Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS anu terbatas. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo browser anu diénggalan (atanapi mareuman Modeu Kompatibilitas dina Internet Explorer). Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngarender situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Métode imunologis sareng spéktrométri massa anyar pikeun analisis kompléks oligosakarida persisten dina kompor jagong anu parantos diolah nganggo AFEX. Biomassa lignoselulosa mangrupikeun alternatif anu lestari pikeun bahan bakar fosil sareng seueur dianggo pikeun ngembangkeun biotéhnologi pikeun produksi produk sapertos dahareun, pakan, bahan bakar sareng bahan kimia. Konci pikeun téknologi ieu nyaéta pamekaran prosés anu kompetitif biaya pikeun ngarobih karbohidrat kompléks anu aya dina témbok sél pepelakan janten gula saderhana sapertos glukosa, xilosa sareng arabinosa. Kusabab biomassa lignoselulosa bandel pisan, éta kedah ngalaman perlakuan termokimia (contona, pengelupasan serat amonia (AFEX), asam encer (DA), cairan ionik (IL)) sareng perlakuan biologis (contona, hidrolisis énzimatik sareng fermentasi mikroba) digabungkeun pikeun kéngingkeun produk anu dipikahoyong. Nanging, nalika énzim jamur komérsial dianggo dina prosés hidrolisis, ngan ukur 75-85% tina gula anu leyur anu kabentuk nyaéta monosakarida, sareng sésana 15-25% nyaéta oligosakarida anu leyur sareng teu tiasa diubaran, anu henteu salawasna sayogi pikeun mikroorganisme. Saméméhna, urang geus hasil ngasingkeun jeung ngamurnikeun oligosakarida anu bandel anu leyur ngagunakeun kombinasi kromatografi pamisahan jeung pangaluaran ukuran karbon jeung taneuh diatom, sarta ogé nalungtik sipat inhibisi énzimna. Urang geus manggihan yén oligosakarida anu ngandung tingkat polimérisasi (DP) anu leuwih luhur tina substitusi asam uronat termetilasi leuwih hésé diprosés ku campuran énzim komérsial tibatan oligosakarida DP rendah jeung nétral. Di dieu urang ngalaporkeun panggunaan sababaraha métode tambahan, kaasup profil glikan ngagunakeun antibodi monoklonal (mAbs) husus pikeun glikan biomassa tutuwuhan pikeun ngacirikeun beungkeut glikan dina témbok sél tutuwuhan jeung hidrolisat énzimatik, ionisasi desorpsi laser anu dibantuan matriks, spéktrométri massa waktu-penerbangan. . MALDI-TOF-MS) ngagunakeun puncak diagnostik informatif struktur anu diala ku spéktroskopi sanggeus buruk sekundér ion négatip, kromatografi gas jeung spéktrométri massa (GC-MS) pikeun ngacirikeun beungkeut oligosakarida kalayan jeung tanpa derivatisasi. Kusabab ukuran oligosakarida anu leutik (DP 4–20), molekul-molekul ieu hésé dianggo pikeun ngabeungkeut sareng karakterisasi mAb. Pikeun ngungkulan masalah ieu, kami nerapkeun metode imobilisasi oligosakarida dumasar konjugasi biotin énggal anu suksés ngalabel mayoritas oligosakarida leyur DP rendah dina permukaan mikroplat, anu teras dianggo dina sistem mAb throughput tinggi pikeun analisis ligasi khusus. Metodeu anyar ieu bakal ngagampangkeun pamekaran uji glikome throughput tinggi anu langkung maju di masa depan anu tiasa dianggo pikeun ngasingkeun sareng ngacirikeun oligosakarida anu aya dina biomarker pikeun tujuan diagnostik.
Biomassa lignoselulosa, anu diwangun ku bahan tatanén, kehutanan, jukut sareng kai, mangrupikeun bahan baku poténsial pikeun produksi produk berbasis bio, kalebet dahareun, pakan, bahan bakar sareng prékursor kimia pikeun ngahasilkeun produk anu langkung berharga1. Karbohidrat (sapertos selulosa sareng hemiselulosa) anu aya dina témbok sél pepelakan didepolimerisasi janten monosakarida ku cara ngolah kimia sareng biotransformasi (sapertos hidrolisis énzimatik sareng fermentasi mikroba). Pra-perawatan umum kalebet ékspansi serat amonia (AFEX), asam éncer (DA), cairan ionik (IL), sareng ledakan uap (SE), anu nganggo kombinasi bahan kimia sareng panas pikeun ngirangan produksi lignoselulosa ku cara muka témbok sél pepelakan3,4. kakerasan zat, 5. Hidrolisis énzimatik dilaksanakeun dina beban padet anu luhur nganggo énzim anu ngandung karbohidrat aktif komérsial (CAZymes) sareng fermentasi mikroba nganggo ragi atanapi baktéri transgenik pikeun ngahasilkeun bahan bakar sareng bahan kimia berbasis bio6.
