Mèsi paske ou te vizite Nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a gen yon sipò CSS limite. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou w itilize yon navigatè ki ajou (oswa dezaktive Mòd Konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinyèl, nou pral rann sit la san estil ak JavaScript.
Nouvo metòd iminolojik ak espektwometri mas pou analiz konplèks oligosakarid pèsistan nan pay mayi pretrete ak AFEX. Biomas lignocellulosic se yon altènatif dirab pou konbistib fosil epi li lajman itilize pou devlope bioteknoloji pou pwodiksyon pwodwi tankou manje, fouraj, konbistib ak pwodui chimik. Kle teknoloji sa yo se devlopman pwosesis konpetitif an tèm de pri pou konvèti idrat kabòn konplèks ki prezan nan mi selil plant yo an sik senp tankou glikoz, ksiloz ak arabinoz. Paske biomas lignocellulosic trè fèm, li dwe sibi tretman tèmochimik (pa egzanp, èksfolyasyon fib amonyak (AFEX), asid dilye (DA), likid iyonik (IL)) ak tretman byolojik (pa egzanp, idwoliz anzimatik ak fèmantasyon mikwòb) an konbinezon pou jwenn pwodwi a vle. Sepandan, lè anzim fonjik komèsyal yo itilize nan pwosesis idwoliz la, se sèlman 75-85% nan sik idrosolubl ki fòme yo ki se monosakarid, epi 15-25% ki rete yo se oligosakarid idrosolubl, entraksib, ki pa toujou disponib pou mikwo-òganis. Anvan sa, nou te reyisi izole epi pirifye oligosakarid fè tèt di idrosolubl yo lè l sèvi avèk yon konbinezon separasyon kabòn ak tè diatom ak kwomatografi esklizyon gwosè, epi nou te envestige tou pwopriyete inibitwa anzim yo. Nou te jwenn ke oligosakarid ki gen sibstitisyon asid uronik metile ki gen pi gwo degre polimerizasyon (DP) yo pi difisil pou trete ak melanj anzim komèsyal pase oligosakarid ki gen DP ki ba ak net. La a, nou rapòte itilizasyon plizyè metòd adisyonèl, tankou pwofilaj glikan lè l sèvi avèk antikò monoklonal (mAbs) espesifik pou glikan byomas plant pou karakterize lyezon glikan nan mi selil plant yo ak idroliza anzimatik, iyonizasyon desòpsyon lazè asistans matris, spektwometri mas tan-de-vòl. . MALDI-TOF-MS) itilize pik dyagnostik enfòmatif estrikti ki jwenn pa spektroskopi apre dezentegrasyon segondè iyon negatif, kwomatografi gaz ak spektwometri mas (GC-MS) pou karakterize lyezon oligosakarid avèk ak san derivatizasyon. Akòz ti gwosè oligosakarid yo (DP 4-20), molekil sa yo difisil pou itilize pou lyezon ak karakterizasyon antikò monoklonal (mAb). Pou simonte pwoblèm sa a, nou te aplike yon nouvo metòd imobilizasyon oligosakarid ki baze sou konjigezon biotin ki te make avèk siksè majorite oligosakarid idrosolubl ki gen DP ki ba sou sifas mikwoplak la, ki te itilize apre sa nan yon sistèm mAb ki gen gwo debi pou analiz ligasyon espesifik. Nouvo metòd sa a pral fasilite devlopman tès glikòm ki gen gwo debi ki pi avanse nan lavni ki ka itilize pou izole ak karakterize oligosakarid ki prezan nan byomarkè pou rezon dyagnostik.
Byomas lignoselulozik, ki konpoze de materyèl agrikòl, forè, zèb ak bwa, se yon matyè premyè potansyèl pou pwodiksyon pwodwi ki baze sou byoloji, tankou manje, fouraj, konbistib ak prekisè chimik pou pwodui pwodwi ki gen plis valè1. Idrat kabòn (tankou seluloz ak emiseluloz) ki prezan nan mi selil plant yo depolimerize an monosakarid pa pwosesis chimik ak byotransfòmasyon (tankou idwoliz anzimatik ak fèmantasyon mikwòb). Pre-tretman komen yo enkli ekspansyon fib amonyak (AFEX), asid dilye (DA), likid iyonik (IL), ak eksplozyon vapè (SE), ki itilize yon konbinezon pwodui chimik ak chalè pou diminye pwodiksyon lignoseluloz lè yo louvri mi selil plant yo3,4. tèt di matyè, 5. Idwoliz anzimatik fèt nan yon chaj solid ki wo lè l sèvi avèk anzim komèsyal aktif ki gen idrat kabòn (CAZymes) ak fèmantasyon mikwòb lè l sèvi avèk ledven oswa bakteri transjenik pou pwodui konbistib ak pwodui chimik ki baze sou byoloji6.
