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Nouvelles méthodes immunologiques et spectrométriques de masse pour l'analyse complexe des oligosaccharides persistants dans les tiges de maïs prétraitées par AFEX. La biomasse lignocellulosique constitue une alternative durable aux combustibles fossiles et est largement utilisée pour développer des biotechnologies pour la production de produits tels que l'alimentation humaine et animale, les carburants et les produits chimiques. La clé de ces technologies réside dans le développement de procédés compétitifs en termes de coûts pour convertir les glucides complexes présents dans les parois cellulaires végétales en sucres simples tels que le glucose, le xylose et l'arabinose. La biomasse lignocellulosique étant très tenace, elle doit être soumise à des traitements thermochimiques (par exemple, exfoliation des fibres à l'ammoniac (AFEX), acides dilués (AD), liquides ioniques (IL)) et biologiques (par exemple, hydrolyse enzymatique et fermentation microbienne) combinés pour obtenir le produit souhaité. Français Cependant, lorsque des enzymes fongiques commerciales sont utilisées dans le processus d'hydrolyse, seulement 75 à 85 % des sucres solubles formés sont des monosaccharides, et les 15 à 25 % restants sont des oligosaccharides solubles et intraitables, qui ne sont pas toujours disponibles pour les micro-organismes. Auparavant, nous avons isolé et purifié avec succès des oligosaccharides solubles tenaces en utilisant une combinaison de séparation du carbone et de la terre de diatomées et de chromatographie d'exclusion stérique, et avons également étudié leurs propriétés inhibitrices enzymatiques. Nous avons constaté que les oligosaccharides contenant des substitutions d'acide uronique méthylé à degré de polymérisation (DP) plus élevé sont plus difficiles à traiter avec des mélanges d'enzymes commerciaux que les oligosaccharides à faible DP et neutres. Nous rapportons ici l'utilisation de plusieurs méthodes supplémentaires, y compris le profilage des glycanes à l'aide d'anticorps monoclonaux (mAbs) spécifiques des glycanes de la biomasse végétale pour caractériser les liaisons glycanes dans les parois cellulaires végétales et les hydrolysats enzymatiques, la désorption-ionisation laser assistée par matrice, la spectrométrie de masse à temps de vol. . La méthode MALDI-TOF-MS utilise des pics diagnostiques structuraux informatifs obtenus par spectroscopie après désintégration secondaire des ions négatifs, chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (GC-MS) pour caractériser les liaisons oligosaccharidiques avec et sans dérivatisation. En raison de la petite taille des oligosaccharides (DP 4-20), ces molécules sont difficiles à utiliser pour la liaison et la caractérisation des anticorps monoclonaux (Acm). Pour surmonter ce problème, nous avons appliqué une nouvelle méthode d'immobilisation des oligosaccharides basée sur la conjugaison de la biotine, qui a marqué avec succès la majorité des oligosaccharides solubles à faible DP à la surface de la microplaque. Ces oligosaccharides ont ensuite été utilisés dans un système d'anticorps monoclonaux à haut débit pour une analyse de ligature spécifique. Cette nouvelle méthode facilitera le développement futur de dosages de glycomes à haut débit plus avancés, permettant d'isoler et de caractériser les oligosaccharides présents dans les biomarqueurs à des fins diagnostiques.
Français La biomasse lignocellulosique, composée de matières agricoles, forestières, herbagères et ligneuses, est une matière première potentielle pour la production de produits biosourcés, notamment des denrées alimentaires, des aliments pour animaux, des carburants et des précurseurs chimiques pour produire des produits à plus forte valeur ajoutée1. Les glucides (tels que la cellulose et l'hémicellulose) présents dans les parois cellulaires des plantes sont dépolymérisés en monosaccharides par traitement chimique et biotransformation (comme l'hydrolyse enzymatique et la fermentation microbienne). Les prétraitements courants comprennent l'expansion des fibres à l'ammoniac (AFEX), l'acide dilué (DA), le liquide ionique (IL) et l'explosion à la vapeur (SE), qui utilisent une combinaison de produits chimiques et de chaleur pour réduire la production de lignocellulose en ouvrant les parois cellulaires des plantes3,4. l'obstination de la matière, 5. L'hydrolyse enzymatique est réalisée à une charge solide élevée en utilisant des enzymes commerciales contenant des glucides actifs (CAZymes) et la fermentation microbienne en utilisant des levures ou des bactéries transgéniques pour produire des carburants et des produits chimiques biosourcés 6 .
