Nature.comను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌లో CSS మద్దతు పరిమితంగా ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు అప్‌డేట్ చేయబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాలని (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో కంపాటిబిలిటీ మోడ్‌ను నిలిపివేయాలని) మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోగా, మద్దతు కొనసాగేలా చూసేందుకు, మేము స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ను రెండర్ చేస్తాము.
AFEX తో ముందుగా శుద్ధి చేయబడిన మొక్కజొన్న కాండంలో ఉండే నిరంతర ఒలిగోశాకరైడ్‌ల సంక్లిష్ట విశ్లేషణ కోసం కొత్త ఇమ్యునోలాజికల్ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రిక్ పద్ధతులు. లిగ్నోసెల్యులోసిక్ బయోమాస్ అనేది శిలాజ ఇంధనాలకు ఒక సుస్థిరమైన ప్రత్యామ్నాయం మరియు ఆహారం, పశుగ్రాసం, ఇంధనాలు మరియు రసాయనాలు వంటి ఉత్పత్తుల తయారీకి అవసరమైన బయోటెక్నాలజీలను అభివృద్ధి చేయడానికి ఇది విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతుంది. మొక్కల కణ గోడలలో ఉండే సంక్లిష్ట కార్బోహైడ్రేట్లను గ్లూకోజ్, జైలోజ్ మరియు అరబినోజ్ వంటి సరళ చక్కెరలుగా మార్చడానికి, తక్కువ ఖర్చుతో కూడిన ప్రక్రియలను అభివృద్ధి చేయడమే ఈ టెక్నాలజీలకు కీలకం. లిగ్నోసెల్యులోసిక్ బయోమాస్ చాలా మొండిది కాబట్టి, ఆశించిన ఉత్పత్తిని పొందడానికి దీనిని థర్మోకెమికల్ చికిత్సలు (ఉదాహరణకు, అమ్మోనియా ఫైబర్ ఎక్స్‌ఫోలియేషన్ (AFEX), విలీన ఆమ్లాలు (DA), అయానిక్ లిక్విడ్స్ (IL)) మరియు జీవసంబంధమైన చికిత్సలు (ఉదాహరణకు, ఎంజైమాటిక్ హైడ్రోలైసిస్ మరియు మైక్రోబియల్ ఫెర్మెంటేషన్) రెండింటికీ కలిపి గురిచేయాలి. అయితే, జలవిశ్లేషణ ప్రక్రియలో వాణిజ్య శిలీంధ్ర ఎంజైమ్‌లను ఉపయోగించినప్పుడు, ఏర్పడిన కరిగే చక్కెరలలో 75-85% మాత్రమే మోనోశాకరైడ్‌లు ఉంటాయి, మరియు మిగిలిన 15-25% కరిగే, విచ్ఛిన్నం చేయలేని ఒలిగోశాకరైడ్‌లుగా ఉంటాయి, ఇవి సూక్ష్మజీవులకు ఎల్లప్పుడూ అందుబాటులో ఉండవు. గతంలో, మేము కార్బన్ మరియు డయాటోమేషియస్ ఎర్త్ వేరుచేయడం మరియు సైజ్ ఎక్స్‌క్లూజన్ క్రోమాటోగ్రఫీ కలయికను ఉపయోగించి కరిగే మొండి ఒలిగోశాకరైడ్‌లను విజయవంతంగా వేరుచేసి శుద్ధి చేశాము, మరియు వాటి ఎంజైమ్ నిరోధక లక్షణాలను కూడా పరిశోధించాము. తక్కువ డిగ్రీ ఆఫ్ పాలిమరైజేషన్ (DP) మరియు తటస్థ ఒలిగోశాకరైడ్‌లతో పోలిస్తే, అధిక డిగ్రీ ఆఫ్ పాలిమరైజేషన్ (DP) మిథైలేటెడ్ యూరోనిక్ యాసిడ్ ప్రత్యామ్నాయాలను కలిగి ఉన్న ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వాణిజ్య ఎంజైమ్ మిశ్రమాలతో ప్రాసెస్ చేయడం మరింత కష్టమని మేము కనుగొన్నాము. మొక్కల కణ గోడలు మరియు ఎంజైమాటిక్ హైడ్రోలైసేట్‌లలోని గ్లైకాన్ బంధాలను వర్గీకరించడానికి, మొక్కల బయోమాస్ గ్లైకాన్‌లకు ప్రత్యేకమైన మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీలను (mAbs) ఉపయోగించి గ్లైకాన్ ప్రొఫైలింగ్, మ్యాట్రిక్స్-అసిస్టెడ్ లేజర్ డీసార్ప్షన్ అయనైజేషన్, టైమ్-ఆఫ్-ఫ్లైట్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ వంటి అనేక అదనపు పద్ధతుల వాడకాన్ని ఇక్కడ మేము నివేదిస్తున్నాము. MALDI-TOF-MS, డెరివేటైజేషన్‌తో మరియు లేకుండా ఒలిగోశాకరైడ్ బంధాలను వర్గీకరించడానికి, నెగటివ్ అయాన్‌ల సెకండరీ డికే తర్వాత స్పెక్ట్రోస్కోపీ ద్వారా పొందిన నిర్మాణం-సమాచార డయాగ్నస్టిక్ పీక్‌లను, గ్యాస్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (GC-MS)ని ఉపయోగిస్తుంది. ఒలిగోశాకరైడ్‌ల (DP 4–20) చిన్న పరిమాణం కారణంగా, ఈ అణువులను mAb బైండింగ్ మరియు వర్గీకరణ కోసం ఉపయోగించడం కష్టం. ఈ సమస్యను అధిగమించడానికి, మేము ఒక కొత్త బయోటిన్ సంయోగ-ఆధారిత ఒలిగోశాకరైడ్ స్థిరీకరణ పద్ధతిని అనువర్తించాము. ఇది మైక్రోప్లేట్ ఉపరితలంపై తక్కువ DP ద్రావణీయత గల అధికశాకరైడ్‌లలో అధిక భాగాన్ని విజయవంతంగా లేబుల్ చేసింది, దీనిని తరువాత నిర్దిష్ట లైగేషన్ విశ్లేషణ కోసం ఒక హై థ్రూపుట్ mAb వ్యవస్థలో ఉపయోగించారు. ఈ కొత్త పద్ధతి భవిష్యత్తులో మరింత అధునాతనమైన హై థ్రూపుట్ గ్లైకోమ్ అస్సేల అభివృద్ధిని సులభతరం చేస్తుంది, వీటిని రోగనిర్ధారణ ప్రయోజనాల కోసం బయోమార్కర్లలో ఉండే ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వేరుచేయడానికి మరియు వాటి లక్షణాలను గుర్తించడానికి ఉపయోగించవచ్చు.
వ్యవసాయ, అటవీ, గడ్డి మరియు కలప పదార్థాలతో కూడిన లిగ్నోసెల్యులోసిక్ బయోమాస్, ఆహారం, పశుగ్రాసం, ఇంధనం మరియు అధిక విలువ కలిగిన ఉత్పత్తులను తయారు చేయడానికి రసాయన పూర్వగాములతో సహా జీవ-ఆధారిత ఉత్పత్తుల ఉత్పత్తికి ఒక సంభావ్య ఫీడ్‌స్టాక్. మొక్కల కణ గోడలలో ఉండే కార్బోహైడ్రేట్లు (సెల్యులోజ్ మరియు హెమిసెల్యులోజ్ వంటివి) రసాయన ప్రక్రియ మరియు బయోట్రాన్స్‌ఫర్మేషన్ (ఎంజైమాటిక్ హైడ్రోలైసిస్ మరియు మైక్రోబియల్ ఫెర్మెంటేషన్ వంటివి) ద్వారా మోనోశాకరైడ్‌లుగా డీపాలిమరైజ్ చేయబడతాయి. సాధారణ ప్రీ-ట్రీట్‌మెంట్‌లలో అమ్మోనియా ఫైబర్ ఎక్స్‌పాన్షన్ (AFEX), డైల్యూట్ యాసిడ్ (DA), అయానిక్ లిక్విడ్ (IL), మరియు స్టీమ్ ఎక్స్‌ప్లోజన్ (SE) ఉన్నాయి, ఇవి మొక్కల కణ గోడలను తెరవడం ద్వారా లిగ్నోసెల్యులోజ్ ఉత్పత్తిని తగ్గించడానికి రసాయనాలు మరియు వేడి కలయికను ఉపయోగిస్తాయి. ఎంజైమాటిక్ హైడ్రోలైసిస్‌ను వాణిజ్యపరంగా చురుకైన కార్బోహైడ్రేట్-కలిగిన ఎంజైమ్‌లను (CAZymes) ఉపయోగించి అధిక ఘనపదార్థాల లోడ్‌తో నిర్వహిస్తారు మరియు జీవ-ఆధారిత ఇంధనాలు మరియు రసాయనాలను ఉత్పత్తి చేయడానికి ట్రాన్స్‌జెనిక్ ఈస్ట్‌లు లేదా బ్యాక్టీరియాను ఉపయోగించి మైక్రోబియల్ ఫెర్మెంటేషన్ నిర్వహిస్తారు.
