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O metotia fou o le puipuiga o le tino ma le tele o le spectrometric mo le suʻesuʻega faigata o oligosaccharides tumau i totonu o le ogaumu sana na togafitia muamua i le AFEX. O le lignocellulosic biomass o se isi auala e gafataulimaina i suauʻu faʻavae ma e faʻaaogaina lautele e atiina ae ai tekinolosi faʻasao mo le gaosiga o oloa e pei o meaʻai, meaʻai a manu, suauʻu ma vailaʻau. O le ki i nei tekinolosi o le atinaʻeina lea o faiga taugofie mo le liua o carbohydrates faigata o loʻo i totonu o puipui o sela o laʻau i suka faigofie e pei o le glucose, xylose ma le arabinose. Talu ai ona o le lignocellulosic biomass e matua faigata lava, e tatau ona faia i ai togafitiga faʻavevela (e pei o le ammonia fiber exfoliation (AFEX), dilute acids (DA), ionic liquids (IL)) ma togafitiga faʻaola (e pei o le enzymatic hydrolysis ma le microbial fermentation) faʻatasi e maua ai le oloa manaʻomia. . Peitaʻi, pe a faʻaaogaina enzymes fungal faapisinisi i le faagasologa o le hydrolysis, e naʻo le 75-85% o suka soluble na fausia o monosaccharides, ma o le 15-25% o totoe o oligosaccharides soluble, intractable, e le o taimi uma e maua ai e meaola ninii. Muamua, ua matou fa'amavaeina ma fa'amamāina ma le manuia o oligosaccharides faigata ona solo e fa'aaoga ai le tu'ufa'atasia o le carbon ma le diatomaceous earth separation ma le size exclusion chromatography, ma ua su'esu'eina fo'i o latou meatotino fa'asaina o le enzyme. Ua matou iloa ai o oligosaccharides o lo'o i ai le tikeri maualuga o le polymerization (DP) methylated uronic acid substitutions e sili atu ona faigata ona fa'agasolo i fa'afefiloi enzyme fa'apisinisi nai lo oligosaccharides maualalo DP ma neutral. O iinei matou te lipotia ai le fa'aaogaina o le tele o isi metotia, e aofia ai le glycan profiling e fa'aaoga ai monoclonal antibodies (mAbs) e fa'apitoa i glycans biomass o la'au e fa'ailoa ai fusi glycan i puipui o sela o la'au ma enzymatic hydrolysates, matrix-assisted laser desorption ionization, time-of-flight mass- spectrometry. . MALDI-TOF-MS) e fa'aogaina ai tumutumuga fa'ama'i fa'amatalaga-fa'atulagaina e maua mai le spectroscopy pe a mae'a le pala lona lua o negative ions, gas chromatography ma le mass spectrometry (GC-MS) e fa'ailoa ai fusi oligosaccharide ma e aunoa ma le derivatization. Ona o le laʻititi o oligosaccharides (DP 4–20), e faigata ona faʻaaogaina nei mole mo le fusifusia ma le faʻamatalaina o le mAb. Ina ia foia lenei faʻafitauli, na matou faʻaaogaina se metotia fou o le biotin conjugation-based oligosaccharide immobilization lea na faʻailogaina ma le manuia le tele o oligosaccharides maualalo le DP soluble i luga o le microplate surface, lea na faʻaaogaina i se high throughput mAb system mo se auiliiliga faʻapitoa o le ligation. O lenei metotia fou o le a faʻafaigofieina ai le atinaʻeina o suʻega glycome maualuga le throughput i le lumanaʻi e mafai ona faʻaaogaina e vavaeʻese ma faʻamatalaina ai oligosaccharides o loʻo i totonu o biomarkers mo faʻamoemoega faʻamaʻi.
O le lignocellulosic biomass, e aofia ai mea fa'ato'aga, vaomatua, mutia ma mea la'au, o se mea e mafai ona fa'aaogaina mo le gaosiga o oloa fa'avae i meaola, e aofia ai mea'ai, mea'ai a manu, suau'u ma vaila'au fa'asolosolo e gaosia ai oloa e sili atu ona taua1. O carbohydrates (e pei o le cellulose ma le hemicellulose) o lo'o i totonu o puipui o sela o la'au e fa'aliliuina i totonu o monosaccharides e ala i le fa'agasologaina o vaila'au ma le biotransformation (e pei o le enzymatic hydrolysis ma le microbial fermentation). O togafitiga muamua masani e aofia ai le ammonia fiber expansion (AFEX), dilute acid (DA), ionic liquid (IL), ma le steam explosion (SE), lea e fa'aogaina ai le tu'ufa'atasiga o vaila'au ma le vevela e fa'aitiitia ai le gaosiga o le lignocellulose e ala i le tatalaina o puipui o sela o la'au3,4. faigata o mea, 5. O le enzymatic hydrolysis e fa'atinoina i se avega maualuga o mea malo e fa'aaoga ai enzymes o lo'o i ai le carbohydrate (CAZymes) ma le microbial fermentation e fa'aaoga ai mea fa'afefete transgenic po'o siama e gaosia ai suau'u ma vaila'au fa'avae i meaola6.
O CAZymes i totonu o enzymes faapisinisi e aofia ai se paluga faigata o enzymes e vaeluaina faatasi ai sootaga faigata o le carbohydrate-suka e fausia ai monosaccharides2,7. E pei ona matou lipotia muamua, o le fesoʻotaʻiga faigata o polymers aromatic o le lignin ma carbohydrates e matua faigata ai ona foia, lea e oʻo atu ai i le liua atoatoa o le suka, e faaputuputu ai le 15-25% o sex oligosaccharides e le gaosia i le taimi o le hydrolysis enzymatic o le biomass ua uma ona togafitia. O se faafitauli masani lea i auala eseese o le biomass pretreatment. O nisi o mafuaaga mo lenei faafitauli e aofia ai le taofia o le enzyme i le taimi o le hydrolysis, po o le leai po o le maualalo o le maualuga o enzymes taua e manaomia e motusia ai sootaga suka i le biomass o laau. O le malamalama i le tuufaatasiga ma uiga faatulagaina o suka, e pei o sootaga suka i oligosaccharides, o le a fesoasoani ia i tatou e faaleleia atili ai le liua o le suka i le taimi o le hydrolysis, ma avea ai faiga biotechnological ma tau faatauva ma oloa e maua mai le suauu.