CAZyme dina énzim komérsial diwangun ku campuran énzim kompléks anu sacara sinergis megatkeun beungkeut karbohidrat-gula kompléks pikeun ngabentuk monosakarida2,7. Sapertos anu kami laporkeun sateuacanna, jaringan kompléks polimér aromatik lignin sareng karbohidrat ngajantenkeun aranjeunna hésé pisan diubaran, anu nyababkeun konvérsi gula anu teu lengkep, ngumpulkeun 15-25% oligosakarida séks anu henteu dihasilkeun nalika hidrolisis énzimatik tina biomassa anu parantos diolah sateuacanna. Ieu mangrupikeun masalah umum sareng rupa-rupa metode pretreatment biomassa. Sababaraha alesan pikeun hambatan ieu kalebet inhibisi énzim nalika hidrolisis, atanapi henteuna atanapi tingkat énzim penting anu diperyogikeun pikeun megatkeun beungkeut gula dina biomassa pepelakan. Ngartos komposisi sareng karakteristik struktural gula, sapertos beungkeut gula dina oligosakarida, bakal ngabantosan urang ningkatkeun konvérsi gula nalika hidrolisis, ngajantenkeun prosés biotéhnologi kompetitif biaya sareng produk anu diturunkeun tina minyak bumi.
Nangtukeun struktur karbohidrat téh nangtang sarta merlukeun kombinasi métode saperti kromatografi cair (LC)11,12, spéktroskopi résonansi magnét nuklir (NMR)13, éléktroforésis kapiler (CE)14,15,16 jeung spéktrométri massa (MS)17.,dalapan belas. Métode MS saperti spéktrométri massa time-of-flight kalawan désorpsi laser sarta ionisasi ngagunakeun matriks (MALDI-TOF-MS) mangrupa métode serbaguna pikeun ngaidentipikasi struktur karbohidrat. Anyar-anyar ieu, tandem Disosiasi anu Diinduksi Tabrakan (CID) tina adduct ion natrium geus paling loba dipaké pikeun ngaidentipikasi sidik jari anu pakait jeung posisi kantétan oligosakarida, konfigurasi anomerik, runtuyan, sarta posisi percabangan 20, 21.
Analisis glikan mangrupikeun alat anu saé pisan pikeun idéntifikasi beungkeut karbohidrat anu jero22. Métode ieu nganggo antibodi monoklonal (mAbs) anu diarahkeun ka glikan témbok sél tutuwuhan salaku probe pikeun ngartos beungkeutan karbohidrat kompléks. Langkung ti 250 mAb sayogi di sakumna dunya, dirancang ngalawan rupa-rupa oligosakarida linier sareng cabang nganggo rupa-rupa sakarida24. Sababaraha mAb parantos seueur dianggo pikeun ngacirikeun struktur, komposisi, sareng modifikasi témbok sél tutuwuhan, sabab aya béda anu signifikan gumantung kana jinis sél tutuwuhan, organ, umur, tahapan kamekaran, sareng lingkungan kamekaran25,26. Langkung énggal, metode ieu parantos dianggo pikeun ngartos populasi vesikel dina sistem tutuwuhan sareng sato sareng peran masing-masing dina transportasi glikan sakumaha anu ditangtukeun ku spidol subselular, tahapan kamekaran, atanapi rangsangan lingkungan, sareng pikeun nangtukeun aktivitas énzimatik. Sababaraha struktur glikan sareng xilan anu parantos diidéntifikasi kalebet pektin (P), xilan (X), mannan (M), xiloglukan (XylG), glukan ikatan campuran (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomanan (GalG), asam glukuronat-arabinoksilan (GArbX) sareng arabino-galaktan (ArbG)29.
Nanging, sanaos sadaya upaya panilitian ieu, ngan ukur sababaraha panilitian anu museur kana sifat akumulasi oligosakarida salami hidrolisis beban padet anu luhur (HSL), kalebet pelepasan oligosakarida, parobahan panjang ranté oligomerik salami hidrolisis, rupa-rupa polimér DP rendah, sareng kurva na. distribusi 30,31,32. Samentawis éta, sanaos analisis glikan parantos kabuktosan janten alat anu mangpaat pikeun analisis komprehensif ngeunaan struktur glikan, hésé pikeun meunteun oligosakarida DP rendah anu leyur dina cai nganggo metode antibodi. Oligosakarida DP anu langkung alit kalayan beurat molekul kirang ti 5-10 kDa henteu ngabeungkeut kana pelat ELISA 33, 34 sareng dikumbah sateuacan ditambahkeun antibodi.
Di dieu, pikeun kahiji kalina, urang nunjukkeun uji ELISA dina pelat anu dilapis avidin nganggo antibodi monoklonal, ngagabungkeun prosedur biotinilasi hiji léngkah pikeun oligosakarida refraktori leyur sareng analisis glikome. Pendekatan urang kana analisis glikome divalidasi ku analisis MALDI-TOF-MS sareng GC-MS dumasar kana beungkeut oligosakarida komplementer nganggo derivatisasi trimetilsilil (TMS) tina komposisi gula anu dihidrolisis. Pendekatan inovatif ieu tiasa dikembangkeun salaku metode throughput anu luhur di hareup sareng mendakan aplikasi anu langkung lega dina panalungtikan biomédis35.
Modifikasi pasca-translasi énzim sareng antibodi, sapertos glikosilasi,36 mangaruhan aktivitas biologisna. Salaku conto, parobahan dina glikosilasi protéin sérum maénkeun peran penting dina radang sendi, sareng parobahan dina glikosilasi dianggo salaku pananda diagnostik37. Rupa-rupa glikan parantos dilaporkeun dina literatur gampang muncul dina rupa-rupa panyakit, kalebet panyakit radang kronis dina saluran pencernaan sareng ati, inféksi virus, kanker ovarium, payudara, sareng prostat38,39,40. Ngartos struktur glikan nganggo metode ELISA glikan berbasis antibodi bakal masihan kapercayaan tambahan dina diagnosis panyakit tanpa nganggo metode MS anu rumit.
