LCのトラブルシューティングに関するトピックの中には、機器技術が時間とともに向上してもLCの実践において問題が発生することがあるため、時代遅れになることのないものがあります。LCシステムでは、さまざまな方法で問題が発生し、ピーク形状が悪くなる可能性があります。ピーク形状に関連する問題が発生した場合、これらの結果の考えられる原因の短いリストは、トラブルシューティングを簡素化するのに役立ちます。
この「LCトラブルシューティング」コラムを執筆し、毎月のトピックについて考えるのは楽しいものです。なぜなら、時代遅れにならないトピックもあるからです。クロマトグラフィー研究の分野では、より新しく優れたアイデアに取って代わられると、特定のトピックやアイデアは時代遅れになりますが、トラブルシューティングの分野では、1983年にこのジャーナル（当時はLCジャーナル）に最初のトラブルシューティング記事が掲載されて以来、いくつかのトピックは今でも関連性があります（1）。過去数年間、私はLCトラブルシューティングのいくつかのセクションで、液体クロマトグラフィー（LC）に影響を与える現代のトレンド（例えば、保持に対する圧力の影響に関する理解の相対的な比較[2] 新しい進歩）に焦点を当ててきました。LC結果の解釈と、最新のLC機器でのトラブルシューティング方法。今月の記事では、2021年12月に開始したシリーズ（3）を継続します。このシリーズでは、LCトラブルシューティングの「生死を分ける」トピック、つまり、使用しているシステムの年代に関係なく、あらゆるトラブルシューターにとって不可欠な要素に焦点を当てています。このシリーズの中核となるトピックは、多くの研究所に掲示されているLCGCの有名な「LCトラブルシューティングガイド」の壁掛けチャート（4）。このシリーズの第3部では、ピーク形状またはピーク特性に関連する問題に焦点を当てることにしました。驚くべきことに、この壁掛けチャートには、ピーク形状が不良になる可能性のある44の異なる原因が記載されています。1つの記事でこれらの問題すべてを詳細に検討することはできないため、このトピックに関する最初の記事では、私が最もよく目にするいくつかの問題に焦点を当てます。若いLCユーザーもベテランLCユーザーも、この重要なトピックに関する役立つヒントや注意点を見つけてくれることを願っています。
トラブルシューティングの質問に対して「何でもあり得る」と答えることが増えています。解釈が難しい観察結果を考慮すると、この答えは簡単に思えるかもしれませんが、多くの場合適切だと感じています。ピーク形状の不良には多くの原因が考えられるため、問題が何であるかを検討する際には柔軟な考え方を持ち、トラブルシューティングの取り組みを開始するために潜在的な原因に優先順位を付け、最も一般的な可能性に焦点を当てることが重要です。この点は非常に重要です。
トラブルシューティング作業における重要なステップ（しかし、過小評価されていると思われるステップ）は、解決すべき問題があることを認識することです。問題があることを認識するということは、多くの場合、ツールに起こっていることが、理論、経験的知識、経験によって形成される私たちの期待と異なっていることを認識することです（5）。ここで言及されている「ピーク形状」は、実際にはピークの形状（対称、非対称、滑らか、ふわふわ、リーディングエッジ、テーリングなど）だけでなく、幅も指します。実際のピーク形状に対する私たちの期待は単純です。理論（6）は、ほとんどの場合、クロマトグラフィーのピークは対称であり、図1aに示すようにガウス分布の形状に適合するという教科書的な期待を十分に裏付けています。ピーク幅に対する私たちの期待はより複雑な問題であり、このトピックについては今後の記事で議論します。図1の他のピーク形状は、観察される可能性のある他のいくつかの可能性、つまり、物事がうまくいかない可能性のあるいくつかの方法を示しています。今回は、これらの形状タイプにつながる具体的な状況例をいくつか取り上げて解説していきます。
クロマトグラムでは、溶出が予想される箇所にピークが全く現れないことがあります。上記のウォールチャートは、ピークが見られない場合（サンプルに目的の分析対象物が、検出器の応答がノイズを上回るのに十分な濃度で含まれていると仮定した場合）、通常は機器の問題または不適切な移動相条件（そもそもピークが現れる場合）に関連していることを示しています。ピークは通常「弱すぎる」のです。このカテゴリの潜在的な問題と解決策の簡単なリストは、表 I に記載されています。
前述のように、どの程度のピーク幅の広がりを許容してから注意を払い、修正を試みるべきかという問題は複雑なトピックであり、今後の記事で議論する予定です。私の経験では、著しいピーク幅の広がりは、ピーク形状の著しい変化を伴うことが多く、ピークの裾引きは、ピーク前や分裂よりも一般的です。しかし、名目上対称なピークも広がることがあり、これはいくつかの異なる原因によって引き起こされる可能性があります。
