Unele subiecte de depanare a problemelor LC nu sunt niciodată demodate, deoarece există probleme în practica LC, chiar și pe măsură ce tehnologia instrumentelor se îmbunătățește în timp. Există multe moduri în care pot apărea probleme într-un sistem LC și pot duce la o formă slabă a vârfurilor. Atunci când apar probleme legate de forma vârfurilor, o scurtă listă de cauze posibile pentru aceste rezultate ajută la simplificarea experienței noastre de depanare.
A fost distractiv să scriu această rubrică „Depanare LC” și să mă gândesc la subiecte în fiecare lună, deoarece unele subiecte nu se demodează niciodată. În timp ce în domeniul cercetării în cromatografie anumite subiecte sau idei devin învechite pe măsură ce sunt înlocuite de idei mai noi și mai bune, în domeniul depanării, de la primul articol despre depanare a apărut în această revistă (LC Journal la acea vreme - deoarece unele subiecte sunt încă relevante) în 1983 (1). În ultimii ani, m-am concentrat pe mai multe secțiuni de depanare LC pe tendințele contemporane care afectează cromatografia lichidă (LC) (de exemplu, compararea relativă a înțelegerii noastre asupra efectului presiunii asupra retenției [2] Noi progrese) Interpretarea noastră a rezultatelor LC și cum să depanăm cu instrumente LC moderne. În ediția din această lună, continui seria mea (3), care a început în decembrie 2021, care s-a concentrat pe unele dintre subiectele „de viață și de moarte” ale depanării LC - elementele care sunt excelente pentru orice depanator sunt esențiale, indiferent de vârsta sistemului pe care îl folosim. Subiectul principal al acestei serii este extrem de relevant pentru faimosul tabel mural „Ghid de depanare LC” al LCGC (4). atârnat în multe laboratoare. Pentru a treia parte a acestei serii, am ales să mă concentrez pe probleme legate de forma vârfului sau de caracteristicile vârfurilor. Incredibil, diagrama de perete enumeră 44 de cauze potențiale diferite ale unei forme slabe a vârfurilor! Nu putem analiza toate aceste probleme în detaliu într-un singur articol, așa că în această primă parte pe această temă, mă voi concentra pe unele dintre cele pe care le văd cel mai des. Sper că utilizatorii LC, tineri și bătrâni, vor găsi câteva sfaturi și mementouri utile pe această temă importantă.
Mă surprind din ce în ce mai des răspunzând la întrebările de depanare cu „orice este posibil”. Acest răspuns poate părea ușor atunci când se iau în considerare observații dificil de interpretat, dar îl consider adesea potrivit. Având în vedere numeroasele cauze posibile ale unei forme slabe a vârfurilor, este important să ne păstrăm mintea deschisă atunci când luăm în considerare care ar putea fi problema și să putem prioritiza cauzele potențiale pentru a începe eforturile de depanare, concentrându-ne pe cele mai comune posibilități; acest punct este foarte important.
Un pas cheie în orice exercițiu de depanare - dar unul care cred că este subestimat - este recunoașterea faptului că există o problemă care trebuie rezolvată. Recunoașterea faptului că există o problemă înseamnă adesea recunoașterea faptului că ceea ce se întâmplă cu instrumentul este diferit de așteptările noastre, care sunt modelate de teorie, cunoștințe empirice și experiență (5). „Forma vârfului” la care se face referire aici se referă de fapt nu numai la forma vârfului (simetric, asimetric, neted, pufos, marginea anterioară, coadă etc.), ci și la lățime. Așteptările noastre privind forma reală a vârfului sunt simple. Teoria (6) susține bine așteptarea din manuale conform căreia, în majoritatea cazurilor, vârfurile cromatografice ar trebui să fie simetrice și să se conformeze formei unei distribuții gaussiene, așa cum se arată în Figura 1a. Ceea ce ne așteptăm de la lățimile vârfurilor este o problemă mai complexă și vom discuta acest subiect într-un articol viitor. Celelalte forme de vârfuri din Figura 1 arată unele dintre celelalte posibilități care ar putea fi observate - cu alte cuvinte, unele dintre modurile în care lucrurile ar putea merge prost. În restul acestei părți, vom petrece timp discutând câteva exemple specifice de situații care pot duce la acestea. tipuri de forme.
