Някои теми за отстраняване на неизправности в течнокристалните хроматографи никога не са остарели, тъй като съществуват проблеми в практиката на течнокристалните хроматографи, дори когато технологията на инструментите се усъвършенства с течение на времето. Има много начини, по които проблемите могат да възникнат в течнокристална система и да доведат до лоша форма на пиковете. Когато възникнат проблеми, свързани с формата на пиковете, кратък списък с възможни причини за тези резултати помага да се опрости процесът ни на отстраняване на неизправности.
Забавно е да пиша тази рубрика „Отстраняване на неизправности при течна хроматография“ и да мисля за теми всеки месец, защото някои теми никога не излизат от мода. Докато в областта на хроматографските изследвания определени теми или идеи остаряват, тъй като биват заменени от по-нови и по-добри идеи, в областта на отстраняването на неизправности, откакто първата статия за отстраняване на неизправности се появи в това списание (LC Journal по това време), тъй като някои теми са все още актуални през 1983 г. (1). През последните няколко години фокусирах няколко раздела за отстраняване на неизправности при течна хроматография върху съвременните тенденции, засягащи течната хроматография (LC) (например, относителното сравнение на нашето разбиране за ефекта на налягането върху задържането [2] Нови постижения), нашата интерпретация на резултатите от LC и как да отстраняваме неизправности със съвременни LC инструменти. В тази месечна част продължавам поредицата си (3), която започна през декември 2021 г., фокусирана върху някои от темите на „живота и смъртта“ при отстраняване на неизправности при LC — елементи, които са чудесни за всеки специалист по отстраняване на неизправности, са от съществено значение, независимо от възрастта на системата, която използваме. Основната тема на тази поредица е силно свързана с известната стенна диаграма „Ръководство за отстраняване на неизправности при LC“ (4), окачена в... много лаборатории. За третата част от тази поредица избрах да се съсредоточа върху проблеми, свързани с формата или характеристиките на пиковете. Невероятно е, че стенната диаграма изброява 44 различни потенциални причини за лоша форма на пиковете! Не можем да разгледаме подробно всички тези проблеми в една статия, така че в тази първа част по темата ще се съсредоточа върху някои от тези, които виждам най-често. Надявам се, че млади и стари потребители на течен хроматограф ще намерят полезни съвети и напомняния по тази важна тема.
Все по-често отговарям на въпроси за отстраняване на неизправности с „всичко е възможно“. Този отговор може да изглежда лесен, когато се разглеждат наблюдения, които са трудни за интерпретиране, но често го намирам за подходящ. С многото възможни причини за лоша форма на пика е важно да бъдем отворени, когато обмисляме какъв може да е проблемът, и да можем да приоритизираме потенциалните причини, за да започнем усилията си за отстраняване на неизправности, фокусирайки се върху най-често срещаните възможности, това е много важно.
Ключова стъпка във всяко упражнение за отстраняване на неизправности – но такава, която според мен е подценявана – е признаването, че има проблем, който трябва да бъде решен. Признаването на наличието на проблем често означава признаване, че това, което се случва с инструмента, е различно от нашите очаквания, които са оформени от теория, емпирични знания и опит (5). „Формата на пика“, за която се говори тук, всъщност се отнася не само до формата на пика (симетрична, асиметрична, гладка, пухкава, водещ ръб, опашка и т.н.), но и до ширината. Нашите очаквания за действителната форма на пика са прости. Теория (6) добре подкрепя очакването от учебника, че в повечето случаи хроматографските пикове трябва да са симетрични и да съответстват на формата на Гаусово разпределение, както е показано на Фигура 1а. Това, което очакваме от ширините на пиковете, е по-сложен въпрос и ще обсъдим тази тема в бъдеща статия. Другите форми на пиковете на Фигура 1 показват някои от другите възможности, които биха могли да се наблюдават – с други думи, някои от начините, по които нещата биха могли да се объркат. В останалата част от тази част ще отделим време за обсъждане на някои конкретни примери за ситуации, които могат да доведат до тези типове форма.
Понякога пиковете изобщо не се наблюдават в хроматограмата, където се очаква да бъдат елуирани. Горната стенна диаграма показва, че липсата на пик (ако приемем, че пробата действително съдържа целевия аналит в концентрация, която би трябвало да направи реакцията на детектора достатъчна, за да го види над шума) обикновено е свързана с някакъв проблем с инструмента или неправилни условия на мобилната фаза (ако изобщо се наблюдават). Пиковете, обикновено твърде „слаби“). Кратък списък с потенциални проблеми и решения в тази категория може да бъде намерен в Таблица I.