Panilitian kami sateuacanna nunjukkeun yén oligosakarida anu bandel tetep teu dihidrolisis saatos perlakuan awal sareng hidrolisis énzimatik (Gambar 1). Dina karya kami anu diterbitkeun sateuacanna, kami ngembangkeun metode ékstraksi fase padet areng aktif pikeun ngasingkeun oligosakarida tina hidrolisat jagong anu dirawat sateuacanna ku AFEX (ACSH)8. Saatos ékstraksi sareng pamisahan awal, oligosakarida salajengna difraksinasi ku kromatografi pangaluaran ukuran (SEC) sareng dikumpulkeun dumasar kana beurat molekul. Monomer gula sareng oligomer anu dileupaskeun tina rupa-rupa perlakuan awal dianalisis ku analisis komposisi gula. Nalika ngabandingkeun eusi oligomer gula anu diala ku rupa-rupa metode perlakuan awal, ayana oligosakarida anu bandel mangrupikeun masalah umum dina konvérsi biomassa janten monosakarida sareng tiasa nyababkeun panurunan hasil gula sahenteuna 10-15% sareng bahkan dugi ka 18%. AS. Metode ieu dianggo pikeun produksi fraksi oligosakarida skala ageung salajengna. ACH anu dihasilkeun sareng fraksi salajengna kalayan beurat molekul anu béda dianggo salaku bahan ékspérimén pikeun karakterisasi oligosakarida dina karya ieu.
Saatos perlakuan awal sareng hidrolisis énzimatik, oligosakarida anu tetep tetep teu dihidrolisis. Di dieu (A) mangrupikeun metode pamisahan oligosakarida dimana oligosakarida diisolasi tina hidrolisat jagong anu parantos dirawat AFEX (ACSH) nganggo lapisan karbon aktif sareng taneuh diatom anu dipak; (B) Metode pikeun pamisahan oligosakarida. Oligosakarida salajengna dipisahkeun ku kromatografi pengecualian ukuran (SEC); (C) Monomer sareng oligomer sakarida anu dileupaskeun tina rupa-rupa perlakuan awal (asam éncér: DA, cairan ionik: IL sareng AFEX). Kaayaan hidrolisis énzimatik: beban padet anu luhur 25% (w/w) (kira-kira 8% beban glukan), hidrolisis 96 jam, beban énzim komérsial 20 mg/g (rasio Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) sareng (D) Monomer sareng oligomer gula glukosa, xilosa sareng arabinosa anu dileupaskeun tina jagong anu parantos dirawat AFEX (ACS).
Analisis glikan parantos kabuktosan janten alat anu kapaké pikeun analisis struktural glikan anu komprehensif dina ekstrak anu diisolasi tina résidu biomassa padet. Nanging, sakarida anu leyur dina cai kirang diwakilan nganggo metode tradisional ieu41 sabab oligosakarida beurat molekul rendah hésé diimobilisasi dina pelat ELISA sareng dikumbah sateuacan ditambahkeun antibodi. Ku alatan éta, pikeun ngabeungkeut sareng karakterisasi antibodi, metode biotinilasi hiji léngkah dianggo pikeun ngalapis oligosakarida anu leyur sareng henteu patuh kana pelat ELISA anu dilapis avidin. Metode ieu diuji nganggo ACSH anu diproduksi sateuacanna sareng fraksi dumasar kana beurat molekulna (atanapi tingkat polimérisasi, DP). Biotinilasi hiji léngkah dianggo pikeun ningkatkeun afinitas ngabeungkeut oligosakarida ku cara nambihan biotin-LC-hidrazida kana tungtung réduksi karbohidrat (Gambar 2). Dina leyuran, gugus hemiacetal dina tungtung réduksi meta sareng gugus hidrazida biotin-LC-hidrazida pikeun ngabentuk beungkeut hidrazon. Ku ayana agén pangurang NaCNBH3, beungkeut hidrazon diréduksi jadi produk ahir biotinilasi anu stabil. Kalayan modifikasi tungtung pangurang gula, pangiket oligosakarida DP rendah kana pelat ELISA janten mungkin, sareng dina panilitian kami ieu dilakukeun dina pelat anu dilapis avidin nganggo mAbs anu ditujukeun ku glikan.
Panyaringan antibodi monoklonal dumasar kana ELISA pikeun oligosakarida biotinilasi. Di dieu (A) biotinilasi gabungan oligosakarida sareng panyaringan ELISA salajengna nganggo mAbs anu ditujukeun glikan dina pelat anu dilapis NeutrAvidin sareng (B) nunjukkeun prosedur hiji léngkah pikeun biotinilasi produk réaksi.
Pelat anu dilapis ku Avidin sareng antibodi konjugasi oligosakarida teras ditambahkeun kana antibodi primér sareng sekundér teras dikumbah dina média anu sénsitip kana cahaya sareng waktos. Saatos pangiket antibodi réngsé, tambahkeun substrat TMB pikeun ngainkubasi pelat. Réaksi pamustunganana dieureunkeun ku asam sulfat. Pelat anu diinkubasi dianalisis nganggo pamaca ELISA pikeun nangtukeun kakuatan pangiket unggal antibodi pikeun ngadeteksi cross-linking spésifik antibodi. Pikeun detil sareng parameter ékspérimén, tingali bagian anu saluyu "Bahan sareng Métode".