これらの問題はそれぞれ、以前のトラブルシューティングLCの記事で詳しく解説されています。これらのトピックに関心のある読者は、これらの問題の根本原因と潜在的な解決策に関する情報については、以前の記事を参照してください。詳細はこちら。
ピークテーリング、ピークフロント、およびピークスプリッティングはすべて化学的または物理的な現象によって引き起こされる可能性があり、これらの問題に対する潜在的な解決策のリストは、化学的問題か物理的問題かによって大きく異なります。多くの場合、クロマトグラムのさまざまなピークを比較することで、原因が何であるかについての重要な手がかりを見つけることができます。クロマトグラムのすべてのピークが同様の形状を示している場合、原因は物理的なものではない可能性が最も高いです。1つまたは少数のピークのみが影響を受け、残りは正常に見える場合、原因は化学的なものである可能性が最も高いです。
ピークテーリングの化学的原因は複雑すぎて、ここで簡単に説明するには不十分です。興味のある読者は、より詳細な議論については「LC Troubleshooting」の最新号を参照してください（10）。ただし、簡単に試せるのは、注入する分析対象物の質量を減らして、ピーク形状が改善されるかどうかを確認することです。改善される場合は、問題が「質量過負荷」であることを示す良い手がかりとなります。この場合、分析対象物の注入量を少量に制限するか、より大きな質量を注入しても良好なピーク形状が得られるようにクロマトグラフィー条件を変更する必要があります。
ピークテーリングには、多くの潜在的な物理的原因も存在します。可能性についての詳細な議論に興味のある読者は、「LC Troubleshooting」の最近の別の号を参照してください (11)。ピークテーリングのより一般的な物理的原因の 1 つは、インジェクターと検出器の間のポイントでの接続不良です (12)。数週間前に私の研究室で得られた極端な例を図 1d に示します。この場合、以前に使用したことのない新しいインジェクションバルブを使用してシステムを構築し、ステンレス鋼キャピラリーに成形されたフェルールを備えた小容量インジェクションループを取り付けました。いくつかの初期トラブルシューティング実験の後、インジェクションバルブステーターのポートの深さが、私たちが慣れているよりもはるかに深く、その結果、ポートの底に大きなデッドボリュームが発生していることがわかりました。この問題は、インジェクションループを別のチューブに交換することで簡単に解決できます。フェルールを適切な位置に調整して、ポートの底のデッドボリュームをなくすことができます。
図 1e に示すようなピークの先端は、物理的または化学的な問題によっても発生する可能性があります。先端の一般的な物理的原因は、カラムの粒子ベッドが十分に充填されていないか、粒子が時間の経過とともに再配列していることです。この物理的現象によって引き起こされるピークのテーリングと同様に、これを解決する最善の方法は、カラムを交換して続行することです。根本的に、化学的起源を持つ先端のピーク形状は、いわゆる「非線形」保持条件から生じることがよくあります。理想的な (線形) 条件下では、固定相によって保持される分析対象物の量 (したがって、保持係数) は、カラム内の分析対象物の濃度と線形関係にあります。クロマトグラフィー的には、これは、カラムに注入される分析対象物の質量が増加するにつれて、ピークが高くなるが、幅は広くならないことを意味します。保持挙動が非線形の場合、この関係は崩れ、注入される質量が増えるにつれて、ピークは高くなるだけでなく、幅も広くなります。さらに、非線形形状はクロマトグラフィーのピークの形状を決定し、先端または後端のピークが発生します。ピークテーリングを引き起こす質量過負荷（10）と同様に、非線形保持によって引き起こされるピークリーディングも、注入する分析対象物の質量を減らすことで診断できます。ピーク形状が改善された場合は、リーディングエッジを引き起こす注入品質を超えないようにメソッドを変更するか、この挙動を最小限に抑えるようにクロマトグラフィー条件を変更する必要があります。
図 1f に示すように、「分裂」したピークが観察されることがあります。この問題を解決するための最初のステップは、ピークの形状が部分的な共溶出 (つまり、2 つの異なるが近接して溶出する化合物の存在) によるものかどうかを判断することです。実際に 2 つの異なる分析対象物が近接して溶出している場合は、それらの分離度を向上させること (たとえば、選択性、保持、または理論段数を増やすことによって) が重要であり、見かけ上の「分裂」したピークは物理的な問題に関連しており、カラム自体とは関係ありません。多くの場合、この判断の最も重要な手がかりは、クロマトグラムのすべてのピークが分裂形状を示すか、1 つまたは 2 つだけであるかです。1 つまたは 2 つだけの場合は、おそらく共溶出の問題です。すべてのピークが分裂している場合は、おそらく物理的な問題であり、おそらくカラム自体に関連しています。