వాణిజ్య ఎంజైమ్‌లలోని CAZymes అనేవి, సంక్లిష్టమైన కార్బోహైడ్రేట్-చక్కెర బంధాలను సమన్వయంతో విచ్ఛిన్నం చేసి మోనోశాకరైడ్‌లను ఏర్పరిచే ఎంజైమ్‌ల సంక్లిష్ట మిశ్రమంతో కూడి ఉంటాయి2,7. మేము ఇంతకుముందు నివేదించినట్లుగా, కార్బోహైడ్రేట్‌లతో కూడిన లిగ్నిన్ యొక్క ఆరోమాటిక్ పాలిమర్‌ల సంక్లిష్టమైన నెట్‌వర్క్ వాటిని అత్యంత కఠినంగా చేస్తుంది, ఇది చక్కెర మార్పిడిని అసంపూర్ణంగా చేస్తుంది. దీనివల్ల, ముందుగా శుద్ధి చేసిన బయోమాస్ యొక్క ఎంజైమాటిక్ హైడ్రోలైసిస్ సమయంలో ఉత్పత్తి కాని 15-25% ఆరు ఒలిగోశాకరైడ్‌లు పేరుకుపోతాయి. వివిధ బయోమాస్ ప్రీట్రీట్‌మెంట్ పద్ధతులలో ఇది ఒక సాధారణ సమస్య. ఈ ప్రతిబంధకానికి కొన్ని కారణాలలో హైడ్రోలైసిస్ సమయంలో ఎంజైమ్ నిరోధం, లేదా మొక్కల బయోమాస్‌లోని చక్కెర బంధాలను విచ్ఛిన్నం చేయడానికి అవసరమైన ముఖ్యమైన ఎంజైమ్‌లు లేకపోవడం లేదా తక్కువ స్థాయిలో ఉండటం వంటివి ఉన్నాయి. ఒలిగోశాకరైడ్‌లలోని చక్కెర బంధాల వంటి చక్కెరల కూర్పు మరియు నిర్మాణ లక్షణాలను అర్థం చేసుకోవడం, హైడ్రోలైసిస్ సమయంలో చక్కెర మార్పిడిని మెరుగుపరచడంలో మనకు సహాయపడుతుంది, తద్వారా బయోటెక్నలాజికల్ ప్రక్రియలను పెట్రోలియం-ఉత్పన్న ఉత్పత్తులతో ఖర్చు పరంగా పోటీపడేలా చేస్తుంది.
కార్బోహైడ్రేట్ల నిర్మాణాన్ని నిర్ధారించడం సవాలుతో కూడుకున్నది మరియు దీనికి లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (LC)11,12, న్యూక్లియర్ మాగ్నెటిక్ రెసొనెన్స్ స్పెక్ట్రోస్కోపీ (NMR)13, క్యాపిల్లరీ ఎలక్ట్రోఫోరెసిస్ (CE)14,15,16 మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MS)17, పద్దెనిమిది వంటి పద్ధతుల కలయిక అవసరం. కార్బోహైడ్రేట్ నిర్మాణాలను గుర్తించడానికి, లేజర్ డీసార్ప్షన్ మరియు మ్యాట్రిక్స్ ఉపయోగించి అయనీకరణతో కూడిన టైమ్-ఆఫ్-ఫ్లైట్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MALDI-TOF-MS) వంటి MS పద్ధతులు ఒక బహుముఖ పద్ధతి. ఇటీవల, ఒలిగోశాకరైడ్ అటాచ్మెంట్ స్థానాలు, అనోమెరిక్ కాన్ఫిగరేషన్లు, సీక్వెన్సులు మరియు బ్రాంచింగ్ స్థానాలకు సంబంధించిన ఫింగర్‌ప్రింట్‌లను గుర్తించడానికి సోడియం అయాన్ అడక్ట్‌ల యొక్క కొలిజన్-ఇండ్యూస్డ్ డిస్సోసియేషన్ (CID) టాండెమ్ MS అత్యంత విస్తృతంగా ఉపయోగించబడింది 20, 21.
కార్బోహైడ్రేట్ బంధాలను లోతుగా గుర్తించడానికి గ్లైకాన్ విశ్లేషణ ఒక అద్భుతమైన సాధనం22. ఈ పద్ధతి సంక్లిష్ట కార్బోహైడ్రేట్ అనుసంధానాలను అర్థం చేసుకోవడానికి, మొక్కల కణ గోడ గ్లైకాన్‌కు నిర్దేశించబడిన మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీలను (mAbs) ప్రోబ్స్‌గా ఉపయోగిస్తుంది. ప్రపంచవ్యాప్తంగా, వివిధ శాకరైడ్‌లను ఉపయోగించి, వివిధ సరళ మరియు శాఖల ఒలిగోశాకరైడ్‌లకు వ్యతిరేకంగా రూపొందించబడిన 250 కంటే ఎక్కువ mAbs అందుబాటులో ఉన్నాయి24. మొక్కల కణ రకం, అవయవం, వయస్సు, అభివృద్ధి దశ మరియు పెరుగుదల వాతావరణాన్ని బట్టి గణనీయమైన తేడాలు ఉన్నందున25,26, మొక్కల కణ గోడ యొక్క నిర్మాణం, కూర్పు మరియు మార్పులను వర్గీకరించడానికి అనేక mAbs విస్తృతంగా ఉపయోగించబడ్డాయి. ఇటీవలి కాలంలో, ఈ పద్ధతిని మొక్క మరియు జంతు వ్యవస్థలలోని వెసికిల్ సమూహాలను మరియు ఉపకణ గుర్తులు, అభివృద్ధి దశలు లేదా పర్యావరణ ప్రేరకాల ద్వారా నిర్ధారించబడిన గ్లైకాన్ రవాణాలో వాటి సంబంధిత పాత్రలను అర్థం చేసుకోవడానికి, మరియు ఎంజైమాటిక్ కార్యాచరణను నిర్ధారించడానికి ఉపయోగించారు. గుర్తించబడిన గ్లైకాన్‌లు మరియు జైలాన్‌ల యొక్క కొన్ని విభిన్న నిర్మాణాలలో పెక్టిన్ (P), జైలాన్ (X), మన్నాన్ (M), జైలోగ్లూకాన్‌లు (XylG), మిశ్రమ బంధ గ్లూకాన్‌లు (MLG), అరబినోజైలాన్ (ArbX), గాలక్టోమన్నాన్ (GalG), గ్లూకురోనిక్ ఆమ్లం-అరబినోజైలాన్ (GArbX) మరియు అరబినో-గాలక్టాన్ (ArbG)29 ఉన్నాయి.
అయినప్పటికీ, ఈ పరిశోధన ప్రయత్నాలన్నీ ఉన్నప్పటికీ, అధిక ఘనపదార్థాల భారం (HSL) జలవిశ్లేషణ సమయంలో ఒలిగోశాకరైడ్ చేరడం యొక్క స్వభావంపై కొన్ని అధ్యయనాలు మాత్రమే దృష్టి సారించాయి, వీటిలో ఒలిగోశాకరైడ్ విడుదల, జలవిశ్లేషణ సమయంలో ఒలిగోమెరిక్ గొలుసు పొడవు మార్పులు, వివిధ తక్కువ DP పాలిమర్‌లు మరియు వాటి పంపిణీ వక్రతలు 30,31,32 ఉన్నాయి. అదే సమయంలో, గ్లైకాన్ నిర్మాణం యొక్క సమగ్ర విశ్లేషణకు గ్లైకాన్ విశ్లేషణ ఒక ఉపయోగకరమైన సాధనంగా నిరూపించబడినప్పటికీ, యాంటీబాడీ పద్ధతులను ఉపయోగించి నీటిలో కరిగే తక్కువ DP ఒలిగోశాకరైడ్‌లను మూల్యాంకనం చేయడం కష్టం. 5-10 kDa కంటే తక్కువ అణుభారం ఉన్న చిన్న DP ఒలిగోశాకరైడ్‌లు ELISA ప్లేట్‌లకు బంధించవు 33, 34 మరియు యాంటీబాడీని జోడించడానికి ముందే కొట్టుకుపోతాయి.
ఇక్కడ, మేము మొదటిసారిగా, కరిగే మొండి ఒలిగోశాకరైడ్‌ల కోసం ఒక-దశ బయోటినైలేషన్ విధానాన్ని గ్లైకోమ్ విశ్లేషణతో కలిపి, మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీలను ఉపయోగించి అవిడిన్-పూత పూసిన ప్లేట్లపై ఒక ELISA పరీక్షను ప్రదర్శిస్తున్నాము. జలవిశ్లేషణ చెందిన చక్కెర సమ్మేళనాల ట్రైమిథైల్సిలిల్ (TMS) డెరివేటైజేషన్‌ను ఉపయోగించి, కాంప్లిమెంటరీ ఒలిగోశాకరైడ్ లింకేజ్‌ల యొక్క MALDI-TOF-MS మరియు GC-MS ఆధారిత విశ్లేషణ ద్వారా గ్లైకోమ్ విశ్లేషణకు మా విధానం ధృవీకరించబడింది. ఈ వినూత్న విధానాన్ని భవిష్యత్తులో ఒక హై-త్రూపుట్ పద్ధతిగా అభివృద్ధి చేయవచ్చు మరియు బయోమెడికల్ పరిశోధనలో విస్తృత అనువర్తనాన్ని కనుగొనవచ్చు35.
