Một số chủ đề khắc phục sự cố LC không bao giờ lỗi thời, vì vẫn luôn có những vấn đề phát sinh trong thực tiễn LC, ngay cả khi công nghệ thiết bị được cải tiến theo thời gian. Có rất nhiều cách mà các vấn đề có thể phát sinh trong hệ thống LC và dẫn đến hình dạng đỉnh kém. Khi các vấn đề liên quan đến hình dạng đỉnh xuất hiện, một danh sách ngắn các nguyên nhân có thể gây ra những kết quả này sẽ giúp đơn giản hóa quá trình khắc phục sự cố của chúng ta.
Viết chuyên mục “Khắc phục sự cố LC” này và suy nghĩ về các chủ đề mỗi tháng thật thú vị, bởi vì một số chủ đề không bao giờ lỗi thời. Trong khi trong lĩnh vực nghiên cứu sắc ký, một số chủ đề hoặc ý tưởng trở nên lỗi thời khi chúng được thay thế bởi những ý tưởng mới hơn và tốt hơn, thì trong lĩnh vực khắc phục sự cố, kể từ khi bài báo khắc phục sự cố đầu tiên xuất hiện trên tạp chí này (tạp chí LC vào thời điểm đó) vào năm 1983 (1), một số chủ đề vẫn còn phù hợp. Trong vài năm qua, tôi đã tập trung một số phần Khắc phục sự cố LC vào các xu hướng đương đại ảnh hưởng đến sắc ký lỏng (LC) (ví dụ: so sánh tương đối về hiểu biết của chúng ta về ảnh hưởng của áp suất lên khả năng giữ lại [2] Những tiến bộ mới), cách chúng ta diễn giải kết quả LC và cách khắc phục sự cố với các thiết bị LC hiện đại. Trong phần này, tôi tiếp tục loạt bài (3) của mình, bắt đầu từ tháng 12 năm 2021, tập trung vào một số chủ đề “sống còn” của việc khắc phục sự cố LC — những yếu tố tuyệt vời cho bất kỳ người khắc phục sự cố nào đều rất cần thiết, bất kể tuổi đời của hệ thống chúng ta đang sử dụng. Chủ đề cốt lõi của loạt bài này rất phù hợp với “Hướng dẫn khắc phục sự cố LC” nổi tiếng của LCGC. biểu đồ (4) treo trong nhiều phòng thí nghiệm. Đối với phần thứ ba của loạt bài này, tôi chọn tập trung vào các vấn đề liên quan đến hình dạng đỉnh hoặc đặc điểm đỉnh. Thật đáng kinh ngạc, biểu đồ treo tường liệt kê 44 nguyên nhân tiềm ẩn khác nhau gây ra hình dạng đỉnh kém! Chúng ta không thể xem xét tất cả các vấn đề này một cách chi tiết trong một bài viết, vì vậy trong phần đầu tiên về chủ đề này, tôi sẽ tập trung vào một số vấn đề mà tôi thường thấy nhất. Tôi hy vọng người dùng LC trẻ tuổi và người dùng lâu năm sẽ tìm thấy một số lời khuyên và nhắc nhở hữu ích về chủ đề quan trọng này.
Tôi thấy mình ngày càng trả lời các câu hỏi khắc phục sự cố bằng câu "mọi thứ đều có thể xảy ra". Câu trả lời này có vẻ dễ dàng khi xem xét các quan sát khó diễn giải, nhưng tôi thấy nó thường phù hợp. Với nhiều nguyên nhân có thể gây ra hình dạng đỉnh kém, điều quan trọng là phải giữ thái độ cởi mở khi xem xét vấn đề có thể là gì, và phải có khả năng ưu tiên các nguyên nhân tiềm tàng để bắt đầu nỗ lực khắc phục sự cố, tập trung vào những khả năng phổ biến nhất, điểm này rất quan trọng.
