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AFEX से उपचारित मक्के के भूसे में मौजूद स्थायी ऑलिगोसैकेराइड्स के जटिल विश्लेषण के लिए नई प्रतिरक्षात्मक और द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्रिक विधियाँ। लिग्नोसेलुलोसिक बायोमास जीवाश्म ईंधन का एक स्थायी विकल्प है और इसका व्यापक रूप से खाद्य, पशु आहार, ईंधन और रसायन जैसे उत्पादों के उत्पादन के लिए जैव प्रौद्योगिकी विकसित करने में उपयोग किया जाता है। इन प्रौद्योगिकियों की कुंजी पौधों की कोशिका भित्तियों में मौजूद जटिल कार्बोहाइड्रेट को ग्लूकोज, जाइलोस और अरेबिनोस जैसी सरल शर्करा में परिवर्तित करने के लिए लागत-प्रतिस्पर्धी प्रक्रियाओं का विकास है। क्योंकि लिग्नोसेलुलोसिक बायोमास बहुत ही कठोर होता है, इसलिए वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए इसे थर्मोकेमिकल उपचारों (जैसे, अमोनिया फाइबर एक्सफोलिएशन (AFEX), तनु अम्ल (DA), आयनिक तरल पदार्थ (IL)) और जैविक उपचारों (जैसे, एंजाइमेटिक जल अपघटन और सूक्ष्मजीव किण्वन) के संयोजन से गुजरना पड़ता है। हालांकि, जब हाइड्रोलिसिस प्रक्रिया में व्यावसायिक कवक एंजाइमों का उपयोग किया जाता है, तो बनने वाली घुलनशील शर्कराओं में से केवल 75-85% ही मोनोसैकेराइड होती हैं, और शेष 15-25% घुलनशील, अघुलनशील ओलिगोसैकेराइड होती हैं, जो सूक्ष्मजीवों के लिए हमेशा उपलब्ध नहीं होती हैं। इससे पहले, हमने कार्बन और डायटोमेशियस अर्थ पृथक्करण और आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी के संयोजन का उपयोग करके घुलनशील अघुलनशील ओलिगोसैकेराइड को सफलतापूर्वक पृथक और शुद्ध किया है, और उनके एंजाइम अवरोधक गुणों का भी अध्ययन किया है। हमने पाया है कि उच्च बहुलकीकरण (डीपी) वाले मिथाइलेटेड यूरॉनिक एसिड प्रतिस्थापन वाले ओलिगोसैकेराइड को कम डीपी और तटस्थ ओलिगोसैकेराइड की तुलना में व्यावसायिक एंजाइम मिश्रणों के साथ संसाधित करना अधिक कठिन होता है। यहां हम कई अतिरिक्त विधियों के उपयोग की रिपोर्ट करते हैं, जिनमें पादप कोशिका भित्तियों और एंजाइमेटिक हाइड्रोलाइज़ेट्स में ग्लाइकन बंधों की विशेषता निर्धारित करने के लिए पादप बायोमास ग्लाइकन के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) का उपयोग करके ग्लाइकन प्रोफाइलिंग, मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्प्शन आयनीकरण, टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएएलडीआई-टीओएफ-एमएस) और गैस क्रोमेटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) शामिल हैं। एमएएलडीआई-टीओएफ-एमएस ऋणात्मक आयनों के द्वितीयक क्षय के बाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त संरचना-सूचनात्मक नैदानिक ​​शिखरों का उपयोग करके व्युत्पन्न और बिना व्युत्पन्न के ऑलिगोसैकेराइड बंधों की विशेषता निर्धारित करता है। ऑलिगोसैकेराइड के छोटे आकार (डीपी 4-20) के कारण, इन अणुओं का उपयोग एमएबी बंधन और लक्षण वर्णन के लिए करना कठिन है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने बायोटिन संयुग्मन-आधारित एक नई ऑलिगोसैकेराइड स्थिरीकरण विधि का प्रयोग किया, जिसने कम डीपी वाले अधिकांश घुलनशील ऑलिगोसैकेराइड को माइक्रोप्लेट सतह पर सफलतापूर्वक लेबल किया। इसके बाद, विशिष्ट लिगेशन विश्लेषण के लिए इसे उच्च थ्रूपुट एमएबी प्रणाली में उपयोग किया गया। यह नई विधि भविष्य में अधिक उन्नत उच्च थ्रूपुट ग्लाइकोम परीक्षणों के विकास को सुगम बनाएगी, जिनका उपयोग नैदानिक ​​उद्देश्यों के लिए बायोमार्कर में मौजूद ऑलिगोसैकेराइड को पृथक करने और उनकी विशेषताओं का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।
कृषि, वानिकी, घास और लकड़ी सामग्री से बना लिग्नोसेलुलोसिक बायोमास, खाद्य, चारा, ईंधन और उच्च मूल्य वाले उत्पादों के उत्पादन के लिए रासायनिक अग्रदूतों सहित जैव-आधारित उत्पादों के उत्पादन के लिए एक संभावित कच्चा माल है।1 पौधों की कोशिका भित्तियों में मौजूद कार्बोहाइड्रेट (जैसे सेलुलोज और हेमिकेलुलोज) रासायनिक प्रसंस्करण और जैव-रूपांतरण (जैसे एंजाइमेटिक जल अपघटन और सूक्ष्मजीव किण्वन) द्वारा मोनोसैकेराइड में विघटित हो जाते हैं। सामान्य पूर्व-उपचारों में अमोनिया फाइबर विस्तार (AFEX), तनु अम्ल (DA), आयनिक द्रव (IL), और भाप विस्फोट (SE) शामिल हैं, जो पौधों की कोशिका भित्तियों को खोलकर लिग्नोसेलुलोज उत्पादन को कम करने के लिए रसायनों और गर्मी के संयोजन का उपयोग करते हैं।3,4 पदार्थ की कठोरता,5 एंजाइमेटिक जल अपघटन व्यावसायिक सक्रिय कार्बोहाइड्रेट युक्त एंजाइमों (CAZymes) का उपयोग करके उच्च ठोस भार पर किया जाता है और सूक्ष्मजीव किण्वन जैव-आधारित ईंधन और रसायनों के उत्पादन के लिए ट्रांसजेनिक खमीर या बैक्टीरिया का उपयोग करके किया जाता है।6
व्यावसायिक एंजाइमों में पाए जाने वाले CAZymes एंजाइमों के एक जटिल मिश्रण से बने होते हैं जो सहक्रियात्मक रूप से जटिल कार्बोहाइड्रेट-शर्करा बंधों को तोड़कर मोनोसैकेराइड बनाते हैं2,7। जैसा कि हमने पहले बताया था, कार्बोहाइड्रेट के साथ लिग्निन के सुगंधित बहुलकों का जटिल नेटवर्क उन्हें अत्यधिक अघुलनशील बनाता है, जिससे शर्करा का अपूर्ण रूपांतरण होता है और 15-25% ऐसे ओलिगोसैकेराइड जमा हो जाते हैं जो पूर्व-उपचारित बायोमास के एंजाइमेटिक जल अपघटन के दौरान उत्पादित नहीं होते हैं। यह विभिन्न बायोमास पूर्व-उपचार विधियों में एक आम समस्या है। इस बाधा के कुछ कारणों में जल अपघटन के दौरान एंजाइम अवरोध, या पादप बायोमास में शर्करा बंधों को तोड़ने के लिए आवश्यक एंजाइमों की अनुपस्थिति या निम्न स्तर शामिल हैं। शर्करा की संरचना और संरचनात्मक विशेषताओं, जैसे कि ओलिगोसैकेराइड में शर्करा बंधों को समझना, जल अपघटन के दौरान शर्करा रूपांतरण को बेहतर बनाने में हमारी मदद करेगा, जिससे जैव प्रौद्योगिकी प्रक्रियाएं पेट्रोलियम-व्युत्पन्न उत्पादों के साथ लागत-प्रतिस्पर्धी बन सकेंगी।