Les CAZymes des enzymes commerciales sont composés d'un mélange complexe d'enzymes qui clivent de manière synergique les liaisons complexes glucides-sucres pour former des monosaccharides2,7. Comme indiqué précédemment, le réseau complexe de polymères aromatiques de lignine avec les glucides les rend très difficiles à traiter, ce qui entraîne une conversion incomplète des sucres, accumulant 15 à 25 % d'oligosaccharides sexuels non produits lors de l'hydrolyse enzymatique de la biomasse prétraitée. Il s'agit d'un problème courant avec diverses méthodes de prétraitement de la biomasse. Parmi les raisons de ce goulot d'étranglement figurent l'inhibition enzymatique pendant l'hydrolyse, ou l'absence ou la faible concentration d'enzymes essentielles nécessaires à la rupture des liaisons sucres dans la biomasse végétale. La compréhension de la composition et des caractéristiques structurelles des sucres, telles que les liaisons sucres dans les oligosaccharides, nous aidera à améliorer la conversion des sucres pendant l'hydrolyse, rendant les procédés biotechnologiques compétitifs en termes de coûts par rapport aux produits dérivés du pétrole.
Français La détermination de la structure des glucides est difficile et nécessite une combinaison de méthodes telles que la chromatographie liquide (LC)11,12, la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)13, l'électrophorèse capillaire (EC)14,15,16 et la spectrométrie de masse (MS)17. ,dix-huit. Les méthodes de MS telles que la spectrométrie de masse à temps de vol avec désorption et ionisation laser utilisant une matrice (MALDI-TOF-MS) sont une méthode polyvalente pour identifier les structures des glucides. Récemment, la MS en tandem par dissociation induite par collision (CID) des adduits d'ions sodium a été la plus largement utilisée pour identifier les empreintes digitales correspondant aux positions de fixation des oligosaccharides, aux configurations anomériques, aux séquences et aux positions de ramification 20, 21 .
L'analyse des glycanes est un excellent outil pour l'identification approfondie des liaisons glucidiques22. Cette méthode utilise des anticorps monoclonaux (mAbs) dirigés contre les glycanes de la paroi cellulaire végétale comme sondes pour comprendre les liaisons glucidiques complexes. Plus de 250 mAbs sont disponibles dans le monde, conçus contre divers oligosaccharides linéaires et ramifiés à partir de divers saccharides24. Plusieurs mAbs ont été largement utilisés pour caractériser la structure, la composition et les modifications de la paroi cellulaire végétale, car il existe des différences significatives selon le type de cellule végétale, l'organe, l'âge, le stade de développement et l'environnement de croissance25,26. Plus récemment, cette méthode a été utilisée pour comprendre les populations de vésicules dans les systèmes végétaux et animaux et leurs rôles respectifs dans le transport des glycanes, déterminés par des marqueurs subcellulaires, les stades de développement ou des stimuli environnementaux, et pour déterminer l'activité enzymatique. Certaines des différentes structures de glycanes et de xylanes qui ont été identifiées comprennent la pectine (P), le xylane (X), le mannane (M), les xyloglucanes (XylG), les glucanes à liaison mixte (MLG), l'arabinoxylane (ArbX), le galactomannane (GalG), l'acide glucuronique-arabinoxylane (GArbX) et l'arabino-galactane (ArbG)29.
Cependant, malgré tous ces efforts de recherche, seules quelques études se sont concentrées sur la nature de l'accumulation d'oligosaccharides pendant l'hydrolyse à haute charge solide (HSL), y compris la libération d'oligosaccharides, les changements de longueur de chaîne oligomérique pendant l'hydrolyse, divers polymères à faible DP et leurs courbes. distributions 30,31,32. Pendant ce temps, bien que l'analyse des glycanes se soit avérée être un outil utile pour une analyse complète de la structure des glycanes, il est difficile d'évaluer les oligosaccharides à faible DP hydrosolubles à l'aide de méthodes d'anticorps. Les oligosaccharides DP plus petits avec un poids moléculaire inférieur à 5-10 kDa ne se lient pas aux plaques ELISA 33, 34 et sont éliminés par lavage avant l'ajout d'anticorps.
Nous présentons ici, pour la première fois, un test ELISA sur plaques recouvertes d'avidine utilisant des anticorps monoclonaux, combinant une procédure de biotinylation en une étape pour les oligosaccharides réfractaires solubles avec l'analyse du glycome. Notre approche d'analyse du glycome a été validée par une analyse par MALDI-TOF-MS et GC-MS des liaisons oligosaccharidiques complémentaires par dérivatisation triméthylsilyle (TMS) de compositions de sucres hydrolysés. Cette approche innovante pourrait être développée comme méthode à haut débit à l'avenir et trouver une application plus large en recherche biomédicale35.
Les modifications post-traductionnelles des enzymes et des anticorps, telles que la glycosylation,36 affectent leur activité biologique. Par exemple, les modifications de la glycosylation des protéines sériques jouent un rôle important dans l'arthrite inflammatoire, et ces modifications sont utilisées comme marqueurs diagnostiques37. La littérature médicale rapporte que divers glycanes apparaissent facilement dans diverses maladies, notamment les maladies inflammatoires chroniques du tractus gastro-intestinal et du foie, les infections virales, les cancers de l'ovaire, du sein et de la prostate38,39,40. La compréhension de la structure des glycanes à l'aide de méthodes ELISA basées sur les anticorps renforcera la fiabilité du diagnostic sans recourir à des méthodes de spectrométrie de masse complexes.