CAZym nan anzim komèsyal yo konpoze de yon melanj konplèks anzim ki fann lyezon konplèks idrat kabòn-sik an sinèji pou fòme monosakarid2,7. Jan nou te rapòte pi bonè, rezo konplèks polimè aromatik lignin ak idrat kabòn yo fè yo trè difisil pou trete, sa ki mennen nan yon konvèsyon sik enkonplè, akimile 15-25% oligosakarid sèks ki pa pwodui pandan idwoliz anzimatik byomas pretrete a. Sa a se yon pwoblèm komen ak divès metòd pretretman byomas. Kèk rezon pou blokaj sa a gen ladan anpèchman anzim pandan idwoliz, oswa absans oswa nivo ki ba nan anzim esansyèl esansyèl ki nesesè pou kraze lyezon sik nan byomas plant lan. Konprann konpozisyon ak karakteristik estriktirèl sik yo, tankou lyezon sik nan oligosakarid yo, ap ede nou amelyore konvèsyon sik pandan idwoliz, sa ki fè pwosesis byoteknolojik yo konpetitif an tèm de pri ak pwodwi ki sòti nan petwòl.
Detèmine estrikti idrat kabòn yo se yon defi epi li mande yon konbinezon metòd tankou kromatografi likid (LC)11,12, spektroskopi rezonans mayetik nikleyè (NMR)13, elektwoforèz kapilè (CE)14,15,16 ak spektrometri mas (MS)17. ,dizwit. Metòd MS tankou spektrometri mas tan-de-vòl ak desòpsyon lazè ak iyonizasyon lè l sèvi avèk yon matris (MALDI-TOF-MS) se yon metòd versatile pou idantifye estrikti idrat kabòn yo. Dènyèman, Disosyasyon Pwovoke pa Kolizyon (CID) tandem MS nan addik iyon sodyòm yo te pi lajman itilize pou idantifye anprent ki koresponn ak pozisyon atachman oligosakarid, konfigirasyon anomerik, sekans, ak pozisyon branchman 20, 21.
Analiz glikan se yon zouti ekselan pou idantifikasyon apwofondi lyezon idrat kabòn22. Metòd sa a itilize antikò monoklonal (mAbs) ki dirije sou glikan miray selil plant kòm sond pou konprann lyezon idrat kabòn konplèks. Plis pase 250 mAbs disponib atravè lemond, ki fèt kont divès oligosakarid lineyè ak branche lè l sèvi avèk divès sakarid24. Plizyè mAbs yo te lajman itilize pou karakterize estrikti, konpozisyon ak modifikasyon miray selil plant lan, paske gen diferans enpòtan selon kalite selil plant, ògàn, laj, etap devlopman ak anviwònman kwasans25,26. Tou dènyèman, metòd sa a te itilize pou konprann popilasyon vezikil nan sistèm plant ak bèt ak wòl respektif yo nan transpò glikan jan makè subselilè, etap devlopman oswa stimuli anviwònman detèmine yo, epi pou detèmine aktivite anzimatik. Kèk nan diferan estrikti glikan ak ksilan yo te idantifye yo enkli pektin (P), ksilan (X), manan (M), ksiloglikan (XylG), glikan lyezon melanje (MLG), arabinoksilinan (ArbX), galaktomanan (GalG), asid glukuronik-arabinoksilinan (GArbX) ak arabino-galaktan (ArbG)29.
Sepandan, malgre tout efò rechèch sa yo, se sèlman kèk etid ki konsantre sou nati akimilasyon oligosakarid pandan idwoliz ak gwo chaj solid (HSL), ki gen ladan liberasyon oligosakarid, chanjman longè chèn oligomerik pandan idwoliz, divès polimè ki gen DP ki ba, ak koub distribisyon yo 30,31,32. Pandansetan, byenke analiz glikan te pwouve li se yon zouti itil pou yon analiz konplè sou estrikti glikan, li difisil pou evalye oligosakarid ki gen DP ki ba idrosolubl lè l sèvi avèk metòd antikò. Oligosakarid DP ki pi piti ki gen yon pwa molekilè mwens pase 5-10 kDa pa mare ak plak ELISA 33, 34 epi yo lave anvan yo ajoute antikò.
Isit la, pou premye fwa, nou demontre yon tès ELISA sou plak kouvri ak avidin lè l sèvi avèk antikò monoklonal, konbine yon pwosedi biotinilasyon yon sèl etap pou oligosakarid refraktè idrosolubl ak analiz glikòm. Apwòch nou an pou analiz glikòm te valide pa analiz MALDI-TOF-MS ak GC-MS sou lyen oligosakarid konplemantè lè l sèvi avèk derivatizasyon trimetilsilil (TMS) nan konpozisyon sik idrolize. Apwòch inovatè sa a ka devlope kòm yon metòd gwo débit nan lavni epi jwenn yon aplikasyon pi laj nan rechèch byomedikal35.
Modifikasyon post-tradiksyonèl anzim ak antikò yo, tankou glikozilasyon,36 afekte aktivite byolojik yo. Pa egzanp, chanjman nan glikozilasyon pwoteyin serik yo jwe yon wòl enpòtan nan atrit enflamatwa, epi chanjman nan glikozilasyon yo itilize kòm makè dyagnostik37. Yo rapòte plizyè glikan nan literati a ki parèt fasilman nan yon varyete maladi, tankou maladi enflamatwa kwonik nan aparèy dijestif la ak fwa a, enfeksyon viral, kansè nan ovè, tete ak pwostat38,39,40. Konprann estrikti glikan yo lè l sèvi avèk metòd ELISA glikan ki baze sou antikò ap bay plis konfyans nan dyagnostik maladi san yo pa itilize metòd MS konplèks.
