Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан браузердин версиясында CSS колдоосу чектелүү. Эң жакшы тажрыйба алуу үчүн, жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде шайкештик режимин өчүрүңүз). Ошол эле учурда, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
AFEX менен алдын ала иштетилген жүгөрү бышыргычындагы туруктуу олигосахариддерди комплекстүү анализдөө үчүн жаңы иммунологиялык жана массалык спектрометриялык ыкмалар. Лигноцеллюлозалык биомасса казылып алынган отунга туруктуу альтернатива болуп саналат жана азык-түлүк, тоют, отун жана химиялык заттар сыяктуу продукцияларды өндүрүү үчүн биотехнологияларды иштеп чыгууда кеңири колдонулат. Бул технологиялардын ачкычы - өсүмдүк клеткаларынын дубалдарында бар болгон татаал углеводдорду глюкоза, ксилоза жана арабиноза сыяктуу жөнөкөй канттарга айландыруу үчүн атаандаштыкка жөндөмдүү процесстерди иштеп чыгуу. Лигноцеллюлозалык биомасса абдан өжөр болгондуктан, каалаган продукцияны алуу үчүн аны термохимиялык иштетүүлөргө (мисалы, аммиак буласын эксфолиациялоо (AFEX), суюлтулган кислоталар (DA), иондук суюктуктар (IL)) жана биологиялык иштетүүлөргө (мисалы, ферменттик гидролиз жана микробдук ферментация) айкалыштыруу керек. Бирок, гидролиз процессинде коммерциялык грибоктук ферменттер колдонулганда, пайда болгон эрүүчү канттардын 75-85% гана моносахариддер, ал эми калган 15-25% эрүүчү, эригич олигосахариддер болуп саналат, алар микроорганизмдер үчүн дайыма эле жеткиликтүү боло бербейт. Буга чейин биз көмүртек жана диатомдуу жер бөлүү жана өлчөмдөрдү алып салуу хроматографиясынын айкалышын колдонуп, эрүүчү өжөр олигосахариддерди ийгиликтүү бөлүп алып, тазалаганбыз, ошондой эле алардын ферменттик ингибирлөө касиеттерин изилдегенбиз. Биз полимерлешүүнүн жогорку даражасын (DP) метилденген урон кислотасынын алмаштыруучуларын камтыган олигосахариддерди коммерциялык фермент аралашмалары менен иштетүү төмөн DP жана нейтралдуу олигосахариддерге караганда кыйыныраак экенин аныктадык. Бул жерде биз өсүмдүк клеткаларынын дубалдарындагы гликан байланыштарын жана ферменттик гидролизаттарды мүнөздөө үчүн өсүмдүк биомассасынын гликандарына мүнөздүү моноклоналдык антителолорду (mAbs) колдонуп гликан профилдөө, матрица жардамы менен лазердик десорбция иондоштуруу, учуу убактысы боюнча масса-спектрометрия сыяктуу бир нече кошумча ыкмаларды колдонуу жөнүндө билдиребиз. . MALDI-TOF-MS) терс иондордун экинчилик ажыроосунан кийин спектроскопия, газ хроматографиясы жана массалык спектрометрия (GC-MS) аркылуу алынган түзүлүш-маалыматтык диагностикалык чокуларды дериватизациялоо менен жана ансыз олигосахариддик байланыштарды мүнөздөө үчүн колдонот. Олигосахариддердин кичинекей өлчөмүнөн улам (DP 4–20), бул молекулаларды mAb байланышы жана мүнөздөмөсү үчүн колдонуу кыйын. Бул көйгөйдү чечүү үчүн биз микропластинанын бетинде DPде эрүүчү олигосахариддердин көпчүлүгүн ийгиликтүү белгилеген биотин конъюгациясына негизделген жаңы олигосахарид иммобилизациялоо ыкмасын колдондук, ал андан кийин жогорку өткөрүмдүүлүктөгү mAb системасында атайын байлоо анализи үчүн колдонулган. Бул жаңы ыкма келечекте диагностикалык максаттарда биомаркерлерде бар болгон олигосахариддерди бөлүп алуу жана мүнөздөө үчүн колдонула турган жогорку өткөрүмдүүлүктөгү гликом анализдерин иштеп чыгууга көмөктөшөт.