Français Notre étude précédente a montré que les oligosaccharides tenaces restaient non hydrolysés après prétraitement et hydrolyse enzymatique (Figure 1). Dans nos travaux publiés précédemment, nous avons développé une méthode d'extraction en phase solide sur charbon actif pour isoler les oligosaccharides de l'hydrolysat de cannes de maïs prétraité par AFEX (ACSH)8. Après l'extraction et la séparation initiales, les oligosaccharides ont été fractionnés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC) et collectés par ordre de poids moléculaire. Les monomères et oligomères de sucre libérés par divers prétraitements ont été analysés par analyse de la composition en sucre. Lorsque l'on compare la teneur en oligomères de sucre obtenus par diverses méthodes de prétraitement, la présence d'oligosaccharides tenaces est un problème courant dans la conversion de la biomasse en monosaccharides et peut entraîner une réduction du rendement en sucre d'au moins 10 à 15 %, voire jusqu'à 18 %. États-Unis. Cette méthode est utilisée pour la production à grande échelle de fractions d'oligosaccharides. L'ACH résultant et ses fractions ultérieures avec différents poids moléculaires ont été utilisés comme matériel expérimental pour la caractérisation des oligosaccharides dans ce travail.
Français Après prétraitement et hydrolyse enzymatique, les oligosaccharides persistants sont restés non hydrolysés. Ici (A) est une méthode de séparation des oligosaccharides dans laquelle les oligosaccharides sont isolés de l'hydrolysat de tiges de maïs prétraité par AFEX (ACSH) en utilisant un lit tassé de charbon actif et de terre de diatomées ; (B) Méthode de séparation des oligosaccharides. Les oligosaccharides ont été séparés davantage par chromatographie d'exclusion stérique (SEC) ; (C) Monomères et oligomères de saccharide libérés par divers prétraitements (acide dilué : DA, liquide ionique : IL et AFEX). Conditions d'hydrolyse enzymatique : charge élevée en solides de 25 % (p/p) (charge en glucane d'environ 8 %), hydrolyse de 96 heures, charge enzymatique commerciale de 20 mg/g (rapport Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) et (D) Monomères et oligomères de sucre de glucose, xylose et arabinose libérés de la tige de maïs prétraitée par AFEX (ACS).
L'analyse des glycanes s'est avérée être un outil utile pour une analyse structurale complète des glycanes dans les extraits isolés de résidus de biomasse solide. Cependant, les saccharides hydrosolubles sont sous-représentés avec cette méthode traditionnelle41, car les oligosaccharides de faible poids moléculaire sont difficiles à immobiliser sur les plaques ELISA et sont éliminés par lavage avant l'ajout d'anticorps. Par conséquent, pour la liaison et la caractérisation des anticorps, une méthode de biotinylation en une étape a été utilisée pour revêtir des oligosaccharides solubles et non conformes sur des plaques ELISA revêtues d'avidine. Cette méthode a été testée avec notre ACSH produit précédemment et une fraction basée sur son poids moléculaire (ou degré de polymérisation, DP). La biotinylation en une étape a été utilisée pour augmenter l'affinité de liaison des oligosaccharides en ajoutant de la biotine-LC-hydrazide à l'extrémité réductrice du glucide (Fig. 2). En solution, le groupe hémiacétal à l'extrémité réductrice réagit avec le groupe hydrazide de la biotine-LC-hydrazide pour former une liaison hydrazone. En présence de l'agent réducteur NaCNBH3, la liaison hydrazone est réduite en un produit final biotinylé stable. La modification de l'extrémité réductrice du sucre a permis la liaison d'oligosaccharides à faible DP aux plaques ELISA. Dans notre étude, cette liaison a été réalisée sur des plaques recouvertes d'avidine à l'aide d'anticorps monoclonaux ciblant les glycanes.
Criblage d'anticorps monoclonaux par ELISA pour les oligosaccharides biotinylés. (A) La biotinylation combinée des oligosaccharides et le criblage ELISA ultérieur avec des anticorps monoclonaux ciblant les glycanes sur des plaques revêtues de NeutrAvidin sont présentés. (B) La biotinylation des produits de réaction est réalisée en une seule étape.
Des plaques recouvertes d'avidine contenant des anticorps conjugués à des oligosaccharides ont ensuite été ajoutées aux anticorps primaires et secondaires, puis lavées dans un milieu photosensible et sensible au temps. Une fois la liaison de l'anticorps terminée, le substrat TMB a été ajouté pour incuber la plaque. La réaction a été stoppée avec de l'acide sulfurique. Les plaques incubées ont été analysées à l'aide d'un lecteur ELISA afin de déterminer la force de liaison de chaque anticorps et de détecter une réticulation spécifique. Pour plus de détails et les paramètres de l'expérience, voir la section correspondante « Matériel et méthodes ».