ఎంజైమ్‌లు మరియు యాంటీబాడీల యొక్క అనువాదానంతర మార్పులు, ఉదాహరణకు గ్లైకోసైలేషన్,36 వాటి జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను ప్రభావితం చేస్తాయి. ఉదాహరణకు, సీరం ప్రోటీన్ల గ్లైకోసైలేషన్‌లో మార్పులు ఇన్ఫ్లమేటరీ ఆర్థరైటిస్‌లో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తాయి మరియు గ్లైకోసైలేషన్‌లోని మార్పులను రోగనిర్ధారణ గుర్తులుగా ఉపయోగిస్తారు37. జీర్ణాశయం మరియు కాలేయానికి సంబంధించిన దీర్ఘకాలిక ఇన్ఫ్లమేటరీ వ్యాధులు, వైరల్ ఇన్ఫెక్షన్లు, అండాశయ, రొమ్ము మరియు ప్రోస్టేట్ క్యాన్సర్‌లతో సహా అనేక రకాల వ్యాధులలో వివిధ గ్లైకాన్‌లు సులభంగా కనిపిస్తాయని సాహిత్యంలో నివేదించబడింది38,39,40. యాంటీబాడీ-ఆధారిత గ్లైకాన్ ELISA పద్ధతులను ఉపయోగించి గ్లైకాన్‌ల నిర్మాణాన్ని అర్థం చేసుకోవడం, సంక్లిష్టమైన MS పద్ధతులను ఉపయోగించకుండా వ్యాధి నిర్ధారణలో అదనపు విశ్వాసాన్ని అందిస్తుంది.
మా మునుపటి అధ్యయనం, ప్రీట్రీట్‌మెంట్ మరియు ఎంజైమాటిక్ హైడ్రోలైసిస్ తర్వాత కూడా మొండి ఒలిగోశాకరైడ్‌లు హైడ్రోలైజ్ కాకుండా మిగిలిపోయాయని చూపించింది (పటం 1). మేము గతంలో ప్రచురించిన మా పరిశోధనలో, AFEX-ప్రీట్రీటెడ్ కార్న్ స్టోవర్ హైడ్రోలైజేట్ (ACSH)8 నుండి ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వేరుచేయడానికి ఒక యాక్టివేటెడ్ చార్‌కోల్ సాలిడ్-ఫేజ్ ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ పద్ధతిని అభివృద్ధి చేశాము. ప్రాథమిక వెలికితీత మరియు విభజన తర్వాత, ఒలిగోశాకరైడ్‌లను సైజ్ ఎక్స్‌క్లూజన్ క్రోమాటోగ్రఫీ (SEC) ద్వారా మరింతగా ఫ్రాక్షనేట్ చేసి, వాటి అణుభారం క్రమంలో సేకరించారు. వివిధ ప్రీట్రీట్‌మెంట్‌ల నుండి విడుదలైన షుగర్ మోనోమర్‌లు మరియు ఒలిగోమర్‌లను షుగర్ కంపోజిషన్ అనాలిసిస్ ద్వారా విశ్లేషించారు. వివిధ ప్రీట్రీట్‌మెంట్ పద్ధతుల ద్వారా పొందిన షుగర్ ఒలిగోమర్‌ల పరిమాణాన్ని పోల్చినప్పుడు, బయోమాస్‌ను మోనోశాకరైడ్‌లుగా మార్చే ప్రక్రియలో మొండి ఒలిగోశాకరైడ్‌ల ఉనికి ఒక సాధారణ సమస్య అని, ఇది చక్కెర దిగుబడిలో కనీసం 10-15% మరియు 18% వరకు కూడా తగ్గుదలకు దారితీస్తుందని తేలింది. ఈ పద్ధతిని ఒలిగోశాకరైడ్ ఫ్రాక్షన్‌ల తదుపరి భారీ-స్థాయి ఉత్పత్తి కోసం ఉపయోగిస్తారు. ఈ అధ్యయనంలో ఒలిగోశాకరైడ్‌ల లక్షణాలను నిర్ధారించడానికి, ఫలితంగా వచ్చిన ACH మరియు వివిధ అణు భారాలు గల దాని తదుపరి భిన్నాలను ప్రయోగాత్మక పదార్థంగా ఉపయోగించారు.
పూర్వచికిత్స మరియు ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ తర్వాత, నిరంతర ఒలిగోశాకరైడ్‌లు జలవిశ్లేషణకు గురికాకుండా మిగిలిపోయాయి. ఇక్కడ (A) అనేది ఒక ఒలిగోశాకరైడ్ వేరుచేసే పద్ధతి, దీనిలో యాక్టివేటెడ్ కార్బన్ మరియు డయాటోమేషియస్ ఎర్త్‌తో కూడిన ప్యాక్డ్ బెడ్‌ను ఉపయోగించి AFEX-పూర్వచికిత్స పొందిన మొక్కజొన్న కాండం హైడ్రోలైసేట్ (ACSH) నుండి ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వేరుచేస్తారు; (B) ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వేరుచేసే పద్ధతి. ఒలిగోశాకరైడ్‌లను సైజ్ ఎక్స్‌క్లూజన్ క్రోమాటోగ్రఫీ (SEC) ద్వారా మరింతగా వేరు చేశారు; (C) వివిధ పూర్వచికిత్సల (విలీన ఆమ్లం: DA, అయానిక్ ద్రవం: IL మరియు AFEX) నుండి విడుదలైన శాకరైడ్ మోనోమర్‌లు మరియు ఒలిగోమర్‌లు. ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ పరిస్థితులు: 25% (w/w) అధిక ఘనపదార్థాల లోడింగ్ (సుమారు 8% గ్లూకాన్ లోడింగ్), 96 గంటల జలవిశ్లేషణ, 20 mg/g వాణిజ్య ఎంజైమ్ లోడింగ్ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 నిష్పత్తి) మరియు (D) AFEX తో ముందుగా శుద్ధి చేసిన మొక్కజొన్న కాండం (ACS) నుండి విడుదలైన గ్లూకోజ్, జైలోజ్ మరియు అరబినోజ్ యొక్క చక్కెర మోనోమర్లు మరియు ఒలిగోమర్లు.
ఘన జీవద్రవ్య అవశేషాల నుండి వేరుచేయబడిన సారాలలో గ్లైకాన్‌ల సమగ్ర నిర్మాణ విశ్లేషణకు గ్లైకాన్ విశ్లేషణ ఒక ఉపయోగకరమైన సాధనంగా నిరూపించబడింది. అయితే, ఈ సాంప్రదాయ పద్ధతిని ఉపయోగించి నీటిలో కరిగే శాకరైడ్‌లు తక్కువగా ప్రాతినిధ్యం వహిస్తాయి41 ఎందుకంటే తక్కువ అణుభారం గల ఒలిగోశాకరైడ్‌లను ELISA ప్లేట్లపై స్థిరీకరించడం కష్టం మరియు యాంటీబాడీని జోడించడానికి ముందే అవి కడిగివేయబడతాయి. అందువల్ల, యాంటీబాడీ బంధనం మరియు లక్షణీకరణ కోసం, అవిడిన్-కోటెడ్ ELISA ప్లేట్లపై కరిగే, నాన్-కంప్లైంట్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లకు పూత పూయడానికి ఒక-దశ బయోటినైలేషన్ పద్ధతిని ఉపయోగించారు. ఈ పద్ధతిని మేము గతంలో ఉత్పత్తి చేసిన ACSH మరియు దాని అణుభారం (లేదా పాలిమరైజేషన్ డిగ్రీ, DP) ఆధారంగా ఒక ఫ్రాక్షన్‌ను ఉపయోగించి పరీక్షించాము. కార్బోహైడ్రేట్ యొక్క రిడ్యూసింగ్ ఎండ్‌కు బయోటిన్-LC-హైడ్రజైడ్‌ను జోడించడం ద్వారా ఒలిగోశాకరైడ్ బంధన అనుబంధాన్ని పెంచడానికి ఒక-దశ బయోటినైలేషన్‌ను ఉపయోగించారు (పటం 2). ద్రావణంలో, రిడ్యూసింగ్ ఎండ్‌లోని హెమియాసెటల్ సమూహం బయోటిన్-LC-హైడ్రజైడ్ యొక్క హైడ్రజైడ్ సమూహంతో చర్య జరిపి హైడ్రజోన్ బంధాన్ని ఏర్పరుస్తుంది. క్షయకరణ కారకం NaCNBH3 సమక్షంలో, హైడ్రాజోన్ బంధం ఒక స్థిరమైన బయోటినిలేటెడ్ అంతిమ ఉత్పత్తిగా క్షయకరణం చెందుతుంది. చక్కెర క్షయకరణ అంతిమ భాగాన్ని సవరించడం ద్వారా, తక్కువ DP ఉన్న ఒలిగోశాకరైడ్‌లను ELISA ప్లేట్‌లకు బంధించడం సాధ్యమైంది, మరియు మా అధ్యయనంలో గ్లైకాన్-లక్షిత mAbs ఉపయోగించి అవిడిన్-పూత పూసిన ప్లేట్లపై ఇది చేయబడింది.
బయోటినైలేటెడ్ ఒలిగోశాకరైడ్‌ల కోసం ELISA ఆధారంగా మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీల స్క్రీనింగ్. ఇక్కడ (A) ఒలిగోశాకరైడ్‌ల సంయుక్త బయోటినైలేషన్ మరియు న్యూట్రావిడిన్ పూత పూసిన ప్లేట్లపై గ్లైకాన్-లక్షిత mAbsతో తదుపరి ELISA స్క్రీనింగ్ మరియు (B) చర్య ఉత్పత్తుల బయోటినైలేషన్ కోసం ఒక-దశల విధానాన్ని చూపుతుంది.