O le fuafuaina o le fausaga o carbohydrates e faigata ma e manaʻomia ai le tuʻufaʻatasia o metotia e pei o le liquid chromatography (LC)11,12, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)13, capillary electrophoresis (CE)14,15,16 ma le mass spectrometry (MS)17. ,sefuluvalu. O metotia MS e pei o le time-of-flight mass spectrometry ma le laser desorption ma le ionization e faʻaaoga ai se matrix (MALDI-TOF-MS) o se metotia e tele ona aoga mo le faʻailoaina o fausaga carbohydrate. Talu ai nei, o le Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS o sodium ion adducts ua sili ona faʻaaogaina e faʻailoa ai tamatamailima e fetaui ma tulaga o le faʻapipiʻiina o oligosaccharide, anomeric configurations, sequences, ma branching positions 20, 21.
O le au'ili'iliga o le Glycan o se meafaigaluega sili ona lelei mo le fa'ailoaina loloto o fusi o le carbohydrate22. O lenei metotia e fa'aaogaina ai monoclonal antibodies (mAbs) e fa'atatau i le glycan o le puipui o le sela o la'au e fai ma su'ega e malamalama ai i so'otaga faigata o le carbohydrate. E silia ma le 250 mAbs o lo'o maua i le lalolagi atoa, ua mamanuina fa'asaga i le tele o oligosaccharides linear ma branched e fa'aaoga ai saccharides eseese24. O le tele o mAbs ua fa'aaogaina lautele e fa'ailoa ai le fausaga, tu'ufa'atasiga, ma suiga o le puipui o le sela o la'au, aua e iai eseesega taua e fa'atatau i le ituaiga o sela o la'au, totoga, matua, tulaga o le atina'e, ma le siosiomaga o le tuputupu a'e25,26. Talu ai nei, ua fa'aaogaina lenei metotia e malamalama ai i le faitau aofa'i o vesicle i totonu o faiga o la'au ma manu ma a latou matafaioi ta'itasi i le felauaiga o le glycan e pei ona fuafuaina e fa'ailoga subcellular, tulaga o le atina'e, po'o fa'aosofia o le siosiomaga, ma e fuafua ai le gaioiga o le enzymatic. O nisi o fausaga eseese o glycans ma xylans ua fa'ailoa mai e aofia ai le pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), mixed bond glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) ma le arabino-galactan (ArbG)29.
Peita’i, e ui lava i nei taumafaiga uma o su’esu’ega, e na’o ni nai su’esu’ega ua taula’i i le natura o le fa’aputuga o oligosaccharide i le taimi o le hydrolysis o le maualuga o le solids load (HSL), e aofia ai le fa’asa’olotoina o oligosaccharide, suiga o le umi o le filifili oligomeric i le taimi o le hydrolysis, polymers eseese DP maualalo, ma a latou pi’o. tufatufaga 30,31,32. I le taimi nei, e ui lava ina ua fa’amaonia le au’ili’iliga o le glycan o se meafaigaluega aoga mo se au’ili’iliga atoatoa o le fausaga o le glycan, ae e faigata ona iloilo oligosaccharides DP maualalo e mafai ona sosolo i le vai e fa’aaoga ai metotia antibody. O oligosaccharides DP laiti ma le mamafa molecular e itiiti ifo i le 5-10 kDa e le fusifusia i papatusi ELISA 33, 34 ma e fufulu ese a’o le’i fa’aopoopoina le antibody.
O iinei, mo le taimi muamua, matou te faʻaalia ai se suʻega ELISA i luga o ipu ua ufiufi i avidin e faʻaaogaina ai monoclonal antibodies, e tuʻufaʻatasia ai se faiga biotinylation e tasi le laʻasaga mo soluble refractory oligosaccharides ma le auʻiliʻiliga glycome. O la matou auala i le auʻiliʻiliga glycome na faʻamaonia e le MALDI-TOF-MS ma le auʻiliʻiliga GC-MS o fesoʻotaʻiga oligosaccharide faʻaopoopo e faʻaaoga ai le trimethylsilyl (TMS) derivatization o faʻaputuga suka hydrolyzed. O lenei auala fou e mafai ona atiaʻe o se metotia maualuga-throughput i le lumanaʻi ma maua ai le faʻaaogaina lautele i suʻesuʻega faʻafomaʻi35.
O suiga pe a uma ona faaliliuina o enzymes ma antibodies, e pei o le glycosylation,36 e aafia ai a latou gaioiga faaletino. Mo se faataitaiga, o suiga i le glycosylation o porotini serum e taua tele i le gugu mumū, ma o suiga i le glycosylation e faaaogaina o ni faailoga o le suesuega37. Ua lipotia mai i tusitusiga le tele o glycans e faigofie ona aliali mai i le tele o faamai eseese, e aofia ai faamai mumū tumau o le gastrointestinal tract ma le ate, siama viral, kanesa o le ovarian, susu, ma le prostate38,39,40. O le malamalama i le fausaga o glycans e faaaoga ai metotia glycan ELISA e faavae i luga o le antibody o le a maua ai le mautinoa faaopoopo i le suesuega o faamai e aunoa ma le faaaogaina o metotia faigata o le MS.