Nous démontrons l'utilité de cette méthode nouvellement développée pour des applications spécifiques en caractérisant les oligosaccharides solubles présents dans l'ACSH ainsi que dans les fractions oligosaccharidiques brutes et purifiées isolées d'hydrolysats lignocellulosiques. Comme le montre la figure 3, les xylanes à épitope substitué les plus fréquemment identifiés dans l'ACSH par dosage du glycome bioacylé sont généralement les arabinogalactanes uroniques (U) ou méthyluroniques (MeU) et pectiques. La plupart d'entre eux ont également été trouvés lors de notre précédente étude sur l'analyse des glycanes de solides non hydrolysés (UHS)43.
Détection d'épitopes oligosaccharidiques récalcitrants à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre le glycane de la paroi cellulaire. La fraction « neutre » correspond à la fraction ACN et la fraction « acide » à la fraction FA. Les rouges plus vifs sur la carte thermique indiquent une teneur en épitopes plus élevée, tandis que les bleus plus vifs indiquent un fond blanc. Les valeurs de couleur sur l'échelle sont basées sur les valeurs de DO brutes pour les formulations N=2. Les principaux épitopes reconnus par les anticorps sont indiqués à droite.
Ces structures non cellulosiques n'ont pas pu être clivées par les cellulases et hémicellulases les plus courantes dans le mélange d'enzymes commercial testé, qui comprend les enzymes commerciales les plus couramment utilisées. Par conséquent, de nouvelles enzymes auxiliaires sont nécessaires à leur hydrolyse. Sans les enzymes accessoires non cellulosiques nécessaires, ces liaisons non cellulosiques empêchent une conversion complète en monosaccharides, même si leurs polymères de sucre parents sont largement hydrolysés en fragments plus courts et dissous à l'aide de mélanges d'enzymes commerciaux.
Une étude plus approfondie de la distribution du signal et de sa force de liaison a montré que les épitopes de liaison étaient plus faibles dans les fractions sucrées à DP élevé (A, B, C, DP jusqu'à 20+) que dans les fractions à DP faible (D, E, F, DP) dans les dimères (Fig. 1). Les fragments acides sont plus fréquents dans les épitopes non cellulosiques que dans les fragments neutres. Ces phénomènes sont cohérents avec le schéma observé dans notre étude précédente, où les fractions à DP élevé et acides étaient plus résistantes à l'hydrolyse enzymatique. Par conséquent, la présence d'épitopes glycanes non cellulosiques et de substitutions U et MeU peut grandement contribuer à la stabilité des oligosaccharides. Il convient de noter que l'efficacité de la liaison et de la détection peut être problématique pour les oligosaccharides à faible DP, en particulier si l'épitope est un oligosaccharide dimérique ou trimérique. Cela peut être testé en utilisant des oligosaccharides commerciaux de différentes longueurs, chacun ne contenant qu'un seul épitope qui se lie à un mAb spécifique.
Ainsi, l'utilisation d'anticorps spécifiques de structure a révélé certains types de liaisons récalcitrantes. Selon le type d'anticorps utilisé, le schéma de ligature approprié et l'intensité du signal produit (le plus ou le moins abondant), de nouvelles enzymes peuvent être identifiées et ajoutées de manière semi-quantitative au mélange enzymatique pour une glycoconversion plus complète. En prenant l'exemple de l'analyse des oligosaccharides ACSH, nous pouvons créer une base de données de liaisons glycaniques pour chaque matériau de biomasse. Il convient de noter ici que les différentes affinités des anticorps doivent être prises en compte ; si leur affinité est inconnue, cela créera certaines difficultés lors de la comparaison des signaux de différents anticorps. De plus, la comparaison des liaisons glycaniques peut être plus efficace entre échantillons pour un même anticorps. Ces liaisons récalcitrantes peuvent ensuite être liées à la base de données CAZyme, à partir de laquelle nous pouvons identifier les enzymes, sélectionner les enzymes candidates et tester les enzymes brisant les liaisons, ou développer des systèmes microbiens pour exprimer ces enzymes en vue de leur utilisation en bioraffinerie44.
Français Pour évaluer comment les méthodes immunologiques complètent les méthodes alternatives pour caractériser les oligosaccharides de faible poids moléculaire présents dans les hydrolysats lignocellulosiques, nous avons effectué une MALDI (Fig. 4, S1-S8) et une analyse des saccharides dérivés du TMS basée sur la GC-MS sur la même partie oligosaccharidique du panneau (Fig. 5). La MALDI est utilisée pour comparer si la distribution de masse des molécules d'oligosaccharides correspond à la structure souhaitée. La fig. 4 montre la MS des composants neutres ACN-A et ACN-B. L'analyse ACN-A a confirmé une gamme de sucres pentoses allant de DP 4-8 (Fig. 4) à DP 22 (Fig. S1), dont les poids correspondent aux oligosaccharides MeU-xylane. L'analyse ACN-B a confirmé les séries pentose et glucoxylane avec DP 8-15. Dans des documents supplémentaires tels que la figure S3, les cartes de distribution massique de la fraction acide FA-C montrent une gamme de sucres pentoses substitués par (Me)U avec un DP de 8 à 15, cohérents avec les xylanes substitués trouvés lors du criblage d'anticorps monoclonaux par ELISA. Les épitopes sont cohérents.