Айыл чарба, токой чарбасы, чөп жана жыгач материалдарынан турган лигноцеллюлозалык биомасса жогорку баалуу продукцияларды өндүрүү үчүн азык-түлүк, тоют, отун жана химиялык прекурсорлорду камтыган биологиялык негиздеги продукцияларды өндүрүү үчүн потенциалдуу чийки зат болуп саналат1. Өсүмдүк клеткаларынын дубалдарындагы углеводдор (мисалы, целлюлоза жана гемицеллюлоза) химиялык иштетүү жана биотрансформация (мисалы, ферменттик гидролиз жана микробдук ачытуу) аркылуу моносахариддерге деполимерленет. Кеңири таралган алдын ала иштетүүлөргө аммиак буласынын кеңейиши (AFEX), суюлтулган кислота (DA), иондук суюктук (IL) жана буу жарылуусу (SE) кирет, алар өсүмдүк клеткаларынын дубалдарын ачуу менен лигноцеллюлоза өндүрүшүн азайтуу үчүн химиялык заттардын жана жылуулуктун айкалышын колдонушат3,4. заттын өжөрлүгү, 5. Ферменттик гидролиз коммерциялык активдүү углевод камтыган ферменттерди (CAZymes) колдонуу менен катуу заттардын жогорку жүктөмүндө жана биологиялык негиздеги отундарды жана химиялык заттарды өндүрүү үчүн трансгендик ачыткыларды же бактерияларды колдонуу менен микробдук ачытуу аркылуу жүргүзүлөт6.
Коммерциялык ферменттердеги CAZymes татаал углевод-кант байланыштарын синергетикалык түрдө үзүп, моносахариддерди пайда кылган ферменттердин татаал аралашмасынан турат2,7. Буга чейин кабарлаганыбыздай, лигниндин углеводдор менен ароматтык полимерлеринин татаал тармагы аларды өтө татаал кылат, бул канттын толук эмес конверсиясына алып келет, алдын ала иштетилген биомассанын ферменттик гидролизи учурунда өндүрүлбөгөн 15-25% жыныстык олигосахариддерди топтойт. Бул биомассанын алдын ала иштетүүнүн ар кандай ыкмаларында кеңири таралган көйгөй. Бул тоскоолдуктун кээ бир себептерине гидролиз учурунда ферменттин ингибирлениши же өсүмдүк биомассасындагы кант байланыштарын үзүү үчүн зарыл болгон маанилүү маанилүү ферменттердин жоктугу же төмөн деңгээли кирет. Олигосахариддердеги кант байланыштары сыяктуу канттардын курамын жана структуралык мүнөздөмөлөрүн түшүнүү гидролиз учурунда канттын конверсиясын жакшыртууга жардам берет, бул биотехнологиялык процесстерди мунайдан алынган продуктылар менен атаандаштыкка жөндөмдүү кылат.
Углеводдордун түзүлүшүн аныктоо татаал жана суюк хроматография (LC)11,12, ядролук магниттик-резонанстык спектроскопия (ЯМР)13, капиллярдык электрофорез (CE)14,15,16 жана массалык-спектрометрия (MS)17 сыяктуу ыкмалардын айкалышын талап кылат. , он сегиз. Лазердик десорбция жана матрицаны (MALDI-TOF-MS) колдонуу менен иондоштуруу менен учуу убактысынын массалык-спектрометриясы сыяктуу MS ыкмалары углеводдордун түзүлүштөрүн аныктоонун ар тараптуу ыкмасы болуп саналат. Жакында эле натрий иондорунун аддукттарынын кагылышуудан улам диссоциацияланган (CID) тандемдик MS олигосахариддердин байланыш позицияларына, аномердик конфигурацияларына, ырааттуулуктарына жана бутактануу позицияларына туура келген манжа издерин аныктоо үчүн эң кеңири колдонулуп келет 20, 21.