O la matou suʻesuʻega muamua na faʻaalia ai o oligosaccharides faigata na tumau pea le leʻi faʻa-hydrolyzed ina ua maeʻa le togafitiga muamua ma le enzymatic hydrolysis (Ata 1). I la matou galuega na lolomiina muamua, na matou atiaʻe ai se metotia o le faʻaosoina o le malala malosi e vavaeʻese ai oligosaccharides mai le AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8. Ina ua maeʻa le faʻaosoina muamua ma le vavaeʻeseina, na toe vaevaeina oligosaccharides e ala i le size exclusion chromatography (SEC) ma aoina i le faasologa o le mamafa molecular. O monomers suka ma oligomers na faʻasaʻolotoina mai togafitiga muamua eseese na iloiloina e ala i le auiliiliga o le tuufaatasiga o suka. A faʻatusatusa le aofaʻi o oligomers suka na maua mai auala eseese o togafitiga muamua, o le i ai o oligosaccharides faigata o se faʻafitauli masani i le liua o le biomass i monosaccharides ma e mafai ona oʻo atu ai i le faʻaitiitia o le suka e le itiiti ifo i le 10-15% ma e oʻo atu i le 18%. US. O lenei metotia e faʻaaogaina mo le gaosiga tele o vaega o oligosaccharide. O le ACH na maua ma ona vaega mulimuli ane ma mamafa molecular eseese na faʻaaogaina o ni mea faʻataʻitaʻi mo le faʻamatalaina o oligosaccharides i lenei galuega.
A maeʻa le togafitiga muamua ma le hydrolysis enzymatic, o oligosaccharides tumau e leʻi hydrolyzed. O iinei (A) o se metotia vavaeʻese oligosaccharide lea e vavaeʻese ai oligosaccharides mai le AFEX-pretreated corn stover hydrolysate (ACSH) e faʻaaoga ai se moega ua faʻapipiʻiina o le carbon activated ma le diatomaceous earth; (B) Metotia mo le vavaeʻeseina o oligosaccharides. O oligosaccharides na toe vaeluaina e ala i le size exclusion chromatography (SEC); (C) Saccharide monomers ma oligomers na faʻasaʻolotoina mai togafitiga muamua eseese (diluted acid: DA, ionic liquid: IL ma AFEX). Tulaga hydrolysis enzymatic: uta maualuga o solids e 25% (w/w) (pe tusa ma le 8% glucan loading), 96 itula hydrolysis, 20 mg/g commercial enzyme loading (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratio) ma le (D) Suka monomers ma oligomers o le glucose, xylose ma le arabinose na faʻasaʻolotoina mai le AFEX pre-treated corn stover (ACS).
Ua fa'amaonia le au'ili'iliga o le Glycan o se meafaigaluega aoga mo se au'ili'iliga atoatoa o le fausaga o glycans i mea na maua mai i toega o le biomass. Peita'i, o saccharides e mafai ona sosolo i le vai e le lava le fa'atusalia e fa'aaoga ai lenei metotia masani41 ona o oligosaccharides mamafa molecular maualalo e faigata ona fa'agaoioia i luga o ipu ELISA ma e fufulu ese a'o le'i fa'aopoopoina le antibody. O le mea lea, mo le fusifusia ma le fa'ailoaina o le antibody, o se metotia biotinylation e tasi le la'asaga na fa'aaogaina e ufiufi ai oligosaccharides e mafai ona sosolo, e le fetaui ma le avidin-collient plates ELISA. O lenei metotia na fa'ata'ita'iina e fa'aaoga ai la matou ACSH na gaosia muamua ma se vaega e fa'avae i luga o lona mamafa molecular (po'o le tikeri o le polymerization, DP). O le biotinylation e tasi le la'asaga na fa'aaogaina e fa'ateleina ai le fusifusia o le oligosaccharide e ala i le fa'aopoopoina o le biotin-LC-hydrazide i le pito fa'aitiitia o le carbohydrate (Ata 2). I le fofo, o le vaega hemiacetal i le pito fa'aitiitia e tali atu ma le vaega hydrazide o le biotin-LC-hydrazide e fausia ai se fusifusia hydrazone. I le i ai o le mea fa'aitiitia NaCNBH3, e fa'aitiitia ai le fusi o le hydrazone i se oloa fa'ai'u biotinylated mautu. Faatasi ai ma le suiga o le pito fa'aitiitia o le suka, ua mafai ai ona fusifusia o oligosaccharides DP maualalo i ipu ELISA, ma i la matou su'esu'ega na faia lenei mea i luga o ipu ua ufiufi i le avidin e fa'aaoga ai glycan-targeted mAbs.
Su'esu'ega o monoclonal antibodies e fa'avae i luga o le ELISA mo biotinylated oligosaccharides. O iinei (A) tu'ufa'atasia o le biotinylation o oligosaccharides ma le su'esu'ega ELISA mulimuli ane ma glycan-targeted mAbs i luga o NeutrAvidin coated plates ma le (B) o lo'o fa'aalia ai se faiga e tasi le la'asaga mo le biotinylation o oloa o le tali atu.
O ipu ua ufiufi i le Avidin faatasi ai ma antibodies ua fa'apipi'i i le oligosaccharide ona fa'aopoopo lea i antibodies muamua ma lona lua ma fufuluina i se mea e maaleale i le malamalama ma le taimi. A mae'a ona fusifusia le antibody, fa'aopoopo le TMB substrate e fa'asusu ai le ipu. Na iu lava ina taofia le tali atu i le sulfuric acid. Na su'esu'eina ipu ua fa'asusu e fa'aaoga ai se ELISA reader e iloa ai le malosi o le fusifusia o antibody ta'itasi e iloa ai le feso'ota'iga fa'apitoa a le antibody. Mo fa'amatalaga auiliili ma parakalafa o le fa'ata'ita'iga, taga'i i le vaega talafeagai "Meafaitino ma Metotia".
Matou te faʻaalia le aoga o lenei metotia fou ua atiaʻe mo faʻaoga faʻapitoa e ala i le faʻailoaina o oligosaccharides soluble o loʻo iai i le ACSH faʻapea foʻi ma vaega o oligosaccharide mata ma mama ua vavaeʻese mai lignocellulosic hydrolysates. E pei ona faʻaalia i le Ata 3, o xylans e sili ona taatele e suia epitope ua faʻailoaina i le ACSH e faʻaaoga ai metotia o le bioacylated glycome assay e masani lava o le uronic (U) poʻo le methyluronic (MeU) ma le pectic arabinogalactans. O le tele o ia mea na maua foi i la matou suʻesuʻega muamua i le auʻiliʻiliga o glycans o mea e leʻi hydrolyzed (UHS)43.