कार्बोहाइड्रेट की संरचना का निर्धारण चुनौतीपूर्ण है और इसके लिए तरल क्रोमेटोग्राफी (LC)11,12, परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (NMR)13, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस (CE)14,15,16 और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS)17 जैसी विधियों के संयोजन की आवश्यकता होती है। MS विधियाँ, जैसे कि मैट्रिक्स (MALDI-TOF-MS) का उपयोग करके लेजर डीसॉर्प्शन और आयनीकरण के साथ टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री, कार्बोहाइड्रेट संरचनाओं की पहचान करने के लिए एक बहुमुखी विधि है। हाल ही में, सोडियम आयन एडक्ट्स के कोलिजन-इंड्यूस्ड डिसोसिएशन (CID) टैंडम MS का उपयोग ऑलिगोसैकेराइड अटैचमेंट पोजीशन, एनोमेरिक कॉन्फ़िगरेशन, अनुक्रम और शाखाकरण पोजीशन 20, 21 के अनुरूप फिंगरप्रिंट की पहचान करने के लिए सबसे व्यापक रूप से किया गया है।
ग्लाइकन विश्लेषण कार्बोहाइड्रेट बंधों की गहन पहचान के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है22। यह विधि जटिल कार्बोहाइड्रेट लिंकेज को समझने के लिए पादप कोशिका भित्ति ग्लाइकन के लिए निर्देशित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) का उपयोग करती है। दुनिया भर में 250 से अधिक एमएबी उपलब्ध हैं, जिन्हें विभिन्न सैकराइड का उपयोग करके विभिन्न रैखिक और शाखित ऑलिगोसैकराइड के विरुद्ध डिज़ाइन किया गया है24। कई एमएबी का व्यापक रूप से पादप कोशिका भित्ति की संरचना, संघटन और संशोधनों को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया गया है, क्योंकि पादप कोशिका प्रकार, अंग, आयु, विकासीय अवस्था और विकास पर्यावरण के आधार पर महत्वपूर्ण अंतर होते हैं25,26। हाल ही में, इस विधि का उपयोग पादप और पशु प्रणालियों में वेसिकल आबादी और उपकोशिकीय मार्करों, विकासीय अवस्थाओं या पर्यावरणीय उत्तेजनाओं द्वारा निर्धारित ग्लाइकन परिवहन में उनकी संबंधित भूमिकाओं को समझने और एंजाइमेटिक गतिविधि को निर्धारित करने के लिए किया गया है। ग्लाइकैन और ज़ाइलन की कुछ अलग-अलग संरचनाओं की पहचान की गई है, जिनमें पेक्टिन (पी), ज़ाइलन (एक्स), मैनन (एम), ज़ाइलोग्लूकैन (ज़ाइलजी), मिश्रित बंध ग्लूकैन (एमएलजी), अरबिनोक्सिलन (आर्बएक्स), गैलेक्टोमैनन (गैलजी), ग्लूकोरोनाइक एसिड-अरबिनोक्सिलन (जीएआरबीएक्स) और अरबिनो-गैलेक्टन (आर्बजी)29 शामिल हैं।
हालांकि, इन सभी शोध प्रयासों के बावजूद, उच्च ठोस भार (एचएसएल) जल अपघटन के दौरान ऑलिगोसैकेराइड संचय की प्रकृति पर केवल कुछ ही अध्ययन केंद्रित हैं, जिनमें ऑलिगोसैकेराइड रिलीज, जल अपघटन के दौरान ऑलिगोमेरिक श्रृंखला की लंबाई में परिवर्तन, विभिन्न निम्न डीपी पॉलिमर और उनके वितरण वक्र शामिल हैं। 30,31,32। इस बीच, हालांकि ग्लाइकन विश्लेषण ग्लाइकन संरचना के व्यापक विश्लेषण के लिए एक उपयोगी उपकरण साबित हुआ है, एंटीबॉडी विधियों का उपयोग करके जल-घुलनशील निम्न डीपी ऑलिगोसैकेराइड का मूल्यांकन करना मुश्किल है। 5-10 kDa से कम आणविक भार वाले छोटे डीपी ऑलिगोसैकेराइड ELISA प्लेटों से नहीं जुड़ते हैं 33, 34 और एंटीबॉडी मिलाने से पहले ही धुल जाते हैं।
यहां, पहली बार, हम मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके एविडिन-कोटेड प्लेटों पर एक ELISA परख का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें घुलनशील प्रतिरोधी ऑलिगोसैकेराइड के लिए एक-चरणीय बायोटिनिलेशन प्रक्रिया को ग्लाइकोम विश्लेषण के साथ संयोजित किया गया है। ग्लाइकोम विश्लेषण के लिए हमारे दृष्टिकोण को हाइड्रोलाइज्ड शर्करा संरचनाओं के ट्राइमिथाइलसिलिल (TMS) व्युत्पन्न का उपयोग करके पूरक ऑलिगोसैकेराइड लिंकेज के MALDI-TOF-MS और GC-MS आधारित विश्लेषण द्वारा मान्य किया गया था। इस अभिनव दृष्टिकोण को भविष्य में एक उच्च-थ्रूपुट विधि के रूप में विकसित किया जा सकता है और जैव चिकित्सा अनुसंधान में व्यापक अनुप्रयोग प्राप्त हो सकता है।35
एंजाइमों और एंटीबॉडी के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन, जैसे कि ग्लाइकोसिलेशन,36 उनकी जैविक गतिविधि को प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, सीरम प्रोटीन के ग्लाइकोसिलेशन में परिवर्तन सूजन संबंधी गठिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और ग्लाइकोसिलेशन में परिवर्तन का उपयोग नैदानिक ​​मार्कर के रूप में किया जाता है37। साहित्य में विभिन्न ग्लाइकैन को कई बीमारियों में आसानी से पाए जाने की सूचना दी गई है, जिनमें गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट और लीवर के क्रोनिक सूजन संबंधी रोग, वायरल संक्रमण, डिम्बग्रंथि, स्तन और प्रोस्टेट कैंसर शामिल हैं38,39,40। एंटीबॉडी-आधारित ग्लाइकैन ELISA विधियों का उपयोग करके ग्लाइकैन की संरचना को समझना जटिल MS विधियों के उपयोग के बिना रोग निदान में अतिरिक्त विश्वास प्रदान करेगा।