カラム自体の物理的特性に関連するピークの分裂は、通常、入口または出口のフリットが部分的に詰まっているか、カラム内の粒子が再編成されて、カラムチャネル形成の特定の領域で移動相が他の領域よりも速く流れるようになることが原因です (11)。部分的に詰まったフリットは、カラムを通る流れを逆転させることで解消できる場合もありますが、私の経験では、これは通常、長期的な解決策ではなく短期的な解決策です。粒子がカラム内で再結合すると、これは現代のカラムでは致命的になることがよくあります。この時点で、カラムを交換して続行するのが最善です。
図 1g のピークは、私の研究室で最近発生した事例ですが、通常は信号が非常に高く、応答範囲の上限に達したことを示しています。光吸収検出器 (この場合は UV-vis) の場合、分析対象物の濃度が非常に高いと、分析対象物が検出器フローセルを通過する光のほとんどを吸収し、検出される光はごくわずかになります。このような状況では、光検出器からの電気信号は、迷光や「暗電流」などのさまざまなノイズ源の影響を大きく受け、信号が非常に「ぼやけて」見え、分析対象物の濃度とは無関係になります。このような場合、分析対象物の注入量を減らすことで、多くの場合、問題は簡単に解決できます。注入量を減らす、サンプルを希釈する、またはその両方を行うなどです。
クロマトグラフィーの学校では、検出器信号（つまり、クロマトグラムのy軸）をサンプル中の分析対象物の濃度の指標として使用します。そのため、信号がゼロより小さいクロマトグラムを見ると奇妙に思えます。単純に解釈すると、これは分析対象物の濃度が負であることを示していることになりますが、もちろん物理的には不可能です。私の経験では、負のピークは、光学的吸光度検出器（例：UV-vis）を使用した場合に最もよく観察されます。
この場合、負のピークとは、カラムから溶出する分子が、ピークの直前と直後の移動相自体よりも光を吸収しにくいことを意味します。これは、例えば、比較的低い検出波長（<230 nm）を使用し、これらの波長でほとんどの光を吸収する移動相添加剤を使用した場合に発生する可能性があります。このような添加剤は、メタノールなどの移動相溶媒成分、または酢酸塩やギ酸塩などの緩衝成分です。実際には、負のピークを使用して検量線を作成し、正確な定量情報を得ることができるため、それ自体を避ける根本的な理由はありません（この方法は「間接UV検出」と呼ばれることもあります）（13）。ただし、負のピークを完全に避けたい場合は、吸光度検出の場合、分析対象物が移動相よりも多く光を吸収するように異なる検出波長を使用するか、分析対象物よりも光を吸収しにくいように移動相の組成を変更するのが最善の解決策です。
屈折率（RI）検出を使用する場合、試料中の分析対象物以外の成分（溶媒マトリックスなど）の屈折率が移動相の屈折率と異なる場合、負のピークが現れることがあります。これはUV-vis検出でも起こりますが、RI検出に比べてその影響は弱まる傾向があります。どちらの場合も、試料マトリックスの組成を移動相の組成により近づけることで、負のピークを最小限に抑えることができます。
LCトラブルシューティングの基本トピックに関する第3部では、観測されたピーク形状が期待される、または通常のピーク形状と異なる状況について説明しました。このような問題の効果的なトラブルシューティングは、期待されるピーク形状（理論または既存の方法による過去の経験に基づく）に関する知識から始まります。これにより、これらの期待からの逸脱が明らかになります。ピーク形状の問題には、さまざまな原因（幅が広すぎる、テールが長すぎる、リーディングエッジが長すぎるなど）が考えられます。今回の記事では、私が最もよく目にするいくつかの原因について詳しく説明します。これらの詳細を知ることは、トラブルシューティングを開始するのに良い出発点となりますが、すべての可能性を網羅しているわけではありません。原因と解決策のより詳細なリストに関心のある読者は、LCGCの「LCトラブルシューティングガイド」ウォールチャートを参照してください。
（4）LCGC「LCトラブルシューティングガイド」壁掛けチャート。https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart（2021年）。
（6）A. Felinger、『クロマトグラフィーにおけるデータ分析と信号処理』（Elsevier、ニューヨーク、NY、1998年）、43-96ページ。
(8) Wahab MF、Dasgupta PK、Kadjo AF、Armstrong DW、Anal.Chim.Journal.Rev. 907、31–44 (2016)。https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043。