Sommige onderwerpen voor het oplossen van LC-problemen blijven actueel, omdat er problemen blijven bestaan ​​in de LC-praktijk, zelfs als de instrumenttechnologie in de loop van de tijd verbetert. Er zijn veel manieren waarop problemen kunnen ontstaan ​​in een LC-systeem en kunnen resulteren in een slechte piekvorm. Wanneer er problemen ontstaan ​​met betrekking tot de piekvorm, helpt een korte lijst met mogelijke oorzaken voor deze resultaten onze ervaring met het oplossen van problemen te vereenvoudigen.
Het was leuk om deze column "LC Troubleshooting" te schrijven en elke maand over onderwerpen na te denken, omdat sommige onderwerpen nooit uit de mode raken. Hoewel op het gebied van chromatografisch onderzoek bepaalde onderwerpen of ideeën achterhaald raken, omdat ze worden vervangen door nieuwere en betere ideeën, op het gebied van troubleshooting, sinds het eerste artikel over troubleshooting in dit tijdschrift verscheen (destijds het LC Journal) (aangezien sommige onderwerpen nog steeds relevant zijn) in 1983 (1). De afgelopen jaren heb ik verschillende secties over LC Troubleshooting gewijd aan hedendaagse trends die van invloed zijn op vloeistofchromatografie (LC) (bijvoorbeeld de relatieve vergelijking van ons begrip van het effect van druk op retentie [2] Nieuwe ontwikkelingen) Onze interpretatie van LC-resultaten en hoe u problemen kunt oplossen met moderne LC-instrumenten. In de aflevering van deze maand vervolg ik mijn serie (3), die begon in december 2021, die zich richtte op enkele van de "levensbelangrijke" onderwerpen van LC-probleemoplossing - elementen die geweldig zijn voor elke probleemoplosser zijn essentieel, ongeacht de leeftijd van het systeem dat we gebruiken. Het kernthema van deze serie is zeer relevant voor De beroemde wandkaart "LC Troubleshooting Guide" (4) van de LCGC hangt in veel laboratoria. Voor het derde deel van deze serie heb ik ervoor gekozen om me te richten op problemen met betrekking tot de piekvorm of piekkarakteristieken. Ongelooflijk genoeg vermeldt de wandkaart 44 verschillende mogelijke oorzaken van een slechte piekvorm! We kunnen niet al deze problemen in detail in één artikel behandelen, dus in deze eerste aflevering over dit onderwerp zal ik me concentreren op enkele van de problemen die ik het vaakst zie. Ik hoop dat jonge en oude LC-gebruikers wat nuttige tips en herinneringen zullen vinden over dit belangrijke onderwerp.
Ik merk dat ik steeds vaker op vragen over probleemoplossing antwoord met "alles is mogelijk". Dit antwoord lijkt misschien eenvoudig bij observaties die moeilijk te interpreteren zijn, maar ik vind het vaak terecht. Omdat er zoveel mogelijke oorzaken zijn voor een slechte piekvorm, is het belangrijk om open te staan ​​voor nieuwe ideeën over wat het probleem zou kunnen zijn. Ook is het belangrijk om potentiële oorzaken te prioriteren voordat we beginnen met onze probleemoplossing. We moeten ons richten op de meest voorkomende mogelijkheden. Dit is een zeer belangrijk punt.
Een belangrijke stap in elke probleemoplossingsoefening – maar een die ik denk dat wordt onderschat – is erkennen dat er een probleem is dat moet worden opgelost. Erkennen dat er een probleem is, betekent vaak erkennen dat wat er met het gereedschap gebeurt, anders is dan onze verwachtingen, die worden gevormd door theorie, empirische kennis en ervaring (5). De "piekvorm" waarnaar hier wordt verwezen, verwijst in feite niet alleen naar de vorm van de piek (symmetrisch, asymmetrisch, glad, pluizig, voorrand, staartvormig, enz.), maar ook naar de breedte. Onze verwachtingen voor de werkelijke piekvorm zijn eenvoudig. Theorie (6) ondersteunt de leerboekverwachting dat de chromatografische pieken in de meeste gevallen symmetrisch moeten zijn en de vorm van een Gaussische verdeling moeten volgen, zoals weergegeven in figuur 1a. Wat we verwachten van piekbreedtes is een complexere kwestie, en we zullen dit onderwerp in een toekomstig artikel bespreken. De andere piekvormen in figuur 1 tonen enkele van de andere mogelijkheden die kunnen worden waargenomen – met andere woorden, enkele van de manieren waarop dingen mis kunnen gaan. In de rest van deze aflevering, We zullen tijd besteden aan het bespreken van een aantal specifieke voorbeelden van situaties die tot deze vormtypen kunnen leiden.