Kami nunjukkeun mangpaat tina metode anu nembé dikembangkeun ieu pikeun aplikasi khusus ku cara ngacirikeun oligosakarida leyur anu aya dina ACSH ogé dina fraksi oligosakarida atah sareng murni anu diisolasi tina hidrolisat lignoselulosa. Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar 3, xilan anu disubstitusi epitop anu paling umum anu diidentifikasi dina ACSH nganggo metode uji glikome bioasilasi biasana uronik (U) atanapi metiluronik (MeU) sareng arabinogalactan pektik. Kaseueuran ogé kapanggih dina panilitian kami sateuacana ngeunaan analisis glikan tina padatan anu henteu dihidrolisis (UHS)43.
Deteksi epitop oligosakarida rekalsitran nganggo antibodi monoklonal anu diarahkeun kana glikan témbok sél. Fraksi "nétral" nyaéta fraksi ACN sareng fraksi "asam" nyaéta fraksi FA. Beureum anu langkung caang dina peta panas nunjukkeun eusi epitop anu langkung luhur, sareng biru anu langkung caang nunjukkeun latar tukang kosong. Nilai warna dina skala dumasar kana nilai OD atah pikeun formulasi N=2. Epitop utama anu dikenal ku antibodi dipidangkeun di katuhu.
Struktur non-selulosa ieu teu tiasa dibeulah ku selulase sareng hemiselulase anu paling umum dina campuran énzim komérsial anu diuji, anu kalebet énzim komérsial anu paling umum dianggo. Ku alatan éta, énzim bantu anyar diperyogikeun pikeun hidrolisisna. Tanpa énzim aksésoris non-selulosa anu diperyogikeun, beungkeut non-selulosa ieu nyegah konvérsi lengkep kana monosakarida, sanaos polimér gula indukna dihidrolisis sacara éksténsif kana fragmen anu langkung pondok sareng leyur nganggo campuran énzim komérsial.
Panilitian salajengna ngeunaan distribusi sinyal sareng kakuatan pangiketna nunjukkeun yén epitop pangiket langkung handap dina fraksi gula DP anu luhur (A, B, C, DP dugi ka 20+) tibatan dina fraksi DP anu handap (D, E, F, DP) dina dimer) (Gambar 1). Fragmen asam langkung umum dina epitop non-selulosa tibatan fragmen nétral. Fenomena ieu saluyu sareng pola anu dititénan dina panilitian kami sateuacana, dimana DP anu luhur sareng gugus asam langkung tahan kana hidrolisis énzimatik. Ku alatan éta, ayana epitop glikan non-selulosa sareng substitusi U sareng MeU tiasa nyumbang pisan kana stabilitas oligosakarida. Perlu dicatet yén efisiensi pangiket sareng deteksi tiasa janten masalah pikeun oligosakarida DP anu handap, khususna upami epitop mangrupikeun oligosakarida dimerik atanapi trimerik. Ieu tiasa diuji nganggo oligosakarida komérsial anu panjangna béda-béda, masing-masing ngan ukur ngandung hiji epitop anu ngabeungkeut kana mAb khusus.
Ku kituna, panggunaan antibodi anu spésifik kana struktur ngungkabkeun sababaraha jinis beungkeut bandel. Gumantung kana jinis antibodi anu dianggo, pola ligasi anu pas, sareng kakuatan sinyal anu dihasilkeun (paling seueur sareng paling saeutik), énzim énggal tiasa diidentifikasi sareng ditambahkeun sacara semi-kuantitatif kana campuran énzim pikeun glikokonversi anu langkung lengkep. Nyandak analisis oligosakarida ACSH salaku conto, urang tiasa nyiptakeun database beungkeut glikan pikeun unggal bahan biomassa. Perlu dicatet di dieu yén afinitas antibodi anu béda kedah diperhatoskeun, sareng upami afinitasna henteu dipikanyaho, ieu bakal nyiptakeun kasusah anu tangtu nalika ngabandingkeun sinyal antibodi anu béda. Salaku tambahan, babandingan beungkeut glikan tiasa dianggo pangsaéna antara sampel pikeun antibodi anu sami. Beungkeut anu bandel ieu teras tiasa dihubungkeun kana database CAZyme, ti mana urang tiasa ngaidentipikasi énzim, milih calon énzim sareng nguji énzim anu megatkeun beungkeut, atanapi ngembangkeun sistem mikroba pikeun ngébréhkeun énzim ieu pikeun dianggo dina biorefineries44.