Гликан анализи углевод байланыштарын терең аныктоо үчүн эң сонун курал болуп саналат22. Бул ыкма татаал углевод байланыштарын түшүнүү үчүн өсүмдүктүн клетка дубалынын гликанына багытталган моноклоналдык антителолорду (mAbs) зонд катары колдонот. Дүйнө жүзү боюнча 250дөн ашык mAbs бар, алар ар кандай сахариддерди колдонуу менен ар кандай сызыктуу жана тармакталган олигосахариддерге каршы иштелип чыккан24. Өсүмдүктүн клетка дубалынын түзүлүшүн, курамын жана модификацияларын мүнөздөө үчүн бир нече mAbs кеңири колдонулган, анткени өсүмдүк клеткасынын түрүнө, органына, жашына, өнүгүү этабына жана өсүү чөйрөсүнө жараша олуттуу айырмачылыктар бар25,26. Жакында эле бул ыкма өсүмдүктөр жана жаныбарлар системаларындагы везикулалардын популяцияларын жана алардын гликан ташуудагы тиешелүү ролдорун субклеткалык маркерлер, өнүгүү этаптары же айлана-чөйрөнүн стимулдары менен аныкталгандай түшүнүү жана ферменттик активдүүлүктү аныктоо үчүн колдонулуп келет. Гликандардын жана ксиландардын аныкталган ар кандай түзүлүштөрүнө пектин (P), ксилан (X), маннан (M), ксилоглюкандар (XylG), аралаш байланыш глюкандары (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкурон кислотасы-арабиноксилан (GArbX) жана арабино-галактан (ArbG) кирет29.
Бирок, ушул изилдөө иштеринин баарына карабастан, бир нече гана изилдөөлөр катуу заттардын жогорку жүктөмү (HSL) гидролизи учурунда олигосахариддердин топтолушунун мүнөзүнө багытталган, анын ичинде олигосахариддердин бөлүнүп чыгышы, гидролиз учурунда олигомердик чынжырдын узундугунун өзгөрүшү, ар кандай аз ДП полимерлери жана алардын ийри сызыктары. бөлүштүрүүлөр 30,31,32. Ошол эле учурда, гликан анализи гликан түзүлүшүн комплекстүү талдоо үчүн пайдалуу курал болуп чыкканы менен, сууда эрүүчү аз ДП олигосахариддерин антитело ыкмаларын колдонуу менен баалоо кыйын. Молекулярдык салмагы 5-10 кДадан аз болгон кичирээк ДП олигосахариддери ELISA пластиналарына 33, 34 байланбайт жана антитело кошулганга чейин жуулуп кетет.
Бул жерде биз биринчи жолу авидин менен капталган пластинкаларда моноклоналдык антителолорду колдонуп, эрүүчү отко чыдамдуу олигосахариддер үчүн бир баскычтуу биотинилдөө процедурасын гликом анализи менен айкалыштырган ELISA анализин көрсөтөбүз. Гликом анализине болгон мамилебиз гидролизденген кант курамдарын триметилсилил (TMS) менен деривациялоону колдонуу менен комплементардуу олигосахарид байланыштарынын MALDI-TOF-MS жана GC-MS негизиндеги анализи менен тастыкталды. Бул инновациялык ыкма келечекте жогорку өндүрүмдүүлүктөгү ыкма катары иштелип чыгышы жана биомедициналык изилдөөлөрдө кеңири колдонулушу мүмкүн35.
Ферменттердин жана антителолордун трансляциядан кийинки модификациялары, мисалы, гликозилдөө,36 алардын биологиялык активдүүлүгүнө таасир этет. Мисалы, кан сары суусунун белокторунун гликозилдөөсүндөгү өзгөрүүлөр сезгенүү артритинде маанилүү ролду ойнойт жана гликозилдөөдөгү өзгөрүүлөр диагностикалык маркерлер катары колдонулат37. Адабиятта ар кандай гликандар ашказан-ичеги трактынын жана боордун өнөкөт сезгенүү оорулары, вирустук инфекциялар, энелик бездин, эмчектин жана простата безинин рагдары сыяктуу ар кандай ооруларда оңой эле пайда болору кабарланган38,39,40. Гликандардын түзүлүшүн антитело негизиндеги гликан ELISA ыкмаларын колдонуу менен түшүнүү татаал MS ыкмаларын колдонбостон ооруну аныктоодо кошумча ишенимди камсыз кылат.