Etid anvan nou an te montre ke oligosakarid ki te fè tèt di yo te rete san idrolize apre pretretman ak idwoliz anzimatik (Figi 1). Nan travay nou te pibliye deja, nou te devlope yon metòd ekstraksyon faz solid chabon aktive pou izole oligosakarid ki soti nan idroliza mayi pretrete ak AFEX (ACSH)8. Apre premye ekstraksyon ak separasyon an, oligosakarid yo te fraksyone plis pa kromatografi esklizyon gwosè (SEC) epi yo te kolekte yo nan lòd pwa molekilè. Monomè ak oligomè sik ki te libere nan divès pretretman yo te analize pa analiz konpozisyon sik. Lè nou konpare kontni oligomè sik ki te jwenn pa divès metòd pretretman, prezans oligosakarid ki te fè tèt di yo se yon pwoblèm komen nan konvèsyon byomas an monosakarid epi li ka mennen nan yon rediksyon nan sede sik omwen 10-15% e menm jiska 18%. US. Metòd sa a itilize pou plis pwodiksyon gwo echèl fraksyon oligosakarid. ACH ki te rezilta a ak fraksyon ki vin apre yo ak diferan pwa molekilè yo te itilize kòm materyèl eksperimantal pou karakterizasyon oligosakarid nan travay sa a.
Apre pretretman ak idwoliz anzimatik, oligosakarid pèsistan yo te rete san idrolize. Men (A) yon metòd separasyon oligosakarid kote oligosakarid yo izole nan idroliza mayi pretrete ak AFEX (ACSH) lè l sèvi avèk yon kabann chaje ak chabon aktive ak tè diatom; (B) Metòd pou separasyon oligosakarid yo. Oligosakarid yo te separe plis pa kromatografi esklizyon gwosè (SEC); (C) Monomè ak oligomè sakarid ki libere nan divès pretretman (asid dilye: DA, likid iyonik: IL ak AFEX). Kondisyon idwoliz anzimatik: gwo chaj solid 25% (p/p) (apeprè 8% chaj glukan), 96 èdtan idwoliz, 20 mg/g chaj anzim komèsyal (rapò Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) ak (D) Monomè ak oligomè sik glikoz, ksiloz ak arabinoz ki libere nan mayi pretrete ak AFEX (ACS).
Analiz glikan pwouve li se yon zouti itil pou yon analiz estriktirèl konplè glikan nan ekstrè izole nan rezidi byomas solid. Sepandan, sakarid idrosolubl yo pa byen reprezante lè l sèvi avèk metòd tradisyonèl sa a41 paske oligosakarid ki gen pwa molekilè ki ba yo difisil pou imobilize sou plak ELISA epi yo lave anvan yo ajoute antikò. Se poutèt sa, pou lyezon ak karakterizasyon antikò, yo te itilize yon metòd biotinilasyon yon sèl etap pou kouvri oligosakarid idrosolubl ki pa konfòm sou plak ELISA ki kouvri ak avidin. Yo te teste metòd sa a lè l sèvi avèk ACSH nou te pwodui deja a ak yon fraksyon ki baze sou pwa molekilè li (oswa degre polimerizasyon, DP). Yo te itilize biotinilasyon yon sèl etap pou ogmante afinite lyezon oligosakarid lè yo te ajoute biotin-LC-idrazid nan bout reduktè idrat kabòn nan (Fig. 2). Nan solisyon, gwoup emiasetal nan bout reduktè a reyaji ak gwoup idrazid biotin-LC-idrazid la pou fòme yon lyezon idrazòn. An prezans ajan reduktè NaCNBH3 la, lyezon idrazòn nan redwi a yon pwodwi final biotinile ki estab. Avèk modifikasyon bout ki diminye sik la, li te vin posib pou oligosakarid ki gen ti DP yo lye ak plak ELISA yo, e nan etid nou an, nou te fè sa sou plak kouvri ak avidin lè l sèvi avèk antikò monoklonal ki vize glikan.
Depistaj antikò monoklonal ki baze sou ELISA pou oligosakarid biotinile. La a (A) konbine biotinilasyon oligosakarid yo ak tès depistaj ELISA ki vin apre a ak antikò monoklonal ki vize glikan sou plak kouvri ak NeutrAvidin epi (B) montre yon pwosedi yon sèl etap pou biotinilasyon pwodui reyaksyon yo.
Apre sa, yo te ajoute plak kouvri ak avidin avèk antikò konjige ak oligosakarid nan antikò prensipal ak segondè yo epi yo te lave yo nan yon medyòm sansib a limyè ak tan. Apre lyezon antikò a fini, ajoute substrat TMB pou enkube plak la. Finalman, yo te kanpe reyaksyon an avèk asid silfirik. Yo te analize plak enkube yo lè l sèvi avèk yon lektè ELISA pou detèmine fòs lyezon chak antikò pou detekte lyezon kwa espesifik antikò a. Pou plis detay ak paramèt eksperyans lan, gade seksyon korespondan "Materyèl ak Metòd".