Pikeun meunteun kumaha metode imunologis ngalengkepan metode alternatif pikeun ngacirikeun oligosakarida beurat molekul rendah anu aya dina hidrolisat lignoselulosa, urang ngalaksanakeun MALDI (Gambar 4, S1-S8) sareng analisis sakarida anu diturunkeun tina TMS dumasar kana GC-MS dina bagian oligosakarida panel anu sami (Gambar 5). MALDI dianggo pikeun ngabandingkeun naha distribusi massa molekul oligosakarida cocog sareng struktur anu dimaksud. Dina gambar 4 nunjukkeun MS tina komponén nétral ACN-A sareng ACN-B. Analisis ACN-A mastikeun rupa-rupa gula pentosa ti mimiti DP 4–8 (Gambar 4) dugi ka DP 22 (Gambar S1), anu beuratna pakait sareng oligosakarida MeU-xylan. Analisis ACN-B mastikeun séri pentosa sareng glukoksilan sareng DP 8-15. Dina bahan tambahan sapertos Gambar S3, peta distribusi massa gugus asam FA-C nunjukkeun rentang gula pentosa anu disubstitusi (Me)U kalayan DP 8-15 anu konsisten sareng xilan anu disubstitusi anu kapanggih dina panyaringan mAb berbasis ELISA. Epitopna konsisten.
Spéktrum MALDI-MS tina oligosakarida anu teu patuh kana aturan anu leyur anu aya dina ACS. Di dieu, (A) Fraksi rentang beurat rendah ACN-A anu ngandung oligosakarida glukuroksilan anu disubstitusi ku asam uronat termetilasi (DP 4-8) sareng (B) oligosakarida ACN-B xylan sareng asam uronat termetilasi anu disubstitusi ku glukuroksilan (DP 8-15).
Analisis komposisi résidu glikan tina oligosakarida refraktori. Di dieu (A) Komposisi sakarida TMS tina rupa-rupa fraksi oligosakarida anu diala nganggo analisis GC-MS. (B) Struktur rupa-rupa gula turunan TMS anu aya dina oligosakarida. ACN – fraksi asetonitril anu ngandung oligosakarida nétral sareng FA – fraksi asam ferulat anu ngandung oligosakarida asam.
Kacindekan anu pikaresepeun deui dicandak tina analisis LC-MS tina fraksi oligosakarida, sapertos anu dipidangkeun dina Gambar S9 (métode tiasa ditingali dina bahan tambahan éléktronik). Fragmen gugus heksosa sareng -OAc dititénan sacara berulang nalika ligasi fraksi ACN-B. Panemuan ieu henteu ngan ukur mastikeun fragmentasi anu dititénan dina analisis glikomé sareng MALDI-TOF, tapi ogé nyayogikeun inpormasi énggal ngeunaan turunan karbohidrat poténsial dina biomassa lignoselulosa anu parantos diolah sateuacanna.
Kami ogé ngalaksanakeun analisis komposisi glikan tina fraksi oligosakarida nganggo derivatisasi glikan TMS. Nganggo GC-MS, kami nangtukeun komposisi gula saraf (non-turunan) sareng gula asam (GluA sareng GalA) dina fraksi oligosakarida (Gambar 5). Asam glukuronat kapanggih dina komponén asam C sareng D, sedengkeun asam galakturonat kapanggih dina komponén asam A sareng B, duanana mangrupikeun komponén DP anu luhur tina gula asam. Hasil ieu henteu ngan ukur mastikeun data ELISA sareng MALDI kami, tapi ogé konsisten sareng panilitian kami sateuacana ngeunaan akumulasi oligosakarida. Ku alatan éta, kami yakin yén metode imunologis modéren anu nganggo biotinilasi oligosakarida sareng panyaringan ELISA salajengna cekap pikeun ngadeteksi oligosakarida rekalsitran anu leyur dina rupa-rupa sampel biologis.
Kusabab metode panyaringan mAb berbasis ELISA parantos divalidasi ku sababaraha metode anu béda, kami hoyong langkung ngajalajah poténsi metode kuantitatif énggal ieu. Dua oligosakarida komérsial, oligosakarida xylohexakarida (XHE) sareng 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriosa (A2XX), dipésér sareng diuji nganggo pendekatan mAb énggal anu nargétkeun glikan témbok sél. Gambar 6 nunjukkeun korélasi linier antara sinyal beungkeutan biotinilasi sareng konsentrasi log konsentrasi oligosakarida, nunjukkeun kamungkinan modél adsorpsi Langmuir. Di antara mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, sareng CCRC-M151 berkorelasi sareng XHE, sareng CCRC-M108, CCRC-M109, sareng LM11 berkorelasi sareng A2XX dina kisaran 1 nm dugi ka 100 nano. Kusabab kasadiaan antibodi anu terbatas salami ékspérimén, ékspérimén terbatas dilakukeun sareng unggal konsentrasi oligosakarida. Perlu dicatet di dieu yén sababaraha antibodi réaksina béda pisan kana oligosakarida anu sami salaku substrat, sigana kusabab éta ngabeungkeut kana epitop anu rada béda sareng tiasa gaduh afinitas ngabeungkeut anu béda pisan. Mékanisme sareng implikasi tina idéntifikasi epitop anu akurat bakal langkung rumit nalika pendekatan mAb énggal diterapkeun kana sampel nyata.
Dua oligosakarida komérsial dianggo pikeun nangtukeun rentang deteksi rupa-rupa mAb anu nargétkeun glikan. Di dieu, korélasi linier kalayan log konsentrasi konsentrasi oligosakarida nunjukkeun pola adsorpsi Langmuir pikeun (A) XHE kalayan mAb sareng (B) A2XX kalayan mAb. Epitop anu saluyu nunjukkeun struktur oligosakarida komérsial anu dianggo salaku substrat dina uji coba.