Soms worden pieken in het chromatogram helemaal niet waargenomen, terwijl ze zouden moeten worden geëlueerd. Bovenstaande grafiek geeft aan dat de afwezigheid van een piek (ervan uitgaande dat het monster daadwerkelijk de doelanalyt bevat in een concentratie die de detectorrespons voldoende zou moeten maken om deze boven de ruis te zien) meestal te maken heeft met een probleem met het instrument of met onjuiste omstandigheden voor de mobiele fase (als er überhaupt pieken worden waargenomen). Een korte lijst met mogelijke problemen en oplossingen in deze categorie is te vinden in Tabel I.
Zoals hierboven vermeld, is de vraag hoeveel piekverbreding getolereerd moet worden voordat er aandacht aan wordt besteed en geprobeerd wordt dit te verhelpen, een complex onderwerp dat ik in een toekomstig artikel zal bespreken. Mijn ervaring is dat aanzienlijke piekverbreding vaak gepaard gaat met een aanzienlijke verandering in de piekvorm, en piekstaartvorming komt vaker voor dan pre-piek of splitsing. De nominaal symmetrische pieken worden echter ook verbreed, wat om een ​​paar verschillende redenen kan worden veroorzaakt:
Elk van deze problemen is uitgebreid besproken in eerdere nummers van Troubleshooting LC. Lezers die geïnteresseerd zijn in deze onderwerpen kunnen deze eerdere artikelen raadplegen voor informatie over de grondoorzaken en mogelijke oplossingen voor deze problemen. Meer details.
Peak tailing, peak fronting en splitting kunnen allemaal worden veroorzaakt door chemische of fysische verschijnselen. De lijst met mogelijke oplossingen voor deze problemen loopt sterk uiteen, afhankelijk van of het om een ​​chemisch of fysisch probleem gaat. Vaak kunt u door de verschillende pieken in een chromatogram te vergelijken belangrijke aanwijzingen vinden over welke de boosdoener is. Als alle pieken in een chromatogram dezelfde vorm hebben, is de oorzaak waarschijnlijk niet fysiek. Als slechts één of enkele pieken zijn aangetast, maar de rest er goed uitziet, is de oorzaak waarschijnlijk chemisch.
De chemische oorzaken van piekstaartvorming zijn te complex om hier kort te bespreken. De geïnteresseerde lezer wordt verwezen naar de recente uitgave van "LC Troubleshooting" voor een meer diepgaande bespreking (10). Het is echter eenvoudig om de massa van de geïnjecteerde analyt te verminderen en te kijken of de piekvorm verbetert. Als dat zo is, dan is dit een goede aanwijzing dat het probleem "massa-overbelasting" is. In dit geval moet de methode worden beperkt tot het injecteren van kleine analytmassa's, of moeten de chromatografische omstandigheden worden gewijzigd zodat goede piekvormen kunnen worden verkregen, zelfs met grotere geïnjecteerde massa's.
Er zijn ook veel potentiële fysieke redenen voor piekstaartvorming. Lezers die geïnteresseerd zijn in een gedetailleerde bespreking van de mogelijkheden, worden verwezen naar een andere recente uitgave van "LC Troubleshooting" (11). Een van de meest voorkomende fysieke oorzaken van piekstaartvorming is een slechte verbinding op een punt tussen de injector en de detector (12). Een extreem voorbeeld wordt getoond in Figuur 1d, een paar weken geleden verkregen in mijn lab. In dit geval hebben we een systeem gebouwd met een nieuwe injectieklep die we nog niet eerder hadden gebruikt, en een injectielus met een klein volume geïnstalleerd met een ferrule die op een roestvrijstalen capillair was gegoten. Na enkele eerste experimenten met probleemoplossing realiseerden we ons dat de poortdiepte in de stator van de injectieklep veel dieper was dan we gewend waren, wat resulteerde in een groot dood volume aan de onderkant van de poort. Dit probleem kan eenvoudig worden opgelost door de injectielus te vervangen door een andere buis, we kunnen de ferrule op de juiste positie afstellen om het dode volume aan de onderkant van de poort te elimineren.