Spectre MALDI-MS des oligosaccharides solubles non conformes présents dans l'ACS. Ici, (A) les fractions de faible poids d'ACN-A contenant des oligosaccharides glucuroxylanes substitués par de l'acide uronique méthylé (DP 4-8) et (B) les oligosaccharides glucuroxylanes et xylanes d'ACN-B substitués par du glucuroxylane (DP 8-15).
Analyse de la composition des résidus glycaniques d'oligosaccharides réfractaires. (A) Composition en saccharides TMS de diverses fractions d'oligosaccharides obtenue par analyse GC-MS. (B) Structures de divers sucres dérivés du TMS présents dans les oligosaccharides. ACN – fraction acétonitrile contenant des oligosaccharides neutres et FA – fraction acide férulique contenant des oligosaccharides acides.
Une autre conclusion intéressante a été tirée de l'analyse LC-MS de la fraction oligosaccharidique, comme le montre la figure S9 (les méthodes sont présentées dans le supplément électronique). Des fragments de groupes hexose et -OAc ont été observés à plusieurs reprises lors de la ligature de la fraction ACN-B. Cette découverte confirme non seulement la fragmentation observée lors des analyses du glycome et MALDI-TOF, mais fournit également de nouvelles informations sur les dérivés glucidiques potentiels dans la biomasse lignocellulosique prétraitée.
Nous avons également réalisé une analyse de la composition en glycanes des fractions oligosaccharidiques par dérivatisation des glycanes par TMS. Par GC-MS, nous avons déterminé la composition en sucres neuraux (non dérivés) et acides (GluA et GalA) dans la fraction oligosaccharidique (Fig. 5). L'acide glucuronique est présent dans les composants acides C et D, tandis que l'acide galacturonique est présent dans les composants acides A et B, tous deux des composants à DP élevé des sucres acides. Ces résultats confirment non seulement nos données ELISA et MALDI, mais sont également cohérents avec nos précédentes études sur l'accumulation d'oligosaccharides. Par conséquent, nous pensons que les méthodes immunologiques modernes utilisant la biotinylation des oligosaccharides et le criblage ELISA ultérieur sont suffisantes pour détecter les oligosaccharides récalcitrants solubles dans divers échantillons biologiques.
Les méthodes de criblage d'anticorps monoclonaux (ACM) par ELISA ayant été validées par plusieurs méthodes différentes, nous avons souhaité explorer plus avant le potentiel de cette nouvelle méthode quantitative. Deux oligosaccharides commerciaux, l'oligosaccharide xylohexasaccharide (XHE) et le 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ont été achetés et testés à l'aide d'une nouvelle approche d'ACM ciblant le glycane de la paroi cellulaire. La figure 6 montre une corrélation linéaire entre le signal de liaison biotinylé et la concentration logarithmique de l'oligosaccharide, suggérant un possible modèle d'adsorption de Langmuir. Parmi les ACM, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 et CCRC-M151 étaient corrélés à XHE, et CCRC-M108, CCRC-M109 et LM11 étaient corrélés à A2XX sur une plage de 1 nm à 100 nano. En raison de la disponibilité limitée des anticorps pendant l'expérience, un nombre limité d'expériences a été réalisé avec chaque concentration d'oligosaccharide. Il convient de noter ici que certains anticorps réagissent très différemment au même oligosaccharide comme substrat, probablement parce qu'ils se lient à des épitopes légèrement différents et peuvent avoir des affinités de liaison très différentes. Les mécanismes et les implications d'une identification précise des épitopes seront beaucoup plus complexes lorsque la nouvelle approche mAb sera appliquée à des échantillons réels.
Deux oligosaccharides commerciaux ont été utilisés pour déterminer la plage de détection de divers anticorps monoclonaux ciblant les glycanes. Ici, les corrélations linéaires avec la concentration logarithmique de l'oligosaccharide indiquent les profils d'adsorption de Langmuir pour (A) XHE avec anticorps monoclonal et (B) A2XX avec anticorps monoclonal. Les épitopes correspondants indiquent les structures des oligosaccharides commerciaux utilisés comme substrats dans le test.
L'utilisation d'anticorps monoclonaux ciblant les glycanes (analyse glycocomique ou criblage d'anticorps monoclonaux par ELISA) est un outil puissant pour la caractérisation approfondie de la plupart des principaux glycanes des parois cellulaires qui composent la biomasse végétale. Cependant, l'analyse classique des glycanes ne caractérise que les glycanes de plus grande taille, car la plupart des oligosaccharides ne sont pas immobilisés efficacement sur les plaques ELISA. Dans cette étude, des tiges de maïs prétraitées par AFEX ont été hydrolysées enzymatiquement à haute teneur en solides. L'analyse des sucres a permis de déterminer la composition des glucides récalcitrants de la paroi cellulaire dans l'hydrolysat. Cependant, l'analyse par anticorps monoclonaux des oligosaccharides plus petits dans les hydrolysats est sous-estimée, et des outils supplémentaires sont nécessaires pour immobiliser efficacement les oligosaccharides sur les plaques ELISA.
