Sababaraha topik ngungkulan masalah LC henteu pernah ketinggalan jaman, sabab aya masalah dina prakték LC, sanaos téknologi instrumen ningkat kana waktosna. Aya seueur cara dimana masalah tiasa timbul dina sistem LC sareng tungtungna dina bentuk puncak anu goréng. Nalika masalah anu aya hubunganana sareng bentuk puncak timbul, daptar pondok anu mungkin nyababkeun hasil ieu ngabantosan nyederhanakeun pangalaman ngungkulan masalah urang.
Ngarasa senang nulis kolom "LC Troubleshooting" ieu sareng mikiran topik unggal bulan, sabab sababaraha topik henteu pernah kaluar tina gaya. Nalika dina widang panalungtikan kromatografi, topik atanapi ideu anu tangtu janten luntur sabab diganti ku ideu anu langkung énggal sareng langkung saé, dina widang ngungkulan masalah, saprak artikel ngungkulan masalah anu munggaran muncul dina jurnal ieu (LC Journal dina waktos éta) kumargi sababaraha topik masih relevan) dina taun 1983 (1). Salila sababaraha taun ka pengker, kuring parantos museurkeun sababaraha bagian LC Troubleshooting kana tren kontemporer anu mangaruhan kromatografi cair (LC) (contona, babandingan relatif pamahaman urang ngeunaan pangaruh tekanan kana ingetan [2] Kamajuan Anyar) Interpretasi urang ngeunaan hasil LC sareng kumaha ngungkulan masalah nganggo instrumen LC modéren. Dina cicilan bulan ieu, kuring neraskeun séri kuring (3), anu dimimitian dina Désémber 2021, anu museurkeun kana sababaraha topik "hirup sareng maot" tina ngungkulan masalah LC — unsur-unsur anu saé pikeun saha waé anu ngungkulan masalah penting, henteu paduli umur sistem anu urang anggo. Topik inti séri ieu relevan pisan sareng LCGC anu kasohor Bagan témbok "Pituduh Ngungkulan Masalah LC" (4) digantung di seueur laboratorium. Pikeun bagian katilu tina séri ieu, kuring milih fokus kana masalah anu aya hubunganana sareng bentuk puncak atanapi karakteristik puncak. Anu luar biasa, bagan témbok ngadaptar 44 panyabab poténsial anu béda tina bentuk puncak anu goréng! Urang teu tiasa mertimbangkeun sadaya masalah ieu sacara rinci dina hiji tulisan, janten dina cicilan munggaran ngeunaan topik ieu, kuring bakal fokus kana sababaraha anu paling sering kuring tingali. Kuring miharep pangguna LC ngora sareng sepuh bakal mendakan sababaraha tip sareng panginget anu mangpaat ngeunaan topik penting ieu.
Kuring beuki sering ngajawab patarosan ngungkulan masalah ku "naon waé tiasa dilakukeun". Réspon ieu sigana gampang nalika mertimbangkeun observasi anu hésé diinterpretasi, tapi kuring sering mendakan éta cocog. Kalayan seueur kamungkinan panyabab bentuk puncak anu goréng, penting pikeun tetep pikiran kabuka nalika mertimbangkeun naon masalahna, sareng pikeun tiasa ngutamakeun panyabab poténsial pikeun ngamimitian usaha ngungkulan masalah urang, fokus kana kamungkinan anu paling umum, poin ieu penting pisan.
Léngkah konci dina latihan ngungkulan masalah naon waé — tapi anu kuring pikir kurang dihargaan — nyaéta mikawanoh yén aya masalah anu kedah direngsekeun. Mikawanoh yén aya masalah sering hartosna mikawanoh yén naon anu kajantenan kana alat éta béda ti ekspektasi urang, anu dibentuk ku téori, pangaweruh empiris, sareng pangalaman (5). "Bentuk puncak" anu disebutkeun di dieu sabenerna henteu ngan ukur nujul kana bentuk puncak (simetris, asimetris, lemes, mengembang, ujung utama, buntut, jsb.), tapi ogé kana lébarna. Ekspektasi urang pikeun bentuk puncak anu saleresna saderhana. Téori (6) ngadukung ekspektasi buku téks yén, dina kalolobaan kasus, puncak kromatografi kedah simetris sareng saluyu sareng bentuk distribusi Gaussian, sapertos anu dipidangkeun dina Gambar 1a. Naon anu urang ngarepkeun tina lébar puncak mangrupikeun masalah anu langkung rumit, sareng urang bakal ngabahas topik ieu dina tulisan anu bakal datang. Bentuk puncak anu sanés dina Gambar 1 nunjukkeun sababaraha kamungkinan sanés anu tiasa dititénan — ku kecap sanésna, sababaraha cara hal-hal tiasa lepat. Dina sésana cicilan ieu, urang bakal nyéépkeun waktos ngabahas sababaraha conto khusus kaayaan anu tiasa nyababkeun jinis-jinis wangun ieu.