Piekfronten zoals weergegeven in figuur 1e kunnen ook worden veroorzaakt door fysieke of chemische problemen. Een veelvoorkomende fysieke oorzaak van de voorrand is dat het deeltjesbed van de kolom niet goed is gepakt, of dat de deeltjes zich in de loop van de tijd hebben gereorganiseerd. Net als bij piekstaartvorming, veroorzaakt door dit fysieke fenomeen, is de beste manier om dit te verhelpen de kolom te vervangen en door te gaan. Fundamenteel ontstaan ​​voorrandpiekvormen met chemische oorsprong vaak onder wat we "niet-lineaire" retentieomstandigheden noemen. Onder ideale (lineaire) omstandigheden is de hoeveelheid analyt die door de stationaire fase wordt vastgehouden (dus de retentiefactor) lineair gerelateerd aan de concentratie van de analyt in de kolom. Chromatografisch betekent dit dat naarmate de massa van de analyt die in de kolom wordt geïnjecteerd toeneemt, de piek hoger wordt, maar niet breder. Deze relatie wordt verbroken wanneer het retentiegedrag niet-lineair is, en de pieken niet alleen hoger maar ook breder worden naarmate er meer massa wordt geïnjecteerd. Bovendien bepalen niet-lineaire vormen de vorm van chromatografische pieken, wat resulteert in voor- of achterranden. Net als bij massa overbelasting die piekstaartvorming veroorzaakt (10), piekvoorloop veroorzaakt door niet-lineaire retentie kan ook worden gediagnosticeerd door de geïnjecteerde analytmassa te verminderen. Als de piekvorm verbetert, moet de methode worden aangepast om de injectiekwaliteit die de voorlooprand veroorzaakt niet te overschrijden, of moeten de chromatografische omstandigheden worden gewijzigd om dit gedrag te minimaliseren.
Soms zien we wat lijkt op een "gespleten" piek, zoals weergegeven in figuur 1f. De eerste stap bij het oplossen van dit probleem is bepalen of de piekvorm het gevolg is van gedeeltelijke co-elutie (d.w.z. de aanwezigheid van twee verschillende, maar dicht bij elkaar eluerende verbindingen). Als er in werkelijkheid twee verschillende analyten dicht bij elkaar elueren, is het een kwestie van het verbeteren van hun resolutie (bijvoorbeeld door de selectiviteit, retentie of plaattelling te verhogen), en de ogenschijnlijk "gespleten" pieken zijn gerelateerd aan fysieke prestaties. Prestaties hebben niets te maken met de kolom zelf. Vaak is de belangrijkste aanwijzing voor deze beslissing of alle pieken in het chromatogram een ​​gespleten vorm vertonen, of slechts één of twee. Als het er slechts één of twee zijn, is er waarschijnlijk sprake van co-elutie; als alle pieken gesplitst zijn, is het waarschijnlijk een fysiek probleem, hoogstwaarschijnlijk gerelateerd aan de kolom zelf.
Gespleten pieken die verband houden met de fysieke eigenschappen van de kolom zelf, worden meestal veroorzaakt door gedeeltelijk geblokkeerde inlaat- of uitlaatfrit, of door een reorganisatie van deeltjes in de kolom, waardoor de mobiele fase in bepaalde gebieden van de kolomkanaalformatie sneller stroomt dan de mobiele fase zelf (11). Gedeeltelijk verstopte frit kan soms worden verwijderd door de stroming door de kolom om te keren; in mijn ervaring is dit echter meestal een oplossing voor de korte termijn in plaats van een oplossing voor de lange termijn. Dit is vaak fataal bij moderne kolommen als de deeltjes zich binnen de kolom opnieuw combineren. Op dit punt is het het beste om de kolom te vervangen en verder te gaan.
