機器技術が時間とともに向上しても、LC の実践には問題が存在するため、一部の LC トラブルシューティングのトピックは決して古くなりません。LC システムで問題が発生し、ピーク形状が悪くなる原因は数多くあります。ピーク形状に関連する問題が発生した場合、これらの結果の考えられる原因の短いリストがあると、トラブルシューティングが簡単になります。
この「LCトラブルシューティング」コラムを書き、毎月のトピックについて考えるのは楽しいことです。なぜなら、決して時代遅れにならないトピックがあるからです。クロマトグラフィー研究の分野では、特定のトピックやアイデアは、より新しく優れたアイデアに取って代わられるにつれて時代遅れになりますが、トラブルシューティングの分野では、最初のトラブルシューティング記事がこのジャーナル（当時のLCジャーナル）に1983年に掲載されて以来（一部のトピックは今でも関連性があるため）、1983年（1）に登場しました。過去数年間、私はいくつかのLCトラブルシューティングセクションで、液体クロマトグラフィー（LC）に影響を与える現代の傾向（例えば、圧力が保持に及ぼす影響についての理解の相対的な比較[2]新しい進歩）、LC結果の解釈、そして現代のLC機器のトラブルシューティング方法など）に焦点を当ててきました。今月の投稿では、2021年12月に開始したシリーズ（3）を継続します。このシリーズでは、LCトラブルシューティングの「生死に関わる」トピックのいくつかに焦点を当てました。これは、使用しているシステムの古さに関係なく、あらゆるトラブルシューターにとって役立つ要素が不可欠です。このシリーズの中核となるトピックは、多くの研究室に掛けられている LCGC の有名な「LC トラブルシューティング ガイド」壁掛けチャート (4)。このシリーズの第 3 部では、ピーク形状やピーク特性に関連する問題に焦点を当てることにしました。驚くべきことに、この壁掛けチャートには、ピーク形状が悪い場合の 44 種類の潜在的な原因がリストされています。1 つの記事でこれらすべての問題を詳細に検討することはできないため、このトピックの最初の回では、最も頻繁に目にする問題のいくつかに焦点を当てます。若い LC ユーザーから年配の LC ユーザーまで、この重要なトピックに関する役立つヒントや注意事項が見つかることを願っています。
トラブルシューティングの質問に対して、「何でも可能です」と答えることが増えていることに気づきました。解釈が難しい観察結果を考えるとき、この返答は簡単に思えるかもしれませんが、多くの場合適切だと感じています。ピーク形状が悪い原因は多数考えられるため、問題が何であるかを検討する際には先入観を持たず、最も一般的な可能性に焦点を当ててトラブルシューティングの取り組みを開始し、潜在的な原因に優先順位を付けられるようにすることが重要です。この点は非常に重要です。
トラブルシューティングの重要なステップは、解決すべき問題があることを認識することです。しかし、これは過小評価されていると思います。問題があることを認識するということは、多くの場合、ツールに発生する現象が、理論、経験的知識、そして経験によって形成される私たちの期待とは異なることを認識することを意味します (5)。ここで言及されている「ピーク形状」は、実際にはピークの形状（対称、非対称、滑らか、ふわふわ、リーディングエッジ、テーリングなど）だけでなく、ピークの幅も指します。実際のピーク形状に対する私たちの期待は単純です。理論 (6) は、ほとんどの場合、クロマトグラフィーピークは対称で、図 1a に示すようにガウス分布の形状に従うという教科書的な期待をよく裏付けています。ピーク幅から何を期待するかはより複雑な問題であり、このトピックについては今後の記事で説明します。図 1 の他のピーク形状は、観察される可能性のある他の可能性、つまり、物事がうまくいかない可能性のあるいくつかの方法を示しています。この回の残りの部分では、これらの形状タイプにつながる可能性のある状況の具体的な例をいくつか説明します。
ピークが、クロマトグラムで溶出すると予想される場所にまったく観察されないことがあります。上の図は、ピークが存在しない原因 (サンプルに実際にターゲット分析物が、検出器の応答でノイズを超えてピークが見えるほどの濃度で含まれていると仮定) は、通常、機器の問題または移動相の条件が正しくないこと (そもそもピークが観察される場合) に関連していることを示しています。このカテゴリで発生する可能性のある問題と解決策の短いリストは、表 I に記載されています。
前述のように、注意を払い、修正を試みる前に、どの程度のピークの広がりを許容すべきかという問題は複雑なトピックであり、今後の記事で取り上げる予定です。私の経験では、ピークの大幅な広がりは、多くの場合、ピーク形状の大幅な変化を伴い、ピークテーリングはプレピークや分裂よりも一般的です。ただし、名目上は対称的なピークも広がり、これはいくつかの異なる理由によって引き起こされる可能性があります。