Một bước quan trọng trong bất kỳ bài tập khắc phục sự cố nào — nhưng tôi nghĩ là bị đánh giá thấp — là nhận ra rằng có một vấn đề cần được giải quyết. Việc nhận ra rằng có một vấn đề thường có nghĩa là nhận ra rằng những gì xảy ra với công cụ khác với kỳ vọng của chúng ta, được hình thành bởi lý thuyết, kiến ​​thức thực nghiệm và kinh nghiệm (5). “Hình dạng đỉnh” được đề cập ở đây thực chất không chỉ đề cập đến hình dạng của đỉnh (đối xứng, không đối xứng, mịn, xốp, cạnh trước, đuôi, v.v.) mà còn cả độ rộng. Kỳ vọng của chúng ta về hình dạng đỉnh thực tế rất đơn giản. Lý thuyết (6) ủng hộ mạnh mẽ kỳ vọng trong sách giáo khoa rằng, trong hầu hết các trường hợp, các đỉnh sắc ký phải đối xứng và phù hợp với hình dạng của phân bố Gaussian, như được hiển thị trong Hình 1a. Những gì chúng ta kỳ vọng từ độ rộng đỉnh là một vấn đề phức tạp hơn, và chúng ta sẽ thảo luận về chủ đề này trong một bài viết sau. Các hình dạng đỉnh khác trong Hình 1 cho thấy một số khả năng khác có thể được quan sát — nói cách khác, một số cách mà mọi thứ có thể sai. Trong phần còn lại của phần này, chúng ta sẽ dành thời gian thảo luận về một số ví dụ cụ thể về các tình huống có thể dẫn đến các kiểu hình dạng này.
Đôi khi, các đỉnh tín hiệu không được quan sát thấy trong sắc ký đồ tại vị trí mà chúng được dự kiến ​​sẽ xuất hiện. Biểu đồ trên cho thấy rằng sự vắng mặt của một đỉnh tín hiệu (giả sử mẫu thực sự chứa chất phân tích mục tiêu ở nồng độ đủ để tín hiệu đầu dò đủ mạnh để phát hiện ra nó trên nền nhiễu) thường liên quan đến một số vấn đề về thiết bị hoặc điều kiện pha động không chính xác (nếu có quan sát thấy). Một danh sách ngắn các vấn đề và giải pháp tiềm ẩn trong trường hợp này có thể được tìm thấy trong Bảng I.
Như đã đề cập ở trên, câu hỏi về mức độ giãn rộng đỉnh nào có thể chấp nhận được trước khi chú ý và cố gắng khắc phục nó là một chủ đề phức tạp mà tôi sẽ thảo luận trong một bài viết khác. Kinh nghiệm của tôi cho thấy sự giãn rộng đỉnh đáng kể thường đi kèm với sự thay đổi đáng kể về hình dạng đỉnh, và hiện tượng kéo dài đuôi đỉnh phổ biến hơn hiện tượng xuất hiện đỉnh trước hoặc tách đỉnh. Tuy nhiên, các đỉnh đối xứng trên danh nghĩa cũng bị giãn rộng, điều này có thể do một vài nguyên nhân khác nhau:
Mỗi vấn đề này đã được thảo luận chi tiết trong các số trước của Troubleshooting LC, và độc giả quan tâm đến các chủ đề này có thể tham khảo các bài viết trước đó để tìm hiểu về nguyên nhân gốc rễ và các giải pháp tiềm năng cho các vấn đề này. Xem thêm chi tiết.
Hiện tượng kéo dài đuôi đỉnh, kéo dài đầu đỉnh và tách đỉnh đều có thể do các hiện tượng hóa học hoặc vật lý gây ra, và danh sách các giải pháp tiềm năng cho những vấn đề này rất đa dạng, tùy thuộc vào việc chúng ta đang đối phó với vấn đề hóa học hay vật lý. Thông thường, bằng cách so sánh các đỉnh khác nhau trong sắc ký đồ, bạn có thể tìm ra những manh mối quan trọng về nguyên nhân gây ra vấn đề. Nếu tất cả các đỉnh trong sắc ký đồ đều có hình dạng tương tự, nguyên nhân rất có thể không phải do vật lý. Nếu chỉ có một hoặc một vài đỉnh bị ảnh hưởng, nhưng các đỉnh còn lại vẫn bình thường, nguyên nhân rất có thể là do hóa học.