De piek in figuur 1g, eveneens afkomstig uit een recent voorbeeld in mijn eigen lab, geeft meestal aan dat het signaal zo hoog is dat het de bovengrens van het responsbereik heeft bereikt. Bij optische absorptiedetectoren (in dit geval UV-vis) absorbeert de analyt, wanneer de analytconcentratie zeer hoog is, het grootste deel van het licht dat door de detectorstroomcel gaat, waardoor er zeer weinig licht overblijft om te detecteren. Onder deze omstandigheden wordt het elektrische signaal van de fotodetector sterk beïnvloed door verschillende ruisbronnen, zoals strooilicht en "donkerstroom", waardoor het signaal er erg "vaag" uitziet en onafhankelijk is van de analytconcentratie. Wanneer dit gebeurt, kan het probleem vaak eenvoudig worden opgelost door het injectievolume van de analyt te verkleinen – door het injectievolume te verkleinen, het monster te verdunnen, of beide.
Op de chromatografieschool gebruiken we het detectorsignaal (d.w.z. de y-as in het chromatogram) als indicator voor de analytconcentratie in het monster. Het lijkt dus vreemd om een ​​chromatogram te zien met een signaal onder nul, omdat de eenvoudige interpretatie is dat dit een negatieve analytconcentratie aangeeft – wat natuurlijk fysiek niet mogelijk is. In mijn ervaring worden negatieve pieken het vaakst waargenomen bij het gebruik van optische absorptiedetectoren (bijvoorbeeld UV-vis).
In dit geval betekent een negatieve piek eenvoudigweg dat de moleculen die uit de kolom elueren minder licht absorberen dan de mobiele fase zelf, direct voor en na de piek. Dit kan bijvoorbeeld gebeuren bij gebruik van relatief lage detectiegolflengten (<230 nm) en mobiele fase-additieven die het meeste licht bij deze golflengten absorberen. Dergelijke additieven kunnen mobiele fase-oplosmiddelcomponenten zijn zoals methanol of buffercomponenten zoals acetaat of formiaat. Men kan negatieve pieken feitelijk gebruiken om een ​​kalibratiecurve voor te bereiden en nauwkeurige kwantitatieve informatie te verkrijgen, dus er is geen fundamentele reden om ze per se te vermijden (deze methode wordt soms "indirecte UV-detectie" genoemd) (13). Als we echter echt negatieve pieken helemaal willen vermijden, in het geval van absorptiedetectie, is de beste oplossing om een ​​andere detectiegolflengte te gebruiken, zodat de analyt meer absorbeert dan de mobiele fase, of de samenstelling van de mobiele fase te veranderen zodat Ze absorberen minder licht dan analyten.
Negatieve pieken kunnen ook ontstaan ​​bij gebruik van detectie van de brekingsindex (RI) als de brekingsindex van andere componenten dan de analyt in het monster, zoals de oplosmiddelmatrix, verschilt van de brekingsindex van de mobiele fase. Dit gebeurt ook bij UV-vis-detectie, maar dit effect is meestal minder sterk dan bij RI-detectie. In beide gevallen kunnen negatieve pieken worden geminimaliseerd door de samenstelling van de monstermatrix beter af te stemmen op die van de mobiele fase.
In deel drie over het basisonderwerp LC-probleemoplossing besprak ik situaties waarin de waargenomen piekvorm afwijkt van de verwachte of normale piekvorm. Effectieve probleemoplossing bij dergelijke problemen begint met kennis van de verwachte piekvormen (gebaseerd op theorie of eerdere ervaring met bestaande methoden), waardoor afwijkingen van deze verwachtingen duidelijk zijn. Problemen met piekvormen kunnen verschillende oorzaken hebben (te breed, tailing, leading edge, enz.). In deze aflevering bespreek ik gedetailleerd enkele van de redenen die ik het vaakst zie. Kennis van deze details biedt een goed startpunt voor probleemoplossing, maar omvat niet alle mogelijkheden. Lezers die geïnteresseerd zijn in een meer gedetailleerde lijst met oorzaken en oplossingen, kunnen de wandkaart "LC Troubleshooting Guide" van LCGC raadplegen.
(4) LCGC “LC Troubleshooting Guide” wandkaart. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data-analyse en signaalverwerking in chromatografie (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF en Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.