これらの問題はそれぞれ、過去の「LCのトラブルシューティング」で詳しく取り上げられています。これらのトピックにご興味のある方は、これらの過去の記事を参照して、問題の根本原因と潜在的な解決策に関する情報を入手してください。詳細はこちらをご覧ください。
ピークのテーリング、ピークの先端化、および分裂はすべて化学的または物理的現象によって引き起こされる可能性があり、これらの問題に対する潜在的な解決策のリストは、化学的問題か物理的問題のどちらを扱っているかによって大きく異なります。多くの場合、クロマトグラム内の異なるピークを比較することにより、どれが原因であるかに関する重要な手がかりを見つけることができます。クロマトグラム内のすべてのピークが同様の形状を示す場合、原因は物理的なものではない可能性が高いです。1 つまたはいくつかのピークのみが影響を受けており、残りのピークは正常である場合、原因は化学的なものである可能性が高いです。
ピークテーリングの化学的原因は、ここで簡単に説明するにはあまりにも複雑です。興味のある読者は、より詳細な説明については、最新号の「LC トラブルシューティング」を参照してください (10)。ただし、簡単に試せるのは、注入する分析種の質量を減らして、ピーク形状が改善するかどうかを確認することです。改善された場合、問題は「質量オーバーロード」であることを示す良い手がかりになります。この場合は、少量の分析種の注入に限定するか、より大きな質量を注入しても良好なピーク形状が得られるようにクロマトグラフィー条件を変更する必要があります。
ピークテーリングには、潜在的な物理的な理由も数多くあります。可能性に関する詳細な議論にご興味のある方は、最近発行された「LC トラブルシューティング」(11) を参照してください。ピークテーリングのより一般的な物理的原因の 1 つは、インジェクタと検出器の間のポイントでの接続不良です (12)。極端な例を図 1d に示します。これは数週間前に私の研究室で得られたものです。このケースでは、これまで使用したことのない新しいインジェクションバルブを使用してシステムを構築し、ステンレス鋼のキャピラリーに成形されたフェルールを使用して、小容量のインジェクションループを取り付けました。いくつかの初期のトラブルシューティング実験の後、インジェクションバルブステータのポートの深さが従来のものよりもはるかに深く、ポートの底部で大きなデッドボリュームが発生していることが分かりました。この問題は、インジェクションループを別のチューブに交換し、フェルールを適切な位置に調整してポートの底部のデッドボリュームをなくすことで簡単に解決できます。
図1eに示すようなピークフロントは、物理的または化学的な問題によっても発生する可能性があります。リーディングエッジの一般的な物理的原因としては、カラムの粒子ベッドが十分に充填されていないか、粒子が時間の経過とともに再配置されたことが挙げられます。この物理的現象によって引き起こされるピークテーリングと同様に、これを修正する最良の方法は、カラムを交換して使い続けることです。基本的に、化学的原因によるリーディングエッジのピーク形状は、いわゆる「非線形」保持条件から生じることがよくあります。理想的な（線形）条件下では、固定相に保持される分析対象物質の量（したがって保持係数）は、カラム内の分析対象物質の濃度と線形に関係しています。クロマトグラフィー的には、これはカラムに注入される分析対象物質の質量が増加すると、ピークは高くなりますが、幅は広くならないことを意味します。保持挙動が非線形の場合、この関係は破れ、注入量が増えるとピークは高くなるだけでなく、幅も広くなります。さらに、非線形形状はクロマトグラフィーピークの形状を決定し、リーディングまたはピークテーリングを引き起こす質量オーバーロードと同様に（10）、非線形保持によって引き起こされるピークリーディングも、注入された分析物の質量を減らすことで診断できます。ピーク形状が改善した場合は、リーディングエッジを引き起こす注入品質を超えないようにメソッドを修正するか、この動作を最小限に抑えるようにクロマトグラフィー条件を変更する必要があります。
図 1f に示すように、ピークが「分裂」しているように見える場合があります。この問題を解決するための最初のステップは、ピークの形状が部分的な共溶出 (つまり、2 つの異なるが近くに溶出する化合物の存在) によるものかどうかを判断することです。実際に 2 つの異なる分析対象物が近くで溶出している場合は、それらの分解能を向上させること (たとえば、選択性、保持時間、または理論段数を増やす) が問題であり、見かけ上の「分裂」ピークは物理的な問題に関係しています。パフォーマンスは、カラム自体とは関係ありません。多くの場合、この決定を下すための最も重要な手がかりは、クロマトグラムのすべてのピークが分裂した形状を示しているか、それとも 1 つまたは 2 つだけであるかです。1 つまたは 2 つだけの場合は、おそらく共溶出の問題であり、すべてのピークが分裂している場合は、おそらく物理的な問題であり、カラム自体に関連していると考えられます。