Uneori, vârfurile nu sunt observate deloc în cromatogramă, unde se așteaptă să fie eluate. Diagrama murală de mai sus indică faptul că absența unui vârf (presupunând că proba conține de fapt analitul țintă la o concentrație care ar trebui să facă răspunsul detectorului suficient pentru a-l vedea deasupra zgomotului) este de obicei legată de o problemă a instrumentului sau de condiții incorecte ale fazei mobile (dacă sunt observate deloc). Vârfuri, de obicei prea „slabe”). O scurtă listă de probleme potențiale și soluții din această categorie poate fi găsită în Tabelul I.
Așa cum am menționat mai sus, întrebarea despre cât de multă lărgire a vârfurilor ar trebui tolerată înainte de a acorda atenție și a încerca să o remediem este un subiect complex pe care îl voi discuta într-un articol viitor. Experiența mea este că lărgirea semnificativă a vârfurilor este adesea însoțită de o modificare semnificativă a formei vârfurilor, iar coada vârfurilor este mai frecventă decât pre-vârf sau divizarea. Cu toate acestea, vârfurile nominal simetrice sunt, de asemenea, lărgite, ceea ce poate fi cauzat de câteva motive diferite:
Fiecare dintre aceste probleme a fost discutată în detaliu în numerele anterioare ale revistei Troubleshooting LC, iar cititorii interesați de aceste subiecte pot consulta articolele anterioare pentru informații despre cauzele principale și potențialele soluții la aceste probleme. Mai multe detalii.
Coada de vârfuri, frontul de vârfuri și divizarea pot fi cauzate de fenomene chimice sau fizice, iar lista soluțiilor potențiale la aceste probleme variază foarte mult, în funcție de problema chimică sau fizică. Adesea, comparând diferitele vârfuri dintr-o cromatogramă, puteți găsi indicii importante despre care este vinovatul. Dacă toate vârfurile dintr-o cromatogramă prezintă forme similare, cel mai probabil cauza nu este fizică. Dacă doar unul sau câteva vârfuri sunt afectate, dar restul arată bine, cel mai probabil cauza este chimică.
Cauzele chimice ale defecțiunii vârfurilor sunt prea complexe pentru a fi discutate pe scurt aici. Cititorul interesat este invitat să consulte numărul recent al revistei „LC Troubleshooting” (Depanare LC) pentru o discuție mai aprofundată (10). Cu toate acestea, o metodă ușoară este reducerea masei analitului injectat și observarea dacă forma vârfului se îmbunătățește. Dacă da, atunci acesta este un indiciu bun că problema este „supraîncărcarea cu masă”. În acest caz, metoda trebuie limitată la injectarea unor mase mici de analitul respectiv sau condițiile cromatografice trebuie modificate astfel încât să se poată obține forme bune ale vârfurilor chiar și cu mase mai mari injectate.
Există, de asemenea, multe motive fizice potențiale pentru apariția coadei de vârf. Cititorii interesați de o discuție detaliată a posibilităților sunt recomandați să consulte o altă ediție recentă a revistei „LC Troubleshooting” (11). Una dintre cele mai frecvente cauze fizice ale apariției coadei de vârf este o conexiune slabă într-un punct dintre injector și detector (12). Un exemplu extrem este prezentat în Figura 1d, obținut în laboratorul meu acum câteva săptămâni. În acest caz, am construit un sistem cu o nouă supapă de injecție pe care nu o mai folosisem înainte și am instalat o buclă de injecție cu volum mic, cu o ferulă turnată pe un capilar din oțel inoxidabil. După câteva experimente inițiale de depanare, ne-am dat seama că adâncimea orificiului din statorul supapei de injecție era mult mai adâncă decât eram obișnuiți, rezultând un volum mort mare în partea de jos a orificiului. Această problemă se rezolvă ușor prin înlocuirea buclei de injecție cu un alt tub, putem regla ferulă în poziția corectă pentru a elimina volumul mort în partea de jos a orificiului.