Nou demontre itilite metòd sa a ki fèk devlope a pou aplikasyon espesifik lè nou karakterize oligosakarid idrosolubl ki prezan nan ACSH ansanm ak fraksyon oligosakarid brit ak pirifye ki izole nan idroliza lignoselulozik yo. Jan yo montre nan Figi 3, ksilan ki pi komen ki sibstitye ak epitòp yo idantifye nan ACSH lè l sèvi avèk metòd tès glikòm byosilate yo anjeneral se arabinogalaktan uronik (U) oswa metiluronik (MeU) ak pektik. Pifò nan yo te jwenn tou nan etid anvan nou an sou analiz glikan solid ki pa idrolize (UHS)43.
Deteksyon epitòp oligosakarid rekalsitran yo lè l sèvi avèk yon antikò monoklonal ki dirije sou glikan miray selilè a. Fraksyon "net" la se fraksyon ACN lan epi fraksyon "asid" la se fraksyon FA a. Wouj ki pi klere sou kat chalè a endike yon pi gwo kontni epitòp, epi ble ki pi klere endike yon background vid. Valè koulè sou echèl la baze sou valè OD brit pou fòmilasyon N=2. Epitòp prensipal antikò yo rekonèt yo montre sou bò dwat la.
Selulaz ak emiselilaz ki pi komen nan melanj anzim komèsyal yo teste a, ki gen ladan anzim komèsyal ki pi souvan itilize yo, pa t kapab fann estrikti ki pa seluloz sa yo. Se poutèt sa, nouvo anzim oksilyè yo nesesè pou idwoliz yo. San anzim akseswa ki pa seluloz ki nesesè yo, lyezon ki pa seluloz sa yo anpeche konvèsyon konplè an monosakarid, menm si polimè sik paran yo idrolize anpil an fragman ki pi kout epi fonn lè l sèvi avèk melanj anzim komèsyal yo.
Pli lwen etid sou distribisyon siyal la ak fòs lyezon li te montre ke epitòp lyezon yo te pi ba nan fraksyon sik ki gen DP wo (A, B, C, DP jiska 20+) pase nan fraksyon ki gen DP ba (D, E, F, DP) nan dimè yo (Fig. 1). Fragman asid yo pi komen nan epitòp ki pa seluloz pase fragman net. Fenomèn sa yo konsistan avèk modèl ki te obsève nan etid anvan nou an, kote DP wo ak pati asid yo te pi rezistan a idwoliz anzimatik. Se poutèt sa, prezans epitòp glikan ki pa seluloz ak sibstitisyon U ak MeU ka kontribye anpil nan estabilite oligosakarid yo. Li ta dwe note ke efikasite lyezon ak deteksyon ka pwoblèmatik pou oligosakarid ki gen DP ba, sitou si epitòp la se yon oligosakarid dimerik oswa trimerik. Sa a ka teste lè l sèvi avèk oligosakarid komèsyal ki gen diferan longè, chak ki gen yon sèl epitòp ki mare ak yon mAb espesifik.
Kidonk, itilizasyon antikò espesifik pou estrikti a te revele sèten kalite lyezon rekalsitran. Tou depan de kalite antikò ki itilize a, modèl ligasyon ki apwopriye a, ak fòs siyal li pwodui a (ki pi abondan ak ki mwens abondan), yo ka idantifye nouvo anzim epi ajoute yo semi-kantitativman nan melanj anzim lan pou yon glikokonvèsyon ki pi konplè. Si nou pran analiz oligosakarid ACSH yo kòm egzanp, nou ka kreye yon baz done lyezon glikan pou chak materyèl byomas. Li enpòtan pou note isit la ke yo ta dwe pran an kont diferan afinite antikò yo, epi si afinite yo enkoni, sa ap kreye sèten difikilte lè n ap konpare siyal diferan antikò yo. Anplis de sa, konparezon lyezon glikan yo ka pi byen mache ant echantiyon yo pou menm antikò a. Lè sa a, nou ka lye lyezon ki fè tèt di sa yo ak baz done CAZyme a, kote nou ka idantifye anzim yo, chwazi anzim kandida yo epi teste anzim ki kraze lyezon yo, oswa devlope sistèm mikwòb pou eksprime anzim sa yo pou itilize nan byorafinri44.
Pou evalye kijan metòd iminolojik yo konplete metòd altènatif pou karakterize oligosakarid ki gen pwa molekilè ki ba ki prezan nan idroliza lignoselulozik yo, nou te fè MALDI (Fig. 4, S1-S8) ak analiz sakarid ki sòti nan TMS ki baze sou GC-MS sou menm panèl oligosakarid la (Fig. 5). MALDI itilize pou konpare si distribisyon mas molekil oligosakarid yo koresponn ak estrikti prevwa a. Sou fig. 4 montre MS konpozan net ACN-A ak ACN-B yo. Analiz ACN-A te konfime yon seri sik pentoz ki sòti nan DP 4-8 (Fig. 4) rive nan DP 22 (Fig. S1), ki gen pwa ki koresponn ak oligosakarid MeU-ksilan. Analiz ACN-B te konfime seri pentoz ak glikoksilan ak DP 8-15. Nan materyèl siplemantè tankou Figi S3, kat distribisyon mas pati asid FA-C yo montre yon seri sik pentoz (Me)U sibstitue ak yon DP 8-15 ki konsistan avèk ksilan sibstitue yo te jwenn nan tès depistaj mAb ki baze sou ELISA. Epitòp yo konsistan.