हमारे पिछले अध्ययन से पता चला कि पूर्व-उपचार और एंजाइमेटिक जल अपघटन के बाद भी अप्रतिबंधित ऑलिगोसैकेराइड अप्रतिबंधित रहे (चित्र 1)। अपने पूर्व प्रकाशित कार्य में, हमने AFEX-पूर्व-उपचारित मक्का के भूसे के हाइड्रोलाइज़ेट (ACSH)8 से ऑलिगोसैकेराइड को पृथक करने के लिए सक्रिय चारकोल ठोस-चरण निष्कर्षण विधि विकसित की। प्रारंभिक निष्कर्षण और पृथक्करण के बाद, ऑलिगोसैकेराइड को आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (SEC) द्वारा आगे अंशों में विभाजित किया गया और आणविक भार के क्रम में एकत्रित किया गया। विभिन्न पूर्व-उपचारों से मुक्त शर्करा मोनोमर और ऑलिगोमर का शर्करा संरचना विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया। विभिन्न पूर्व-उपचार विधियों द्वारा प्राप्त शर्करा ऑलिगोमर की मात्रा की तुलना करने पर, बायोमास को मोनोसैकेराइड में परिवर्तित करने में अप्रतिबंधित ऑलिगोसैकेराइड की उपस्थिति एक आम समस्या है और इससे शर्करा की उपज में कम से कम 10-15% और यहाँ तक कि 18% तक की कमी हो सकती है। इस विधि का उपयोग ऑलिगोसैकेराइड अंशों के आगे बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए किया जाता है। इस कार्य में ऑलिगोसैकेराइड के लक्षण वर्णन के लिए परिणामी एसीएच और विभिन्न आणविक भार वाले इसके बाद के अंशों को प्रायोगिक सामग्री के रूप में उपयोग किया गया था।
पूर्व-उपचार और एंजाइमेटिक जल अपघटन के बाद, कुछ ओलिगोसैकेराइड अअपघटित रह गए। यहाँ (A) ओलिगोसैकेराइड पृथक्करण विधि है जिसमें सक्रिय कार्बन और डायटोमेशियस अर्थ के पैक्ड बेड का उपयोग करके AFEX-पूर्व-उपचारित कॉर्न स्टॉवर हाइड्रोलाइसेट (ACSH) से ओलिगोसैकेराइड को पृथक किया जाता है; (B) ओलिगोसैकेराइड पृथक्करण की विधि। ओलिगोसैकेराइड को आगे साइज एक्सक्लूजन क्रोमैटोग्राफी (SEC) द्वारा पृथक किया गया; (C) विभिन्न पूर्व-उपचारों (पतला अम्ल: DA, आयनिक द्रव: IL और AFEX) से मुक्त सैकेराइड मोनोमर और ओलिगोमर। एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस की स्थितियाँ: 25% (w/w) की उच्च ठोस लोडिंग (लगभग 8% ग्लूकान लोडिंग), 96 घंटे हाइड्रोलिसिस, 20 मिलीग्राम/ग्राम वाणिज्यिक एंजाइम लोडिंग (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 अनुपात) और (D) AFEX पूर्व-उपचारित मक्का के भूसे (ACS) से मुक्त ग्लूकोज, जाइलोस और अरेबिनोस के शर्करा मोनोमर और ऑलिगोमर।
ठोस बायोमास अवशेषों से पृथक किए गए अर्क में ग्लाइकन के व्यापक संरचनात्मक विश्लेषण के लिए ग्लाइकन विश्लेषण एक उपयोगी उपकरण सिद्ध हुआ है। हालांकि, इस पारंपरिक विधि41 का उपयोग करके जल-घुलनशील सैकेराइड का प्रतिनिधित्व कम होता है क्योंकि कम आणविक भार वाले ऑलिगोसैकेराइड को ELISA प्लेटों पर स्थिर करना कठिन होता है और एंटीबॉडी मिलाने से पहले ही वे धुल जाते हैं। इसलिए, एंटीबॉडी बंधन और लक्षण वर्णन के लिए, घुलनशील, गैर-अनुरूप ऑलिगोसैकेराइड को एविडिन-लेपित ELISA प्लेटों पर लेपित करने के लिए एक-चरणीय बायोटिनिलेशन विधि का उपयोग किया गया था। इस विधि का परीक्षण हमारे पहले उत्पादित ACSH और उसके आणविक भार (या बहुलकीकरण की डिग्री, DP) पर आधारित एक अंश का उपयोग करके किया गया था। ऑलिगोसैकेराइड बंधन आत्मीयता को बढ़ाने के लिए कार्बोहाइड्रेट के अपचायक सिरे पर बायोटिन-LC-हाइड्राज़ाइड मिलाकर एक-चरणीय बायोटिनिलेशन का उपयोग किया गया था (चित्र 2)। विलयन में, अपचायक सिरे पर स्थित हेमीएसिटल समूह, बायोटिन-एलसी-हाइड्राज़ाइड के हाइड्रैज़ाइड समूह के साथ अभिक्रिया करके एक हाइड्रैज़ोन बंध बनाता है। अपचायक NaCNBH3 की उपस्थिति में, हाइड्रैज़ोन बंध अपचयित होकर एक स्थिर बायोटिनयुक्त अंतिम उत्पाद में परिवर्तित हो जाता है। शर्करा के अपचायक सिरे में संशोधन के साथ, कम डीपी वाले ऑलिगोसैकेराइड्स का ELISA प्लेटों से बंधन संभव हो गया, और हमारे अध्ययन में इसे ग्लाइकन-लक्षित mAbs का उपयोग करके एविडिन-लेपित प्लेटों पर किया गया।
बायोटिनिलेटेड ऑलिगोसैकेराइड्स के लिए ELISA पर आधारित मोनोक्लोनल एंटीबॉडीज़ की स्क्रीनिंग। यहाँ (A) ऑलिगोसैकेराइड्स का संयुक्त बायोटिनिलेशन और उसके बाद न्यूट्रएविडिन लेपित प्लेटों पर ग्लाइकन-लक्षित mAbs के साथ ELISA स्क्रीनिंग और (B) प्रतिक्रिया उत्पादों के बायोटिनिलेशन के लिए एक-चरणीय प्रक्रिया को दर्शाया गया है।
इसके बाद, ओलिगोसैकेराइड-संयुग्मित एंटीबॉडी युक्त एविडिन-लेपित प्लेटों में प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी मिलाई गईं और उन्हें प्रकाश और समय के प्रति संवेदनशील माध्यम में धोया गया। एंटीबॉडी के बंधन पूर्ण होने के बाद, प्लेट को इनक्यूबेट करने के लिए TMB सब्सट्रेट मिलाया गया। अंत में, सल्फ्यूरिक एसिड से अभिक्रिया को रोक दिया गया। इनक्यूबेट की गई प्लेटों का विश्लेषण ELISA रीडर का उपयोग करके प्रत्येक एंटीबॉडी की बंधन क्षमता का निर्धारण करने और एंटीबॉडी-विशिष्ट क्रॉस-लिंकिंग का पता लगाने के लिए किया गया। प्रयोग के विवरण और मापदंडों के लिए, संबंधित अनुभाग "सामग्री और विधियाँ" देखें।
हम एसीएसएच में मौजूद घुलनशील ऑलिगोसैकेराइड्स के साथ-साथ लिग्नोसेलुलोसिक हाइड्रोलाइज़ेट्स से पृथक किए गए कच्चे और शुद्ध ऑलिगोसैकेराइड अंशों का लक्षण वर्णन करके विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इस नव विकसित विधि की उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, बायोएसाइलेटेड ग्लाइकोम परख विधियों का उपयोग करके एसीएसएच में पहचाने गए सबसे सामान्य एपिटोप-प्रतिस्थापित ज़ाइलन आमतौर पर यूरॉनिक (यू) या मिथाइल्यूरॉनिक (एमईयू) और पेक्टिक अरेबिनोगैलेक्टन होते हैं। इनमें से अधिकांश हमारे पिछले अध्ययन में भी पाए गए थे, जो गैर-हाइड्रोलाइज़्ड ठोस (यूएचएस)43 के ग्लाइकैन के विश्लेषण पर आधारित था।