Panggunaan antibodi monoklonal anu ditujukeun kana glikan (analisis glikokomik atanapi panyaringan mAb dumasar ELISA) mangrupikeun alat anu kuat pikeun karakterisasi anu jero tina kalolobaan glikan témbok sél utama anu ngawangun biomassa pepelakan. Nanging, analisis glikan klasik ngan ukur ngacirikeun glikan témbok sél anu langkung ageung, sabab kalolobaan oligosakarida henteu diimobilisasi sacara efisien dina pelat ELISA. Dina panilitian ieu, umbi jagong anu dirawat sateuacanna ku AFEX dihidrolisis sacara énzimatik dina eusi padet anu luhur. Analisis gula dianggo pikeun nangtukeun komposisi karbohidrat témbok sél anu rekalsitran dina hidrolisat. Nanging, analisis mAb tina oligosakarida anu langkung alit dina hidrolisat diremehkan, sareng alat tambahan diperyogikeun pikeun sacara efektif ngimobilisasi oligosakarida dina pelat ELISA.
Kami ngalaporkeun di dieu metode imobilisasi oligosakarida anu énggal sareng efisien pikeun skrining mAb ku cara ngagabungkeun biotinilasi oligosakarida dituturkeun ku skrining ELISA dina pelat anu dilapis NeutrAvidin™. Oligosakarida biotinilasi anu diimobilisasi nunjukkeun afinitas anu cekap pikeun antibodi pikeun ngamungkinkeun deteksi oligosakarida anu bandel anu gancang sareng efisien. Analisis komposisi oligosakarida anu bandel ieu dumasar kana spéktrométri massa mastikeun hasil tina pendekatan énggal ieu pikeun imunoskrining. Ku kituna, panilitian ieu nunjukkeun yén kombinasi biotinilasi oligosakarida sareng skrining ELISA sareng antibodi monoklonal anu ditujukeun ku glikan tiasa dianggo pikeun ngadeteksi crosslink dina oligosakarida sareng tiasa diterapkeun sacara lega dina panilitian biokimia sanés anu ngacirikeun struktur oligosakarida.
Métode profiling glikan dumasar biotin ieu mangrupikeun laporan munggaran anu sanggup nalungtik beungkeut karbohidrat anu bandel tina oligosakarida leyur dina biomassa pepelakan. Ieu ngabantosan pikeun ngartos kunaon sababaraha bagian biomassa bandel pisan nalika ngeunaan produksi biofuel. Métode ieu ngeusian lolongkrang anu penting dina metode analisis glikome sareng ngalegaan aplikasi na kana rupa-rupa substrat anu langkung lega saluareun oligosakarida pepelakan. Ka hareupna, urang tiasa nganggo robotika pikeun biotinilasi sareng nganggo metode anu parantos dikembangkeun pikeun analisis throughput sampel anu luhur nganggo ELISA.
Jarami jagong (CS) anu dipelak tina siki hibrida Pioneer 33A14 dipanén dina taun 2010 ti Kramer Farms di Ray, Colorado. Kalayan idin ti nu boga lahan, biomassa ieu tiasa dianggo pikeun panalungtikan. Sampel disimpen garing kalayan kadar cai < 6% dina kantong zip-lock dina suhu kamar. Sampel disimpen garing kalayan kadar cai < 6% dina kantong zip-lock dina suhu kamar. Образцы хранились сухими при влажности < 6% dina пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Sampel disimpen garing dina kalembaban <6% dina kantong resleting dina suhu kamar.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Sampel disimpen dina kantong resleting dina suhu kamar kalayan kalembaban <6%.Panilitian ieu saluyu sareng pedoman lokal sareng nasional. Analisis komposisi dilaksanakeun nganggo protokol NREL. Komposisi ieu kapanggih ngandung 31,4% glukan, 18,7% xilan, 3,3% arabinan, 1,2% galaktan, 2,2% asetil, 14,3% lignin, 1,7% protéin sareng 13,4% lebu.
Cellic® CTec2 (138 mg protéin/ml, lot VCNI 0001) nyaéta campuran kompléks selulase, β-glukosidase sareng Cellic® HTec2 (157 mg protéin/ml, lot VHN00001) ti Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg protéin/mL), campuran kompléks énzim anu ngadégradasi pektin, disumbangkeun ku DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Konsentrasi protéin énzim ditangtukeun ku cara ngira-ngira eusi protéin (sareng ngirangan kontribusi nitrogén non-protéin) nganggo analisis nitrogén Kjeldahl (métode AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Bumi diatom 545 dipésér ti EMD Millipore (Billerica, MA). Karbon aktif (DARCO, granul 100 mesh), Avicel (PH-101), beech xylan, sareng sadaya bahan kimia sanésna dipésér ti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Perlakuan awal AFEX dilaksanakeun di GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Perlakuan awal dilaksanakeun dina suhu 140°C salami 15 menit. Waktu tinggal 46 menit dina babandingan 1:1 amonia anhidrat jeung biomassa dina beban 60% (w/w) dina réaktor batch stainless steel (Parr Instruments Company). Butuh waktu 30 menit. Réaktor dibawa ka 140°C sareng amonia gancang dileupaskeun, sahingga biomassa gancang balik deui ka suhu kamar. Komposisi AFEX pre-treated corn stover (ACS) sami sareng corn stover anu teu diubaran (UT-CS).