Espèk MALDI-MS oligosakarid idrosolubl ki pa konfòm ki prezan nan ACS. La a, (A) fraksyon ACN-A ki gen ti pwa epi ki gen oligosakarid glukuroksilan ki ranplase pa asid ironik metile (DP 4-8) epi (B) oligosakarid ksilan ACN-B ak asid ironik metile ki ranplase pa glukuroksilan (DP 8-15).
Analiz konpozisyon rezidi glikan oligosakarid refraktè yo. Isit la (A) Konpozisyon sakarid TMS nan divès fraksyon oligosakarid yo jwenn lè l sèvi avèk analiz GC-MS. (B) Estrikti divès sik ki sòti nan TMS ki prezan nan oligosakarid yo. ACN – fraksyon asetonitril ki gen oligosakarid net ak FA – fraksyon asid ferilik ki gen oligosakarid asid.
Yo te tire yon lòt konklizyon enteresan nan analiz LC-MS fraksyon oligosakarid la, jan yo montre nan Figi S9 (metòd yo ka wè nan materyèl siplemantè elektwonik la). Yo te obsève fragman gwoup ekzoz ak -OAc plizyè fwa pandan ligasyon fraksyon ACN-B la. Rezilta sa a pa sèlman konfime fragmentasyon yo obsève nan analiz glikòm ak MALDI-TOF la, men tou li bay nouvo enfòmasyon sou potansyèl dérivés idrat kabòn nan byomas lignoselulozik pretrete a.
Nou te fè tou analiz konpozisyon glikan nan fraksyon oligosakarid yo lè l sèvi avèk derivatizasyon glikan TMS. Lè l sèvi avèk GC-MS, nou te detèmine konpozisyon sik neworal (ki pa derive) ak sik asid (GluA ak GalA) nan fraksyon oligosakarid la (Fig. 5). Asid glikuronik yo jwenn nan konpozan asid C ak D, alòske asid galakturonik yo jwenn nan konpozan asid A ak B, tou de se konpozan DP segondè nan sik asid. Rezilta sa yo pa sèlman konfime done ELISA ak MALDI nou yo, men yo tou konsistan avèk etid anvan nou yo sou akimilasyon oligosakarid. Se poutèt sa, nou kwè ke metòd iminolojik modèn ki itilize biotinilasyon oligosakarid ak tès depistaj ELISA ki vin apre yo sifizan pou detekte oligosakarid rekalsitran idrosolubl nan divès echantiyon byolojik.
Piske metòd tès depistaj antikò monoklonal ki baze sou ELISA yo te valide pa plizyè metòd diferan, nou te vle eksplore plis potansyèl nouvo metòd kantitatif sa a. De oligosakarid komèsyal, oligosakarid ksiloheksasakarid (XHE) ak 23-α-L-arabinofuranosil-ksilotriyoz (A2XX), te achte epi teste lè l sèvi avèk yon nouvo apwòch antikò monoklonal ki vize glikan miray selilè a. Figi 6 montre yon korelasyon lineyè ant siyal lyezon biotinile a ak konsantrasyon logaritmik konsantrasyon oligosakarid la, ki sijere yon posib modèl adsorption Langmuir. Pami antikò monoklonal yo, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ak CCRC-M151 te korele ak XHE, epi CCRC-M108, CCRC-M109, ak LM11 te korele ak A2XX sou yon seri 1 nm a 100 nano. Akòz disponiblite limite antikò pandan eksperyans lan, yo te fè kèk eksperyans limite ak chak konsantrasyon oligosakarid. Li enpòtan pou note ke gen kèk antikò ki reyaji yon fason trè diferan ak menm oligosakarid la kòm yon substra, pwobableman paske yo mare ak epitòp ki yon ti jan diferan epi yo ka gen afinite lyezon ki trè diferan. Mekanis ak enplikasyon idantifikasyon epitòp ki egzat yo pral pi konplèks lè yo aplike nouvo apwòch mAb la sou echantiyon reyèl.
Yo te itilize de oligosakarid komèsyal pou detèmine limit deteksyon plizyè antikò monoklonal ki vize glikan. La a, korelasyon lineyè ak konsantrasyon logaritmik oligosakarid la endike modèl adsorpsyon Langmuir pou (A) XHE ak antikò monoklonal ak (B) A2XX ak antikò monoklonal. Epitòp korespondan yo endike estrikti oligosakarid komèsyal yo te itilize kòm substrats nan tès la.
Itilizasyon antikò monoklonal ki vize glikan (analiz glikokomik oswa tès depistaj antikò monoklonal ki baze sou ELISA) se yon zouti pwisan pou karakterizasyon apwofondi pifò nan glikan miray selilè prensipal yo ki fòme byomas plant yo. Sepandan, analiz glikan klasik la sèlman karakterize glikan miray selilè ki pi gwo yo, paske pifò oligosakarid yo pa imobilize avèk efikasite sou plak ELISA yo. Nan etid sa a, yo te idrolize pay mayi pre-trete ak AFEX anzimatikman nan yon kontni solid ki wo. Yo te itilize analiz sik pou detèmine konpozisyon idrat kabòn miray selilè rekalsitran yo nan idroliza a. Sepandan, yo souzestime analiz antikò monoklonal pou oligosakarid ki pi piti nan idroliza yo, epi yo bezwen zouti adisyonèl pou imobilize oligosakarid yo avèk efikasite sou plak ELISA yo.