Мурунку изилдөөбүз көрсөткөндөй, өжөр олигосахариддер алдын ала иштетүүдөн жана ферменттик гидролизден кийин гидролизденбеген бойдон калган (1-сүрөт). Мурда жарыяланган ишибизде биз AFEX менен алдын ала иштетилген жүгөрү стовер гидролизатынан (ACSH)8 олигосахариддерди бөлүп алуу үчүн активдештирилген көмүрдүн катуу фазалуу экстракция ыкмасын иштеп чыкканбыз. Баштапкы экстракциядан жана бөлүүдөн кийин, олигосахариддер өлчөмдү четтетүү хроматографиясы (SEC) аркылуу андан ары фракцияланып, молекулярдык салмактын тартибинде чогултулган. Ар кандай алдын ала иштетүүдөн бөлүнүп чыккан кант мономерлери жана олигомерлери канттын курамын талдоо аркылуу талданган. Ар кандай алдын ала иштетүү ыкмалары менен алынган кант олигомерлеринин курамын салыштырганда, өжөр олигосахариддердин болушу биомассаны моносахариддерге айландыруудагы кеңири таралган көйгөй болуп саналат жана канттын түшүмдүүлүгүн кеминде 10-15% га, ал тургай 18% га чейин төмөндөтүшү мүмкүн. АКШда бул ыкма олигосахарид фракцияларын андан ары ири масштабда өндүрүү үчүн колдонулат. Бул иште олигосахариддерди мүнөздөө үчүн эксперименталдык материал катары алынган ACH жана андан кийинки ар кандай молекулярдык салмактагы фракциялар колдонулган.
Алдын ала иштетүүдөн жана ферменттик гидролизден кийин, туруктуу олигосахариддер гидролизденбеген бойдон калган. Бул жерде (A) олигосахариддерди бөлүү ыкмасы, анда олигосахариддер AFEX менен алдын ала иштетилген жүгөрү гидролизатынан (ACSH) активдештирилген көмүртек жана диатомдуу топурактын топтолуп турган катмарын колдонуу менен бөлүнүп алынат; (B) Олигосахариддерди бөлүү ыкмасы. Олигосахариддер андан ары өлчөмдөгү бөлүп алуу хроматографиясы (SEC) менен бөлүнгөн; (C) Ар кандай алдын ала иштетүүдөн бөлүнүп чыккан сахарид мономерлери жана олигомерлери (суюлтулган кислота: DA, иондук суюктук: IL жана AFEX). Ферменттик гидролиз шарттары: катуу заттардын жогорку жүктөмү 25% (салмак/салмак) (болжол менен 8% глюкан жүктөмү), 96 сааттык гидролиз, 20 мг/г коммерциялык фермент жүктөмү (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 катышы) жана (D) AFEX алдын ала иштетилген жүгөрү бышыргычынан (ACS) бөлүнүп чыккан глюкозанын, ксилозанын жана арабинозанын кант мономерлери жана олигомерлери.
Гликан анализи катуу биомасса калдыктарынан бөлүнүп алынган экстракттардагы гликандардын комплекстүү структуралык анализи үчүн пайдалуу курал болуп чыкты. Бирок, бул салттуу ыкманы колдонууда сууда эрүүчү сахариддер аз көрсөтүлөт41, анткени төмөнкү молекулярдык салмактагы олигосахариддерди ELISA плиталарында иммобилизациялоо кыйын жана антитело кошуудан мурун жуулуп кетет. Ошондуктан, антителолорду байланыштыруу жана мүнөздөө үчүн, авидин менен капталган ELISA плиталарындагы эрүүчү, шайкеш келбеген олигосахариддерди каптоо үчүн бир баскычтуу биотинилдөө ыкмасы колдонулган. Бул ыкма мурда өндүрүлгөн ACSH жана анын молекулярдык салмагына (же полимерлешүү даражасына, DP) негизделген фракцияны колдонуу менен сыналган. Бир баскычтуу биотинилдөө углеводдун калыбына келтирүүчү учуна биотин-LC-гидразид кошуу менен олигосахариддердин байланышуу жакындыгын жогорулатуу үчүн колдонулган (2-сүрөт). Эритмеде калыбына келтирүүчү учундагы гемиацеталдык топ биотин-LC-гидразиддин гидразид тобу менен реакцияга кирип, гидразон байланышын түзөт. NaCNBH3 калыбына келтирүүчү агентинин катышуусунда гидразон байланышы туруктуу биотинделген акыркы продуктуга чейин калыбына келет. Кантты калыбына келтирүүчү учту өзгөртүү менен, аз ДП олигосахариддерин ELISA плиталарына байланыштыруу мүмкүн болду жана биздин изилдөөдө бул гликанга багытталган mAbs колдонуу менен авидин менен капталган плиталарда жасалды.