कोशिका भित्ति ग्लाइकन को लक्षित करने वाले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रतिरोधी ऑलिगोसैकेराइड एपिटोप्स का पता लगाना। "उदासीन" अंश एसीएन अंश है और "अम्लीय" अंश एफए अंश है। हीटमैप पर चमकीले लाल रंग उच्च एपिटोप सामग्री को दर्शाते हैं, और चमकीले नीले रंग एक खाली पृष्ठभूमि को दर्शाते हैं। पैमाने पर रंग मान N=2 फॉर्मूलेशन के लिए कच्चे ओडी मानों पर आधारित हैं। एंटीबॉडी द्वारा पहचाने जाने वाले मुख्य एपिटोप्स दाईं ओर दिखाए गए हैं।
परीक्षण किए गए व्यावसायिक एंजाइम मिश्रण में मौजूद सबसे आम सेल्युलेज और हेमिकेल्युलेज एंजाइम इन गैर-सेल्युलोज संरचनाओं को नहीं तोड़ सके, जबकि इस मिश्रण में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले व्यावसायिक एंजाइम शामिल हैं। इसलिए, इनके जल अपघटन के लिए नए सहायक एंजाइमों की आवश्यकता होती है। आवश्यक गैर-सेल्युलोज सहायक एंजाइमों के बिना, ये गैर-सेल्युलोज बंध मोनोसैकेराइड में पूर्ण रूपांतरण को रोकते हैं, भले ही उनके मूल शर्करा बहुलक व्यावसायिक एंजाइम मिश्रणों का उपयोग करके छोटे टुकड़ों में व्यापक रूप से जल अपघटित होकर घुल जाएं।
सिग्नल वितरण और इसकी बंधन क्षमता के आगे के अध्ययन से पता चला कि उच्च DP शर्करा अंशों (A, B, C, DP 20+ तक) में बंधनकारी एपिटोप निम्न DP अंशों (D, E, F, DP) की तुलना में कम थे (चित्र 1)। अम्लीय अंश गैर-सेल्युलोज एपिटोप में उदासीन अंशों की तुलना में अधिक सामान्य हैं। ये घटनाएँ हमारे पिछले अध्ययन में देखे गए पैटर्न के अनुरूप हैं, जहाँ उच्च DP और अम्लीय अंश एंजाइमेटिक जल अपघटन के प्रति अधिक प्रतिरोधी थे। इसलिए, गैर-सेल्युलोज ग्लाइकन एपिटोप और U तथा MeU प्रतिस्थापनों की उपस्थिति ऑलिगोसैकेराइड की स्थिरता में महत्वपूर्ण योगदान दे सकती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि निम्न DP ऑलिगोसैकेराइड के लिए बंधन और पहचान दक्षता समस्याग्रस्त हो सकती है, विशेष रूप से यदि एपिटोप एक द्विमितीय या त्रिमितीय ऑलिगोसैकेराइड हो। इसका परीक्षण विभिन्न लंबाई के व्यावसायिक ऑलिगोसैकेराइड का उपयोग करके किया जा सकता है, जिनमें से प्रत्येक में केवल एक एपिटोप होता है जो एक विशिष्ट mAb से बंधता है।
इस प्रकार, संरचना-विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग से कुछ प्रकार के अड़ियल बंधों का पता चला। उपयोग की गई एंटीबॉडी के प्रकार, उपयुक्त लिगेशन पैटर्न और उससे उत्पन्न सिग्नल की तीव्रता (सबसे अधिक और सबसे कम मात्रा में) के आधार पर, नए एंजाइमों की पहचान की जा सकती है और उन्हें अधिक पूर्ण ग्लाइकोकनवर्जन के लिए एंजाइम मिश्रण में अर्ध-मात्रात्मक रूप से जोड़ा जा सकता है। ACSH ऑलिगोसैकेराइड के विश्लेषण को उदाहरण के रूप में लेते हुए, हम प्रत्येक बायोमास सामग्री के लिए ग्लाइकन बंधों का एक डेटाबेस बना सकते हैं। यहाँ यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एंटीबॉडी की अलग-अलग आत्मीयता को ध्यान में रखा जाना चाहिए, और यदि उनकी आत्मीयता अज्ञात है, तो विभिन्न एंटीबॉडी के संकेतों की तुलना करते समय कुछ कठिनाइयाँ उत्पन्न होंगी। इसके अलावा, ग्लाइकन बंधों की तुलना समान एंटीबॉडी के लिए नमूनों के बीच सबसे अच्छी तरह से काम कर सकती है। इन अड़ियल बंधों को फिर CAZyme डेटाबेस से जोड़ा जा सकता है, जिससे हम एंजाइमों की पहचान कर सकते हैं, संभावित एंजाइमों का चयन कर सकते हैं और बंध-तोड़ने वाले एंजाइमों का परीक्षण कर सकते हैं, या बायोरेफाइनरी में उपयोग के लिए इन एंजाइमों को व्यक्त करने के लिए माइक्रोबियल सिस्टम विकसित कर सकते हैं।44
लिग्नोसेलुलोसिक हाइड्रोलाइज़ेट्स में मौजूद कम आणविक भार वाले ऑलिगोसैकेराइड्स के लक्षण वर्णन के लिए प्रतिरक्षात्मक विधियाँ वैकल्पिक विधियों की पूरक कैसे हैं, इसका मूल्यांकन करने के लिए, हमने MALDI (चित्र 4, S1-S8) और उसी पैनल (चित्र 5) ऑलिगोसैकेराइड भाग पर GC-MS आधारित TMS-व्युत्पन्न सैकेराइड्स का विश्लेषण किया। MALDI का उपयोग यह तुलना करने के लिए किया जाता है कि क्या ऑलिगोसैकेराइड अणुओं का द्रव्यमान वितरण इच्छित संरचना से मेल खाता है। चित्र 4 में तटस्थ घटकों ACN-A और ACN-B का MS दिखाया गया है। ACN-A विश्लेषण ने DP 4-8 (चित्र 4) से DP 22 (चित्र S1) तक की पेंटोस शर्करा की एक श्रृंखला की पुष्टि की, जिनका भार MeU-ज़ाइलन ऑलिगोसैकेराइड्स के अनुरूप है। ACN-B विश्लेषण ने DP 8-15 के साथ पेंटोस और ग्लूकोक्सिलन श्रृंखला की पुष्टि की। चित्र S3 जैसे पूरक सामग्री में, FA-C अम्लीय अंश द्रव्यमान वितरण मानचित्र 8-15 के DP वाले (Me)U प्रतिस्थापित पेंटोस शर्करा की एक श्रृंखला दर्शाते हैं जो ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंग में पाए गए प्रतिस्थापित ज़ाइलान के अनुरूप हैं। एपिटोप्स सुसंगत हैं।
ACS में मौजूद घुलनशील गैर-अनुरूप ऑलिगोसैकेराइड्स का MALDI-MS स्पेक्ट्रम। यहाँ, (A) ACN-A निम्न भार श्रेणी के अंश जिनमें मिथाइलेटेड यूरॉनिक एसिड (DP 4-8) प्रतिस्थापित ग्लूकोरोक्सिलन ऑलिगोसैकेराइड्स हैं और (B) ACN-B ज़ाइलन और मिथाइलेटेड यूरॉनिक एसिड ऑलिगोसैकेराइड्स जिनमें ग्लूकोरोक्सिलन (DP 8-15) प्रतिस्थापित हैं।
प्रतिरोधी ऑलिगोसैकेराइड्स के ग्लाइकन अवशेष की संरचना का विश्लेषण। यहाँ (A) GC-MS विश्लेषण द्वारा प्राप्त विभिन्न ऑलिगोसैकेराइड अंशों की TMS सैकेराइड संरचना दर्शाई गई है। (B) ऑलिगोसैकेराइड्स में मौजूद विभिन्न TMS-व्युत्पन्न शर्कराओं की संरचनाएँ दर्शाई गई हैं। ACN – एसीटोनिट्राइल अंश जिसमें उदासीन ऑलिगोसैकेराइड्स होते हैं और FA – फेरुलिक अम्ल अंश जिसमें अम्लीय ऑलिगोसैकेराइड्स होते हैं।