ఆలిగోశాకరైడ్-సంయుక్త యాంటీబాడీలతో కూడిన అవిడిన్-పూత పూసిన ప్లేట్లను ప్రాథమిక మరియు ద్వితీయ యాంటీబాడీలకు జోడించి, కాంతి మరియు సమయ-సున్నిత మాధ్యమంలో కడిగారు. యాంటీబాడీ బంధనం పూర్తయిన తర్వాత, ప్లేట్‌ను ఇంక్యుబేట్ చేయడానికి TMB సబ్‌స్ట్రేట్‌ను జోడించండి. చివరగా, సల్ఫ్యూరిక్ ఆమ్లంతో చర్యను నిలిపివేశారు. యాంటీబాడీ-నిర్దిష్ట క్రాస్-లింకింగ్‌ను గుర్తించడానికి, ప్రతి యాంటీబాడీ యొక్క బంధన బలాన్ని నిర్ధారించడానికి ఇంక్యుబేట్ చేసిన ప్లేట్లను ELISA రీడర్‌ను ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. ప్రయోగం యొక్క వివరాలు మరియు పారామితుల కోసం, సంబంధిత "పదార్థాలు మరియు పద్ధతులు" విభాగాన్ని చూడండి.
ACSHలో అలాగే లిగ్నోసెల్యులోసిక్ హైడ్రోలైసేట్‌ల నుండి వేరుచేయబడిన ముడి మరియు శుద్ధి చేయబడిన ఒలిగోశాకరైడ్ ఫ్రాక్షన్‌లలో ఉండే కరిగే ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వర్గీకరించడం ద్వారా, నిర్దిష్ట అనువర్తనాల కోసం ఈ కొత్తగా అభివృద్ధి చేయబడిన పద్ధతి యొక్క ప్రయోజనాన్ని మేము ప్రదర్శిస్తాము. పటం 3లో చూపినట్లుగా, బయోఅసైలేటెడ్ గ్లైకోమ్ అస్సే పద్ధతులను ఉపయోగించి ACSHలో గుర్తించబడిన అత్యంత సాధారణ ఎపిటోప్-ప్రతిక్షేపిత జైలాన్‌లు సాధారణంగా యూరోనిక్ (U) లేదా మిథైల్ యూరోనిక్ (MeU) మరియు పెక్టిక్ అరబినోగాలక్టాన్‌లు. వాటిలో చాలా వరకు హైడ్రోలైజ్ చేయని ఘనపదార్థాల (UHS)43 గ్లైకాన్‌ల విశ్లేషణపై మా మునుపటి అధ్యయనంలో కూడా కనుగొనబడ్డాయి.
కణ గోడ గ్లైకాన్‌కు నిర్దేశించబడిన మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీని ఉపయోగించి మొండి ఒలిగోశాకరైడ్ ఎపిటోప్‌లను గుర్తించడం. "తటస్థ" భాగం ACN భాగం మరియు "ఆమ్ల" భాగం FA భాగం. హీట్‌మ్యాప్‌పై ప్రకాశవంతమైన ఎరుపు రంగులు అధిక ఎపిటోప్ కంటెంట్‌ను సూచిస్తాయి మరియు ప్రకాశవంతమైన నీలం రంగులు ఖాళీ నేపథ్యాన్ని సూచిస్తాయి. స్కేల్‌పై రంగు విలువలు N=2 ఫార్ములేషన్‌ల కోసం ముడి OD విలువలపై ఆధారపడి ఉంటాయి. యాంటీబాడీలచే గుర్తించబడిన ప్రధాన ఎపిటోప్‌లు కుడివైపున చూపబడ్డాయి.
పరీక్షించిన వాణిజ్య ఎంజైమ్ మిశ్రమంలోని అత్యంత సాధారణ సెల్యులేజ్‌లు మరియు హెమిసెల్యులేజ్‌ల ద్వారా ఈ సెల్యులోజ్-యేతర నిర్మాణాలను విచ్ఛిన్నం చేయడం సాధ్యపడలేదు; ఈ మిశ్రమంలో అత్యంత సాధారణంగా ఉపయోగించే వాణిజ్య ఎంజైమ్‌లు కూడా ఉన్నాయి. అందువల్ల, వాటి జలవిశ్లేషణకు కొత్త సహాయక ఎంజైమ్‌లు అవసరం. అవసరమైన సెల్యులోజ్-యేతర సహాయక ఎంజైమ్‌లు లేకుండా, వాణిజ్య ఎంజైమ్ మిశ్రమాలను ఉపయోగించి వాటి మాతృ చక్కెర పాలిమర్‌లను చిన్న చిన్న ఖండాలుగా విస్తృతంగా జలవిశ్లేషణ చేసి కరిగించినప్పటికీ, ఈ సెల్యులోజ్-యేతర బంధాలు మోనోశాకరైడ్‌లుగా పూర్తి మార్పిడిని నిరోధిస్తాయి.
సిగ్నల్ పంపిణీ మరియు దాని బంధన బలంపై జరిపిన తదుపరి అధ్యయనంలో, తక్కువ DP ఫ్రాక్షన్‌ల (డైమర్‌లలో) కంటే అధిక DP చక్కెర ఫ్రాక్షన్‌లలో (A, B, C, DP 20+ వరకు) బంధన ఎపిటోప్‌లు తక్కువగా ఉన్నాయని తేలింది (పటం 1). తటస్థ ఫ్రాగ్మెంట్‌ల కంటే నాన్-సెల్యులోజ్ ఎపిటోప్‌లలో ఆమ్ల ఫ్రాగ్మెంట్‌లు ఎక్కువగా ఉంటాయి. ఈ దృగ్విషయాలు మా మునుపటి అధ్యయనంలో గమనించిన నమూనాతో సరిపోలుతున్నాయి, అక్కడ అధిక DP మరియు ఆమ్ల భాగాలు ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణకు ఎక్కువ నిరోధకతను కలిగి ఉన్నాయి. అందువల్ల, నాన్-సెల్యులోజ్ గ్లైకాన్ ఎపిటోప్‌లు మరియు U, MeU ప్రత్యామ్నాయాల ఉనికి ఒలిగోశాకరైడ్‌ల స్థిరత్వానికి ఎంతగానో దోహదం చేస్తుంది. తక్కువ DP ఒలిగోశాకరైడ్‌లకు, ముఖ్యంగా ఎపిటోప్ ఒక డైమెరిక్ లేదా ట్రైమెరిక్ ఒలిగోశాకరైడ్ అయితే, బంధన మరియు గుర్తింపు సామర్థ్యం సమస్యాత్మకంగా ఉండవచ్చని గమనించాలి. ఒక నిర్దిష్ట mAbకు బంధించే ఒకే ఒక ఎపిటోప్‌ను కలిగి ఉన్న వివిధ పొడవుల వాణిజ్య ఒలిగోశాకరైడ్‌లను ఉపయోగించి దీనిని పరీక్షించవచ్చు.
ఈ విధంగా, నిర్మాణం-నిర్దిష్ట యాంటీబాడీల వాడకం కొన్ని రకాల మొండి బంధాలను వెల్లడించింది. ఉపయోగించిన యాంటీబాడీ రకం, సరైన లైగేషన్ నమూనా, మరియు అది ఉత్పత్తి చేసే సిగ్నల్ బలం (అత్యధికంగా మరియు అత్యల్పంగా) ఆధారంగా, కొత్త ఎంజైమ్‌లను గుర్తించి, మరింత సంపూర్ణ గ్లైకోకన్వర్షన్ కోసం ఎంజైమ్ మిశ్రమానికి పాక్షిక-పరిమాణాత్మకంగా జోడించవచ్చు. ACSH ఒలిగోశాకరైడ్‌ల విశ్లేషణను ఉదాహరణగా తీసుకుంటే, మనం ప్రతి బయోమాస్ పదార్థానికి గ్లైకాన్ బంధాల డేటాబేస్‌ను సృష్టించవచ్చు. ఇక్కడ గమనించవలసిన విషయం ఏమిటంటే, యాంటీబాడీల విభిన్న అనుబంధాన్ని పరిగణనలోకి తీసుకోవాలి, మరియు వాటి అనుబంధం తెలియకపోతే, ఇది వేర్వేరు యాంటీబాడీల సిగ్నల్‌లను పోల్చేటప్పుడు కొన్ని ఇబ్బందులను సృష్టిస్తుంది. అదనంగా, గ్లైకాన్ బంధాల పోలిక ఒకే యాంటీబాడీకి చెందిన నమూనాల మధ్య ఉత్తమంగా పనిచేయవచ్చు. ఈ మొండి బంధాలను అప్పుడు CAZyme డేటాబేస్‌కు అనుసంధానించవచ్చు, దాని నుండి మనం ఎంజైమ్‌లను గుర్తించవచ్చు, అభ్యర్థి ఎంజైమ్‌లను ఎంచుకోవచ్చు మరియు బంధాలను విచ్ఛిన్నం చేసే ఎంజైమ్‌ల కోసం పరీక్షించవచ్చు, లేదా బయోరిఫైనరీలలో ఉపయోగం కోసం ఈ ఎంజైమ్‌లను వ్యక్తీకరించడానికి సూక్ష్మజీవ వ్యవస్థలను అభివృద్ధి చేయవచ్చు44.