Su'esu'ega o epitopes oligosaccharide recalcitrant e fa'aaoga ai se monoclonal antibody e fa'asino i le glycan puipui o le sela. O le vaega "neutral" o le vaega ACN ma le vaega "acidic" o le vaega FA. O mumu susulu i luga o le heatmap e fa'ailoa mai ai le maualuga o le aofa'i o epitope, ma o lanumoana susulu e fa'ailoa mai ai se talaaga gaogao. O tau o lanu i luga o le fua e fa'avae i luga o tau o le OD mata mo fa'atulagaga N=2. O epitopes autu e iloa e antibodies o lo'o fa'aalia i le taumatau.
E le mafai ona vaeluaina nei fausaga e le o ni cellulases ma hemicellulases e sili ona taatele i le paluga enzyme faapisinisi ua tofotofoina, lea e aofia ai enzymes faapisinisi e sili ona faaaogaina. O le mea lea, e manaomia ni enzymes fesoasoani fou mo lo latou hydrolysis. A aunoa ma enzymes fesoasoani e le o ni cellulose e manaomia, o nei fusi e le o ni cellulose e taofia ai le liua atoatoa i monosaccharides, e tusa lava pe o latou matua suka polymers e hydrolyzed tele i ni fasi pupuu ma faataapeina e faaaoga ai paluga enzyme faapisinisi.
O suʻesuʻega faʻaopoopo o le tufatufaina o faʻailoga ma lona malosi o le fusifusia na faʻaalia ai o epitopes fusifusia e maualalo i vaega suka DP maualuga (A, B, C, DP e oʻo atu i le 20+) nai lo vaega DP maualalo (D, E, F, DP) i dimers) (Ata 1). O vaega oona e sili atu ona taatele i epitopes e le o le cellulose nai lo vaega e le o le neutral. O nei mea e ogatusa ma le mamanu na matauina i la matou suʻesuʻega muamua, lea e sili atu ona teteʻe atu ai vaega o le DP maualuga ma le acid i le enzymatic hydrolysis. O le mea lea, o le i ai o epitopes glycan e le o le cellulose ma le U ma le MeU substitutions e mafai ona fesoasoani tele i le mautu o oligosaccharides. E tatau ona maitauina o le lelei o le fusifusia ma le iloa e mafai ona avea ma faʻafitauli mo oligosaccharides DP maualalo, aemaise lava pe afai o le epitope o se dimeric poʻo se trimeric oligosaccharide. E mafai ona faʻataʻitaʻiina lenei mea e faʻaaoga ai oligosaccharides faapisinisi o umi eseese, e tofu ma le tasi epitope e fusifusia i se mAb faapitoa.
O le mea lea, o le faʻaaogaina o antibodies faʻapitoa i le fausaga na faʻaalia ai ni ituaiga o fusi faʻalavelave. Faʻalagolago i le ituaiga o antibody e faʻaaogaina, le mamanu talafeagai o le fusi, ma le malosi o le faʻailoga e gaosia (tele ma itiiti), e mafai ona faʻailoaina ni enzymes fou ma faʻaopoopoina i le faʻafefiloi o le enzyme mo le glycoconversion sili atu ona atoatoa. I le faʻaaogaina o le auʻiliʻiliga o le ACSH oligosaccharides o se faʻataʻitaʻiga, e mafai ona tatou fatuina se faʻamaumauga o fusi glycan mo mea taʻitasi o le biomass. E tatau ona maitauina iinei e tatau ona amanaʻia le eseesega o le vavalalata o antibodies, ma afai e le o iloa lo latou vavalalata, o le a mafua ai ni faigata pe a faʻatusatusa faʻailoga o antibodies eseese. E le gata i lea, o le faʻatusatusaga o fusi glycan atonu e sili ona lelei le galue i le va o faʻataʻitaʻiga mo le antibody lava e tasi. Ona mafai lea ona faʻafesoʻotaʻi nei fusi faigata i le faʻamaumauga CAZyme, lea e mafai ai ona tatou faʻailoaina enzymes, filifili enzymes sui ma faʻataʻitaʻi mo enzymes e motusia ai fusi, pe atiaʻe ni faiga microbial e faʻaalia ai nei enzymes mo le faʻaaogaina i biorefineries44.
Ina ia iloilo pe faʻapefea ona faʻaopoopo e metotia faʻafomaʻi puipuiga isi metotia mo le faʻailoaina o oligosaccharides mamafa mole maualalo o loʻo iai i lignocellulosic hydrolysates, na matou faʻatinoina le MALDI (Ata 4, S1-S8) ma le auʻiliʻiliga o saccharides e maua mai i le TMS e faʻavae i luga o le GC-MS i luga o le vaega lava e tasi (Ata 5) oligosaccharide. E faʻaaogaina le MALDI e faʻatusatusa ai pe tutusa le tufatufaina atu o le tele o mole oligosaccharide ma le fausaga faʻamoemoeina. I le ata 4 o loʻo faʻaalia ai le MS o vaega e le faʻavae ACN-A ma le ACN-B. Na faʻamaonia e le auʻiliʻiliga ACN-A se vaega o suka pentose e amata mai le DP 4–8 (Ata 4) i le DP 22 (Ata S1), o latou mamafa e tutusa ma MeU-xylan oligosaccharides. Na faʻamaonia e le auʻiliʻiliga ACN-B le faʻasologa o pentose ma glucoxylan ma le DP 8-15. I mea faaopoopo e pei o le Ata S3, o faʻafanua o le tufatufaina atu o le vaega o le FA-C acidic o loʻo faʻaalia ai se vaega o suka pentose ua suia (Me)U ma le DP o le 8-15 e ogatasi ma xylans ua suia o loʻo maua i le suʻega mAb e faʻavae i le ELISA. E ogatasi epitopes.