ओलिगोसैकेराइड अंश के LC-MS विश्लेषण से एक और दिलचस्प निष्कर्ष निकाला गया, जैसा कि चित्र S9 में दिखाया गया है (विधियाँ इलेक्ट्रॉनिक पूरक सामग्री में देखी जा सकती हैं)। ACN-B अंश के लिगेशन के दौरान हेक्सोज़ और -OAc समूहों के खंड बार-बार देखे गए। यह निष्कर्ष न केवल ग्लाइकोम और MALDI-TOF विश्लेषण में देखे गए विखंडन की पुष्टि करता है, बल्कि पूर्व-उपचारित लिग्नोसेलुलोसिक बायोमास में संभावित कार्बोहाइड्रेट व्युत्पन्नों के बारे में नई जानकारी भी प्रदान करता है।
हमने टीएमएस ग्लाइकेन डेरिवेटाइजेशन का उपयोग करके ऑलिगोसैकेराइड अंशों का ग्लाइकेन संघटन विश्लेषण भी किया। जीसी-एमएस का उपयोग करके, हमने ऑलिगोसैकेराइड अंश में न्यूरल (गैर-व्युत्पन्न) और अम्लीय शर्करा (ग्लूए और गैलए) की संरचना निर्धारित की (चित्र 5)। अम्लीय घटक सी और डी में ग्लुकुरोनिक अम्ल पाया गया, जबकि अम्लीय घटक ए और बी में गैलेक्टुरोनिक अम्ल पाया गया, ये दोनों ही अम्लीय शर्करा के उच्च डीपी घटक हैं। ये परिणाम न केवल हमारे एलिसा और एमएएलडीआई डेटा की पुष्टि करते हैं, बल्कि ऑलिगोसैकेराइड संचय पर हमारे पिछले अध्ययनों के अनुरूप भी हैं। इसलिए, हमारा मानना ​​है कि ऑलिगोसैकेराइड के बायोटिनिलेशन और उसके बाद एलिसा स्क्रीनिंग का उपयोग करने वाली आधुनिक प्रतिरक्षात्मक विधियाँ विभिन्न जैविक नमूनों में घुलनशील प्रतिरोधी ऑलिगोसैकेराइड का पता लगाने के लिए पर्याप्त हैं।
चूंकि ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंग विधियों को कई अलग-अलग विधियों द्वारा मान्य किया जा चुका है, इसलिए हम इस नई मात्रात्मक विधि की क्षमता का और अधिक पता लगाना चाहते थे। दो व्यावसायिक ऑलिगोसैकेराइड, ज़ाइलोहेक्सासेकेराइड ऑलिगोसैकेराइड (XHE) और 23-α-L-अराबिनोफ्यूरानोसिल-ज़ाइलोट्रायोस (A2XX) खरीदे गए और कोशिका भित्ति ग्लाइकन को लक्षित करने वाले एक नए mAb दृष्टिकोण का उपयोग करके उनका परीक्षण किया गया। चित्र 6 बायोटिनिलेटेड बाइंडिंग सिग्नल और ऑलिगोसैकेराइड सांद्रता के लॉग सांद्रता के बीच एक रैखिक सहसंबंध दर्शाता है, जो एक संभावित लैंगमुइर अधिशोषण मॉडल का सुझाव देता है। माइक्रोएब्स में से, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 और CCRC-M151 XHE के साथ सहसंबंधित थे, जबकि CCRC-M108, CCRC-M109 और LM11 1 nm से 100 नैनोमीटर की सीमा में A2XX के साथ सहसंबंधित थे। प्रयोग के दौरान एंटीबॉडी की सीमित उपलब्धता के कारण, प्रत्येक ऑलिगोसैकेराइड सांद्रता के साथ सीमित प्रयोग किए गए। यहाँ यह ध्यान देने योग्य है कि कुछ एंटीबॉडी एक ही ऑलिगोसैकेराइड के प्रति सब्सट्रेट के रूप में बहुत अलग तरह से प्रतिक्रिया करते हैं, संभवतः इसलिए क्योंकि वे थोड़े अलग एपिटोप से बंधते हैं और उनकी बंधन क्षमता बहुत भिन्न हो सकती है। जब नए माइक्रोएब दृष्टिकोण को वास्तविक नमूनों पर लागू किया जाएगा, तो सटीक एपिटोप पहचान की क्रियाविधि और निहितार्थ कहीं अधिक जटिल होंगे।
विभिन्न ग्लाइकन-लक्ष्यीकरण mAbs की पहचान सीमा निर्धारित करने के लिए दो व्यावसायिक ऑलिगोसैकेराइड का उपयोग किया गया। यहाँ, ऑलिगोसैकेराइड सांद्रता के लॉग सांद्रता के साथ रैखिक सहसंबंध (A) XHE के साथ mAb और (B) A2XX के साथ mAb के लिए लैंगमुइर अधिशोषण पैटर्न को दर्शाते हैं। संबंधित एपिटोप्स परख में सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किए गए व्यावसायिक ऑलिगोसैकेराइड की संरचनाओं को इंगित करते हैं।
ग्लाइकन-लक्षित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (ग्लाइकोकोमिक विश्लेषण या ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंग) का उपयोग पादप बायोमास बनाने वाले अधिकांश प्रमुख कोशिका भित्ति ग्लाइकनों के गहन लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, पारंपरिक ग्लाइकन विश्लेषण केवल बड़े कोशिका भित्ति ग्लाइकनों का ही लक्षण वर्णन करता है, क्योंकि अधिकांश ऑलिगोसैकेराइड ELISA प्लेटों पर कुशलतापूर्वक स्थिर नहीं होते हैं। इस अध्ययन में, AFEX-पूर्व उपचारित मक्के के भूसे को उच्च ठोस सामग्री पर एंजाइमेटिक रूप से जल अपघटित किया गया। जल अपघटित पदार्थ में प्रतिरोधी कोशिका भित्ति कार्बोहाइड्रेट की संरचना निर्धारित करने के लिए शर्करा विश्लेषण का उपयोग किया गया। हालांकि, जल अपघटित पदार्थों में छोटे ऑलिगोसैकेराइडों का mAb विश्लेषण कम आंका जाता है, और ऑलिगोसैकेराइडों को ELISA प्लेटों पर प्रभावी ढंग से स्थिर करने के लिए अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता है।
हम यहां ऑलिगोसैकेराइड बायोटिनिलेशन और उसके बाद न्यूट्रएविडिन™ लेपित प्लेटों पर ELISA स्क्रीनिंग को मिलाकर mAb स्क्रीनिंग के लिए एक नवीन और कुशल ऑलिगोसैकेराइड स्थिरीकरण विधि प्रस्तुत करते हैं। स्थिरीकृत बायोटिनिलेटेड ऑलिगोसैकेराइड ने एंटीबॉडी के लिए पर्याप्त आत्मीयता प्रदर्शित की, जिससे प्रतिरोधी ऑलिगोसैकेराइड का तीव्र और कुशल पता लगाना संभव हो गया। द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री के आधार पर इन प्रतिरोधी ऑलिगोसैकेराइड की संरचना के विश्लेषण ने इम्यूनोस्क्रीनिंग के इस नए दृष्टिकोण के परिणामों की पुष्टि की। इस प्रकार, ये अध्ययन दर्शाते हैं कि ऑलिगोसैकेराइड बायोटिनिलेशन और ग्लाइकन-लक्षित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ ELISA स्क्रीनिंग का संयोजन ऑलिगोसैकेराइड में क्रॉसलिंक का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और ऑलिगोसैकेराइड की संरचना का लक्षण वर्णन करने वाले अन्य जैव रासायनिक अध्ययनों में व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।