లిగ్నోసెల్యులోసిక్ హైడ్రోలైసేట్స్‌లో ఉండే తక్కువ అణుభారం గల ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వర్గీకరించడానికి ప్రత్యామ్నాయ పద్ధతులకు ఇమ్యునోలాజికల్ పద్ధతులు ఎలా తోడ్పడతాయో మూల్యాంకనం చేయడానికి, మేము అదే ప్యానెల్ (Fig. 5) ఒలిగోశాకరైడ్ భాగంపై MALDI (Fig. 4, S1-S8) మరియు GC-MS ఆధారంగా TMS-ఉత్పన్న శాకరైడ్‌ల విశ్లేషణను నిర్వహించాము. ఒలిగోశాకరైడ్ అణువుల ద్రవ్యరాశి పంపిణీ ఉద్దేశించిన నిర్మాణానికి సరిపోలుతుందో లేదో పోల్చడానికి MALDI ఉపయోగించబడుతుంది. Fig. 4 తటస్థ భాగాలైన ACN-A మరియు ACN-B యొక్క MSను చూపుతుంది. ACN-A విశ్లేషణ DP 4–8 (Fig. 4) నుండి DP 22 (Fig. S1) వరకు ఉన్న పెంటోస్ చక్కెరల శ్రేణిని నిర్ధారించింది, వీటి బరువులు MeU-జైలాన్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లకు అనుగుణంగా ఉంటాయి. ACN-B విశ్లేషణ DP 8-15తో పెంటోస్ మరియు గ్లూకోజైలాన్ శ్రేణిని నిర్ధారించింది. ఫిగర్ S3 వంటి అనుబంధ సమాచారంలో, FA-C ఆమ్ల భాగం ద్రవ్యరాశి పంపిణీ పటాలు 8-15 DP కలిగిన (Me)U ప్రతిక్షేపిత పెంటోస్ చక్కెరల శ్రేణిని చూపుతాయి, ఇవి ELISA-ఆధారిత mAb స్క్రీనింగ్‌లో కనుగొనబడిన ప్రతిక్షేపిత జైలాన్‌లకు అనుగుణంగా ఉంటాయి. ఎపిటోప్‌లు స్థిరంగా ఉన్నాయి.
ACSలో ఉన్న కరిగే నాన్-కంప్లైంట్ ఒలిగోశాకరైడ్‌ల MALDI-MS స్పెక్ట్రమ్. ఇక్కడ, (A) మిథైలేటెడ్ యూరోనిక్ యాసిడ్ (DP 4-8) ప్రతిక్షేపిత గ్లూకురోక్సిలాన్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లను కలిగి ఉన్న ACN-A తక్కువ బరువు పరిధి ఫ్రాక్షన్‌లు మరియు (B) గ్లూకురోక్సిలాన్ (DP 8-15)తో ప్రతిక్షేపితమైన జిలాన్ మరియు మిథైలేటెడ్ యూరోనిక్ యాసిడ్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లు.
రిఫ్రాక్టరీ ఒలిగోశాకరైడ్‌ల గ్లైకాన్ అవశేషం యొక్క కూర్పు విశ్లేషణ. ఇక్కడ (A) GC-MS విశ్లేషణను ఉపయోగించి పొందిన వివిధ ఒలిగోశాకరైడ్ ఫ్రాక్షన్‌ల యొక్క TMS శాకరైడ్ కూర్పు. (B) ఒలిగోశాకరైడ్‌లలో ఉన్న వివిధ TMS-ఉత్పన్న చక్కెరల నిర్మాణాలు. ACN – తటస్థ ఒలిగోశాకరైడ్‌లను కలిగి ఉన్న ఎసిటోనైట్రైల్ ఫ్రాక్షన్ మరియు FA – ఆమ్ల ఒలిగోశాకరైడ్‌లను కలిగి ఉన్న ఫెరులిక్ ఆమ్ల ఫ్రాక్షన్.
ఒలిగోశాకరైడ్ ఫ్రాక్షన్ యొక్క LC-MS విశ్లేషణ నుండి మరొక ఆసక్తికరమైన ముగింపు వెలువడింది, ఇది చిత్రం S9లో చూపబడింది (పద్ధతులను ఎలక్ట్రానిక్ అనుబంధ సామగ్రిలో చూడవచ్చు). ACN-B ఫ్రాక్షన్ యొక్క లైగేషన్ సమయంలో హెక్సోస్ మరియు -OAc సమూహాల శకలాలు పదేపదే గమనించబడ్డాయి. ఈ ఆవిష్కరణ గ్లైకోమ్ మరియు MALDI-TOF విశ్లేషణలో గమనించిన ఫ్రాగ్మెంటేషన్‌ను ధృవీకరించడమే కాకుండా, ముందుగా శుద్ధి చేసిన లిగ్నోసెల్యులోసిక్ బయోమాస్‌లోని సంభావ్య కార్బోహైడ్రేట్ ఉత్పన్నాల గురించి కొత్త సమాచారాన్ని కూడా అందిస్తుంది.
మేము TMS గ్లైకాన్ డెరివేటైజేషన్ ఉపయోగించి ఒలిగోశాకరైడ్ ఫ్రాక్షన్ల యొక్క గ్లైకాన్ కూర్పు విశ్లేషణను కూడా నిర్వహించాము. GC-MS ఉపయోగించి, మేము ఒలిగోశాకరైడ్ ఫ్రాక్షన్‌లో తటస్థ (డెరివేటివ్ కాని) మరియు ఆమ్ల చక్కెరల (GluA మరియు GalA) కూర్పును నిర్ధారించాము (పటం 5). గ్లూకురోనిక్ ఆమ్లం ఆమ్ల భాగాలు C మరియు D లలో కనుగొనబడింది, అయితే గాలక్టురోనిక్ ఆమ్లం ఆమ్ల భాగాలు A మరియు B లలో కనుగొనబడింది, ఈ రెండూ ఆమ్ల చక్కెరల యొక్క అధిక DP భాగాలు. ఈ ఫలితాలు మా ELISA మరియు MALDI డేటాను ధృవీకరించడమే కాకుండా, ఒలిగోశాకరైడ్ చేరడంపై మా మునుపటి అధ్యయనాలతో కూడా స్థిరంగా ఉన్నాయి. అందువల్ల, ఒలిగోశాకరైడ్ల బయోటినైలేషన్ మరియు తదుపరి ELISA స్క్రీనింగ్‌ను ఉపయోగించే ఆధునిక ఇమ్యునోలాజికల్ పద్ధతులు వివిధ జీవ నమూనాలలో కరిగే మొండి ఒలిగోశాకరైడ్లను గుర్తించడానికి సరిపోతాయని మేము నమ్ముతున్నాము.
ELISA-ఆధారిత mAb స్క్రీనింగ్ పద్ధతులు అనేక విభిన్న పద్ధతుల ద్వారా ధృవీకరించబడినందున, మేము ఈ కొత్త పరిమాణాత్మక పద్ధతి యొక్క సామర్థ్యాన్ని మరింతగా అన్వేషించాలనుకున్నాము. కణ గోడ గ్లైకాన్‌ను లక్ష్యంగా చేసుకున్న ఒక కొత్త mAb విధానాన్ని ఉపయోగించి, రెండు వాణిజ్య ఒలిగోశాకరైడ్‌లు, జైలోహెక్సాశాకరైడ్ ఒలిగోశాకరైడ్ (XHE) మరియు 23-α-L-అరబినోఫ్యూరనోసిల్-జైలోట్రియోస్ (A2XX) లను కొనుగోలు చేసి పరీక్షించడం జరిగింది. పటం 6, బయోటినిలేటెడ్ బైండింగ్ సిగ్నల్ మరియు ఒలిగోశాకరైడ్ గాఢత యొక్క లాగ్ గాఢత మధ్య ఒక సరళ సంబంధాన్ని చూపిస్తుంది, ఇది సాధ్యమయ్యే లాంగ్‌ముయిర్ అధిశోషణ నమూనాను సూచిస్తుంది. mAbs లలో, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, మరియు CCRC-M151 లు XHE తో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి, మరియు CCRC-M108, CCRC-M109, మరియు LM11 లు 1 nm నుండి 100 నానో పరిధిలో A2XX తో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి. ప్రయోగ సమయంలో యాంటీబాడీల లభ్యత పరిమితంగా ఉన్నందున, ప్రతి ఒలిగోశాకరైడ్ గాఢతతో పరిమిత ప్రయోగాలు మాత్రమే నిర్వహించబడ్డాయి. ఇక్కడ గమనించవలసిన విషయం ఏమిటంటే, కొన్ని యాంటీబాడీలు ఒకే ఒలిగోశాకరైడ్‌ను సబ్‌స్ట్రేట్‌గా ఉపయోగించినప్పుడు చాలా భిన్నంగా ప్రతిస్పందిస్తాయి. బహుశా దీనికి కారణం, అవి కొద్దిగా భిన్నమైన ఎపిటోప్‌లకు బంధించబడటం మరియు చాలా భిన్నమైన బంధన అనుబంధాలను కలిగి ఉండటం కావచ్చు. ఈ కొత్త mAb విధానాన్ని నిజమైన నమూనాలకు వర్తింపజేసినప్పుడు, కచ్చితమైన ఎపిటోప్ గుర్తింపు యొక్క యంత్రాంగాలు మరియు పర్యవసానాలు మరింత సంక్లిష్టంగా ఉంటాయి.
వివిధ గ్లైకాన్-లక్ష్యిత mAbల గుర్తింపు పరిధిని నిర్ధారించడానికి రెండు వాణిజ్య ఒలిగోశాకరైడ్‌లను ఉపయోగించారు. ఇక్కడ, ఒలిగోశాకరైడ్ గాఢత యొక్క లాగ్ గాఢతతో ఉన్న సరళ సంబంధాలు (A) mAbతో XHE మరియు (B) mAbతో A2XX కోసం లాంగ్‌ముయిర్ అధిశోషణ నమూనాలను సూచిస్తాయి. సంబంధిత ఎపిటోప్‌లు ఈ పరీక్షలో సబ్‌స్ట్రేట్‌లుగా ఉపయోగించిన వాణిజ్య ఒలిగోశాకరైడ్‌ల నిర్మాణాలను సూచిస్తాయి.