Биотинделген олигосахариддерди ELISA негизинде моноклоналдык антителолорду скринингдөө. Бул жерде (A) олигосахариддерди айкалыштырылган биотинилдөө жана андан кийинки NeutrAvidin менен капталган пластиналарда гликанга багытталган mAbs менен ELISA скрининги жана (B) реакция продуктуларын биотинилдөөнүн бир кадамдуу процедурасы көрсөтүлгөн.
Андан кийин олигосахарид менен конъюгацияланган антителолор менен авидин менен капталган плиталар биринчилик жана экинчилик антителолорго кошулуп, жарыкка жана убакытка сезгич чөйрөдө жуулган. Антителолордун байланышы аяктагандан кийин, плитаны инкубациялоо үчүн TMB субстратын кошуңуз. Акыры реакция күкүрт кислотасы менен токтотулган. Инкубацияланган плиталар антителого мүнөздүү кайчылаш байланышты аныктоо үчүн ар бир антителонун байланыш күчүн аныктоо максатында ELISA окугучун колдонуу менен талданган. Эксперименттин чоо-жайы жана параметрлери үчүн тиешелүү "Материалдар жана методдор" бөлүмүн караңыз.
Биз бул жаңы иштелип чыккан ыкманын белгилүү бир колдонмолор үчүн пайдалуулугун ACSHде, ошондой эле лигноцеллюлозалык гидролизаттардан бөлүнүп алынган чийки жана тазаланган олигосахарид фракцияларында кездешкен эрүүчү олигосахариддерди мүнөздөө менен көрсөтөбүз. 3-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, биоациллденген гликом анализинин ыкмаларын колдонуу менен ACSHде аныкталган эң кеңири таралган эпитоп менен алмаштырылган ксиландар, адатта, урондук (U) же метилурондук (MeU) жана пектикалык арабиногалактандар болуп саналат. Алардын көпчүлүгү гидролизденбеген катуу заттардын (UHS) гликандарын анализдөө боюнча мурунку изилдөөбүздө да табылган43.
Клетка дубалынын гликанына багытталган моноклоналдык антителону колдонуу менен баш ийбеген олигосахарид эпитопторун аныктоо. "Нейтралдуу" фракция - ACN фракциясы, ал эми "кычкыл" фракция - FA фракциясы. Жылуулук картасындагы ачык кызыл түстөр эпитоптун жогорку курамын, ал эми ачык көк түстөр бош фонду көрсөтөт. Шкаладагы түс маанилери N=2 формулалары үчүн чийки OD маанилерине негизделген. Антителолор тарабынан таанылган негизги эпитоптор оң жакта көрсөтүлгөн.
Бул целлюлоза эмес структураларды сыналган коммерциялык фермент аралашмасындагы эң кеңири таралган целлюлазалар жана гемицеллюлазалар бөлө алган жок, алардын курамына эң көп колдонулган коммерциялык ферменттер кирет. Ошондуктан, алардын гидролизи үчүн жаңы көмөкчү ферменттер талап кылынат. Керектүү целлюлоза эмес кошумча ферменттерсиз, бул целлюлоза эмес байланыштар моносахариддерге толук айланууга тоскоол болот, ал тургай алардын баштапкы кант полимерлери кыска фрагменттерге кеңири гидролизденип, коммерциялык фермент аралашмалары аркылуу эритилсе дагы.