Nou rapòte isit la yon metòd imobilizasyon oligosakarid nouvo ak efikas pou tès depistaj mAb lè nou konbine biotinilasyon oligosakarid ki te swiv pa tès depistaj ELISA sou plak kouvri ak NeutrAvidin™. Oligosakarid biotinile imobilize yo te montre ase afinite pou antikò a pou pèmèt deteksyon rapid ak efikas oligosakarid rekalsitran yo. Analiz konpozisyon oligosakarid fè tèt di sa yo ki baze sou espektwometri mas te konfime rezilta nouvo apwòch sa a pou imunodepistaj. Kidonk, etid sa yo demontre ke konbinezon biotinilasyon oligosakarid ak tès depistaj ELISA ak antikò monoklonal ki vize glikan yo ka itilize pou detekte lyen kwaze nan oligosakarid epi yo ka lajman aplike nan lòt etid byochimik ki karakterize estrikti oligosakarid yo.
Metòd pwofilaj glikan ki baze sou biotin sa a se premye rapò ki kapab envestige lyezon idrat kabòn rekalsitran oligosakarid idrosolubl nan byomas plant yo. Sa ede konprann poukisa kèk pati nan byomas yo tèlman fè tèt di lè li rive pwodiksyon biokarburan. Metòd sa a ranpli yon twou enpòtan nan metòd analiz glikòm epi li pwolonje aplikasyon li nan yon pi gwo seri substrats pi lwen pase oligosakarid plant yo. Nan lavni, nou ka itilize robotik pou biotinilasyon epi itilize metòd nou te devlope a pou analiz echantiyon wo débit lè l sèvi avèk ELISA.
Yo te rekòlte pay mayi (CS) ki te grandi apati grenn ibrid Pioneer 33A14 an 2010 nan Kramer Farms nan Ray, Kolorado. Avèk pèmisyon pwopriyetè tè a, yo ka itilize byomas sa a pou rechèch. Echantiyon yo te konsève nan sache zip-lock nan tanperati chanm, sèk ak mwens ke 6% imidite. Echantiyon yo te konsève nan sache zip-lock nan tanperati chanm, sèk ak mwens ke 6% imidite. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнатной при комтнахп. Echantiyon yo te konsève nan tanperati chanm nan, nan yon tanperati sèk ak mwens ke 6% imidite.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Echantiyon yo estoke nan sache zip nan tanperati chanm ak imidite < 6%.Etid la te konfòm ak direktiv lokal ak nasyonal yo. Analiz konpozisyon an te fèt lè l sèvi avèk pwotokòl NREL la. Yo te jwenn konpozisyon an genyen 31.4% glukan, 18.7% ksilan, 3.3% arabinan, 1.2% galaktan, 2.2% asetil, 14.3% lignin, 1.7% pwoteyin ak 13.4% sann.
Cellic® CTec2 (138 mg pwoteyin/ml, lo VCNI 0001) se yon melanj konplèks selilaz, β-glukozidaz ak Cellic® HTec2 (157 mg pwoteyin/ml, lo VHN00001) ki soti nan Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg pwoteyin/mL), yon melanj konplèks anzim ki degrade pektin, te bay pa DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Konsantrasyon pwoteyin anzim yo te detèmine lè yo te estime kontni pwoteyin nan (epi soustrè kontribisyon azòt ki pa pwoteyin) lè l sèvi avèk analiz azòt Kjeldahl (metòd AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Yo te achte tè dyatome 545 nan men EMD Millipore (Billerica, MA). Yo te achte chabon aktive (DARCO, 100 granules may), Avicel (PH-101), beech xylan, ak tout lòt pwodui chimik yo nan men Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Yo te fè pretretman AFEX la nan GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Yo te fè pretretman an a 140°C pandan 15 minit. Yo te kenbe yon tan rezidans 46 minit nan yon rapò 1:1 ant amonyak anid ak byomass ak yon chaj 60% (p/p) nan yon reaktè an asye pur (Parr Instruments Company). Li te pran 30 minit. Yo te pote reaktè a a 140°C epi yo te lage amonyak la rapidman, sa ki te pèmèt byomass la retounen byen vit nan tanperati chanm nan. Konpozisyon pay mayi pretrete AFEX la (ACS) te sanble ak konpozisyon pay mayi ki pa trete a (UT-CS).
Yo te prepare ACSH 25% (p/p) ki gen anpil solid (apeprè 8% chaj dekstran) kòm yon materyèl depa pou pwodiksyon oligosakarid sou gwo echèl. Yo te fè idwoliz anzimatik ACS la lè l sèvi avèk yon melanj anzim komèsyal ki gen ladan Cellic® Ctec2 10 mg pwoteyin/g glukan (nan byomas pretrete), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg pwoteyin/g glukan, ak Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg pwoteyin/g dekstran. Yo te fè idwoliz anzimatik la nan yon byoreaktè 5 lit ak yon volim travay 3 lit, pH 4.8, 50°C ak 250 rpm. Apre idwoliz pandan 96 èdtan, yo te kolekte idroliza a pa santrifijasyon a 6000 rpm pandan 30 minit epi answit a 14000 rpm pandan 30 minit pou retire solid ki pa t idrolize yo. Apre sa, idroliza a te sibi yon filtrasyon esteril atravè yon bèkè filtre 0.22 mm. Idroliza filtre a te estoke nan boutèy esteril a 4°C epi answit fraksyone sou kabòn.