మొక్కల జీవపదార్థాన్ని (బయోమాస్‌ను) తయారుచేసే చాలా ప్రధాన కణ గోడ గ్లైకాన్‌లను లోతుగా వర్గీకరించడానికి, గ్లైకాన్-లక్షిత మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీల (గ్లైకోకామిక్ విశ్లేషణ లేదా ELISA-ఆధారిత mAb స్క్రీనింగ్) వాడకం ఒక శక్తివంతమైన సాధనం. అయితే, సాంప్రదాయ గ్లైకాన్ విశ్లేషణ కేవలం పెద్ద కణ గోడ గ్లైకాన్‌లను మాత్రమే వర్గీకరిస్తుంది, ఎందుకంటే చాలా ఒలిగోశాకరైడ్‌లు ELISA ప్లేట్లపై సమర్థవంతంగా స్థిరీకరించబడవు. ఈ అధ్యయనంలో, AFEXతో ముందుగా శుద్ధి చేసిన మొక్కజొన్న కాండాన్ని అధిక ఘనపదార్థాల శాతంతో ఎంజైమ్‌ల ద్వారా జలవిశ్లేషణ చేశారు. జలవిశ్లేషణ ద్రావణంలో (హైడ్రోలైజేట్‌లో) మొండి కణ గోడ కార్బోహైడ్రేట్ల కూర్పును నిర్ధారించడానికి చక్కెర విశ్లేషణను ఉపయోగించారు. అయితే, జలవిశ్లేషణ ద్రావణాలలో (హైడ్రోలైజేట్స్‌లో) చిన్న ఒలిగోశాకరైడ్‌ల mAb విశ్లేషణ తక్కువగా అంచనా వేయబడింది, మరియు ఒలిగోశాకరైడ్‌లను ELISA ప్లేట్లపై సమర్థవంతంగా స్థిరీకరించడానికి అదనపు సాధనాలు అవసరం.
న్యూట్రావిడిన్™ పూత పూసిన ప్లేట్లపై ఒలిగోశాకరైడ్ బయోటినైలేషన్ మరియు దాని తర్వాత ELISA స్క్రీనింగ్‌ను కలపడం ద్వారా, mAb స్క్రీనింగ్ కోసం ఒక నూతనమైన మరియు సమర్థవంతమైన ఒలిగోశాకరైడ్ స్థిరీకరణ పద్ధతిని మేము ఇక్కడ నివేదిస్తున్నాము. స్థిరీకరించబడిన బయోటినైలేటెడ్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లు, మొండి ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వేగంగా మరియు సమర్థవంతంగా గుర్తించడానికి వీలుగా యాంటీబాడీ పట్ల తగినంత అనుబంధాన్ని చూపించాయి. మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ ఆధారంగా ఈ మొండి ఒలిగోశాకరైడ్‌ల కూర్పు యొక్క విశ్లేషణ, ఇమ్యునోస్క్రీనింగ్‌కు సంబంధించిన ఈ కొత్త విధానం యొక్క ఫలితాలను ధృవీకరించింది. అందువల్ల, ఈ అధ్యయనాలు ఒలిగోశాకరైడ్ బయోటినైలేషన్ మరియు గ్లైకాన్-లక్షిత మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీలతో ELISA స్క్రీనింగ్ కలయికను ఒలిగోశాకరైడ్‌లలోని క్రాస్‌లింక్‌లను గుర్తించడానికి ఉపయోగించవచ్చని మరియు ఒలిగోశాకరైడ్‌ల నిర్మాణాన్ని వర్గీకరించే ఇతర జీవరసాయన అధ్యయనాలలో దీనిని విస్తృతంగా వర్తింపజేయవచ్చని నిరూపిస్తున్నాయి.
ఈ బయోటిన్ ఆధారిత గ్లైకాన్ ప్రొఫైలింగ్ పద్ధతి, మొక్కల బయోమాస్‌లోని కరిగే ఒలిగోశాకరైడ్‌ల యొక్క మొండి కార్బోహైడ్రేట్ బంధాలను పరిశోధించగల సామర్థ్యం ఉన్న మొట్టమొదటి నివేదిక. బయోఫ్యూయల్ ఉత్పత్తి విషయానికి వస్తే బయోమాస్‌లోని కొన్ని భాగాలు ఎందుకు అంత మొండిగా ఉంటాయో అర్థం చేసుకోవడానికి ఇది సహాయపడుతుంది. ఈ పద్ధతి గ్లైకోమ్ విశ్లేషణ పద్ధతులలోని ఒక ముఖ్యమైన లోటును పూరిస్తుంది మరియు దీని అనువర్తనాన్ని మొక్కల ఒలిగోశాకరైడ్‌లకు మించి విస్తృత శ్రేణి సబ్‌స్ట్రేట్‌లకు విస్తరిస్తుంది. భవిష్యత్తులో, మనం బయోటినైలేషన్ కోసం రోబోటిక్స్‌ను ఉపయోగించవచ్చు మరియు ELISA ఉపయోగించి నమూనాల హై-త్రూపుట్ విశ్లేషణ కోసం మనం అభివృద్ధి చేసిన పద్ధతిని ఉపయోగించవచ్చు.
కొలరాడోలోని రే పట్టణంలో ఉన్న క్రామర్ ఫార్మ్స్ నుండి, పయనీర్ 33A14 హైబ్రిడ్ విత్తనాల నుండి పండించిన మొక్కజొన్న గడ్డి (CS)ని 2010లో కోత కోశారు. భూ యజమాని అనుమతితో, ఈ జీవపదార్థాన్ని పరిశోధన కోసం ఉపయోగించవచ్చు. నమూనాలను గది ఉష్ణోగ్రతలో, 6% కంటే తక్కువ తేమ ఉండేలా జిప్-లాక్ బ్యాగులలో పొడిగా నిల్వ చేశారు. నమూనాలను గది ఉష్ణోగ్రతలో, 6% కంటే తక్కువ తేమ ఉండేలా జిప్-లాక్ బ్యాగులలో పొడిగా నిల్వ చేశారు. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной темпер. నమూనాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద, 6% కంటే తక్కువ తేమలో, జిప్పర్ ఉన్న సంచులలో పొడిగా నిల్వ చేశారు.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% ఒబ్రేసియస్ ట్రాన్సక్ టు పాకెట్స్ స్సస్టేజ్కోయ్-మోల్నియయ్ ప్రై కోమ్నట్నోయ్ టెంపరటురే స్ వ్లాగ్నోస్ట్యుర్ <6%. నమూనాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద, 6% కంటే తక్కువ తేమతో కూడిన జిప్పర్ బ్యాగులలో నిల్వ చేస్తారు.ఈ అధ్యయనం స్థానిక మరియు జాతీయ మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా జరిగింది. NREL ప్రోటోకాల్‌ను ఉపయోగించి కూర్పు విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. ఈ కూర్పులో 31.4% గ్లూకాన్, 18.7% జైలాన్, 3.3% అరబినాన్, 1.2% గాలక్టాన్, 2.2% ఎసిటైల్, 14.3% లిగ్నిన్, 1.7% ప్రోటీన్ మరియు 13.4% బూడిద ఉన్నట్లు కనుగొనబడింది.
సెల్లిక్® CTec2 (138 mg ప్రోటీన్/ml, లాట్ VCNI 0001) అనేది సెల్యులేస్, β-గ్లూకోసిడేస్ మరియు నోవోజైమ్స్ (ఫ్రాంక్లింటన్, NC, USA) నుండి వచ్చిన సెల్లిక్® HTec2 (157 mg ప్రోటీన్/ml, లాట్ VHN00001) యొక్క సంక్లిష్ట మిశ్రమం. పెక్టిన్‌ను విచ్ఛిన్నం చేసే ఎంజైమ్‌ల సంక్లిష్ట మిశ్రమమైన మల్టీఫెక్ట్ పెక్టినేస్® (72 mg ప్రోటీన్/mL)ను డ్యూపాంట్ ఇండస్ట్రియల్ బయోసైన్సెస్ (పాలో ఆల్టో, CA, USA) వారు విరాళంగా ఇచ్చారు. కెల్డాల్ నైట్రోజన్ విశ్లేషణ (AOAC పద్ధతి 2001.11, డైరీ వన్ కోఆపరేటివ్ ఇంక్., ఇథాకా, NY, USA) ఉపయోగించి ప్రోటీన్ కంటెంట్‌ను అంచనా వేయడం ద్వారా (మరియు ప్రోటీన్-యేతర నైట్రోజన్ యొక్క ప్రభావాన్ని తీసివేయడం ద్వారా) ఎంజైమ్ ప్రోటీన్ గాఢతలను నిర్ధారించారు. డయాటోమేషియస్ ఎర్త్ 545ను EMD మిల్లిపోర్ (బిల్లేరికా, MA) నుండి కొనుగోలు చేశారు. యాక్టివేటెడ్ కార్బన్ (DARCO, 100 మెష్ గ్రాన్యూల్స్), అవిసెల్ (PH-101), బీచ్ జైలాన్ మరియు మిగతా అన్ని రసాయనాలను సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ (సెయింట్ లూయిస్, MO) నుండి కొనుగోలు చేయడం జరిగింది.