Nous présentons ici une nouvelle méthode efficace d'immobilisation d'oligosaccharides pour le criblage d'anticorps monoclonaux (mAb), combinant la biotinylation des oligosaccharides suivie d'un criblage ELISA sur des plaques revêtues de NeutrAvidin™. Les oligosaccharides biotinylés immobilisés ont montré une affinité suffisante pour l'anticorps pour permettre une détection rapide et efficace des oligosaccharides récalcitrants. L'analyse de la composition de ces oligosaccharides récalcitrants par spectrométrie de masse a confirmé les résultats de cette nouvelle approche d'immunocriblage. Ainsi, ces études démontrent que la combinaison de la biotinylation des oligosaccharides et du criblage ELISA avec des anticorps monoclonaux ciblant les glycanes peut être utilisée pour détecter les pontages dans les oligosaccharides et peut être largement appliquée à d'autres études biochimiques caractérisant la structure des oligosaccharides.
Cette méthode de profilage des glycanes à base de biotine est la première à étudier les liaisons glucidiques récalcitrantes des oligosaccharides solubles dans la biomasse végétale. Cela permet de comprendre pourquoi certaines parties de la biomasse sont si réticentes à la production de biocarburants. Cette méthode comble une lacune importante dans les méthodes d'analyse des glycomes et étend son application à une gamme plus large de substrats, au-delà des oligosaccharides végétaux. À l'avenir, nous pourrions utiliser la robotique pour la biotinylation et utiliser la méthode que nous avons développée pour l'analyse à haut débit d'échantillons par ELISA.
De la paille de maïs (CS) issue de semences hybrides Pioneer 33A14 a été récoltée en 2010 à Kramer Farms, à Ray, dans le Colorado. Avec l'autorisation du propriétaire, cette biomasse peut être utilisée à des fins de recherche. Les échantillons ont été conservés au sec à < 6 % d'humidité dans des sacs à fermeture éclair à température ambiante. Les échantillons ont été conservés au sec à < 6 % d'humidité dans des sacs à fermeture éclair à température ambiante. Les aliments peuvent contenir des aliments < 6 % dans des emballages à température ambiante. Les échantillons ont été conservés au sec à < 6 % d’humidité dans des sacs à fermeture éclair à température ambiante.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% La température ambiante des paquets est inférieure à 6 %. Les échantillons sont conservés dans des sacs à fermeture éclair à température ambiante avec une humidité < 6 %.L'étude a été réalisée conformément aux directives locales et nationales. L'analyse de la composition a été réalisée selon le protocole du NREL. La composition contenait 31,4 % de glucane, 18,7 % de xylane, 3,3 % d'arabinane, 1,2 % de galactane, 2,2 % d'acétyle, 14,3 % de lignine, 1,7 % de protéines et 13,4 % de cendres.
Cellic® CTec2 (138 mg de protéines/ml, lot VCNI 0001) est un mélange complexe de cellulase, de β-glucosidase et de Cellic® HTec2 (157 mg de protéines/ml, lot VHN00001) de Novozymes (Franklinton, NC, États-Unis). Multifect Pectinase® (72 mg de protéines/ml), un mélange complexe d'enzymes dégradant la pectine, a été offert par DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, États-Unis). Les concentrations enzymatiques en protéines ont été déterminées par estimation de la teneur en protéines (et soustraction de la contribution de l'azote non protéique) par analyse de l'azote selon Kjeldahl (méthode AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, États-Unis). La terre de diatomées 545 a été achetée auprès d'EMD Millipore (Billerica, MA). Le charbon actif (DARCO, granulés de 100 mesh), l'Avicel (PH-101), le xylane de hêtre et tous les autres produits chimiques ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Le prétraitement AFEX a été réalisé au GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, États-Unis). Il a été réalisé à 140 °C pendant 15 minutes. Le temps de séjour était de 46 minutes, avec un rapport ammoniac anhydre/biomasse de 1:1, à 60 % (p/p), dans un réacteur discontinu de paillasse en acier inoxydable (Parr Instruments Company). L'opération a duré 30 minutes. Le réacteur a été porté à 140 °C et l'ammoniac a été rapidement libéré, permettant à la biomasse de revenir rapidement à température ambiante. La composition des tiges de maïs prétraitées AFEX (ACS) était similaire à celle des tiges de maïs non traitées (UT-CS).
De l'ACSH à haute teneur en solides à 25 % (p/p) (charge d'environ 8 % de dextrane) a été préparée comme matière première pour la production à grande échelle d'oligosaccharides. L'hydrolyse enzymatique de l'ACS a été réalisée à l'aide d'un mélange d'enzymes commercial comprenant du Cellic® Ctec2 10 mg de protéines/g de glucane (dans la biomasse prétraitée), du Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg de protéines/g de glucane, et de la pectinase Multifect (Genencor Inc, États-Unis). ). ), 5 mg de protéines/g de dextrane. L'hydrolyse enzymatique a été réalisée dans un bioréacteur de 5 litres avec un volume utile de 3 litres, pH 4,8, 50 °C et 250 tr/min. Après 96 heures d'hydrolyse, l'hydrolysat a été récupéré par centrifugation à 6 000 tr/min pendant 30 minutes, puis à 14 000 tr/min pendant 30 minutes pour éliminer les solides non hydrolysés. L'hydrolysat a ensuite été soumis à une filtration stérile à travers un bécher filtrant de 0,22 mm. L'hydrolysat filtré a été conservé dans des flacons stériles à 4 °C, puis fractionné sur charbon actif.