O le MALDI-MS spectrum o oligosaccharides e le ogatusa ma le soluble o lo'o iai i le ACS. O iinei, (A) O vaega maualalo o le ACN-A e aofia ai le methylated uronic acid (DP 4-8) oligosaccharides ua suia i le glucuroxylan ma le (B) ACN-B xylan ma le methylated uronic acid oligosaccharides ua suia i le glucuroxylan (DP 8-15).
Su'esu'ega o le tu'ufa'atasiga o le toega o le glycan o oligosaccharides e le mafai ona fa'aaogaina. O iinei (A) Tu'ufa'atasiga o le TMS saccharide o vaega eseese o oligosaccharide na maua mai le fa'aaogaina o le su'esu'ega GC-MS. (B) Fausaga o suka eseese e maua mai le TMS o lo'o iai i oligosaccharides. ACN – vaega o le acetonitrile o lo'o iai oligosaccharides e le o ni mea e fa'aaogaina ma le FA – vaega o le ferulic acid o lo'o iai oligosaccharides acid.
O le isi fa'ai'uga manaia na maua mai le au'ili'iliga LC-MS o le vaega o le oligosaccharide, e pei ona fa'aalia i le Ata S9 (e mafai ona va'aia auala i mea fa'aopoopo fa'aeletoronika). O vaega o le hexose ma le -OAc na matauina pea i le taimi o le fusifusia o le vaega o le ACN-B. O lenei sailiga e le gata ina fa'amaonia ai le vaeluaina na matauina i le glycome ma le au'ili'iliga MALDI-TOF, ae maua ai fo'i fa'amatalaga fou e uiga i mea e ono maua mai i le carbohydrate i le lignocellulosic biomass na togafitia muamua.
Sa matou faia fo'i le su'esu'ega o le glycan composition o oligosaccharide fractions e fa'aaoga ai le TMS glycan derivatization. I le fa'aaogaina o le GC-MS, sa matou fuafuaina ai le composition o neural (non-derivative) ma acidic sugars (GluA ma GalA) i le oligosaccharide fraction (Ata 5). O le glucuronic acid e maua i vaega acidic C ma le D, ae o le galacturonic acid e maua i vaega acidic A ma le B, o vaega uma ia e lua o le DP maualuga o suka acidic. O nei taunuuga e le gata ina fa'amaonia ai a matou fa'amaumauga ELISA ma MALDI, ae e ogatasi fo'i ma a matou su'esu'ega muamua o le fa'aputuga o oligosaccharide. O le mea lea, matou te talitonu o metotia fa'aonaponei o le puipuiga o le tino e fa'aaoga ai le biotinylation o oligosaccharides ma le su'esu'ega ELISA mulimuli ane e lava lea e iloa ai soluble recalcitrant oligosaccharides i fa'ata'ita'iga eseese o meaola.
Talu ai ua faʻamaonia auala o le suʻesuʻega mAb e faʻavae i le ELISA e ala i le tele o auala eseese, matou te mananaʻo e suʻesuʻe atili le gafatia o lenei metotia fou faʻatatau. E lua oligosaccharides faapisinisi, o le xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ma le 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), na faʻatauina ma faʻataʻitaʻiina e faʻaaoga ai se auala fou mAb e faʻatatau i le glycan puipui o le sela. O loʻo faʻaalia i le Ata 6 se fesoʻotaʻiga laina i le va o le faʻailoga fusifusia biotinylated ma le log concentration o le oligosaccharide concentration, e faʻaalia ai se faʻataʻitaʻiga adsorption Langmuir e ono mafai. I totonu o mAbs, o le CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ma le CCRC-M151 e fesoʻotaʻi ma le XHE, ma le CCRC-M108, CCRC-M109, ma le LM11 e fesoʻotaʻi ma le A2XX i luga o le va o le 1 nm i le 100 nano. Ona o le faʻatapulaʻaina o le maua o antibodies i le taimi o le faʻataʻitaʻiga, na faia ai ni faʻataʻitaʻiga faʻatapulaʻa ma le oligosaccharide concentration taʻitasi. E tatau ona maitauina iinei o nisi antibodies e matua eseese lava le tali atu i le oligosaccharide lava e tasi e pei o se substrate, atonu ona latou te fusifusia i epitopes e eseese teisi ma e mafai ona i ai ni sootaga fusifusia eseese. O faiga ma aafiaga o le faailoaina sa'o o epitope o le a sili atu ona faigata pe a faaaogaina le auala fou mAb i faataitaiga moni.
E lua oligosaccharides faapisinisi na faaaogaina e fuafua ai le tele o le iloa o le tele o glycan-targeting mAbs. O iinei, o fesootaiga laina ma le log concentration o le oligosaccharide concentration e faailoa mai ai mamanu adsorption Langmuir mo le (A) XHE ma le mAb ma le (B) A2XX ma le mAb. O epitopes talafeagai e faailoa mai ai fausaga o oligosaccharides faapisinisi na faaaogaina o ni substrates i le suʻega.
O le faʻaaogaina o glycan-targeted monoclonal antibodies (glycocomic analysis poʻo le ELISA-based mAb screening) o se meafaigaluega mamana mo le faʻamatalaina loloto o le tele o glycans tetele o puipui o le sela e fausia ai le biomass o laʻau. Peitaʻi, o le classical glycan analysis e naʻo le faʻamatalaina o glycans tetele o puipui o le sela, aua o le tele o oligosaccharides e le o faʻamautuina lelei i luga o ipu ELISA. I lenei suʻesuʻega, o le AFEX-pretreated corn stover na faʻamaʻaʻaina i le enzyme i se maualuga o mea malo. Na faʻaaogaina le suʻesuʻega o le suka e iloa ai le tuufaatasiga o carbohydrates o puipui o le sela recalcitrant i le hydrolyzate. Peitaʻi, o le mAb analysis o oligosaccharides laiti i hydrolysates e le o faʻatauvaʻaina, ma e manaʻomia ni meafaigaluega faʻaopoopo e faʻamautuina lelei ai oligosaccharides i luga o ipu ELISA.