Както бе споменато по-горе, въпросът за това колко разширяване на пиковете трябва да се толерира, преди да се обърне внимание и да се опитаме да го поправим, е сложна тема, която ще обсъдя в бъдеща статия. Моят опит показва, че значителното разширяване на пиковете често е съпроводено със значителна промяна във формата на пика, а „опашката“ на пиковете е по-често срещана, отколкото преди пика или разделянето. Номинално симетричните пикове обаче също са разширени, което може да бъде причинено от няколко различни причини:
Всеки един от тези проблеми е обсъден подробно в предишни броеве на „Отстраняване на проблеми с LC“ и читателите, които се интересуват от тези теми, могат да се обърнат към тези предишни статии за информация относно коренните причини и потенциалните решения на тези проблеми. Повече подробности.
Запушването на пиковете, изпъкването на пиковете и разделянето им могат да бъдат причинени от химични или физични явления, а списъкът с потенциални решения на тези проблеми варира значително в зависимост от това дали се занимаваме с химичен или физичен проблем. Често, чрез сравняване на различните пикове в хроматограма, можете да намерите важни улики за това кой е виновникът. Ако всички пикове в хроматограмата показват сходни форми, причината най-вероятно не е физическа. Ако са засегнати само един или няколко пика, но останалите изглеждат добре, причината най-вероятно е химическа.
Химичните причини за образуването на опашки в пиковете са твърде сложни, за да бъдат обсъдени накратко тук. Заинтересованият читател може да се насочи към скорошния брой на „LC Troubleshooting“ за по-задълбочено обсъждане (10). Лесно нещо, което може да се опита, е да се намали масата на инжектирания аналит и да се види дали формата на пика се подобрява. Ако е така, това е добър знак, че проблемът е „претоварване с маса“. В този случай методът трябва да се ограничи до инжектиране на малки маси аналит или хроматографските условия трябва да се променят, така че да се получат добри форми на пиковете дори при инжектирани по-големи маси.
Съществуват и много потенциални физически причини за пикови опашки. Читателите, които се интересуват от подробно обсъждане на възможностите, се насочват към друг скорошен брой на „LC Troubleshooting“ (11). Една от по-често срещаните физически причини за пикови опашки е лошата връзка в точка между инжектора и детектора (12). Екстремни пример е показан на Фигура 1d, получена в моята лаборатория преди няколко седмици. В този случай изградихме система с нов инжекционен клапан, който не бяхме използвали преди, и инсталирахме инжекционен контур с малък обем с ферула, която беше формована върху капиляр от неръждаема стомана. След някои първоначални експерименти за отстраняване на неизправности, осъзнахме, че дълбочината на отвора в статора на инжекционния клапан е много по-дълбока, отколкото бяхме свикнали, което води до голям мъртъв обем в долната част на отвора. Този проблем се решава лесно чрез замяна на инжекционния контур с друга тръба, като можем да регулираме ферулата в правилната позиция, за да елиминираме мъртвия обем в долната част на отвора.
Фронтовете на пиковете, като показаните на Фигура 1д, могат да бъдат причинени и от физични или химични проблеми. Често срещана физическа причина за водещия ръб е, че слоят от частици в колоната не е добре опакован или че частиците са се реорганизирали с течение на времето. Както при „опашката“ на пиковете, причинена от това физическо явление, най-добрият начин да се поправи това е да се смени колоната и да се продължи. По принцип, формите на пиковете на водещия ръб с химичен произход често възникват от това, което наричаме „нелинейни“ условия на задържане. При идеални (линейни) условия количеството аналит, задържано от стационарната фаза (следователно, коефициентът на задържане), е линейно пропорционално на концентрацията на аналита в колоната. Хроматографски това означава, че с увеличаването на масата на аналита, инжектиран в колоната, пикът става по-висок, но не и по-широк. Тази връзка се нарушава, когато поведението на задържане е нелинейно и пиковете не само стават по-високи, но и по-широки, когато се инжектира повече маса. Освен това, нелинейните форми определят формата на хроматографските пикове, което води до водещи или задни ръбове. Както при масовото претоварване, което причинява „опашка“ на пиковете (10), водещите пикове, причинени от Нелинейното задържане може да се диагностицира и чрез намаляване на масата на инжектирания аналит. Ако формата на пика се подобри, методът трябва да се модифицира, за да не се превишава качеството на инжектиране, което причинява водещия ръб, или хроматографските условия трябва да се променят, за да се сведе до минимум това поведение.
Понякога наблюдаваме нещо, което изглежда като „разделен“ пик, както е показано на Фигура 1f. Първата стъпка в решаването на този проблем е да се определи дали формата на пика се дължи на частично коелуиране (т.е. наличието на две различни, но близко елуиращи съединения). Ако действително има два различни аналита, елуиращи близо един до друг, тогава става въпрос за подобряване на тяхната разделителна способност (например чрез увеличаване на селективността, задържането или броя на плаките) и видимите „разделени“ пикове са свързани с физически характеристики. Производителността няма нищо общо със самата колона. Често най-важният ключ към това решение е дали всички пикове в хроматограмата показват разделени форми или само един или два. Ако е само един или два, вероятно е проблем с коелуирането; ако всички пикове са разделени, вероятно е физически проблем, най-вероятно свързан със самата колона.