AFEX పూర్వచికిత్సను GLBRC (బయోమాస్ కన్వర్షన్ రీసెర్చ్ లాబొరేటరీ, MSU, లాన్సింగ్, MI, USA) వద్ద నిర్వహించారు. ఈ పూర్వచికిత్సను 140° C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు నిర్వహించారు. స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ బెంచ్‌టాప్ బ్యాచ్ రియాక్టర్ (పార్ ఇన్‌స్ట్రుమెంట్స్ కంపెనీ)లో, 60% (w/w) లోడింగ్‌తో బయోమాస్‌కు 1:1 నిష్పత్తిలో నిర్జల అమ్మోనియాను ఉపయోగించి 46 నిమిషాల నివాస సమయం పాటు ఈ ప్రక్రియను చేపట్టారు. దీనికి 30 నిమిషాలు పట్టింది. రియాక్టర్‌ను 140°C కి తీసుకువచ్చి, అమ్మోనియాను వేగంగా విడుదల చేశారు, దీనివల్ల బయోమాస్ త్వరగా గది ఉష్ణోగ్రతకు తిరిగి వచ్చింది. AFEX పూర్వచికిత్స పొందిన మొక్కజొన్న కాండం (ACS) కూర్పు, చికిత్స పొందని మొక్కజొన్న కాండం (UT-CS) కూర్పును పోలి ఉంది.
ఒలిగోశాకరైడ్‌ల భారీ స్థాయి ఉత్పత్తికి ప్రారంభ ముడి పదార్థంగా అధిక ఘనపదార్థాలు గల ACSH 25% (w/w) (సుమారు 8% డెక్స్‌ట్రాన్ లోడింగ్) తయారు చేయబడింది. సెల్లిక్® Ctec2 10 mg ప్రోటీన్/g గ్లూకాన్ (ముందుగా శుద్ధి చేసిన బయోమాస్‌లో), Htec2 (నోవోజైమ్స్, ఫ్రాంక్లింటన్, NC), 5 mg ప్రోటీన్/g గ్లూకాన్, మరియు మల్టీఫెక్ట్ పెక్టినేస్ (జెనెన్‌కోర్ ఇంక్, USA) లతో కూడిన వాణిజ్య ఎంజైమ్ మిశ్రమాన్ని ఉపయోగించి ACS యొక్క ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ చేయబడింది. ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణను 3 లీటర్ల పని పరిమాణం, pH 4.8, 50°C మరియు 250 rpm వద్ద 5-లీటర్ల బయోరియాక్టర్‌లో నిర్వహించారు. 96 గంటల జలవిశ్లేషణ తర్వాత, జలవిశ్లేషణ చెందని ఘనపదార్థాలను తొలగించడానికి, జలవిశ్లేషణ ద్రావణాన్ని 30 నిమిషాల పాటు 6000 rpm వద్ద మరియు ఆ తర్వాత 30 నిమిషాల పాటు 14000 rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా సేకరించారు. ఆ తర్వాత హైడ్రోలైజేట్‌ను 0.22 మిమీ ఫిల్టర్ బీకర్ ద్వారా స్టెరైల్ ఫిల్ట్రేషన్‌కు గురిచేశారు. ఫిల్టర్ చేసిన హైడ్రోలైజేట్‌ను 4° C వద్ద స్టెరైల్ బాటిళ్లలో నిల్వ చేసి, ఆపై కార్బన్‌పై ఫ్రాక్షనేట్ చేశారు.
NREL ప్రయోగశాల విశ్లేషణ విధానాల ప్రకారం సార-ఆధారిత బయోమాస్ నమూనాల కూర్పు విశ్లేషణ: కూర్పు విశ్లేషణ కోసం నమూనాల తయారీ (NREL/TP-510-42620) మరియు బయోమాస్‌లో నిర్మాణాత్మక కార్బోహైడ్రేట్లు మరియు లిగ్నిన్ నిర్ధారణ (NREL/TP-510 – 42618)47.
ఆటోక్లేవ్ ఆధారిత ఆమ్ల జలవిశ్లేషణ పద్ధతిని ఉపయోగించి, 2 ml స్థాయిలో జలవిశ్లేషణ ప్రవాహం యొక్క ఒలిగోశాకరైడ్ విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. 10 ml స్క్రూ క్యాప్ కల్చర్ ట్యూబ్‌లో జలవిశ్లేషణ నమూనాను 69.7 µl 72% సల్ఫ్యూరిక్ ఆమ్లంతో కలిపి, 121 °C వద్ద బెంచ్‌టాప్‌పై 1 గంట పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయండి, ఐస్‌పై చల్లార్చి, హై పర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (HPLC) వయల్‌లోకి ఫిల్టర్ చేయండి. ఆమ్ల-జలవిశ్లేషణ చేయబడిన నమూనాలోని మొత్తం చక్కెర గాఢత నుండి జలవిశ్లేషణ చేయని నమూనాలోని మోనోశాకరైడ్‌ల గాఢతను తీసివేయడం ద్వారా ఒలిగోశాకరైడ్‌ల గాఢతను నిర్ధారించారు.
ఆటోశాంప్లర్, కాలమ్ హీటర్, ఐసోక్రాటిక్ పంప్ మరియు రిఫ్రాక్టివ్ ఇండెక్స్ డిటెక్టర్‌తో కూడిన షిమాడ్జు HPLC సిస్టమ్‌ను ఉపయోగించి, బయో-రాడ్ అమినెక్స్ HPX-87H కాలమ్‌పై ఆమ్ల జలవిశ్లేషణ చేయబడిన బయోమాస్‌లోని గ్లూకోజ్, జైలోజ్ మరియు అరబినోజ్ గాఢతలను విశ్లేషించారు. కాలమ్‌ను 50°C వద్ద ఉంచి, నీటిలో 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 ప్రవాహంతో ఎల్యూట్ చేశారు.
హైడ్రోలైజేట్ సూపర్నాటెంట్‌ను పలుచన చేసి, మోనోమర్ మరియు ఒలిగోశాకరైడ్ కంటెంట్ కోసం విశ్లేషించారు. ఎంజైమాటిక్ హైడ్రోలైసిస్ తర్వాత పొందిన మోనోమెరిక్ షుగర్లను, బయో-రాడ్ (హెర్క్యులెస్, CA) అమైనెక్స్ HPX-87P కాలమ్ మరియు యాష్ గార్డ్ కాలమ్‌తో కూడిన HPLC ద్వారా విశ్లేషించారు. కాలమ్ ఉష్ణోగ్రతను 80°C వద్ద నిర్వహించారు, 0.6 ml/min ప్రవాహ రేటుతో నీటిని మొబైల్ ఫేజ్‌గా ఉపయోగించారు. రిఫరెన్సులు 41, 48, 49లో వివరించిన పద్ధతుల ప్రకారం, 121°C వద్ద పలుచని ఆమ్లంలో హైడ్రోలైసిస్ ద్వారా ఒలిగోశాకరైడ్లను నిర్ధారించారు.
ముడి, AFEX తో ముందుగా శుద్ధి చేయబడిన మరియు జలవిశ్లేషణ చేయని అన్ని బయోమాస్ అవశేషాలపై (క్రమ కణ గోడ సారాల ఉత్పత్తి మరియు వాటి mAb స్క్రీనింగ్‌తో సహా) గతంలో వివరించిన విధానాలు 27, 43, 50, 51 ఉపయోగించి శాకరైడ్ విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. గ్లైకోమ్ విశ్లేషణ కోసం, బయోమాస్ అవశేషాల నుండి మొక్కల కణ గోడ పదార్థం యొక్క ఆల్కహాల్‌లో కరగని అవశేషాలను తయారుచేసి, గతంలో వివరించిన విధంగా 52,53 అమ్మోనియం ఆక్సలేట్ (50 mM), సోడియం కార్బోనేట్ (50 mM మరియు 0.5% w/v), CON. (1M మరియు 4M, రెండూ 1% w/v సోడియం బోరోహైడ్రైడ్‌తో) మరియు యాసిడ్ క్లోరైట్ వంటి మరింత తీవ్రమైన కారకాలతో క్రమంగా వెలికితీతకు గురిచేయబడ్డాయి. ఆ తర్వాత, కణ గోడ గ్లైకాన్‌ను లక్ష్యంగా చేసుకున్న mAb50ల సంక్లిష్ట ప్యానెల్‌కు వ్యతిరేకంగా ఈ సారాలను ELISAకు గురిచేయగా, mAb బంధన ప్రతిచర్యలు హీట్ మ్యాప్‌గా ప్రదర్శించబడ్డాయి. మొక్కల కణ గోడ గ్లైకాన్‌ను లక్ష్యంగా చేసుకున్న mAbs ప్రయోగశాల స్టాక్‌ల నుండి (CCRC, JIM మరియు MAC సిరీస్) కొనుగోలు చేయబడ్డాయి.
ఒలిగోశాకరైడ్‌ల యొక్క ఏక-దశ బయోటినైలేషన్. బయోటిన్-LC-హైడ్రజైడ్‌తో కార్బోహైడ్రేట్‌ల సంయోగం ఈ క్రింది విధానాన్ని ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది. బయోటిన్-LC-హైడ్రజైడ్ (4.6 mg/12 μmol)ను డైమిథైల్ సల్ఫాక్సైడ్ (DMSO, 70 μl)లో 65° C వద్ద 1 నిమిషం పాటు తీవ్రంగా కలుపుతూ మరియు వేడిచేస్తూ కరిగించారు. గ్లేసియల్ ఎసిటిక్ ఆమ్లం (30 µl)ను కలిపి, ఆ మిశ్రమాన్ని సోడియం సైనోబోరోహైడ్రైడ్ (6.4 mg/100 µmol) మీద పోసి, 65° C వద్ద సుమారు 1 నిమిషం పాటు వేడి చేసిన తర్వాత పూర్తిగా కరిగించారు. ఆ తర్వాత, క్షయకరణ చివరపై లేబుల్ యొక్క 10 రెట్లు లేదా అంతకంటే ఎక్కువ మోలార్ మిగులును పొందడానికి, 5 నుండి 8 μl వరకు చర్య మిశ్రమాన్ని ఎండబెట్టిన ఒలిగోశాకరైడ్ (1-100 nmol)కు కలిపారు. ఈ చర్యను 65°C వద్ద 2 గంటల పాటు నిర్వహించారు, ఆ తర్వాత నమూనాలను వెంటనే శుద్ధి చేశారు. క్షయకరణం లేకుండా లేబులింగ్ ప్రయోగాలలో సోడియం సైనోబోరోహైడ్రైడ్ ఉపయోగించబడలేదు, మరియు నమూనాలు 65° C వద్ద 2.5 గంటల పాటు చర్య జరిపాయి.