Nguyên nhân hóa học của hiện tượng kéo dài đỉnh quá phức tạp để thảo luận ngắn gọn ở đây. Người đọc quan tâm có thể tham khảo số gần đây của “Khắc phục sự cố LC” để có thảo luận chuyên sâu hơn (10). Tuy nhiên, một điều dễ thử là giảm khối lượng chất phân tích được tiêm và xem hình dạng đỉnh có được cải thiện hay không. Nếu vậy, thì đây là một manh mối tốt cho thấy vấn đề là “quá tải khối lượng”. Trong trường hợp này, phương pháp phải được giới hạn ở việc tiêm khối lượng chất phân tích nhỏ, hoặc các điều kiện sắc ký phải được thay đổi để có thể thu được hình dạng đỉnh tốt ngay cả khi tiêm khối lượng lớn hơn.
Ngoài ra còn có nhiều nguyên nhân vật lý tiềm ẩn gây ra hiện tượng đuôi đỉnh. Độc giả quan tâm đến thảo luận chi tiết về các khả năng có thể được giới thiệu đến một số ấn phẩm gần đây khác của “Khắc phục sự cố LC” (11). Một trong những nguyên nhân vật lý phổ biến hơn gây ra hiện tượng đuôi đỉnh là kết nối kém tại điểm giữa bộ phun và bộ dò (12). Một ví dụ cực đoan được thể hiện trong Hình 1d, thu được trong phòng thí nghiệm của tôi vài tuần trước. Trong trường hợp này, chúng tôi đã xây dựng một hệ thống với một van phun mới mà chúng tôi chưa từng sử dụng trước đây và lắp đặt một vòng phun thể tích nhỏ với một vòng đệm được đúc trên một ống mao dẫn bằng thép không gỉ. Sau một số thí nghiệm khắc phục sự cố ban đầu, chúng tôi nhận ra rằng độ sâu của cổng trong stato của van phun sâu hơn nhiều so với chúng tôi thường dùng, dẫn đến một thể tích chết lớn ở đáy cổng. Vấn đề này dễ dàng được giải quyết bằng cách thay thế vòng phun bằng một ống khác, chúng ta có thể điều chỉnh vòng đệm đến vị trí thích hợp để loại bỏ thể tích chết ở đáy cổng.
Các đỉnh phía trước như được hiển thị trong Hình 1e cũng có thể do các vấn đề vật lý hoặc hóa học gây ra. Một nguyên nhân vật lý phổ biến của cạnh trước là do lớp hạt trong cột không được đóng gói tốt, hoặc các hạt đã sắp xếp lại theo thời gian. Cũng như hiện tượng đuôi đỉnh do hiện tượng vật lý này gây ra, cách tốt nhất để khắc phục là thay thế cột và tiếp tục. Về cơ bản, hình dạng đỉnh cạnh trước có nguồn gốc hóa học thường phát sinh từ những gì chúng ta gọi là điều kiện giữ lại “phi tuyến tính”. Trong điều kiện lý tưởng (tuyến tính), lượng chất phân tích được giữ lại bởi pha tĩnh (do đó, hệ số giữ lại) có mối quan hệ tuyến tính với nồng độ chất phân tích trong cột. Về mặt sắc ký, điều này có nghĩa là khi khối lượng chất phân tích được tiêm vào cột tăng lên, đỉnh trở nên cao hơn, nhưng không rộng hơn. Mối quan hệ này bị phá vỡ khi hành vi giữ lại là phi tuyến tính, và các đỉnh không chỉ trở nên cao hơn mà còn rộng hơn khi khối lượng được tiêm vào nhiều hơn. Ngoài ra, hình dạng phi tuyến tính xác định hình dạng của các đỉnh sắc ký, dẫn đến các cạnh trước hoặc cạnh sau. Cũng như hiện tượng quá tải khối lượng gây ra đuôi đỉnh (10), đỉnh phía trước Hiện tượng giữ lại không tuyến tính cũng có thể được chẩn đoán bằng cách giảm khối lượng chất phân tích được tiêm vào. Nếu hình dạng đỉnh được cải thiện, phương pháp phải được điều chỉnh để không vượt quá chất lượng tiêm gây ra hiện tượng cạnh dẫn đầu, hoặc các điều kiện sắc ký phải được thay đổi để giảm thiểu hiện tượng này.