बायोटिन पर आधारित यह ग्लाइकन प्रोफाइलिंग विधि, पादप बायोमास में घुलनशील ऑलिगोसैकेराइड्स के अप्रतिरोधी कार्बोहाइड्रेट बंधों की जांच करने में सक्षम पहली रिपोर्ट है। इससे यह समझने में मदद मिलती है कि बायोमास के कुछ भाग जैव ईंधन उत्पादन के मामले में इतने अप्रतिरोधी क्यों होते हैं। यह विधि ग्लाइकोम विश्लेषण विधियों में एक महत्वपूर्ण कमी को पूरा करती है और पादप ऑलिगोसैकेराइड्स के अलावा व्यापक श्रेणी के सब्सट्रेट्स पर इसके अनुप्रयोग का विस्तार करती है। भविष्य में, हम बायोटिनिलेशन के लिए रोबोटिक्स का उपयोग कर सकते हैं और ELISA का उपयोग करके नमूनों के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए अपनी विकसित विधि का उपयोग कर सकते हैं।
2010 में कोलोराडो के रे स्थित क्रेमर फार्म्स से पायनियर 33A14 संकर बीजों से उगाए गए मक्के के भूसे (सीएस) की कटाई की गई थी। भूस्वामी की अनुमति से, इस बायोमास का उपयोग अनुसंधान के लिए किया जा सकता है। नमूनों को कमरे के तापमान पर ज़िप-लॉक बैग में 6% से कम नमी के साथ सूखा रखा गया था। नमूनों को कमरे के तापमान पर ज़िप-लॉक बैग में 6% से कम नमी के साथ सूखा रखा गया था। Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. नमूनों को कमरे के तापमान पर ज़िपर लगे बैगों में 6% से कम आर्द्रता पर सूखा रखा गया था।样品在室温下以干燥<6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной तापमान वृद्धि <6%। नमूनों को कमरे के तापमान पर और 6% से कम आर्द्रता वाले ज़िपर बैग में संग्रहित किया जाता है।यह अध्ययन स्थानीय और राष्ट्रीय दिशानिर्देशों के अनुरूप किया गया। एनआरईएल प्रोटोकॉल का उपयोग करके संरचनात्मक विश्लेषण किया गया। इसमें 31.4% ग्लूकान, 18.7% जाइलन, 3.3% अरेबिनन, 1.2% गैलेक्टन, 2.2% एसिटाइल, 14.3% लिग्निन, 1.7% प्रोटीन और 13.4% राख पाई गई।
Cellic® CTec2 (138 मिलीग्राम प्रोटीन/मिलीलीटर, लॉट VCNI 0001) सेल्युलेज, β-ग्लूकोसिडेज़ और Cellic® HTec2 (157 मिलीग्राम प्रोटीन/मिलीलीटर, लॉट VHN00001) का एक जटिल मिश्रण है, जिसे नोवोज़ाइम्स (फ्रैंकलिनटन, उत्तरी कैरोलिना, संयुक्त राज्य अमेरिका) से प्राप्त किया गया है। मल्टीफेक्ट पेक्टिनेज़® (72 मिलीग्राम प्रोटीन/मिलीलीटर), पेक्टिन को विघटित करने वाले एंजाइमों का एक जटिल मिश्रण, ड्यूपॉन्ट इंडस्ट्रियल बायोसाइंसेज (पालो ऑल्टो, कैलिफ़ोर्निया, संयुक्त राज्य अमेरिका) द्वारा दान किया गया था। एंजाइम प्रोटीन सांद्रता का निर्धारण केल्डाहल नाइट्रोजन विश्लेषण (AOAC विधि 2001.11, डेयरी वन कोऑपरेटिव इंक., इथाका, न्यूयॉर्क, संयुक्त राज्य अमेरिका) का उपयोग करके प्रोटीन सामग्री का अनुमान लगाकर (और गैर-प्रोटीन नाइट्रोजन के योगदान को घटाकर) किया गया था। डायटोमेशियस अर्थ 545 को EMD मिलिपोर (बिलरिका, मैसाचुसेट्स) से खरीदा गया था। सक्रिय कार्बन (डार्को, 100 मेश कणिकाएं), एविकेल (पीएच-101), बीच जाइलन और अन्य सभी रसायन सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ) से खरीदे गए थे।
AFEX प्री-ट्रीटमेंट GLBRC (बायोमास कन्वर्जन रिसर्च लेबोरेटरी, MSU, लैंसिंग, मिशिगन, USA) में किया गया। प्री-ट्रीटमेंट 140°C पर 15 मिनट के लिए किया गया। स्टेनलेस स्टील बेंचटॉप बैच रिएक्टर (पार इंस्ट्रूमेंट्स कंपनी) में 60% (w/w) लोडिंग पर 1:1 अनुपात में निर्जल अमोनिया और बायोमास के साथ 46 मिनट का निवास समय निर्धारित किया गया। इसमें 30 मिनट लगे। रिएक्टर को 140°C तक लाया गया और अमोनिया को तेजी से मुक्त किया गया, जिससे बायोमास जल्दी से कमरे के तापमान पर वापस आ गया। AFEX प्री-ट्रीटेड कॉर्न स्टॉवर (ACS) की संरचना अनुपचारित कॉर्न स्टॉवर (UT-CS) के समान थी।
ओलिगोसैकेराइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में उच्च ठोस ACSH 25% (w/w) (लगभग 8% डेक्सट्रान लोडिंग) तैयार किया गया था। ACS का एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस Cellic® Ctec2 10 मिलीग्राम प्रोटीन/ग्राम ग्लूकान (पूर्व-उपचारित बायोमास में), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 मिलीग्राम प्रोटीन/ग्राम ग्लूकान, और Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) सहित व्यावसायिक एंजाइम मिश्रण का उपयोग करके किया गया था। एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस 5-लीटर बायोरिएक्टर में 3 लीटर के कार्यशील आयतन, pH 4.8, 50°C और 250 rpm पर किया गया था। 96 घंटे तक जल अपघटन के बाद, अपघटित ठोस पदार्थों को हटाने के लिए हाइड्रोलाइज़ेट को 30 मिनट के लिए 6000 आरपीएम और फिर 30 मिनट के लिए 14000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा एकत्रित किया गया। इसके बाद हाइड्रोलाइज़ेट को 0.22 मिमी के फिल्टर बीकर से छानकर रोगाणुरहित किया गया। छने हुए हाइड्रोलाइज़ेट को 4°C पर रोगाणुरहित बोतलों में संग्रहित किया गया और फिर कार्बन पर अंशों में विभाजित किया गया।
एनआरईएल प्रयोगशाला विश्लेषण प्रक्रियाओं के अनुसार अर्क-आधारित बायोमास नमूनों की संरचना का विश्लेषण: संरचना विश्लेषण के लिए नमूनों की तैयारी (एनआरईएल/टीपी-510-42620) और बायोमास में संरचनात्मक कार्बोहाइड्रेट और लिग्निन का निर्धारण (एनआरईएल/टीपी-510-42618)47.