బయోటినిలేటెడ్ ఒలిగోశాకరైడ్‌ల నమూనాల ELISA కోటింగ్ మరియు వాషింగ్. అవిడిన్-కోటెడ్ ప్లేట్‌లోని ప్రతి వెల్‌కు 25 μl బయోటినిలేటెడ్ నమూనాలను (ప్రతి గాఢమైన నమూనా నుండి 100 μl చొప్పున 5 ml 0.1 M ట్రిస్ బఫర్ ద్రావణం (TBS)లో కలిపి) జోడించారు. కంట్రోల్ వెల్స్‌కు 0.1 M TBSలో 10 μg/ml గాఢత వద్ద 50 μl బయోటిన్‌తో కోటింగ్ చేశారు. బ్లాంక్ కొలతల కోసం కోటింగ్‌గా డీయోనైజ్డ్ వాటర్‌ను ఉపయోగించారు. టాబ్లెట్‌ను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద చీకటిలో 2 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. గ్రెనియర్ ఫ్లాట్ 3A కోసం ప్రోగ్రామ్ నెం. 11 ఉపయోగించి, 0.1 M TBSలో 0.1% స్కిమ్డ్ మిల్క్‌తో ప్లేట్‌ను 3 సార్లు కడగండి.
ప్రాథమిక యాంటీబాడీలను కలపడం మరియు కడగడం. ప్రతి వెల్‌కు 40 µl ప్రాథమిక యాంటీబాడీని కలపండి. మైక్రోప్లేట్‌ను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద చీకటిలో 1 గంట పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయండి. ఆ తర్వాత, గ్రెనియర్ ఫ్లాట్ 3A కోసం వాష్ ప్రోగ్రామ్ #11 ఉపయోగించి, 0.1M TBSలో 0.1% పాలతో ప్లేట్లను 3 సార్లు కడగాలి.
సెకండరీ యాంటీబాడీని జోడించి కడగండి. ప్రతి వెల్‌కు 50 µl మౌస్/రాట్ సెకండరీ యాంటీబాడీని (0.1 M TBSలో 0.1% పాలతో 1:5000 నిష్పత్తిలో పలుచబరిచినది) జోడించండి. మైక్రోప్లేట్‌ను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద చీకటిలో 1 గంట పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయండి. ఆ తర్వాత, గ్రెనియర్ ఫ్లాట్ 5A ప్లేట్ వాష్ ప్రోగ్రామ్ #12 ఉపయోగించి, మైక్రోప్లేట్‌లను 0.1 M TBSలో 0.1% పాలతో 5 సార్లు కడిగారు.
సబ్‌స్ట్రేట్‌ను జోడించడం. బేస్ సబ్‌స్ట్రేట్‌కు 50 µl 3,3′,5,5′-టెట్రామెథైల్‌బెంజిడిన్ (TMB)ను జోడించండి (15 ml డీయోనైజ్డ్ నీటికి 2 చుక్కల బఫర్, 3 చుక్కల TMB, 2 చుక్కల హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ జోడించడం ద్వారా). TMB సబ్‌స్ట్రేట్‌ను సిద్ధం చేయండి. మరియు ఉపయోగించే ముందు వోర్టెక్స్ చేయండి). మైక్రోప్లేట్‌ను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాల పాటు చీకటిలో ఇంక్యుబేట్ చేయండి.
దశను పూర్తి చేసి, టాబ్లెట్‌ను చదవండి. ప్రతి వెల్‌కు 50 µl 1 N సల్ఫ్యూరిక్ ఆమ్లాన్ని జోడించి, ELISA రీడర్‌ను ఉపయోగించి 450 నుండి 655 nm వరకు అబ్సార్బెన్స్‌ను నమోదు చేయండి.
ఈ క్రింది విశ్లేష్యకాల యొక్క 1 mg/ml ద్రావణాలను డీయోనైజ్డ్ నీటిలో తయారుచేయండి: అరబినోస్, రామ్నోస్, ఫ్యూకోస్, జైలోస్, గాలక్టురోనిక్ ఆమ్లం (GalA), గ్లూకురోనిక్ ఆమ్లం (GlcA), మాన్నోస్, గ్లూకోస్, గాలక్టోస్, లాక్టోస్, N-ఎసిటైల్మాన్నోసమైన్ (manNAc), N-ఎసిటైల్గ్లూకోసమైన్ (glcNAc), N-ఎసిటైల్గాలక్టోసమైన్ (galNAc), ఇనోసిటాల్ (అంతర్గత ప్రామాణికం). పట్టిక 1లో చూపిన 1 mg/mL చక్కెర ద్రావణాలను కలపడం ద్వారా రెండు ప్రామాణికాలను తయారుచేయడం జరిగింది. నమూనాలలో ఉన్న నీరంతా తొలగిపోయే వరకు (సాధారణంగా సుమారు 12-18 గంటలు) వాటిని -80° C వద్ద ఘనీభవింపజేసి, లైయోఫిలైజ్ చేయడం జరిగింది.
అనలిటికల్ బ్యాలెన్స్‌పై స్క్రూ క్యాప్ ట్యూబ్‌లలోకి 100–500 µg నమూనాను కలపండి. కలిపిన మొత్తాన్ని నమోదు చేయండి. నమూనాను ఒక నిర్దిష్ట గాఢత గల ద్రావణిలో కరిగించి, దానిని ద్రవ రూపంలో ట్యూబ్‌కు కలపడం ఉత్తమం. ప్రతి నమూనా ట్యూబ్‌కు అంతర్గత ప్రమాణంగా 20 µl 1 mg/ml ఇనోసిటాల్‌ను ఉపయోగించండి. నమూనాకు కలిపిన అంతర్గత ప్రమాణం మొత్తం, స్టాండర్డ్ ట్యూబ్‌కు కలిపిన అంతర్గత ప్రమాణం మొత్తానికి సమానంగా ఉండాలి.
స్క్రూ క్యాప్ ఉన్న ఒక చిన్న సీసాలో 8 మిల్లీలీటర్ల నిర్జల మిథనాల్‌ను కలపండి. ఆ తర్వాత 4 మిల్లీలీటర్ల 3 N మిథనాలిక్ HCl ద్రావణాన్ని పోసి, మూత పెట్టి బాగా కదిలించండి. ఈ ప్రక్రియలో నీటిని ఉపయోగించరు.
ఒలిగోశాకరైడ్ నమూనాలకు మరియు ప్రామాణిక TMS ట్యూబ్‌లకు 500 µl 1 M HCl మిథనాల్ ద్రావణాన్ని కలపండి. నమూనాలను థర్మల్ బ్లాక్‌లో 80° C వద్ద రాత్రంతా (168 గంటలు) ఇంక్యుబేట్ చేశారు. మిథనాలిసిస్ ఉత్పత్తిని డ్రైయింగ్ మానిఫోల్డ్ ఉపయోగించి గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద ఆరబెట్టండి. 200 µl MeOH కలిపి మళ్ళీ ఆరబెట్టండి. ఈ ప్రక్రియను రెండుసార్లు పునరావృతం చేస్తారు. నమూనాకు 200 µl మిథనాల్, 100 µl పిరిడిన్ మరియు 100 µl ఎసిటిక్ అనహైడ్రైడ్ కలిపి బాగా కలపండి. నమూనాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసి ఆరబెట్టండి. 200 µl మిథనాల్ కలిపి మళ్ళీ ఆరబెట్టండి.
200 µl ట్రై-సిల్ వేసి, మూత పెట్టిన ట్యూబ్‌ను 80°C వద్ద 20 నిమిషాల పాటు వేడి చేసి, ఆపై గది ఉష్ణోగ్రతకు చల్లార్చండి. నమూనాను సుమారుగా 50 µl పరిమాణానికి వచ్చే వరకు మరింతగా ఆరబెట్టడానికి డ్రైయింగ్ మానిఫోల్డ్‌ను ఉపయోగించండి. నమూనాలను పూర్తిగా ఆరనివ్వలేదని గమనించడం ముఖ్యం.
2 మి.లీ. హెక్సేన్‌ను జోడించి, వోర్టెక్సింగ్ ద్వారా బాగా కలపండి. 5-3/4 అంగుళాల వ్యాసం గల పైపెట్ పైన గ్లాస్ వూల్‌ను ఉంచి, పాశ్చర్ పైపెట్ల (5-8 మి.మీ.) చివరలను నింపండి. నమూనాలను 3000 g వద్ద 2 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. కరగని అవశేషాలు ఏవైనా ఉంటే అవక్షేపించబడతాయి. నమూనాను 100-150 µl వరకు ఆరబెట్టండి. సుమారు 1 µl పరిమాణాన్ని 80 °C ప్రారంభ ఉష్ణోగ్రత మరియు 2.0 నిమిషాల ప్రారంభ సమయం వద్ద GC-MS లోకి ఇంజెక్ట్ చేశారు (పట్టిక 2).