Sommige onderwerpen met betrekking tot het oplossen van problemen met LC-systemen raken nooit verouderd, omdat er zich in de praktijk altijd problemen voordoen, zelfs nu de instrumenttechnologie in de loop der tijd verbetert. Er zijn veel manieren waarop problemen in een LC-systeem kunnen ontstaan ​​en tot een slechte piekvorm kunnen leiden. Wanneer er problemen met de piekvorm optreden, helpt een korte lijst met mogelijke oorzaken voor deze resultaten bij het vereenvoudigen van de probleemoplossing.
Het was leuk om deze column "LC Troubleshooting" te schrijven en elke maand over onderwerpen na te denken, omdat sommige onderwerpen nooit uit de mode raken. Terwijl in het veld van chromatografieonderzoek bepaalde onderwerpen of ideeën verouderd raken doordat ze worden vervangen door nieuwere en betere ideeën, zijn sommige onderwerpen in het veld van probleemoplossing nog steeds relevant sinds het eerste artikel over probleemoplossing in dit tijdschrift (destijds het LC Journal) verscheen in 1983 (1). De afgelopen jaren heb ik verschillende secties van LC Troubleshooting gewijd aan hedendaagse trends die van invloed zijn op vloeistofchromatografie (LC) (bijvoorbeeld de relatieve vergelijking van ons begrip van het effect van druk op retentie [2] Nieuwe ontwikkelingen), onze interpretatie van LC-resultaten en hoe we problemen kunnen oplossen met moderne LC-instrumenten. In de aflevering van deze maand zet ik mijn serie (3) voort, die in december 2021 begon en zich richtte op enkele van de "levensbelangrijke" onderwerpen van LC-probleemoplossing — elementen die voor elke probleemoplosser van essentieel belang zijn, ongeacht de leeftijd van het systeem dat we gebruiken. Het kernthema van deze serie is zeer relevant voor de De beroemde wandkaart "LC Troubleshooting Guide" van LCGC (4) hangt in veel laboratoria. Voor het derde deel van deze serie heb ik ervoor gekozen om me te richten op problemen met betrekking tot piekvorm of piekkarakteristieken. Ongelooflijk, de wandkaart vermeldt 44 verschillende mogelijke oorzaken van een slechte piekvorm! We kunnen al deze problemen niet in detail in één artikel behandelen, dus in dit eerste deel over dit onderwerp zal ik me concentreren op enkele van de problemen die ik het vaakst tegenkom. Ik hoop dat zowel jonge als ervaren LC-gebruikers nuttige tips en herinneringen over dit belangrijke onderwerp zullen vinden.
Ik merk dat ik steeds vaker op vragen over probleemoplossing antwoord met "alles is mogelijk". Dit antwoord lijkt misschien makkelijk gezien de lastig te interpreteren waarnemingen, maar ik vind het vaak wel gepast. Met zoveel mogelijke oorzaken voor een slechte piekvorm is het belangrijk om open te staan ​​voor mogelijke oorzaken en om prioriteiten te stellen bij het oplossen van het probleem. Focus daarbij op de meest voorkomende mogelijkheden; dit punt is cruciaal.
Een cruciale stap in elke probleemoplossingsprocedure – maar een die naar mijn mening onderschat wordt – is erkennen dat er een probleem is dat opgelost moet worden. Erkennen dat er een probleem is, betekent vaak erkennen dat wat er met het instrument gebeurt, anders is dan onze verwachtingen, die gevormd worden door theorie, empirische kennis en ervaring (5). De hier bedoelde "piekvorm" verwijst niet alleen naar de vorm van de piek (symmetrisch, asymmetrisch, glad, pluizig, voorste rand, staart, enz.), maar ook naar de breedte. Onze verwachtingen voor de werkelijke piekvorm zijn eenvoudig. De theorie (6) ondersteunt de verwachting uit leerboeken dat de chromatografische pieken in de meeste gevallen symmetrisch zouden moeten zijn en de vorm van een Gaussische verdeling zouden moeten volgen, zoals weergegeven in Figuur 1a. Wat we verwachten van piekbreedtes is een complexere kwestie, en we zullen dit onderwerp in een toekomstig artikel bespreken. De andere piekvormen in Figuur 1 tonen enkele van de andere mogelijkheden die waargenomen zouden kunnen worden – met andere woorden, enkele van de manieren waarop dingen mis kunnen gaan. In de rest van dit deel zullen we Besteed tijd aan het bespreken van enkele specifieke voorbeelden van situaties die tot deze vormtypen kunnen leiden.