Analyse de la composition des échantillons de biomasse à base d'extraits selon les procédures d'analyse de laboratoire du NREL : préparation des échantillons pour l'analyse de la composition (NREL/TP-510-42620) et détermination des glucides structurels et de la lignine dans la biomasse (NREL/TP-510 – 42618)47.
L'analyse des oligosaccharides du flux d'hydrolysat a été réalisée à l'échelle de 2 ml par une méthode d'hydrolyse acide en autoclave. Mélanger l'échantillon d'hydrolysat avec 69,7 µl d'acide sulfurique à 72 % dans un tube de culture à bouchon à vis de 10 ml et incuber pendant 1 h sur une paillasse à 121 °C, refroidir sur glace et filtrer dans un flacon pour chromatographie liquide haute performance (HPLC). La concentration en oligosaccharides a été déterminée en soustrayant la concentration en monosaccharides de l'échantillon non hydrolysé de la concentration en sucres totaux de l'échantillon hydrolysé en milieu acide.
Les concentrations de glucose, de xylose et d'arabinose dans la biomasse hydrolysée acide ont été analysées à l'aide d'un système HPLC Shimadzu équipé d'un échantillonneur automatique, d'un réchauffeur de colonne, d'une pompe isocratique et d'un détecteur d'indice de réfraction sur une colonne Bio-Rad Aminex HPX-87H. La colonne a été maintenue à 50 °C et éluée avec 0,6 ml/min de H2SO4 5 mM dans l'eau.
Le surnageant d'hydrolysat a été dilué et analysé pour déterminer sa teneur en monomères et en oligosaccharides. Les sucres monomères obtenus après hydrolyse enzymatique ont été analysés par HPLC avec une colonne Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P et une colonne de garde de cendres. La température de la colonne a été maintenue à 80 °C, l'eau servant de phase mobile à un débit de 0,6 ml/min. Les oligosaccharides ont été dosés par hydrolyse en milieu acide dilué à 121 °C selon les méthodes décrites dans les références 41, 48 et 49.
Français L'analyse des saccharides a été réalisée sur des résidus de biomasse bruts, prétraités par AFEX et tous les résidus de biomasse non hydrolysés (y compris la production d'extraits de parois cellulaires en série et leur criblage d'anticorps monoclonaux) en utilisant les procédures décrites précédemment 27, 43, 50, 51 . Pour l'analyse du glycome, des résidus insolubles dans l'alcool de matériel de paroi cellulaire végétale sont préparés à partir de résidus de biomasse et soumis à une extraction en série avec des réactifs de plus en plus agressifs tels que l'oxalate d'ammonium (50 mM), le carbonate de sodium (50 mM et 0,5 % p/v), CON. (1 M et 4 M, tous deux avec 1 % p/v de borohydrure de sodium) et le chlorite acide comme décrit précédemment52,53. Les extraits ont ensuite été soumis à un test ELISA contre un panel complexe d'anticorps monoclonaux50 dirigés contre le glycane de la paroi cellulaire, et les réactions de liaison des anticorps monoclonaux ont été présentées sous forme de carte thermique. Les anticorps monoclonaux ciblant le glycane de la paroi cellulaire végétale ont été achetés à partir de stocks de laboratoire (séries CCRC, JIM et MAC).
Biotinylation d'oligosaccharides en une étape. La conjugaison des glucides avec la biotine-LC-hydrazide a été réalisée selon la procédure suivante. La biotine-LC-hydrazide (4,6 mg/12 µmol) a été dissoute dans du diméthylsulfoxyde (DMSO, 70 µl) par agitation vigoureuse et chauffage à 65 °C pendant 1 min. De l'acide acétique glacial (30 µl) a été ajouté et le mélange a été versé sur du cyanoborohydrure de sodium (6,4 mg/100 µmol) et complètement dissous après chauffage à 65 °C pendant environ 1 minute. Ensuite, 5 à 8 µl du mélange réactionnel ont été ajoutés à l'oligosaccharide séché (1-100 nmol) afin d'obtenir un excès molaire de 10 fois ou plus du marqueur sur l'extrémité réductrice. La réaction a été réalisée à 65 °C pendant 2 h, après quoi les échantillons ont été immédiatement purifiés. Aucun cyanoborohydrure de sodium n'a été utilisé dans les expériences de marquage sans réduction, et les échantillons ont réagi à 65° C pendant 2,5 heures.