Matou te lipotia atu iinei se metotia fou ma lelei o le fa'amautuina o le oligosaccharide mo le siakiina o le mAb e ala i le tu'ufa'atasia o le oligosaccharide biotinylation sosoo ai ma le siakiina o le ELISA i luga o papatusi ufiufi NeutrAvidin™. O oligosaccharides biotinylated ua fa'amautuina ua fa'aalia ai le lava o le malosi mo le antibody e mafai ai ona vave ma lelei le iloa o oligosaccharides recalcitrant. O le su'esu'eina o le tu'ufa'atasiga o nei oligosaccharides faigata e fa'avae i luga o le mass spectrometry na fa'amaonia ai taunu'uga o lenei auala fou i le siakiina o le immunoscreening. O lea la, o nei su'esu'ega e fa'aalia ai o le tu'ufa'atasia o le oligosaccharide biotinylation ma le siakiina o le ELISA fa'atasi ai ma glycan-targeted monoclonal antibodies e mafai ona fa'aaogaina e iloa ai crosslinks i oligosaccharides ma e mafai ona fa'aogaina lautele i isi su'esu'ega biochemical e fa'ailoa ai le fausaga o oligosaccharides.
O lenei metotia o le fa'avasegaina o le glycan e fa'avae i luga o le biotin o le lipoti muamua lea e mafai ona su'esu'eina ai fusi fa'a-karbohidrat faigata o oligosaccharides soluble i totonu o le biomass o la'au. E fesoasoani lea e malamalama ai pe aisea e faigata ai nisi vaega o le biomass pe a o'o i le gaosiga o le biofuel. O lenei metotia e fa'atumuina ai se va taua i metotia o le au'ili'iliga o le glycome ma fa'alauteleina lona fa'aoga i se lautele o substrates e sili atu nai lo oligosaccharides o la'au. I le lumana'i, atonu tatou te fa'aogaina robotics mo le biotinylation ma fa'aaoga le metotia ua tatou atia'e mo le au'ili'iliga maualuga o fa'ata'ita'iga e fa'aaoga ai le ELISA.
O vaomago (CS) na totoina mai fatu fa'afefiloi Pioneer 33A14 na seleseleina i le 2010 mai Kramer Farms i Ray, Colorado. Faatasi ai ma le faatagaga a le e ona le fanua, e mafai ona fa'aaogaina lenei biomass mo su'esu'ega. Sa teuina fa'ata'ita'iga i le mago pe itiiti ifo i le 6% le susu i totonu o taga zip-lock i le vevela o le potu. Sa teuina fa'ata'ita'iga i le mago pe itiiti ifo i le 6% le susu i totonu o taga zip-lock i le vevela o le potu. Образцы хранились сухими при влажности < 6% i пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Sa teuina fa'ata'ita'iga i le mago i le <6% o le susū i totonu o taga ua fa'amauina i le vevela o le potu.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. E teuina faʻataʻitaʻiga i totonu o taga zipper i le vevela o le potu ma le susū e < 6%.Sa tausisia e le suʻesuʻega ia taiala faʻalotoifale ma faʻaleatunuu. Sa faia le suʻesuʻega o le tuufaatasiga e faʻaaoga ai le NREL protocol. Na maua o le tuufaatasiga o loʻo i ai le 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% porotini ma le 13.4% lefulefu.
O le Cellic® CTec2 (138 mg porotini/ml, vaega VCNI 0001) o se fa'afefiloi lavelave o le cellulase, β-glucosidase ma le Cellic® HTec2 (157 mg porotini/ml, vaega VHN00001) mai Novozymes (Franklinton, NC, ISA)). O le Multifect Pectinase® (72 mg porotini/mL), o se fa'afefiloi lavelave o enzymes e fa'aleagaina ai le pectin, na foa'iina mai e le DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ISA). O le maualuga o porotini enzyme na fuafuaina e ala i le fa'atatauina o le aofa'i o porotini (ma to'esea le sao o le nitrogen e le o ni porotini) e fa'aaoga ai le au'ili'iliga o le nitrogen Kjeldahl (metotia AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ISA). O le eleele Diatomaceous 545 na fa'atauina mai le EMD Millipore (Billerica, MA). Na fa'atau mai Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) le kaponi fa'agaoioia (DARCO, 100 mesh granules), Avicel (PH-101), beech xylan, ma isi vaila'au uma.
Sa faia le togafitiga muamua o le AFEX i le GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Sa faia le togafitiga muamua i le 140° C mo le 15 minute. 46 minute le umi e nofo ai i le fua faatatau 1:1 o le ammonia e leai se vai i le biomass i le 60% (w/w) o le uta i totonu o se reactor u'amea e le gaoia (Parr Instruments Company). E 30 minute le umi. Sa aumaia le reactor i le 140°C ma sa vave ona fa'asa'oloto le ammonia, ma mafai ai ona vave toe fo'i le biomass i le vevela o le potu. O le tuufaatasiga o le AFEX pre-treated corn stover (ACS) sa tutusa ma le corn stover e le'i togafitia (UT-CS).
O mea malo maualuluga ACSH 25% (w/w) (pe tusa ma le 8% dextran loading) sa saunia e fai ma mea amata mo le gaosiga tele o oligosaccharides. O le hydrolysis enzymatic o le ACS sa faia e faʻaaoga ai se faʻafefiloi enzyme faapisinisi e aofia ai le Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (i le biomass ua uma ona togafitia), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan, ma le Multifect Pectinase (Genencor Inc, ISA). ), 5 mg protein/g dextran. O le hydrolysis enzymatic sa faia i totonu o se bioreactor 5-lita ma se voluma galue e 3 lita, pH 4.8, 50°C ma le 250 rpm. A maeʻa le hydrolysis mo le 96 itula, ona aoina lea o le hydrolyzate e ala i le centrifugation i le 6000 rpm mo le 30 minute ona sosoo ai lea ma le 14000 rpm mo le 30 minute e aveese ai mea malo e leʻi hydrolyzed. Ona fa'amamāina lea o le hydrolyzate e ala i se ipu fa'amamā e 0.22 mm le lapo'a. O le hydrolyzate ua fa'amamāina sa teuina i totonu o fagu mama i le 4° C. ona fa'avaevaeina lea i luga o le kaponi.