हाइड्रोलाइज़ेट स्ट्रीम का ऑलिगोसैकेराइड विश्लेषण 2 मिलीलीटर के पैमाने पर ऑटोक्लेव-आधारित एसिड हाइड्रोलिसिस विधि का उपयोग करके किया गया। हाइड्रोलाइज़ेट नमूने को 10 मिलीलीटर स्क्रू कैप कल्चर ट्यूब में 69.7 µl 72% सल्फ्यूरिक एसिड के साथ मिलाएं और 121 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए बेंचटॉप पर इनक्यूबेट करें, बर्फ पर ठंडा करें और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) वायल में फ़िल्टर करें। ऑलिगोसैकेराइड की सांद्रता, एसिड-हाइड्रोलाइज्ड नमूने में कुल शर्करा सांद्रता से गैर-हाइड्रोलाइज्ड नमूने में मोनोसैकेराइड की सांद्रता को घटाकर निर्धारित की गई।
अम्ल-अपघटित बायोमास में ग्लूकोज, जाइलोस और अरेबिनोस की सांद्रता का विश्लेषण शिमाद्ज़ू एचपीएलसी प्रणाली का उपयोग करके किया गया, जिसमें ऑटोसेम्प्लर, कॉलम हीटर, आइसोग्रैफिक पंप और अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टर लगे थे। यह विश्लेषण बायो-रैड एमिनेक्स एचपीएक्स-87एच कॉलम पर किया गया। कॉलम को 50°C पर बनाए रखा गया और 0.6 मिली/मिनट की प्रवाह दर से 5 एमएम एच2एसओ4 (पानी में) के घोल से अपचयित किया गया।
हाइड्रोलाइज़ेट सुपरनेटेंट को तनु करके मोनोमर और ऑलिगोसैकेराइड की मात्रा का विश्लेषण किया गया। एंजाइमेटिक हाइड्रोलाइसिस के बाद प्राप्त मोनोमेरिक शर्करा का विश्लेषण बायो-रैड (हर्क्यूलिस, कैलिफ़ोर्निया) एमिनेक्स HPX-87P कॉलम और ऐश गार्ड कॉलम से सुसज्जित HPLC द्वारा किया गया। कॉलम का तापमान 80°C पर स्थिर रखा गया और 0.6 मिली/मिनट की प्रवाह दर के साथ जल को मोबाइल फेज के रूप में उपयोग किया गया। ऑलिगोसैकेराइड का निर्धारण 121°C पर तनु अम्ल में हाइड्रोलाइसिस द्वारा संदर्भ 41, 48, 49 में वर्णित विधियों के अनुसार किया गया।
कच्चे, AFEX से पूर्व-उपचारित और सभी गैर-हाइड्रोलाइज्ड बायोमास अवशेषों (जिसमें सीरियल सेल वॉल एक्सट्रेक्ट्स का उत्पादन और उनकी mAb स्क्रीनिंग शामिल है) पर सैकेराइड विश्लेषण पूर्व वर्णित प्रक्रियाओं 27, 43, 50, 51 का उपयोग करके किया गया था। ग्लाइकोम विश्लेषण के लिए, पादप कोशिका भित्ति सामग्री के अल्कोहल-अघुलनशील अवशेषों को बायोमास अवशेषों से तैयार किया जाता है और अमोनियम ऑक्सालेट (50 mM), सोडियम कार्बोनेट (50 mM और 0.5% w/v), CON (1M और 4M, दोनों 1% w/v सोडियम बोरोहाइड्राइड के साथ) और एसिड क्लोराइट जैसे बढ़ते आक्रामक अभिकर्मकों के साथ सीरियल निष्कर्षण के अधीन किया जाता है, जैसा कि पहले वर्णित है 52, 53। इसके बाद, सेल वॉल ग्लाइकन के लिए निर्देशित mAb 50s के एक जटिल पैनल के खिलाफ ELISA के लिए एक्सट्रेक्ट्स का परीक्षण किया गया, और mAb बंधन प्रतिक्रियाओं को हीट मैप के रूप में प्रस्तुत किया गया। पादप कोशिका भित्ति ग्लाइकन को लक्षित करने वाले एमएबी को प्रयोगशाला स्टॉक (सीसीआरसी, जेआईएम और मैक श्रृंखला) से खरीदा गया था।
ऑलिगोसैकेराइड्स का एक-चरणीय बायोटिनिलेशन। कार्बोहाइड्रेट्स का बायोटिन-एलसी-हाइड्राज़ाइड के साथ संयुग्मन निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग करके किया गया। बायोटिन-एलसी-हाइड्राज़ाइड (4.6 मिलीग्राम/12 माइक्रोमोल) को डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ, 70 माइक्रोलीटर) में 65°C पर 1 मिनट तक तेज़ी से हिलाते और गर्म करते हुए घोला गया। ग्लेशियल एसिटिक एसिड (30 माइक्रोलीटर) मिलाया गया और मिश्रण को सोडियम साइनोबोरहाइड्राइड (6.4 मिलीग्राम/100 माइक्रोमोल) पर डाला गया और 65°C पर लगभग 1 मिनट तक गर्म करने के बाद पूरी तरह से घुल गया। फिर, शुष्क ऑलिगोसैकेराइड (1-100 नैनोमोल) में अभिक्रिया मिश्रण का 5 से 8 माइक्रोलीटर मिलाया गया ताकि अपचायक सिरे पर लेबल की 10 गुना या उससे अधिक मोलर मात्रा प्राप्त हो सके। अभिक्रिया 65°C पर 2 घंटे तक की गई, जिसके बाद नमूनों को तुरंत शुद्ध किया गया। अपचयन रहित लेबलिंग प्रयोगों में सोडियम सायनोबोरहाइड्राइड का उपयोग नहीं किया गया और नमूनों को 65°C पर 2.5 घंटे तक अभिक्रिया कराई गई।
बायोटिनयुक्त ऑलिगोसैकेराइड के नमूनों की ELISA कोटिंग और धुलाई। एविडिन-कोटेड प्लेट के प्रत्येक वेल में 25 μl बायोटिनयुक्त नमूने (प्रत्येक सांद्रित नमूने के 100 μl को 5 ml 0.1 M ट्रिस बफर सॉल्यूशन (TBS) में घोलकर) डाले गए। कंट्रोल वेल को 0.1 M TBS में 10 μg/ml की सांद्रता वाले 50 μl बायोटिन से कोट किया गया। ब्लैंक माप के लिए कोटिंग के रूप में विआयनीकृत जल का उपयोग किया गया। टैबलेट को कमरे के तापमान पर अंधेरे में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। ग्रेनियर फ्लैट 3A के लिए प्रोग्राम संख्या 11 का उपयोग करके प्लेट को 0.1 M TBS में 0.1% स्किम्ड मिल्क से 3 बार धोया गया।