Đôi khi chúng ta quan sát thấy những gì dường như là một đỉnh “tách rời”, như thể hiện trong Hình 1f. Bước đầu tiên để giải quyết vấn đề này là xác định xem hình dạng đỉnh có phải do sự đồng rửa giải một phần (tức là sự hiện diện của hai hợp chất khác nhau nhưng rửa giải gần nhau) hay không. Nếu thực sự có hai chất phân tích khác nhau rửa giải gần nhau, thì đó là vấn đề cải thiện độ phân giải của chúng (ví dụ: bằng cách tăng tính chọn lọc, thời gian lưu giữ hoặc số đĩa), và các đỉnh “tách rời” rõ ràng có liên quan đến hiệu suất vật lý, không liên quan gì đến bản thân cột sắc ký. Thông thường, manh mối quan trọng nhất để đưa ra quyết định này là liệu tất cả các đỉnh trong sắc ký đồ có hình dạng tách rời hay chỉ một hoặc hai đỉnh. Nếu chỉ có một hoặc hai đỉnh bị tách rời, thì có lẽ đó là vấn đề đồng rửa giải; nếu tất cả các đỉnh đều bị tách rời, thì có lẽ đó là vấn đề vật lý, rất có thể liên quan đến chính cột sắc ký.
Các đỉnh tách liên quan đến các đặc tính vật lý của chính cột thường là do các tấm lọc đầu vào hoặc đầu ra bị tắc một phần, hoặc do sự sắp xếp lại các hạt trong cột, cho phép pha động chảy nhanh hơn pha động ở một số khu vực của quá trình hình thành kênh cột ở các khu vực khác (11). Tấm lọc bị tắc một phần đôi khi có thể được làm sạch bằng cách đảo ngược dòng chảy qua cột; tuy nhiên, theo kinh nghiệm của tôi, đây thường là giải pháp ngắn hạn chứ không phải lâu dài. Điều này thường gây hậu quả nghiêm trọng với các cột hiện đại nếu các hạt kết hợp lại bên trong cột. Tại thời điểm này, tốt nhất là nên thay thế cột và tiếp tục.
Đỉnh trong Hình 1g, cũng từ một trường hợp gần đây trong phòng thí nghiệm của tôi, thường cho thấy tín hiệu quá cao đến mức đã đạt đến giới hạn trên của phạm vi đáp ứng. Đối với các đầu dò hấp thụ quang học (UV-vis trong trường hợp này), khi nồng độ chất phân tích rất cao, chất phân tích sẽ hấp thụ hầu hết ánh sáng đi qua buồng dòng của đầu dò, chỉ còn lại rất ít ánh sáng để được phát hiện. Trong điều kiện này, tín hiệu điện từ bộ tách sóng quang bị ảnh hưởng mạnh bởi nhiều nguồn nhiễu khác nhau, chẳng hạn như ánh sáng lạc và "dòng điện tối", làm cho tín hiệu trông rất "mờ" và không phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích. Khi điều này xảy ra, vấn đề thường có thể dễ dàng được giải quyết bằng cách giảm thể tích tiêm chất phân tích - giảm thể tích tiêm, pha loãng mẫu hoặc cả hai.