Soms worden er in het chromatogram helemaal geen pieken waargenomen, terwijl ze daar wel verwacht zouden moeten worden. De bovenstaande grafiek geeft aan dat de afwezigheid van een piek (ervan uitgaande dat het monster daadwerkelijk de doelanalyt bevat in een concentratie die de detectorrespons voldoende zou moeten maken om de piek boven de ruis te detecteren) meestal verband houdt met een probleem met het instrument of onjuiste omstandigheden van de mobiele fase (indien er al pieken worden waargenomen, meestal te "zwak"). Een korte lijst met mogelijke problemen en oplossingen in deze categorie is te vinden in Tabel I.
Zoals hierboven vermeld, is de vraag hoeveel piekverbreding acceptabel is voordat er aandacht aan besteed moet worden en er actie ondernomen moet worden, een complex onderwerp dat ik in een toekomstig artikel zal bespreken. Mijn ervaring is dat aanzienlijke piekverbreding vaak gepaard gaat met een significante verandering in de piekvorm, en dat piekstaartvorming vaker voorkomt dan pre-piekvorming of splitsing. Echter, ook de nominaal symmetrische pieken vertonen verbreding, wat verschillende oorzaken kan hebben:
Elk van deze problemen is uitgebreid besproken in eerdere edities van Troubleshooting LC. Lezers die geïnteresseerd zijn in deze onderwerpen kunnen deze eerdere artikelen raadplegen voor informatie over de oorzaken en mogelijke oplossingen voor deze problemen. Meer details.
Pieken met een staart, pieken met een voorkant en splitsing kunnen allemaal worden veroorzaakt door chemische of fysische verschijnselen, en de lijst met mogelijke oplossingen voor deze problemen varieert sterk, afhankelijk van of het om een ​​chemisch of fysisch probleem gaat. Vaak kun je door de verschillende pieken in een chromatogram te vergelijken belangrijke aanwijzingen vinden over de oorzaak. Als alle pieken in een chromatogram een ​​vergelijkbare vorm hebben, is de oorzaak hoogstwaarschijnlijk niet fysisch. Als slechts één of enkele pieken zijn aangetast, maar de rest er goed uitziet, is de oorzaak hoogstwaarschijnlijk chemisch.
De chemische oorzaken van piektailing zijn te complex om hier kort te bespreken. De geïnteresseerde lezer wordt verwezen naar het recente nummer van “LC Troubleshooting” voor een meer diepgaande bespreking (10). Een eenvoudige test is echter om de massa van de geïnjecteerde analyt te verlagen en te kijken of de piekvorm verbetert. Zo ja, dan is dit een goede aanwijzing dat het probleem “massa-overbelasting” is. In dit geval moet de methode beperkt worden tot het injecteren van kleine analytmassa's, of moeten de chromatografische omstandigheden worden aangepast zodat goede piekvormen kunnen worden verkregen, zelfs met grotere geïnjecteerde massa's.
Er zijn ook veel mogelijke fysieke oorzaken voor piektailing. Lezers die geïnteresseerd zijn in een gedetailleerde bespreking van de mogelijkheden worden verwezen naar een andere recente uitgave van “LC Troubleshooting” (11). Een van de meest voorkomende fysieke oorzaken van piektailing is een slechte verbinding op een punt tussen de injector en de detector (12). Een extreem voorbeeld hiervan is te zien in Figuur 1d, verkregen in mijn lab een paar weken geleden. In dit geval bouwden we een systeem met een nieuwe injectieklep die we nog niet eerder hadden gebruikt, en installeerden we een injectielus met een klein volume en een ferrule die op een roestvrijstalen capillair was gegoten. Na enkele eerste experimenten om het probleem op te lossen, realiseerden we ons dat de poortdiepte in de stator van de injectieklep veel groter was dan we gewend waren, wat resulteerde in een groot dood volume onderin de poort. Dit probleem is eenvoudig op te lossen door de injectielus te vervangen door een andere buis; we kunnen de ferrule dan in de juiste positie afstellen om het dode volume onderin de poort te elimineren.