Fronturile de vârf, precum cele prezentate în Figura 1e, pot fi cauzate și de probleme fizice sau chimice. O cauză fizică frecventă a marginii anterioare este faptul că patul de particule al coloanei nu este bine împachetat sau că particulele s-au reorganizat în timp. Ca ​​și în cazul coadei de vârf cauzate de acest fenomen fizic, cea mai bună modalitate de a remedia acest lucru este înlocuirea coloanei și continuarea procesului. Fundamental, formele vârfurilor de pe marginea anterioară cu origine chimică apar adesea din ceea ce numim condiții de retenție „neliniare”. În condiții ideale (liniare), cantitatea de analit reținută de faza staționară (prin urmare, factorul de retenție) este liniar legată de concentrația analitului din coloană. Cromatografic, aceasta înseamnă că, pe măsură ce masa de analit injectată în coloană crește, vârful devine mai înalt, dar nu mai lat. Această relație este ruptă atunci când comportamentul de retenție este neliniar, iar vârfurile nu numai că devin mai înalte, ci și mai late pe măsură ce se injectează mai multă masă. În plus, formele neliniare determină forma vârfurilor cromatografice, rezultând muchii anterioare sau posterioare. Ca și în cazul supraîncărcării de masă care provoacă coada de vârf (10), vârful Antrenamentul cauzat de retenția neliniară poate fi diagnosticat și prin reducerea masei de analitul injectat. Dacă forma vârfului se îmbunătățește, metoda trebuie modificată pentru a nu depăși calitatea injecției care provoacă marginea anterioară sau condițiile cromatografice trebuie modificate pentru a minimiza acest comportament.
Uneori observăm ceea ce pare a fi un vârf „divizat”, așa cum se arată în Figura 1f. Primul pas în rezolvarea acestei probleme este de a determina dacă forma vârfului se datorează co-eluției parțiale (adică prezenței a doi compuși distincți, dar care eluează strâns). Dacă există de fapt doi analiți diferiți care eluează aproape unul de celălalt, atunci este vorba de îmbunătățirea rezoluției lor (de exemplu, prin creșterea selectivității, retenției sau numărului de plăci), iar vârfurile aparente „divizate” sunt legate de performanța fizică. Performanța nu are nicio legătură cu coloana în sine. Adesea, cel mai important indiciu pentru această decizie este dacă toate vârfurile din cromatogramă prezintă forme divizate sau doar unul sau două. Dacă este vorba doar de unul sau două, este probabil o problemă de co-eluție; dacă toate vârfurile sunt divizate, este probabil o problemă fizică, cel mai probabil legată de coloana în sine.
Vârfurile divizate legate de proprietățile fizice ale coloanei în sine se datorează de obicei fritelor de intrare sau ieșire parțial blocate sau reorganizării particulelor în coloană, permițând fazei mobile să curgă mai repede decât faza mobilă în anumite zone ale formării canalului coloanei, în alte regiuni (11). Frita parțial înfundată poate fi uneori curățată prin inversarea fluxului prin coloană; cu toate acestea, din experiența mea, aceasta este de obicei o soluție pe termen scurt, mai degrabă decât pe termen lung. Acest lucru este adesea fatal în cazul coloanelor moderne dacă particulele se recombină în interiorul coloanei. În acest moment, cel mai bine este să înlocuiți coloana și să continuați.