Analiz konpozisyon echantiyon byomas ki baze sou ekstrè dapre pwosedi analiz laboratwa NREL yo: preparasyon echantiyon pou analiz konpozisyon (NREL/TP-510-42620) ak detèminasyon idrat kabòn estriktirèl ak lignin nan byomas (NREL/TP-510 – 42618)47.
Yo te fè analiz oligosakarid nan kouran idroliza a sou yon echèl 2 ml lè l sèvi avèk yon metòd idwoliz asid ki baze sou otoklav. Melanje echantiyon idroliza a ak 69.7 µl asid silfirik 72% nan yon tib kilti ak bouchon vis 10 ml epi enkube pandan 1 èdtan sou yon tab travay a 121 °C, refwadi sou glas epi filtre nan yon ti boutèy kromatografi likid pèfòmans segondè (HPLC). Yo te detèmine konsantrasyon oligosakarid yo lè yo te soustrè konsantrasyon monosakarid nan echantiyon ki pa idrolize a nan konsantrasyon total sik nan echantiyon ki te idrolize ak asid la.
Yo te analize konsantrasyon glikoz, ksiloz, ak arabinoz nan byomas idrolize ak asid la lè l sèvi avèk yon sistèm Shimadzu HPLC ekipe ak yon otoechantiyonè, yon aparèy chofaj kolòn, yon ponp izokratik, ak yon detektè endis refraksyon sou yon kolòn Bio-Rad Aminex HPX-87H. Yo te kenbe kolòn nan a 50°C epi yo te elye l avèk 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 nan dlo.
Yo te dilye sipènatant idroliza a epi yo te analize li pou kontni monomè ak oligosakarid. Yo te analize sik monomè yo jwenn apre idwoliz anzimatik la pa HPLC ekipe ak yon kolòn Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ak yon kolòn gad sann. Yo te kenbe tanperati kolòn nan a 80°C, yo te itilize dlo kòm faz mobil lan ak yon vitès koule 0.6 ml/min. Yo te detèmine oligosakarid yo pa idwoliz nan asid dilye a 121°C dapre metòd ki dekri nan referans 41, 48, 49 yo.
Yo te fè analiz sakarid sou rezidi byomas kri, trete alavans ak AFEX ak tout rezidi byomas ki pa idrolize (ki gen ladan pwodiksyon ekstrè miray selilè seri ak tès depistaj mAb yo) lè l sèvi avèk pwosedi ki te dekri deja 27, 43, 50, 51. Pou analiz glikòm, yo prepare rezidi materyèl miray selilè plant ki pa ka fonn nan alkòl apati rezidi byomas epi yo sibi ekstraksyon seri ak reyaktif ki pi agresif tankou oksalat amonyòm (50 mM), kabonat sodyòm (50 mM ak 0.5% w/v), CON. (1M ak 4M, tou de ak 1% w/v boroidrid sodyòm) ak klorit asid jan yo te dekri deja52,53. Apre sa, yo te sibi ekstrè yo ELISA kont yon panèl konplèks mAb50 ki dirije sou glikan miray selilè a, epi reyaksyon lyezon mAb yo te prezante kòm yon kat chalè. Yo te achte mAb ki vize glikan miray selilè plant yo nan stock laboratwa (seri CCRC, JIM ak MAC).
Biotinilasyon oligosakarid an yon sèl etap. Konjigasyon idrat kabòn yo ak biotin-LC-idrazid la te fèt lè l sèvi avèk pwosedi sa a. Biotin-LC-idrazid (4.6 mg/12 μmol) te fonn nan dimetil silfoksid (DMSO, 70 μl) lè yo te brase byen fò epi chofe a 65°C pandan 1 minit. Yo te ajoute asid asetik glasyal (30 µl) epi yo te vide melanj lan sou syanoboroidrid sodyòm (6.4 mg/100 µmol) epi li te fonn nèt apre yo te fin chofe a 65°C pandan apeprè 1 minit. Apre sa, yo te ajoute soti nan 5 a 8 μl nan melanj reyaksyon an nan oligosakarid sèk la (1-100 nmol) pou jwenn yon eksè molè 10 fwa oswa plis nan makè a sou bout reduktè a. Yo te fè reyaksyon an a 65°C pandan 2 èdtan, apre sa yo te pirifye echantiyon yo imedyatman. Yo pa t itilize siyanoborodur sodyòm nan eksperyans maketaj yo san rediksyon, epi yo te fè echantiyon yo reyaji a 65°C pandan 2.5 èdtan.