Kadang-kadang puncak teu katingali pisan dina kromatogram dimana diperkirakeun bakal diélusi. Bagan témbok di luhur nunjukkeun yén henteuna puncak (anggapan sampel sabenerna ngandung analit target dina konsentrasi anu kedah ngajantenkeun réspon detektor cekap pikeun ningali éta di luhur noise) biasana aya hubunganana sareng sababaraha masalah instrumen atanapi kaayaan fase gerak anu salah (upami katingali pisan). puncak, biasana "lemah teuing"). Daptar pondok masalah sareng solusi poténsial dina kategori ieu tiasa dipendakan dina Tabel I.
Sakumaha anu parantos disebatkeun di luhur, patarosan ngeunaan sabaraha pelebaran puncak anu kedah ditolerir sateuacan merhatoskeun sareng nyobian ngalereskeunana mangrupikeun topik anu rumit anu bakal kuring bahas dina tulisan anu bakal datang. Pangalaman kuring nyaéta pelebaran puncak anu signifikan sering dibarengan ku parobahan anu signifikan dina bentuk puncak, sareng tailing puncak langkung umum tibatan pra-puncak atanapi pamisahan. Nanging, puncak anu sacara nominal simetris ogé dilegaan, anu tiasa disababkeun ku sababaraha alesan anu béda:
Masing-masing masalah ieu parantos dibahas sacara rinci dina edisi Troubleshooting LC sateuacanna, sareng pamiarsa anu resep kana topik ieu tiasa ningali tulisan-tulisan sateuacanna pikeun inpormasi ngeunaan akar masalah sareng solusi poténsial pikeun masalah ieu. Langkung seueur rinci.
Puncak tailing, puncak fronting, sareng pamisahan sadayana tiasa disababkeun ku fénoména kimia atanapi fisik, sareng daptar solusi poténsial pikeun masalah ieu rupa-rupa pisan, gumantung kana naha urang nuju ngungkulan masalah kimia atanapi fisik. Seringna, ku cara ngabandingkeun puncak anu béda dina kromatogram, anjeun tiasa mendakan petunjuk penting ngeunaan saha anu janten panyababna. Upami sadaya puncak dina kromatogram nunjukkeun bentuk anu sami, panyababna kamungkinan sanés fisik. Upami ngan ukur hiji atanapi sababaraha puncak anu kapangaruhan, tapi sésana katingalina saé, panyababna kamungkinan kimia.
Sabab kimiawi tina tailing puncak téh rumit teuing pikeun dibahas sacara singget di dieu. Pamaca anu kabetot dirujuk kana édisi "LC Troubleshooting" anu nembe diterbitkeun pikeun diskusi anu langkung jero (10). Nanging, hal anu gampang dicobian nyaéta ngirangan massa analit anu diinjeksi sareng ningali naha bentuk puncakna ningkat. Upami kitu, maka ieu mangrupikeun petunjuk anu saé yén masalahna nyaéta "kaleuleuwihan massa". Dina hal ieu, metodena kedah diwatesan pikeun nyuntik massa analit alit, atanapi kaayaan kromatografi kedah dirobih supados bentuk puncak anu saé tiasa didapet bahkan kalayan massa anu langkung ageung diinjeksi.
Aya ogé seueur alesan fisik poténsial pikeun puncak tailing. Pamaca anu resep kana diskusi anu lengkep ngeunaan kamungkinan ieu dirujuk ka édisi "LC Troubleshooting" (11) anu nembe diterbitkeun. Salah sahiji panyabab fisik anu paling umum tina puncak tailing nyaéta sambungan anu goréng dina titik antara injektor sareng detektor (12). Conto anu ekstrim dipidangkeun dina Gambar 1d, anu diala di lab kuring sababaraha minggu ka pengker. Dina hal ieu, urang ngawangun sistem kalayan klep injeksi énggal anu teu acan pernah dianggo sateuacanna, sareng masang loop injeksi volume alit kalayan ferrule anu parantos dicetak kana kapiler stainless steel. Saatos sababaraha ékspérimén ngungkulan masalah awal, urang sadar yén jerona port dina stator klep injeksi langkung jero tibatan anu biasa urang lakukeun, ngahasilkeun volume paéh anu ageung di handapeun port. Masalah ieu gampang direngsekeun ku cara ngagentos loop injeksi ku tabung anu sanés, urang tiasa nyaluyukeun ferrule kana posisi anu leres pikeun ngaleungitkeun volume paéh di handapeun port.