Trong trường đào tạo sắc ký, chúng ta sử dụng tín hiệu của đầu dò (tức là trục y trong sắc ký đồ) làm chỉ thị cho nồng độ chất phân tích trong mẫu. Vì vậy, có vẻ kỳ lạ khi thấy một sắc ký đồ có tín hiệu dưới 0, vì cách giải thích đơn giản là điều này cho thấy nồng độ chất phân tích âm – điều này tất nhiên là không thể về mặt vật lý. Theo kinh nghiệm của tôi, các đỉnh âm thường được quan sát thấy khi sử dụng đầu dò hấp thụ quang học (ví dụ: UV-vis).
Trong trường hợp này, đỉnh âm đơn giản có nghĩa là các phân tử thoát ra khỏi cột hấp thụ ít ánh sáng hơn chính pha động ngay trước và sau đỉnh. Điều này có thể xảy ra, ví dụ, khi sử dụng bước sóng phát hiện tương đối thấp (<230 nm) và các chất phụ gia pha động hấp thụ hầu hết ánh sáng ở các bước sóng này. Các chất phụ gia như vậy có thể là các thành phần dung môi pha động như metanol hoặc các thành phần đệm như axetat hoặc format. Trên thực tế, người ta có thể sử dụng các đỉnh âm để chuẩn bị đường cong hiệu chuẩn và thu được thông tin định lượng chính xác, vì vậy không có lý do cơ bản nào để tránh chúng (phương pháp này đôi khi được gọi là “phát hiện UV gián tiếp”) (13). Tuy nhiên, nếu chúng ta thực sự muốn tránh hoàn toàn các đỉnh âm, trong trường hợp phát hiện độ hấp thụ, giải pháp tốt nhất là sử dụng bước sóng phát hiện khác để chất phân tích hấp thụ nhiều hơn pha động, hoặc thay đổi thành phần của pha động để chúng hấp thụ ít ánh sáng hơn chất phân tích.
Các đỉnh âm cũng có thể xuất hiện khi sử dụng phương pháp phát hiện chỉ số khúc xạ (RI) nếu chỉ số khúc xạ của các thành phần khác ngoài chất phân tích trong mẫu, chẳng hạn như ma trận dung môi, khác với chỉ số khúc xạ của pha động. Điều này cũng xảy ra với phương pháp phát hiện UV-vis, nhưng hiệu ứng này có xu hướng giảm nhẹ hơn so với phương pháp phát hiện RI. Trong cả hai trường hợp, các đỉnh âm có thể được giảm thiểu bằng cách lựa chọn thành phần ma trận mẫu sao cho phù hợp hơn với thành phần của pha động.
Trong phần ba về chủ đề cơ bản khắc phục sự cố LC, tôi đã thảo luận về các trường hợp hình dạng đỉnh quan sát được khác với hình dạng đỉnh dự kiến ​​hoặc bình thường. Việc khắc phục sự cố hiệu quả đối với các vấn đề như vậy bắt đầu bằng việc nắm rõ hình dạng đỉnh dự kiến ​​(dựa trên lý thuyết hoặc kinh nghiệm trước đó với các phương pháp hiện có), để những sai lệch so với những kỳ vọng này là dễ nhận biết. Các vấn đề về hình dạng đỉnh có nhiều nguyên nhân tiềm ẩn khác nhau (quá rộng, đuôi, cạnh trước, v.v.). Trong phần này, tôi sẽ thảo luận chi tiết về một số nguyên nhân mà tôi thường gặp nhất. Việc nắm rõ những chi tiết này cung cấp một điểm khởi đầu tốt để khắc phục sự cố, nhưng không bao quát hết tất cả các khả năng. Độc giả quan tâm đến danh sách chi tiết hơn về các nguyên nhân và giải pháp có thể tham khảo biểu đồ "Hướng dẫn khắc phục sự cố LC" của LCGC.
(4) Biểu đồ treo tường “Hướng dẫn khắc phục sự cố LC” của LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Phân tích dữ liệu và xử lý tín hiệu trong sắc ký (Elsevier, New York, NY, 1998), trang 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF và Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.