Vârful din Figura 1g, tot dintr-un caz recent din propriul meu laborator, indică de obicei că semnalul este atât de ridicat încât a atins limita superioară a intervalului de răspuns. Pentru detectoarele optice de absorbție (UV-vis în acest caz), atunci când concentrația analitului este foarte mare, analitul absoarbe cea mai mare parte a luminii care trece prin celula de flux a detectorului, lăsând foarte puțină lumină de detectat. În aceste condiții, semnalul electric de la fotodetector este puternic influențat de diverse surse de zgomot, cum ar fi lumina parazită și „curentul de întuneric”, ceea ce face ca semnalul să aibă un aspect foarte „neclar” și să fie independent de concentrația analitului. Când se întâmplă acest lucru, problema poate fi adesea rezolvată cu ușurință prin reducerea volumului de injecție al analitului - reducerea volumului de injecție, diluarea probei sau ambele.
În școala de cromatografie, folosim semnalul detectorului (adică axa y din cromatogramă) ca indicator al concentrației de analit din probă. Așadar, pare ciudat să vedem o cromatogramă cu un semnal sub zero, deoarece interpretarea simplă este că aceasta indică o concentrație negativă de analit - ceea ce, desigur, nu este posibil din punct de vedere fizic. Din experiența mea, vârfurile negative sunt cel mai adesea observate atunci când se utilizează detectoare optice de absorbanță (de exemplu, UV-vis).
În acest caz, un vârf negativ înseamnă pur și simplu că moleculele care eluează din coloană absorb mai puțină lumină decât faza mobilă însăși, imediat înainte și după vârf. Acest lucru se poate întâmpla, de exemplu, atunci când se utilizează lungimi de undă de detecție relativ mici (<230 nm) și aditivi pentru faza mobilă care absorb cea mai mare parte a luminii la aceste lungimi de undă. Astfel de aditivi pot fi componente ale solventului pentru faza mobilă, cum ar fi metanolul, sau componente tampon, cum ar fi acetatul sau formiatul. Se pot utiliza de fapt vârfuri negative pentru a pregăti o curbă de calibrare și a obține informații cantitative precise, deci nu există niciun motiv fundamental pentru a le evita în sine (această metodă este uneori denumită „detecție UV indirectă”) (13). Cu toate acestea, dacă dorim cu adevărat să evităm complet vârfurile negative, în cazul detectării absorbanței, cea mai bună soluție este să folosim o lungime de undă de detecție diferită, astfel încât analitul să absoarbă mai mult decât faza mobilă sau să modificăm compoziția fazei mobile astfel încât aceasta să absoarbă mai puțină lumină decât analiții.
Vârfurile negative pot apărea și atunci când se utilizează detectarea indicelui de refracție (RI), atunci când indicele de refracție al componentelor, altele decât analitul, din probă, cum ar fi matricea solventului, este diferit de indicele de refracție al fazei mobile. Acest lucru se întâmplă și cu detectarea UV-vis, dar acest efect tinde să fie atenuat în raport cu detectarea RI. În ambele cazuri, vârfurile negative pot fi reduse la minimum prin potrivirea mai strânsă a compoziției matricei probei cu cea a fazei mobile.
În partea a treia, despre subiectul de bază al depanării LC, am discutat situații în care forma observată a vârfului diferă de forma așteptată sau normală a vârfului. Depanarea eficientă a unor astfel de probleme începe cu cunoașterea formelor așteptate ale vârfurilor (bazată pe teorie sau pe experiența anterioară cu metodele existente), astfel încât abaterile de la aceste așteptări sunt evidente. Problemele legate de forma vârfului au multe cauze potențiale diferite (prea lat, coadă, muchie de atac etc.). În această parte, discut în detaliu câteva dintre motivele pe care le văd cel mai des. Cunoașterea acestor detalii oferă un bun punct de plecare pentru depanare, dar nu surprinde toate posibilitățile. Cititorii interesați de o listă mai detaliată de cauze și soluții pot consulta diagrama murală „Ghidul de depanare LC” al LCGC.
(4) Diagramă murală „Ghid de depanare LC” LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analiza datelor și procesarea semnalelor în cromatografie (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF și Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.