Revêtement ELISA et lavage d'échantillons d'oligosaccharides biotinylés. 25 μl d'échantillons biotinylés (100 μl de chaque échantillon concentré dilués dans 5 ml de solution tampon Tris 0,1 M (TBS)) ont été ajoutés à chaque puits de la plaque recouverte d'avidine. Les puits témoins ont été recouverts de 50 μl de biotine à une concentration de 10 μg/ml dans du TBS 0,1 M. De l'eau déionisée a été utilisée comme revêtement pour les mesures à blanc. Le comprimé a été incubé pendant 2 heures à température ambiante et à l'obscurité. Laver la plaque 3 fois avec du lait écrémé à 0,1 % dans du TBS 0,1 M en utilisant le programme n° 11 pour Grenier flat 3A.
Ajout et lavage des anticorps primaires. Ajouter 40 µl d'anticorps primaire dans chaque puits. Incuber la microplaque pendant 1 heure à température ambiante et à l'obscurité. Les plaques ont ensuite été lavées 3 fois avec du lait à 0,1 % dans du TBS à 0,1 M, selon le programme de lavage n° 11 pour Grenier Flat 3A.
Ajouter l'anticorps secondaire et laver. Ajouter 50 µl d'anticorps secondaire de souris/rat (dilué au 1:5000 dans du lait à 0,1 % dans du TBS 0,1 M) dans chaque puits. Incuber la microplaque pendant 1 heure à température ambiante et à l'obscurité. Les microplaques ont ensuite été lavées 5 fois avec du lait à 0,1 % dans du TBS 0,1 M en utilisant le programme de lavage Grenier Flat 5A n° 12.
Ajout d'un substrat. Ajouter 50 µl de 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB) au substrat de base (en ajoutant 2 gouttes de tampon, 3 gouttes de TMB et 2 gouttes de peroxyde d'hydrogène à 15 ml d'eau déionisée). Préparer le substrat TMB et vortexer avant utilisation. Incuber la microplaque à température ambiante pendant 30 minutes. Dans l'obscurité.
Terminez l'étape et lisez le comprimé. Ajoutez 50 µl d'acide sulfurique 1 N dans chaque puits et enregistrez l'absorbance de 450 à 655 nm à l'aide d'un lecteur ELISA.
Français Préparer des solutions à 1 mg/ml de ces analytes dans de l'eau déionisée : arabinose, rhamnose, fucose, xylose, acide galacturonique (GalA), acide glucuronique (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acétylmannosamine (manNAc), N-acétylglucosamine (glcNAc), N-acétylgalactosamine (galNAc), inositol (étalon interne). Deux étalons ont été préparés en ajoutant les solutions de sucre à 1 mg/mL présentées dans le tableau 1. Les échantillons sont congelés et lyophilisés à -80 °C jusqu'à ce que toute l'eau soit éliminée (généralement environ 12 à 18 heures).
Ajouter 100 à 500 µg d'échantillon dans des tubes à bouchon à vis sur une balance analytique. Noter la quantité ajoutée. Il est préférable de dissoudre l'échantillon dans une concentration spécifique de solvant et de l'ajouter au tube sous forme d'aliquote liquide. Utiliser 20 µl d'inositol à 1 mg/ml comme étalon interne pour chaque tube à échantillon. La quantité d'étalon interne ajoutée à l'échantillon doit être identique à celle ajoutée au tube étalon.
Ajouter 8 ml de méthanol anhydre dans un flacon à bouchon à vis. Ajouter ensuite 4 ml de solution méthanolique de HCl 3 N, refermer et agiter. Ce procédé n'utilise pas d'eau.
Ajouter 500 µl de solution méthanolique HCl 1 M aux échantillons d'oligosaccharides et aux tubes TMS standard. Les échantillons ont été incubés pendant la nuit (168 heures) à 80 °C dans un bloc thermique. Sécher le produit de méthanolyse à température ambiante à l'aide d'un collecteur de séchage. Ajouter 200 µl de MeOH et sécher à nouveau. Ce processus est répété deux fois. Ajouter 200 µl de méthanol, 100 µl de pyridine et 100 µl d'anhydride acétique à l'échantillon et bien mélanger. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes et sécher. Ajouter 200 µl de méthanol et sécher à nouveau.
Ajouter 200 µl de Tri-Sil et chauffer le tube bouché pendant 20 minutes à 80 °C, puis laisser refroidir à température ambiante. Utiliser un collecteur de séchage pour sécher davantage l'échantillon jusqu'à un volume d'environ 50 µl. Il est important de noter que nous n'avons pas laissé sécher complètement les échantillons.
Ajouter 2 ml d'hexane et bien mélanger au vortex. Remplir les embouts des pipettes Pasteur (5-8 mm) avec un morceau de laine de verre en insérant la laine de verre sur une pipette de 5-3/4 pouces de diamètre. Les échantillons ont été centrifugés à 3000 g pendant 2 minutes. Tous les résidus insolubles ont précipité. Sécher l'échantillon à 100-150 µl. Un volume d'environ 1 µl a été injecté dans le GC-MS à une température initiale de 80 °C et un temps initial de 2,0 minutes (tableau 2).