ELISA kouch ak lave echantiyon oligosakarid biotinye yo. Yo te ajoute 25 μl echantiyon biotinye (100 μl nan chak echantiyon konsantre dilye nan 5 ml solisyon tanpon Tris 0.1 M (TBS)) nan chak pi nan plak ki kouvri ak avidin lan. Pi kontwòl yo te kouvri ak 50 μl biotin nan yon konsantrasyon 10 μg/ml nan 0.1 M TBS. Yo te itilize dlo deyonize kòm yon kouch pou mezi vid yo. Yo te enkube grenn nan pandan 2 èdtan nan tanperati chanm nan fènwa. Lave plak la 3 fwa ak 0.1% lèt ekreme nan 0.1 M TBS lè l sèvi avèk pwogram nimewo 11 pou Grenier plat 3A.
Adisyon ak lave antikò prensipal yo. Ajoute 40 µl antikò prensipal nan chak pi. Enkube mikwoplak la pandan 1 èdtan nan tanperati chanm nan fènwa. Apre sa, plak yo te lave 3 fwa ak 0.1% lèt nan 0.1M TBS lè l sèvi avèk pwogram lave #11 pou Grenier Flat 3A.
Ajoute antikò segondè a epi lave l. Ajoute 50 µl antikò segondè sourit/rat (dilye 1:5000 nan 0.1% lèt nan 0.1 M TBS) nan chak pi. Enkube mikwoplak la pandan 1 èdtan nan tanperati chanm nan fènwa. Apre sa, yo te lave mikwoplak yo 5 fwa ak 0.1% lèt nan 0.1 M TBS lè l sèvi avèk pwogram lave plak Grenier Flat 5A #12.
Ajoute yon substrat. Ajoute 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) nan substrat de baz la (lè w ajoute 2 gout solisyon tanpon, 3 gout TMB, 2 gout idwojèn oksijene nan 15 ml dlo deyonize). Prepare substrat TMB a. Epi brase l anvan w itilize li). Enkube mikwoplak la nan tanperati chanm pandan 30 minit. Nan fènwa.
Konplete etap la epi li grenn nan. Ajoute 50 µl asid silfirik 1 N nan chak pi epi anrejistre absòbans lan soti nan 450 rive nan 655 nm avèk yon lektè ELISA.
Prepare solisyon 1 mg/ml nan analit sa yo nan dlo deyonize: arabinoz, ramnoz, fikoz, ksiloz, asid galakturonik (GalA), asid glikuronik (GlcA), mannoz, glikoz, galaktoz, laktoz, N-asetilmannosamin (manNAc), N-asetilglukozamin (glcNAc), N-asetilgalaktozamin (galNAc), inositol (estanda entèn). De estanda te prepare lè yo te ajoute solisyon sik 1 mg/mL yo montre nan Tablo 1. Echantiyon yo te konjele epi liofilize a -80° C jiskaske tout dlo a retire (anjeneral apeprè 12-18 èdtan).
Ajoute 100–500 µg echantiyon nan tib ki gen bouchon vis sou yon balans analyse. Anrejistre kantite ou ajoute a. Li pi bon pou fonn echantiyon an nan yon konsantrasyon espesifik sòlvan epi ajoute l nan tib la kòm yon alikòt likid. Sèvi ak 20 µl inositol 1 mg/ml kòm yon estanda entèn pou chak tib echantiyon. Kantite estanda entèn ki ajoute nan echantiyon an dwe menm ak kantite estanda entèn ki ajoute nan tib estanda a.
Ajoute 8 ml metanòl anid nan yon ti boutèy ak bouchon vis. Apre sa, ajoute 4 ml solisyon 3 N HCl metanolik, fèmen bouchon an epi souke l. Pwosesis sa a pa itilize dlo.
Ajoute 500 µl solisyon metanòl HCl 1 M nan echantiyon oligosakarid yo ak tib TMS estanda yo. Echantiyon yo te enkube pandan tout lannwit lan (168 èdtan) a 80° C nan yon blòk tèmik. Seche pwodwi metanòliz la nan tanperati chanm lè l sèvi avèk yon manifoul siye. Ajoute 200 µl MeOH epi seche ankò. Pwosesis sa a repete de fwa. Ajoute 200 µl metanòl, 100 µl piridin ak 100 µl anidrid asetik nan echantiyon an epi melanje byen. Enkube echantiyon yo nan tanperati chanm pandan 30 minit. epi seche. Ajoute 200 µl metanòl epi seche ankò.
Ajoute 200 µl Tri-Sil epi chofe tib la ak bouchon an pandan 20 minit a 80°C, apresa refwadi l nan tanperati chanm. Sèvi ak yon manifoul siye pou seche echantiyon an plis jiskaske li rive nan yon volim apeprè 50 µl. Li enpòtan pou note ke nou pa t kite echantiyon yo seche nèt.
Ajoute 2 ml hexane epi melanje byen avèk vortex. Ranpli pwent pipèt Pasteur yo (5-8 mm) ak yon moso lenn vè lè w mete lenn vè a sou tèt yon pipèt ki gen yon dyamèt 5-3/4 pous. Echantiyon yo te santrifije a 3000 g pandan 2 minit. Nenpòt rezidi ki pa fonn nan dlo a presipite. Seche echantiyon an a 100-150 µl. Yo te enjekte yon volim apeprè 1 μl nan GC-MS la nan yon tanperati inisyal 80 °C ak yon tan inisyal 2.0 minit (Tablo 2).