Сигналдын таралышын жана анын байланыш күчүн андан ары изилдөө көрсөткөндөй, байланыш эпитоптору жогорку DP кант фракцияларында (A, B, C, DP 20+ чейин) димерлерде төмөнкү DP фракцияларына (D, E, F, DP) караганда төмөн болгон (1-сүрөт). Кислота фрагменттери целлюлоза эмес эпитоптордо нейтралдуу фрагменттерге караганда көбүрөөк кездешет. Бул кубулуштар биздин мурунку изилдөөбүздө байкалган схемага дал келет, анда жогорку DP жана кислота бөлүктөрү ферменттик гидролизге көбүрөөк туруктуу болгон. Ошондуктан, целлюлоза эмес гликан эпитопторунун жана U жана MeU орун басарларынын болушу олигосахариддердин туруктуулугуна чоң салым кошо алат. Байланыш жана аныктоо натыйжалуулугу төмөн DP олигосахариддери үчүн көйгөйлүү болушу мүмкүн экенин белгилей кетүү керек, айрыкча эпитоп димердик же тримердик олигосахарид болсо. Муну ар кандай узундуктагы коммерциялык олигосахариддерди колдонуп текшерүүгө болот, алардын ар бири белгилүү бир mAb менен байланышуучу бир гана эпитопту камтыйт.
Ошентип, түзүлүшкө мүнөздүү антителолорду колдонуу белгилүү бир түрдөгү баш ийбес байланыштарды аныктады. Колдонулган антителонун түрүнө, тиешелүү байлоо схемасына жана ал чыгарган сигналдын күчүнө (эң көп жана эң аз) жараша, жаңы ферменттерди аныктап, толук гликоконверсия үчүн фермент аралашмасына жарым-жартылай сандык түрдө кошууга болот. ACSH олигосахариддерин анализдөөнү мисал катары алып, биз ар бир биомасса материалы үчүн гликан байланыштарынын маалымат базасын түзө алабыз. Бул жерде антителолордун ар кандай жакындыгын эске алуу керектигин жана эгерде алардын жакындыгы белгисиз болсо, бул ар кандай антителолордун сигналдарын салыштырууда белгилүү бир кыйынчылыктарды жаратаарын белгилей кетүү керек. Мындан тышкары, гликан байланыштарын салыштыруу бир эле антитело үчүн үлгүлөрдүн ортосунда эң жакшы иштеши мүмкүн. Андан кийин бул өжөр байланыштарды CAZyme маалымат базасына байланыштырса болот, андан биз ферменттерди аныктай алабыз, кандидат ферменттерди тандай алабыз жана байланышты үзүүчү ферменттерди текшере алабыз же биокайра иштетүүчү заводдордо колдонуу үчүн бул ферменттерди экспрессиялоо үчүн микробдук системаларды иштеп чыга алабыз44.
Лигноцеллюлозалык гидролизаттарда кездешкен төмөнкү молекулярдык салмактагы олигосахариддерди мүнөздөө үчүн иммунологиялык ыкмалардын альтернативдүү ыкмаларды кандайча толуктап тураарын баалоо үчүн, биз MALDI (4-сүрөт, S1-S8) жана GC-MS негизиндеги TMSтен алынган сахариддердин анализин бир эле панелде (5-сүрөт) олигосахарид бөлүгүндө жүргүздүк. MALDI олигосахарид молекулаларынын массалык бөлүштүрүлүшү максаттуу түзүлүшкө дал келерин салыштыруу үчүн колдонулат. 4-сүрөттө ACN-A жана ACN-B нейтралдуу компоненттеринин MS көрсөтүлгөн. ACN-A анализи DP 4–8ден (4-сүрөт) DP 22ге (S1-сүрөт) чейинки пентоза канттарынын диапазонун тастыктады, алардын салмагы MeU-ксилан олигосахариддерине туура келет. ACN-B анализи DP 8-15 менен пентоза жана глюкоксилан катарларын тастыктады. S3-сүрөт сыяктуу кошумча материалдарда FA-C кислоталуу бөлүктүн массалык бөлүштүрүү карталарында ELISA негизиндеги mAb скринингинде табылган алмаштырылган ксиландар менен дал келген DP 8-15 болгон (Me)U алмаштырылган пентоза канттарынын диапазону көрсөтүлгөн. Эпитоптор ырааттуу.