カラム自体の物理的特性に関連するピークの分割は、通常、入口または出口のフリットが部分的に詰まっているか、カラム内の粒子が再編成されて、カラムチャネル形成の特定の領域で移動相が移動相よりも速く流れることが原因で発生します。他の領域では (11)。部分的に詰まったフリットは、カラムを通る流れを逆転させることで解消できる場合があります。ただし、私の経験では、これは通常、長期的な解決策ではなく、短期的な解決策です。粒子がカラム内で再結合すると、最新のカラムでは致命的になることがよくあります。この時点で、カラムを交換して続行するのが最善です。
図 1g のピークは、私の研究室で最近発生した例ですが、通常、信号が非常に高く、応答範囲の上限に達したことを示しています。吸光度検出器 (この場合は UV-vis) の場合、分析物の濃度が非常に高いと、分析物は検出器のフローセルを通過する光のほとんどを吸収し、検出される光はほとんど残りません。このような状況では、光検出器からの電気信号は、迷光や「暗電流」など、さまざまなノイズ源の影響を強く受け、信号が非常に「ぼやけて」見え、分析物の濃度とは無関係になります。このような場合は、分析物の注入量を減らす (注入量を減らす、サンプルを希釈する、またはその両方) ことで、問題を簡単に解決できることがよくあります。
クロマトグラフィーの授業では、検出器の信号（クロマトグラムのY軸）をサンプル内の分析対象物質の濃度の指標として使用します。そのため、信号がゼロ未満のクロマトグラムを見ると奇妙に感じられます。単純に解釈すると、これは負の分析対象物質の濃度を示していることになりますが、これはもちろん物理的に不可能です。私の経験では、負のピークは、光吸収検出器（UV-visなど）を使用した場合に最も頻繁に観察されます。
この場合、負のピークは単に、カラムから溶出する分子がピークの直前と直後の移動相自体よりも光吸収が少ないことを意味します。 これは、たとえば、比較的低い検出波長 (< 230 nm) と、これらの波長でほとんどの光を吸収する移動相添加剤を使用する場合に発生する可能性があります。 このような添加剤には、メタノールなどの移動相溶媒成分、または酢酸塩やギ酸塩などの緩衝液成分があります。 実際には、負のピークを使用して検量線を作成し、正確な定量情報を取得できるため、負のピーク自体を避ける根本的な理由はありません (この方法は「間接 UV 検出」と呼ばれることもあります) (13)。 ただし、吸光度検出の場合に負のピークを完全に回避したい場合は、分析対象物が移動相よりも多くを吸収するように異なる検出波長を使用するか、分析対象物よりも光の吸収が少なくなるように移動相の組成を変更するのが最善の解決策です。
負のピークは、屈折率 (RI) 検出を使用する場合にも発生することがあります。これは、サンプル内の分析対象物以外の成分 (溶媒マトリックスなど) の屈折率が移動相の屈折率と異なる場合に発生します。UV-vis 検出でも発生しますが、この影響は RI 検出に比べて弱まる傾向があります。どちらの場合も、サンプル マトリックスの組成を移動相の組成に近づけることで、負のピークを最小限に抑えることができます。
LC トラブルシューティングの基本トピックに関するパート 3 では、観測されたピーク形状が期待されるピーク形状または通常のピーク形状と異なる状況について説明しました。このような問題を効果的にトラブルシューティングするには、予想されるピーク形状 (理論または既存の方法での以前の経験に基づく) の知識から始まるため、これらの予測からの逸脱は明らかです。ピーク形状の問題には、さまざまな潜在的な原因 (広すぎる、テーリング、リーディング エッジなど) があります。今回は、最も頻繁に見られる原因のいくつかについて詳しく説明します。これらの詳細を知ることは、トラブルシューティングを開始するための良い出発点となりますが、すべての可能性を網羅しているわけではありません。原因と解決策のより詳細なリストに関心のある読者は、LCGC「LC トラブルシューティング ガイド」壁掛けチャートを参照してください。
(4) LCGC「LCトラブルシューティングガイド」ウォールチャート。https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021)。
（６）A.フェリンガー、「クロマトグラフィーにおけるデータ分析と信号処理」（エルゼビア、ニューヨーク、NY、1998年）、pp.43-96。
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AFおよびArmstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.