Piekfronten zoals die in Figuur 1e worden getoond, kunnen ook worden veroorzaakt door fysische of chemische problemen. Een veelvoorkomende fysische oorzaak van de voorste rand is dat het deeltjesbed van de kolom niet goed is gepakt, of dat de deeltjes zich in de loop der tijd hebben herschikt. Net als bij piektailing die door dit fysische fenomeen wordt veroorzaakt, is de beste manier om dit op te lossen het vervangen van de kolom en verdergaan. Fundamenteel ontstaan ​​piekvormen met een voorste rand en een chemische oorsprong vaak door wat we "niet-lineaire" retentieomstandigheden noemen. Onder ideale (lineaire) omstandigheden is de hoeveelheid analyt die door de stationaire fase wordt vastgehouden (vandaar de retentiefactor) lineair gerelateerd aan de concentratie van de analyt in de kolom. Chromatografisch betekent dit dat naarmate de massa analyt die in de kolom wordt geïnjecteerd toeneemt, de piek hoger wordt, maar niet breder. Deze relatie wordt verbroken wanneer het retentiegedrag niet-lineair is, en de pieken worden niet alleen hoger, maar ook breder naarmate er meer massa wordt geïnjecteerd. Bovendien bepalen niet-lineaire vormen de vorm van chromatografische pieken, wat resulteert in voorste of achterste randen. Net als bij massa-overbelasting die piektailing (10), piekvoorsprong veroorzaakt door niet-lineaire retentie, kan ook worden vastgesteld door de geïnjecteerde analytmassa te verlagen. Als de piekvorm verbetert, moet de methode worden aangepast zodat de injectiekwaliteit die de voorsprong veroorzaakt niet wordt overschreden, of moeten de chromatografische omstandigheden worden gewijzigd om dit gedrag te minimaliseren.
Soms zien we wat lijkt op een "gesplitste" piek, zoals weergegeven in figuur 1f. De eerste stap bij het oplossen van dit probleem is vaststellen of de piekvorm te wijten is aan gedeeltelijke co-elutie (d.w.z. de aanwezigheid van twee verschillende, maar dicht bij elkaar eluerende verbindingen). Als er daadwerkelijk twee verschillende analyten dicht bij elkaar elueren, dan is het een kwestie van hun resolutie verbeteren (bijvoorbeeld door de selectiviteit, retentie of het aantal schotels te verhogen), en de ogenschijnlijk "gesplitste" pieken houden verband met fysieke problemen. De prestaties hebben niets te maken met de kolom zelf. Vaak is de belangrijkste aanwijzing voor deze conclusie of alle pieken in het chromatogram een ​​gesplitste vorm vertonen, of slechts één of twee. Als het er slechts één of twee zijn, is het waarschijnlijk een co-elutieprobleem; als alle pieken gesplitst zijn, is het waarschijnlijk een fysiek probleem, hoogstwaarschijnlijk gerelateerd aan de kolom zelf.
Gesplitste pieken die verband houden met de fysieke eigenschappen van de kolom zelf, zijn meestal het gevolg van gedeeltelijk verstopte inlaat- of uitlaatfritten, of van een herschikking van de deeltjes in de kolom, waardoor de mobiele fase in bepaalde delen van de kolom sneller stroomt dan in andere delen (11). Een gedeeltelijk verstopt frit kan soms worden gereinigd door de stroomrichting door de kolom om te keren; mijn ervaring is echter dat dit meestal een oplossing voor de korte termijn is en niet voor de lange termijn. Dit is vaak fataal bij moderne kolommen als de deeltjes zich opnieuw in de kolom combineren. In dat geval is het het beste om de kolom te vervangen en verder te gaan.