Padatan ACSH 25% (w/w) anu luhur (kira-kira 8% muatan dekstran) disiapkeun salaku bahan awal pikeun produksi oligosakarida skala ageung. Hidrolisis énzimatik ACS dilakukeun nganggo campuran énzim komérsial kalebet Cellic® Ctec2 10 mg protéin/g glukan (dina biomassa anu parantos diolah), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protéin/g glukan, sareng Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg protéin/g dekstran. Hidrolisis énzimatik dilakukeun dina bioreaktor 5 liter kalayan volume kerja 3 liter, pH 4,8, 50°C sareng 250 rpm. Saatos hidrolisis salami 96 jam, hidrolisat dikumpulkeun ku cara sentrifugasi dina 6000 rpm salami 30 menit teras dina 14000 rpm salami 30 menit pikeun miceun padatan anu teu dihidrolisis. Hidrolisat éta teras difiltrasi steril ngalangkungan gelas saringan 0,22 mm. Hidrolisat anu parantos disaring disimpen dina botol steril dina suhu 4° C teras difraksinasi dina karbon.
Analisis komposisi sampel biomassa dumasar ekstrak numutkeun prosedur analisis laboratorium NREL: persiapan sampel pikeun analisis komposisi (NREL/TP-510-42620) sareng nangtukeun karbohidrat struktural sareng lignin dina biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analisis oligosakarida tina aliran hidrolisat dilakukeun dina skala 2 ml nganggo metode hidrolisis asam berbasis autoklaf. Campur sampel hidrolisat sareng 69,7 µl asam sulfat 72% dina tabung kultur tutup ulir 10 ml sareng inkubasi salami 1 jam dina méja dina suhu 121 °C, tiiskeun dina és sareng saring kana botol kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Konsentrasi oligosakarida ditangtukeun ku cara ngirangan konsentrasi monosakarida dina sampel anu henteu dihidrolisis tina total konsentrasi gula dina sampel anu dihidrolisis asam.
Konsentrasi glukosa, xilosa, sareng arabinosa dina biomassa anu dihidrolisis asam dianalisis nganggo sistem Shimadzu HPLC anu dilengkepan ku autosampler, pemanas kolom, pompa isokratik, sareng detektor indéks bias dina kolom Bio-Rad Aminex HPX-87H. Kolom dijaga dina suhu 50°C sareng dielusi ku 0,6 ml/mnt 5 mM H2SO4 dina cai.
Supernatan hidrolisat diéncérkeun sareng dianalisis eusi monomer sareng oligosakarida. Gula monomerik anu diala saatos hidrolisis énzimatik dianalisis ku HPLC anu dilengkepan kolom Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P sareng kolom pelindung lebu. Suhu kolom dijaga dina 80°C, cai dianggo salaku fase gerak kalayan laju aliran 0,6 ml/mnt. Oligosakarida ditangtukeun ku hidrolisis dina asam éncer dina suhu 121°C numutkeun metode anu dijelaskeun dina refs. 41, 48, 49.
Analisis sakarida dilakukeun kana résidu biomassa atah, anu parantos diolah sateuacanna ku AFEX sareng sadaya résidu biomassa anu henteu dihidrolisis (kalebet produksi ekstrak témbok sél séri sareng panyaringan mAb-na) nganggo prosedur anu parantos dijelaskeun sateuacanna 27, 43, 50, 51. Pikeun analisis glikome, résidu bahan témbok sél tutuwuhan anu teu leyur dina alkohol disiapkeun tina résidu biomassa sareng diekstraksi séri nganggo réagen anu beuki agrésif sapertos amonium oksalat (50 mM), natrium karbonat (50 mM sareng 0,5% w/v), CON. (1M sareng 4M, duanana nganggo 1% w/v natrium borohidrida) sareng asam klorit sapertos anu parantos dijelaskeun sateuacanna 52,53. Ékstrak teras diekstrak ku ELISA ngalawan panel mAb50 anu kompléks anu diarahkeun kana glikan témbok sél, sareng réaksi ngabeungkeut mAb dipidangkeun salaku peta panas. mAb anu narékahan glikan témbok sél tutuwuhan dipésér tina stok laboratorium (CCRC, JIM sareng séri MAC).
Biotinilasi hiji léngkah oligosakarida. Konjugasi karbohidrat sareng biotin-LC-hidrazida dilaksanakeun nganggo prosedur ieu di handap. Biotin-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) dileyurkeun dina dimetil sulfoksida (DMSO, 70 μl) ku cara diaduk sareng dipanaskeun kalayan kuat dina suhu 65° C salami 1 menit. Asam asetat glasial (30 µl) ditambahkeun sareng campuran dituang kana natrium sianoborohidrida (6,4 mg/100 µmol) sareng dileyurkeun sagemblengna saatos dipanaskeun dina suhu 65° C salami sakitar 1 menit. Teras, ti 5 dugi ka 8 μl campuran réaksi ditambahkeun kana oligosakarida garing (1-100 nmol) pikeun kéngingkeun kaleuwihan molar 10 kali lipat atanapi langkung tina labél di luhur tungtung réduksi. Réaksi dilaksanakeun dina suhu 65°C salami 2 jam, saatos éta sampel langsung dimurnikeun. Taya natrium sianoborohidrida anu dianggo dina ékspérimén panyiri tanpa réduksi, sareng sampel diréaksikeun dina suhu 65° C salami 2,5 jam.