Su'esu'ega o le tu'ufa'atasiga o fa'ata'ita'iga o le biomass e fa'avae i luga o le extract e tusa ai ma faiga su'esu'ega o le fale su'esu'e a le NREL: sauniuniga o fa'ata'ita'iga mo le su'esu'ega o le tu'ufa'atasiga (NREL/TP-510-42620) ma le fuafuaina o le fausaga o carbohydrates ma le lignin i le biomass (NREL/TP-510 – 42618)47.
Sa faia le su'esu'ega o le oligosaccharide o le vaitafe o le hydrolyzate i luga o le fua fa'atatau e 2 ml e fa'aaoga ai le metotia o le autoclave-based acid hydrolysis. Fa'afefiloi le fa'ata'ita'iga hydrolyzate ma le 69.7 µl o le 72% sulfuric acid i totonu o se paipa fa'ato'aga 10 ml screw cap ma fa'asusu mo le 1 itula i luga o le laulau i le 121 °C, fa'amālūlū i luga o le aisa ma fa'amama i totonu o se fagu chromatography vai maualuga (HPLC). O le maualuga o oligosaccharides sa fuafuaina e ala i le to'esea o le maualuga o monosaccharides i le fa'ata'ita'iga e le'i hydrolyzed mai le aofa'i o le suka i le fa'ata'ita'iga acid-hydrolyzed.
Sa su'esu'eina le maualuga o le kulukose, xylose, ma le arabinose i totonu o le acid hydrolyzed biomass e fa'aaoga ai se Shimadzu HPLC system ua fa'apipi'iina i se autosampler, column heater, isocratic pump, ma se refractive index detector i luga o le Bio-Rad Aminex HPX-87H column. Sa tausia le column i le 50°C ma fa'amamāina i le 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 i le vai.
O le hydrolyzate supernatant sa fa'avaivaia ma su'esu'eina mo le aofa'i o le monomer ma le oligosaccharide. O suka monomeric na maua ina ua mae'a le hydrolysis enzymatic sa su'esu'eina e le HPLC ua fa'apipi'iina i le koluma Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ma le koluma puipui lefulefu. O le vevela o le koluma sa tausia i le 80°C, sa fa'aaogaina le vai o le vaega feavea'i ma le fua fa'atatau o le tafe o le 0.6 ml/min. O oligosaccharides sa fuafuaina e ala i le hydrolysis i le acid fa'avaivaia i le 121°C e tusa ai ma metotia o lo'o fa'amatalaina i refs. 41, 48, 49.
Sa faia le su'esu'ega o le Saccharide i luga o mea mata, ua uma ona togafitia i le AFEX ma mea uma e le'i fa'a-hydrolyzed o le biomass (e aofia ai le gaosiga o mea fa'asolosolo o puipui o le sela ma a latou su'esu'ega mAb) e fa'aaoga ai faiga na fa'amatalaina muamua 27, 43, 50, 51. Mo le su'esu'ega o le glycome, o mea e le mafai ona soloia i le ava malosi o le puipui o le sela o la'au e saunia mai mea o le biomass ma faia i ai le fa'asolosolo o le fa'aosoina ma ni mea fa'amalosi e pei o le ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM ma le 0.5% w/v), CON. (1M ma le 4M, e lua ma le 1% w/v sodium borohydride) ma le acid chlorite e pei ona fa'amatalaina muamua 52,53. Ona faia lea o mea fa'asolosolo i le ELISA e fa'asaga i se vaega lavelave o mAb50s na fa'asino i le glycan puipui o le sela, ma o tali o le fusifusia o le mAb na tu'uina atu o se fa'afanua vevela. O mAbs e fa'atatau i le glycan puipui o le sela o la'au na fa'atauina mai faleoloa i fale su'esu'e (CCRC, JIM ma le MAC series).
O le biotinylation e tasi le la'asaga o oligosaccharides. O le fa'afefiloi o carbohydrates ma le biotin-LC-hydrazide na fa'atinoina e fa'aaoga ai le faiga lenei. O le Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) na fa'afefiloi i le dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) e ala i le fa'agae'etia malosi ma le fa'avevela i le 65° C. mo le 1 minute. Na fa'aopoopoina le glacial acetic acid (30 µl) ma sasaa le paluga i luga o le sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) ma fa'afefiloi atoa ina ua uma ona fa'avevela i le 65° C. mo le tusa ma le 1 minute. Ona, mai le 5 i le 8 μl o le paluga tali na fa'aopoopoina i le oligosaccharide mago (1-100 nmol) e maua ai le 10-fold pe sili atu le molar excess o le fa'ailoga i luga o le pito fa'aitiitia. Na fa'atinoina le tali i le 65°C mo le 2 itula, a mae'a lea ona fa'amamāina loa fa'ata'ita'iga. E leai se sodium cyanoborohydride na faʻaaogaina i faʻataʻitaʻiga o le faʻailogaina e aunoa ma le faʻaitiitia, ma na faʻaalia faʻataʻitaʻiga i le 65° C mo le 2.5 itula.