Разделените пикове, свързани с физичните свойства на самата колона, обикновено се дължат на частично блокирани фрити на входа или изхода или на реорганизация на частиците в колоната, което позволява на подвижната фаза да тече по-бързо от подвижната фаза в определени области на образуването на канала на колоната в други области (11). Частично запушената фрита понякога може да се отстрани чрез обръщане на потока през колоната; обаче, по мой опит, това обикновено е краткосрочно, а не дългосрочно решение. Това често е фатално при съвременните колони, ако частиците се рекомбинират в колоната. В този момент е най-добре да се смени колоната и да се продължи.
Пикът на Фигура 1g, също от скорошен случай в моята собствена лаборатория, обикновено показва, че сигналът е толкова висок, че е достигнал горния край на диапазона на реакция. При оптичните абсорбционни детектори (в този случай UV-vis), когато концентрацията на аналита е много висока, аналитът абсорбира по-голямата част от светлината, преминаваща през проточната клетка на детектора, оставяйки много малко светлина за откриване. При тези условия електрическият сигнал от фотодетектора е силно повлиян от различни източници на шум, като например разсеяна светлина и „тъмен ток“, което прави сигнала много „размит“ на вид и независим от концентрацията на аналита. Когато това се случи, проблемът често може лесно да бъде разрешен чрез намаляване на обема на инжектиране на аналита - намаляване на обема на инжектиране, разреждане на пробата или и двете.
В училище по хроматография използваме сигнала от детектора (т.е. оста y в хроматограмата) като индикатор за концентрацията на аналита в пробата. Така че изглежда странно да се види хроматограма със сигнал под нулата, тъй като простата интерпретация е, че това показва отрицателна концентрация на аналита – което, разбира се, не е физически възможно. Според моя опит, отрицателните пикове се наблюдават най-често при използване на оптични абсорбционни детектори (напр. UV-vis).
В този случай, отрицателен пик просто означава, че молекулите, елуирани от колоната, абсорбират по-малко светлина от самата мобилна фаза непосредствено преди и след пика. Това може да се случи например, когато се използват относително ниски дължини на вълната за детекция (<230 nm) и добавки в мобилната фаза, които абсорбират по-голямата част от светлината при тези дължини на вълната. Такива добавки могат да бъдат компоненти на разтворителя в мобилната фаза, като метанол, или буферни компоненти, като ацетат или формиат. Всъщност отрицателните пикове могат да се използват за изготвяне на калибрационна крива и получаване на точна количествена информация, така че няма фундаментална причина да се избягват сами по себе си (този метод понякога се нарича „индиректно UV детектиране“) (13). Ако обаче наистина искаме да избегнем напълно отрицателните пикове, в случай на абсорбционно детектиране, най-доброто решение е да се използва различна дължина на вълната за детекция, така че аналитът да абсорбира повече от мобилната фаза, или да се промени съставът на мобилната фаза, така че те да абсорбират по-малко светлина от аналитите.
Отрицателни пикове могат да се появят и при използване на детекция с индекс на пречупване (RI), когато индексът на пречупване на компоненти, различни от аналита в пробата, като например матрицата на разтворителя, е различен от индекса на пречупване на подвижната фаза. Това се случва и при UV-vis детекция, но този ефект е склонен да бъде отслабен в сравнение с RI детекцията. И в двата случая отрицателните пикове могат да бъдат сведени до минимум чрез по-точно съпоставяне на състава на матрицата на пробата с този на подвижната фаза.
В трета част, посветена на основната тема за отстраняване на неизправности при течнокристални хроматографи (LC), обсъдих ситуации, в които наблюдаваната форма на пика се различава от очакваната или нормалната форма на пика. Ефективното отстраняване на неизправности от такива проблеми започва с познаване на очакваните форми на пиковете (базирани на теория или предишен опит със съществуващи методи), така че отклоненията от тези очаквания са очевидни. Проблемите с формата на пиковете имат много различни потенциални причини (твърде широки, опашка, водещ ръб и др.). В тази част обсъждам подробно някои от причините, които виждам най-често. Познаването на тези подробности предоставя добро място за започване на отстраняване на неизправности, но не обхваща всички възможности. Читателите, които се интересуват от по-подробен списък с причини и решения, могат да се обърнат към стенната диаграма „Ръководство за отстраняване на неизправности при LC“ на LCGC.
(4) Стенна таблица „Ръководство за отстраняване на неизправности при LC“ на LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021 г.).
(6) А. Фелингер, Анализ на данни и обработка на сигнали в хроматографията (Elsevier, Ню Йорк, Ню Йорк, 1998), стр. 43-96.
(8) Уахаб М. Ф., Дасгупта П. К., Каджо А. Ф. и Армстронг Д. У., Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.