Palapis ELISA sareng pangumbahan sampel oligosakarida biotinilasi. 25 μl sampel biotinilasi (100 μl tina unggal sampel kentel anu diéncérkeun dina 5 ml larutan buffer Tris 0,1 M (TBS)) ditambahkeun kana unggal sumur pelat anu dilapis avidin. Sumur kontrol dilapis ku 50 μl biotin dina konsentrasi 10 μg/ml dina 0,1 M TBS. Cai deionisasi dianggo salaku palapis pikeun pangukuran kosong. Tablet diinkubasi salami 2 jam dina suhu kamar dina tempat anu poék. Kumbah pelat 3 kali ku susu skim 0,1% dina 0,1 M TBS nganggo program no. 11 pikeun Grenier flat 3A.
Panambahan sareng pangumbahan antibodi primér. Tambahkeun 40 µl antibodi primér kana unggal sumur. Inkubasi microplate salami 1 jam dina suhu kamar dina tempat anu poék. Pelat-pelat éta teras dikumbah 3 kali nganggo susu 0,1% dina 0,1M TBS nganggo program pangumbahan #11 pikeun Grenier Flat 3A.
Tambahkeun antibodi sekundér teras cuci. Tambahkeun 50 µl antibodi sekundér beurit/tikus (diéncérkeun 1:5000 dina susu 0,1% dina 0,1 M TBS) kana unggal sumur. Inkubasi microplate salami 1 jam dina suhu kamar dina tempat anu poék. Microplate teras dikumbah 5 kali ku susu 0,1% dina 0,1 M TBS nganggo program cuci piring Grenier Flat 5A #12.
Nambahkeun substrat. Tambahkeun 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) kana substrat dasar (ku cara nambahkeun 2 tetes buffer, 3 tetes TMB, 2 tetes hidrogén péroksida kana 15 ml cai deionisasi). Siapkeun substrat TMB. sareng vortex sateuacan dianggo). Inkubasi microplate dina suhu kamar salami 30 menit. Dina tempat anu poék.
Lengkepan léngkah ieu sareng baca tabletna. Tambahkeun 50 µl asam sulfat 1 N kana unggal sumur sareng catet absorbansi ti 450 dugi ka 655 nm nganggo alat maca ELISA.
Siapkeun larutan 1 mg/ml tina analit ieu dina cai deionisasi: arabinosa, rhamnosa, fukosa, xilosa, asam galakturonat (GalA), asam glukuronat (GlcA), manosa, glukosa, galaktosa, laktosa, N-asetilmannosamina (manNAc), N-asetilglukosamin (glcNAc), N-asetilgalaktosamin (galNAc), inositol (standar internal). Dua standar disiapkeun ku cara nambahkeun larutan gula 1 mg/mL anu dipidangkeun dina Tabel 1. Sampel dibekukeun sareng diliofilisasi dina suhu -80°C dugi ka sadaya cai dipiceun (biasana sakitar 12-18 jam).
Tambahkeun 100–500 µg sampel kana tabung tutup ulir dina neraca analitik. Catet jumlah anu ditambahkeun. Leuwih hade ngaleyurkeun sampel dina konsentrasi pangleyur anu khusus teras tambahkeun kana tabung salaku alikuot cair. Anggo 20 µl 1 mg/ml inositol salaku standar internal pikeun unggal tabung sampel. Jumlah standar internal anu ditambahkeun kana sampel kedah sami sareng jumlah standar internal anu ditambahkeun kana tabung standar.
Tambahkeun 8 ml metanol anhidrat kana botol tutup ulir. Teras tambahkeun 4 ml larutan HCl metanol 3 N, tutup teras kocok. Prosés ieu henteu nganggo cai.
Tambahkeun 500 µl larutan metanol 1 M HCl kana sampel oligosakarida sareng tabung TMS standar. Sampel diinkubasi sapeuting (168 jam) dina suhu 80° C. dina blok termal. Keringkeun produk metanolisis dina suhu kamar nganggo manifold pangeringan. Tambahkeun 200 µl MeOH sareng garingkeun deui. Prosés ieu diulang dua kali. Tambahkeun 200 µl metanol, 100 µl piridin sareng 100 µl anhidrida asetat kana sampel sareng aduk rata. Inkubasi sampel dina suhu kamar salami 30 menit. teras garingkeun. Tambahkeun 200 µl metanol sareng garingkeun deui.
Tambahkeun 200 µl Tri-Sil teras panaskeun tabung anu ditutup salami 20 menit. 80°C, teras tiiskeun dugi ka suhu kamar. Anggo manifold pangeringan pikeun ngagaringkeun sampel dugi ka volume sakitar 50 µl. Penting pikeun dicatet yén urang henteu ngantep sampel garing sapinuhna.
Tambahkeun 2 ml heksana teras aduk rata ku cara divortex. Eusian tungtung pipet Pasteur (5-8 mm) ku sapotong wol kaca ku cara nyelapkeun wol kaca kana luhureun pipet diaméter 5-3/4 inci. Sampel disentrifugasi dina 3000 g salami 2 menit. Sésa-sésa anu teu leyur diendapkeun. Keringkeun sampel dugi ka 100-150 µl. Volume sakitar 1 μl diinjeksikeun kana GC-MS dina suhu awal 80 °C sareng waktos awal 2,0 menit (Tabel 2).