Puncak hareup kawas anu dipidangkeun dina Gambar 1e ogé bisa disababkeun ku masalah fisik atawa kimia. Panyabab fisik umum tina ujung hareup nyaéta ranjang partikel kolom teu dipak kalawan hade, atawa partikel geus diatur deui kana waktu. Sapertos puncak tailing anu disababkeun ku fenomena fisik ieu, cara pangalusna pikeun ngalereskeun ieu nyaéta ku ngaganti kolom jeung terus lumangsung. Sacara dasarna, bentuk puncak ujung hareup anu asalna tina kimia sering timbul tina naon anu urang sebut kaayaan ingetan "non-linier". Dina kaayaan idéal (linier), jumlah analit anu ditahan ku fase stasioner (ku kituna, faktor ingetan) sacara linier patali jeung konsentrasi analit dina kolom. Sacara kromatografi, ieu hartina nalika massa analit anu disuntikkeun kana kolom ningkat, puncakna janten langkung jangkung, tapi henteu langkung lega. Hubungan ieu pegat nalika paripolah ingetan non-linier, sareng puncakna henteu ngan ukur janten langkung jangkung tapi ogé langkung lega nalika langkung seueur massa anu disuntikkeun. Salaku tambahan, bentuk nonlinier nangtukeun bentuk puncak kromatografi, anu ngahasilkeun ujung anu ngarah atanapi anu ngaliwat. Sapertos kaleuwihan massa anu nyababkeun puncak tailing (10), Puncak leading anu disababkeun ku ingetan nonlinier ogé tiasa didiagnosis ku cara ngirangan massa analit anu diinjeksikeun. Upami bentuk puncak ningkat, metodena kedah dirobih supados henteu ngaleuwihan kualitas injeksi anu nyababkeun ujung leading, atanapi kaayaan kromatografi kedah dirobih pikeun ngaminimalkeun paripolah ieu.
Kadang-kadang urang niténan naon anu sigana puncak "beulah", sapertos anu dipidangkeun dina Gambar 1f. Léngkah munggaran dina ngarengsekeun masalah ieu nyaéta nangtukeun naha bentuk puncak disababkeun ku ko-élusi parsial (nyaéta, ayana dua sanyawa anu béda tapi raket élusina). Upami aya dua analit anu béda anu padeukeut élusina, maka éta masalah ningkatkeun résolusi na (contona, ku cara ningkatkeun selektivitas, ingetan, atanapi jumlah pelat), sareng puncak "beulah" anu katingali aya hubunganana sareng fisik. Kinerja teu aya hubunganana sareng kolom éta sorangan. Seringna, petunjuk anu paling penting pikeun kaputusan ieu nyaéta naha sadaya puncak dina kromatogram nunjukkeun bentuk beulah, atanapi ngan ukur hiji atanapi dua. Upami ngan ukur hiji atanapi dua, éta sigana masalah ko-élusi; upami sadaya puncak beulah, éta sigana masalah fisik, anu paling dipikaresep aya hubunganana sareng kolom éta sorangan.
Puncak pamisah anu aya hubunganana sareng sipat fisik kolom éta sorangan biasana disababkeun ku frit inlet atanapi outlet anu diblokir sawaréh, atanapi reorganisasi partikel dina kolom, anu ngamungkinkeun fase gerak ngalir langkung gancang tibatan fase gerak di daérah-daérah tertentu dina formasi saluran kolom. di daérah sanés (11). Frit anu diblokir sawaréh kadang tiasa dibersihkeun ku cara ngabalikeun aliran ngalangkungan kolom; kumaha oge, dina pangalaman kuring, ieu biasana solusi jangka pondok tibatan jangka panjang. Ieu sering fatal sareng kolom modéren upami partikel ngahiji deui dina kolom. Dina titik ieu, langkung saé ngagentos kolom sareng teraskeun.