Ufiufi ELISA ma le fufuluina o faʻataʻitaʻiga o oligosaccharides biotinylated. E 25 μl o faʻataʻitaʻiga biotinylated (100 μl o faʻataʻitaʻiga taʻitasi ua faʻafefiloi i le 5 ml o le 0.1 M Tris buffer solution (TBS)) na faʻaopoopoina i pu taʻitasi o le ipu ua ufiufi i le avidin. O pu faʻatonutonu na ufiufi i le 50 μl o le biotin i le malosi o le 10 μg/ml i le 0.1 M TBS. O le vai ua aveeseina le ion sa faʻaaogaina e fai ma ufiufi mo fua faʻatatau. Na faʻasusu le papa mo le 2 itula i le vevela o le potu i le pogisa. Fufulu le ipu faʻatolu i le 0.1% susu ua le faʻaaogaina i le 0.1 M TBS e faʻaaoga ai le polokalame numera 11 mo Grenier flat 3A.
Fa'aopoopo ma le fufuluina o antibodies muamua. Fa'aopoopo le 40 µl o le antibody muamua i pu ta'itasi. Fa'asusu le microplate mo le 1 itula i le vevela o le potu i le pogisa. Ona fufuluina lea o ipu fa'atolu i le susu 0.1% i le 0.1M TBS e fa'aaoga ai le polokalame fufulu #11 mo Grenier Flat 3A.
Fa'aopopo le antibody lona lua ma fufulu. Fa'aopopo le 50 µl o le antibody lona lua a isumu/iole (fa'afefiloi 1:5000 i le 0.1% susu i le 0.1 M TBS) i pu ta'itasi. Fa'apuna le microplate mo le 1 itula i le vevela o le potu i le pogisa. Ona fufuluina lea o microplates fa'alima i le 0.1% susu i le 0.1 M TBS e fa'aaoga ai le polokalame fufulu ipu Grenier Flat 5A #12.
Fa'aopoopoina o se substrate. Fa'aopoopo le 50 µl o le 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) i le substrate autu (e ala i le fa'aopoopoina o mataua e 2 o le buffer, mataua e 3 o le TMB, mataua e 2 o le hydrogen peroxide i le 15 ml o le vai deionized). Saunia le substrate TMB. ma vortex a'o le'i fa'aaogaina). Fa'asusu le microplate i le vevela o le potu mo le 30 minute. I le pogisa.
Fa'amae'a le la'asaga ma faitau le papamaa. Fa'aopopo le 50 µl o le 1 N sulfuric acid i pu ta'itasi ma fa'amaumau le mitiia mai le 450 i le 655 nm e fa'aaoga ai le masini faitau ELISA.
Saunia ni vaifofo e 1 mg/ml o nei analytes i le vai ua fa'amamāina: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (tulaga fa'atonuina i totonu). E lua tulaga fa'atonuina na saunia e ala i le fa'aopoopoina o vaifofo suka e 1 mg/mL o lo'o fa'aalia i le Laulau 1. O fa'ata'ita'iga e fa'a'aisa ma fa'amaluluina i le -80° C se'ia o'o ina aveese uma le vai (e masani lava pe tusa ma le 12-18 itula).
Fa'aopoopo le 100–500 µg o le fa'ata'ita'iga i totonu o paipa tapuni sikulima i luga o se paleni fa'ata'ita'i. Fa'amaumau le aofa'i na fa'aopoopoina. E sili ona lelei le fa'afefiloi o le fa'ata'ita'iga i se tulaga fa'apitoa o le vaila'au fa'amamā ma fa'aopoopo i totonu o le paipa e fai ma vaega vai. Fa'aaoga le 20 µl o le 1 mg/ml inositol e fai ma fa'ata'ita'iga i totonu mo paipa fa'ata'ita'iga ta'itasi. O le aofa'i o le fa'ata'ita'iga i totonu e fa'aopoopo i le fa'ata'ita'iga e tatau ona tutusa ma le aofa'i o le fa'ata'ita'iga i totonu e fa'aopoopo i le paipa fa'ata'ita'i.
Fa'aopopo le 8 ml o le methanol e leai se vai i totonu o se fagu e tapuni ai se'i vili. Ona fa'aopopo lea o le 4 ml o le 3 N. methanolic HCl solution, tapuni ma lūlūina. O lenei faiga e le fa'aaogaina ai le vai.
Fa'aopopo le 500 µl o le 1 M HCl methanol solution i fa'ata'ita'iga oligosaccharide ma paipa masani TMS. Na fa'asusuina fa'ata'ita'iga i le po atoa (168 itula) i le 80° C. i totonu o se poloka vevela. Fa'amago le oloa methanolysis i le vevela o le potu e fa'aaoga ai se manifold fa'amago. Fa'aopopo le 200 µl MeOH ma toe fa'amago. E toe faia fa'alua lenei faiga. Fa'aopopo le 200 µl o le methanol, 100 µl o le pyridine ma le 100 µl o le acetic anhydride i le fa'ata'ita'iga ma fa'afefiloi lelei. Fa'asusu fa'ata'ita'iga i le vevela o le potu mo le 30 minute. ma fa'amago. Fa'aopopo le 200 µl o le methanol ma toe fa'amago.
Fa'aopopo le 200 µl o le Tri-Sil ma fa'avevela le paipa ua tapuni mo le 20 minute. 80°C, ona fa'amālūlū lea i le vevela o le potu. Fa'aaoga se masini fa'amago e fa'amago atili ai le fa'ata'ita'iga i le aofa'i e tusa ma le 50 µl. E taua le maitauina e le'i fa'atagaina fa'ata'ita'iga e mago atoa.
Fa'aopoopo le 2 ml o le hexane ma palu lelei e ala i le vortexing. Fa'atumu pito o Pasteur pipettes (5-8 mm) i se fasi tioata fulufulu mamoe e ala i le tu'uina o le tioata fulufulu mamoe i luga o se pipette e 5-3/4 inisi le lautele. Na fa'asolo fa'ata'ita'i i le 3000 kalama mo le 2 minute. So'o se toega e le mafai ona soloia e fa'aputuina. Fa'amago le fa'ata'ita'iga i le 100-150 µl. O se voluma e tusa ma le 1 μl na tuiina i totonu o le GC-MS i le vevela muamua o le 80 °C ma le taimi muamua o le 2.0 minute (Laulau 2).