo mweusi", na kufanya ishara kuwa "isiyo na mwonekano" sana na isiyotegemea mkusanyiko wa uchanganuzi. Wakati hii inatokea, tatizo mara nyingi linaweza kutatuliwa kwa urahisi kwa kupunguza kiasi cha sindano ya uchanganuzi—kupunguza kiasi cha sindano, kupunguza sampuli, au vyote viwili.
Katika shule ya kromatografia, tunatumia ishara ya kigunduzi (yaani, mhimili wa y kwenye kromatografia) kama kiashiria cha mkusanyiko wa uchanganuzi katika sampuli. Kwa hivyo inaonekana kuwa ya ajabu kuona kromatografia yenye ishara chini ya sifuri, kwani tafsiri rahisi ni kwamba hii inaonyesha mkusanyiko hasi wa uchanganuzi - ambayo bila shaka haiwezekani kimwili. Katika uzoefu wangu, vilele hasi mara nyingi huzingatiwa wakati wa kutumia vigunduzi vya unyonyaji wa macho (km, mwonekano wa UV).
Katika hali hii, kilele hasi kinamaanisha tu kwamba molekuli zinazotoka kwenye safu hunyonya mwanga mdogo kuliko awamu inayotembea yenyewe mara moja kabla na baada ya kilele. Hii inaweza kutokea, kwa mfano, wakati wa kutumia mawimbi ya chini ya kugundua (<230 nm) na viongezeo vya awamu inayotembea ambavyo hunyonya mwanga mwingi kwenye mawimbi haya. Viongezeo hivyo vinaweza kuwa vipengele vya kutengenezea awamu inayotembea kama vile methanoli au vipengele vya bafa kama vile asetati au formate. Mtu anaweza kutumia vilele hasi kuandaa mkunjo wa urekebishaji na kupata taarifa sahihi za kiasi, kwa hivyo hakuna sababu ya msingi ya kuziepuka (njia hii wakati mwingine hujulikana kama "ugunduzi usio wa moja kwa moja wa UV") (13). Hata hivyo, ikiwa tunataka kuepuka vilele hasi kabisa, katika hali ya ugunduzi wa unyonyaji, suluhisho bora ni kutumia mawimbi tofauti ya kugundua ili mchambuzi anyonye zaidi ya awamu inayotembea, au kubadilisha muundo wa awamu inayotembea ili Wanyonye mwanga mdogo kuliko wachambuzi.
Vilele hasi vinaweza pia kuonekana wakati wa kutumia ugunduzi wa faharasa ya kuakisi (RI) wakati faharasa ya kuakisi ya vipengele vingine isipokuwa mchambuzi katika sampuli, kama vile matrix ya kiyeyusho, ni tofauti na faharasa ya kuakisi ya awamu inayotembea. Hii pia hutokea kwa ugunduzi wa msuko wa UV, lakini athari hii huelekea kupunguzwa ikilinganishwa na ugunduzi wa RI. Katika visa vyote viwili, vilele hasi vinaweza kupunguzwa kwa kulinganisha kwa karibu zaidi muundo wa matrix ya sampuli na ule wa awamu inayotembea.
Katika sehemu ya tatu kuhusu mada ya msingi ya utatuzi wa matatizo ya LC, nilijadili hali ambazo umbo la kilele linaloonekana hutofautiana na umbo la kilele linalotarajiwa au la kawaida. Utatuzi mzuri wa matatizo kama hayo huanza na ujuzi wa maumbo ya kilele yanayotarajiwa (kulingana na nadharia au uzoefu wa awali na mbinu zilizopo), kwa hivyo kupotoka kutoka kwa matarajio haya ni dhahiri. Matatizo ya umbo la kilele yana sababu nyingi tofauti zinazowezekana (pana sana, mkia, makali ya kuongoza, n.k.). Katika awamu hii, ninajadili kwa undani baadhi ya sababu ninazoziona mara nyingi. Kujua maelezo haya hutoa mahali pazuri pa kuanza utatuzi wa matatizo, lakini hakuonyeshi uwezekano wote. Wasomaji wanaovutiwa na orodha ya kina zaidi ya sababu na suluhisho wanaweza kurejelea chati ya ukutani ya "Mwongozo wa Utatuzi wa Matatizo ya LC" ya LCGC.
(4) Chati ya ukutani ya "Mwongozo wa Utatuzi wa Matatizo ya LC" ya LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Uchambuzi wa Data na Usindikaji wa Ishara katika Kromatografia (Elsevier, New York, NY, 1998), uk. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF na Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.