प्राथमिक एंटीबॉडी का सम्मिलन और धुलाई। प्रत्येक वेल में 40 µl प्राथमिक एंटीबॉडी डालें। माइक्रोप्लेट को कमरे के तापमान पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। फिर प्लेटों को ग्रेनियर फ्लैट 3A के लिए वॉश प्रोग्राम #11 का उपयोग करके 0.1M TBS में 0.1% दूध से 3 बार धोएं।
द्वितीयक एंटीबॉडी डालें और धो लें। प्रत्येक वेल में 50 µl माउस/चूहे की द्वितीयक एंटीबॉडी (0.1 M TBS में 0.1% दूध में 1:5000 के अनुपात में पतला किया हुआ) डालें। माइक्रोप्लेट को कमरे के तापमान पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद, माइक्रोप्लेट को ग्रेनियर फ्लैट 5A प्लेट वॉश प्रोग्राम #12 का उपयोग करके 0.1 M TBS में 0.1% दूध से 5 बार धोएं।
एक सबस्ट्रेट मिलाना। बेस सबस्ट्रेट में 50 µl 3,3′,5,5′-टेट्रामेथिलबेंज़िडाइन (TMB) मिलाएं (इसके लिए 15 ml डीआयनीकृत पानी में 2 बूंद बफर, 3 बूंद TMB और 2 बूंद हाइड्रोजन पेरोक्साइड मिलाएं)। TMB सबस्ट्रेट तैयार करें और उपयोग से पहले इसे वर्टेक्स करें। माइक्रोप्लेट को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
चरण पूरा करें और टैबलेट पढ़ें। प्रत्येक वेल में 50 µl 1 N सल्फ्यूरिक एसिड डालें और ELISA रीडर का उपयोग करके 450 से 655 nm तक अवशोषण दर्ज करें।
इन विश्लेष्य पदार्थों के 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर विलयन विआयनीकृत जल में तैयार करें: अरेबिनोज, रहमनोज, फ्यूकोज, जाइलोज, गैलेक्ट्यूरोनिक अम्ल (GalA), ग्लूकोरोनिक अम्ल (GlcA), मैनोज, ग्लूकोज, गैलेक्टोज, लैक्टोज, एन-एसिटाइलमैनोसैमाइन (manNAc), एन-एसिटाइलग्लूकोसैमाइन (glcNAc), एन-एसिटाइलगैलेक्टोसैमाइन (galNAc), इनोसिटोल (आंतरिक मानक)। तालिका 1 में दर्शाए गए 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर शर्करा विलयनों को मिलाकर दो मानक तैयार किए गए। नमूनों को -80°C पर तब तक जमाया और लाइयोफिलाइज्ड किया गया जब तक कि सारा पानी निकल न जाए (आमतौर पर लगभग 12-18 घंटे)।
एक विश्लेषणात्मक तराजू पर स्क्रू कैप ट्यूबों में 100-500 µg नमूना डालें। डाली गई मात्रा को रिकॉर्ड करें। नमूने को एक विशिष्ट सांद्रता वाले विलायक में घोलकर ट्यूब में तरल रूप में डालना सबसे अच्छा है। प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए 1 mg/ml इनोसिटोल के 20 µl का उपयोग आंतरिक मानक के रूप में करें। नमूने में डाली गई आंतरिक मानक की मात्रा मानक ट्यूब में डाली गई आंतरिक मानक की मात्रा के बराबर होनी चाहिए।
एक पेंच ढक्कन वाली शीशी में 8 मिलीलीटर निर्जल मेथनॉल डालें। फिर उसमें 4 मिलीलीटर 3 एन मेथनोलिक एचसीएल विलयन डालें, ढक्कन बंद करें और अच्छी तरह हिलाएँ। इस प्रक्रिया में पानी का उपयोग नहीं होता है।
ओलिगोसैकेराइड नमूनों और मानक टीएमएस ट्यूबों में 500 µl 1 M HCl मेथनॉल विलयन मिलाएं। नमूनों को थर्मल ब्लॉक में 80°C पर रात भर (168 घंटे) इनक्यूबेट किया गया। मेथनॉल अपघटन उत्पाद को सुखाने वाले यंत्र का उपयोग करके कमरे के तापमान पर सुखाएं। 200 µl MeOH मिलाएं और फिर से सुखाएं। यह प्रक्रिया दो बार दोहराई जाती है। नमूने में 200 µl मेथनॉल, 100 µl पाइरिडीन और 100 µl एसिटिक एनहाइड्राइड मिलाएं और अच्छी तरह से मिक्स करें। नमूनों को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और सुखाएं। 200 µl मेथनॉल मिलाएं और फिर से सुखाएं।
200 µl ट्राइ-सिल डालें और ट्यूब को 80°C पर 20 मिनट तक गर्म करें, फिर कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें। ड्राइंग मैनिफोल्ड का उपयोग करके नमूने को लगभग 50 µl की मात्रा तक सुखाएं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हमने नमूनों को पूरी तरह से सूखने नहीं दिया।
2 मिलीलीटर हेक्सेन डालें और वर्टेक्सिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएँ। 5-3/4 इंच व्यास वाले पाश्चर पिपेट (5-8 मिमी) के सिरे पर कांच के ऊन का एक टुकड़ा लगाकर उसे भरें। नमूनों को 3000 g पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। कोई भी अघुलनशील अवशेष अवक्षेपित हो गए। नमूने को 100-150 µl तक सुखाएँ। लगभग 1 µl की मात्रा को 80 °C के प्रारंभिक तापमान और 2.0 मिनट के प्रारंभिक समय पर GC-MS में इंजेक्ट किया गया (तालिका 2)।