Puncak dina Gambar 1g, ogé tina conto anyar di lab kuring sorangan, biasana nunjukkeun yén sinyalna luhur pisan sahingga parantos ngahontal tungtung luhur tina rentang réspon. Pikeun detektor absorbansi optik (UV-vis dina hal ieu), nalika konsentrasi analit luhur pisan, analit nyerep kalolobaan cahaya anu ngaliwat sél aliran detektor, nyésakeun saeutik pisan cahaya anu tiasa dideteksi. Dina kaayaan ieu, sinyal listrik tina fotodetektor dipangaruhan pisan ku rupa-rupa sumber noise, sapertos cahaya nyasar sareng "arus poék", ngajantenkeun sinyal katingalina "kabur" sareng henteu gumantung kana konsentrasi analit. Nalika ieu kajadian, masalahna sering tiasa direngsekeun kalayan gampang ku cara ngirangan volume injeksi analit — ngirangan volume injeksi, ngencerkeun sampel, atanapi duanana.
Dina sakola kromatografi, urang nganggo sinyal detektor (nyaéta, sumbu-y dina kromatogram) salaku indikator konsentrasi analit dina sampel. Janten sigana anéh ningali kromatogram kalayan sinyal di handap enol, sabab interpretasi saderhana nyaéta ieu nunjukkeun konsentrasi analit négatip - anu tangtosna henteu mungkin sacara fisik. Dina pangalaman kuring, puncak négatip paling sering dititénan nalika nganggo detektor absorbansi optik (contona, UV-vis).
Dina hal ieu, puncak négatif hartina molekul anu kaluar tina kolom nyerep kirang cahaya tibatan fase gerak sorangan sateuacan sareng saatos puncak. Ieu tiasa kajantenan, contona, nalika nganggo panjang gelombang deteksi anu relatif handap (<230 nm) sareng aditif fase gerak anu nyerep kaseueuran cahaya dina panjang gelombang ieu. Aditif sapertos kitu tiasa janten komponén pangleyur fase gerak sapertos metanol atanapi komponén buffer sapertos asetat atanapi format. Urang sabenerna tiasa nganggo puncak négatif pikeun nyiapkeun kurva kalibrasi sareng kéngingkeun inpormasi kuantitatif anu akurat, janten teu aya alesan dasar pikeun nyingkahanana (métode ieu kadang disebut "deteksi UV teu langsung") (13). Nanging, upami urang leres-leres hoyong nyingkahan puncak négatif sadayana, dina kasus deteksi absorbansi, solusi anu pangsaéna nyaéta nganggo panjang gelombang deteksi anu béda supados analit nyerep langkung ti fase gerak, atanapi ngarobih komposisi fase gerak supados Aranjeunna nyerep kirang cahaya tibatan analit.
Puncak négatif ogé tiasa muncul nalika nganggo deteksi indéks bias (RI) nalika indéks bias komponén salian ti analit dina sampel, sapertos matriks pangleyur, béda ti indéks bias fase gerak. Ieu ogé kajadian dina deteksi UV-vis, tapi pangaruh ieu condong dilemahkeun dibandingkeun sareng deteksi RI. Dina dua kasus éta, puncak négatif tiasa diminimalkeun ku cara cocogkeun komposisi matriks sampel sareng fase gerak.
Dina bagian katilu ngeunaan topik dasar ngungkulan masalah LC, kuring ngabahas kaayaan dimana bentuk puncak anu dititénan béda ti bentuk puncak anu dipiharep atanapi normal. Ngungkulan masalah anu efektif pikeun masalah sapertos kitu dimimitian ku pangaweruh ngeunaan bentuk puncak anu dipiharep (dumasar kana téori atanapi pangalaman sateuacanna sareng metode anu aya), janten panyimpangan tina ekspektasi ieu jelas. Masalah bentuk puncak ngagaduhan seueur sabab poténsial anu béda (lebar teuing, buntut, ujung utama, jsb.). Dina cicilan ieu, kuring ngabahas sacara rinci sababaraha alesan anu paling sering kuring tingali. Nyaho rinci ieu nyayogikeun tempat anu saé pikeun ngamimitian ngungkulan masalah, tapi henteu nangkep sadaya kamungkinan. Pamaca anu resep kana daptar sabab sareng solusi anu langkung jero tiasa ningali bagan témbok "Pituduh Ngungkulan Masalah LC" LCGC.
(4) Bagan témbok "Pituduh Ngatasi Masalah LC" LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analisis Data sareng Pamrosésan Sinyal dina Kromatografi (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF sareng Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.