De piek in figuur 1g, eveneens afkomstig van een recent geval in mijn eigen laboratorium, geeft meestal aan dat het signaal zo hoog is dat het de bovengrens van het responsbereik heeft bereikt. Bij optische absorptiedetectoren (in dit geval UV-vis) absorbeert de analyt, wanneer de concentratie zeer hoog is, het grootste deel van het licht dat door de detectorstroomcel gaat, waardoor er weinig licht overblijft om te detecteren. Onder deze omstandigheden wordt het elektrische signaal van de fotodetector sterk beïnvloed door verschillende ruisbronnen, zoals strooilicht en "donkerstroom", waardoor het signaal er erg "wazig" uitziet en onafhankelijk is van de analytconcentratie. Wanneer dit gebeurt, kan het probleem vaak eenvoudig worden opgelost door het injectievolume van de analyt te verlagen – door het injectievolume te verkleinen, het monster te verdunnen, of beide.
Op de chromatografieschool gebruiken we het detectorsignaal (oftewel de y-as in het chromatogram) als indicator voor de analytconcentratie in het monster. Het lijkt daarom vreemd om een ​​chromatogram te zien met een signaal onder nul, aangezien de simpele interpretatie is dat dit een negatieve analytconcentratie aangeeft – wat natuurlijk fysiek onmogelijk is. In mijn ervaring worden negatieve pieken het vaakst waargenomen bij gebruik van optische absorptiedetectoren (bijvoorbeeld UV-vis).
In dit geval betekent een negatieve piek simpelweg dat de moleculen die uit de kolom elueren minder licht absorberen dan de mobiele fase zelf, vlak voor en na de piek. Dit kan bijvoorbeeld voorkomen bij gebruik van relatief lage detectiegolflengten (<230 nm) en additieven in de mobiele fase die het meeste licht bij deze golflengten absorberen. Dergelijke additieven kunnen oplosmiddelcomponenten van de mobiele fase zijn, zoals methanol, of buffercomponenten zoals acetaat of formiaat. Men kan negatieve pieken zelfs gebruiken om een ​​kalibratiecurve op te stellen en nauwkeurige kwantitatieve informatie te verkrijgen, dus er is geen fundamentele reden om ze per se te vermijden (deze methode wordt soms "indirecte UV-detectie" genoemd) (13). Als we echter echt helemaal geen negatieve pieken willen, is de beste oplossing bij absorptiedetectie het gebruik van een andere detectiegolflengte, zodat de analyt meer absorbeert dan de mobiele fase, of het wijzigen van de samenstelling van de mobiele fase, zodat deze minder licht absorbeert dan de analyten.
Negatieve pieken kunnen ook optreden bij gebruik van refractie-indexdetectie (RI-detectie) wanneer de refractie-index van andere componenten dan de te analyseren stof in het monster, zoals de oplosmiddelmatrix, verschilt van de refractie-index van de mobiele fase. Dit gebeurt ook bij UV-vis-detectie, maar dit effect is doorgaans minder uitgesproken dan bij RI-detectie. In beide gevallen kunnen negatieve pieken worden geminimaliseerd door de samenstelling van de monstermatrix beter af te stemmen op die van de mobiele fase.
In deel drie over het basisonderwerp van LC-probleemoplossing besprak ik situaties waarin de waargenomen piekvorm afwijkt van de verwachte of normale piekvorm. Effectieve probleemoplossing van dergelijke problemen begint met kennis van de verwachte piekvormen (gebaseerd op theorie of eerdere ervaring met bestaande methoden), zodat afwijkingen van deze verwachtingen duidelijk zijn. Problemen met de piekvorm kunnen veel verschillende oorzaken hebben (te breed, staartvorming, voorrand, enz.). In dit deel bespreek ik in detail enkele van de oorzaken die ik het vaakst zie. Kennis van deze details biedt een goed uitgangspunt voor probleemoplossing, maar dekt niet alle mogelijkheden. Lezers die geïnteresseerd zijn in een meer gedetailleerde lijst van oorzaken en oplossingen kunnen de LCGC-wandkaart "LC Troubleshooting Guide" raadplegen.
(4) LCGC “LC Troubleshooting Guide” wandkaart.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data-analyse en signaalverwerking in chromatografie (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF en Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.