ACSте кездешкен эрүүчү шайкеш келбеген олигосахариддердин MALDI-MS спектри. Бул жерде, (A) метилденген урон кислотасын (DP 4-8) алмаштырган глюкуроксилан олигосахариддерин камтыган ACN-A аз салмактагы фракциялары жана (B) глюкуроксилан менен алмаштырылган ACN-B ксилан жана метилденген урон кислотасынын олигосахариддери (DP 8-15).
Отко чыдамдуу олигосахариддердин гликан калдыгынын курамын талдоо. Бул жерде (A) GC-MS анализин колдонуу менен алынган ар кандай олигосахарид фракцияларынын TMS сахарид курамы. (B) Олигосахариддерде кездешкен ар кандай TMSтен алынган канттардын түзүлүштөрү. ACN – нейтралдуу олигосахариддерди камтыган ацетонитрил фракциясы жана FA – кислота олигосахариддерди камтыган ферул кислотасынын фракциясы.
S9-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, олигосахарид фракциясынын LC-MS анализинен дагы бир кызыктуу тыянак чыгарылды (ыкмаларды электрондук кошумча материалдан көрүүгө болот). ACN-B фракциясын байлоо учурунда гексоза жана -OAc топторунун фрагменттери бир нече жолу байкалган. Бул ачылыш гликом жана MALDI-TOF анализинде байкалган фрагментацияны тастыктап гана тим болбостон, алдын ала иштетилген лигноцеллюлозалык биомассадагы углеводдордун потенциалдуу туундулары жөнүндө жаңы маалымат берет.
Ошондой эле, биз TMS гликандын деривациясын колдонуу менен олигосахарид фракцияларынын гликан курамын талдоо жүргүздүк. GC-MS колдонуп, биз олигосахарид фракциясындагы нейрондук (туунду эмес) жана кислоталуу канттардын (GluA жана GalA) курамын аныктадык (5-сүрөт). Глюкурон кислотасы C жана D кислоталуу компоненттеринде кездешет, ал эми галактурон кислотасы A жана B кислоталуу компоненттеринде кездешет, экөө тең кислоталуу канттардын жогорку DP компоненттери болуп саналат. Бул жыйынтыктар биздин ELISA жана MALDI маалыматтарыбызды гана тастыктабастан, ошондой эле олигосахариддердин топтолушу боюнча мурунку изилдөөлөрүбүзгө да дал келет. Ошондуктан, биз олигосахариддерди биотинилдөөнү жана андан кийинки ELISA скринингин колдонуу менен заманбап иммунологиялык ыкмалар ар кандай биологиялык үлгүлөрдө эрүүчү кайра иштетилүүчү олигосахариддерди аныктоо үчүн жетиштүү деп эсептейбиз.
ELISA негизиндеги mAb скрининг ыкмалары бир нече ар кандай ыкмалар менен текшерилгендиктен, биз бул жаңы сандык ыкманын потенциалын андан ары изилдөөнү кааладык. Эки коммерциялык олигосахарид, ксилогексахарид олигосахариди (XHE) жана 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX) сатылып алынып, клетка дубалынын гликанын бутага алган жаңы mAb ыкмасын колдонуу менен сыналган. 6-сүрөттө биотинделген байланыш сигналы менен олигосахарид концентрациясынын логарифмдик концентрациясынын ортосундагы сызыктуу корреляция көрсөтүлгөн, бул Ленгмюр адсорбциясынын мүмкүн болгон моделин көрсөтүп турат. mAbs арасында CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 жана CCRC-M151 XHE менен, ал эми CCRC-M108, CCRC-M109 жана LM11 1 нмден 100 наного чейинки диапазондо A2XX менен корреляцияланган. Эксперимент учурунда антителолордун чектелүү болушунан улам, ар бир олигосахарид концентрациясы менен чектелген эксперименттер жүргүзүлдү. Бул жерде кээ бир антителолор субстрат катары бир эле олигосахаридге абдан башкача реакция кылаарын белгилей кетүү керек, анткени алар бир аз башка эпитопторго байланат жана байланыштыруу жагынан абдан ар башка болушу мүмкүн. Жаңы mAb ыкмасы чыныгы үлгүлөргө колдонулганда, эпитопторду так аныктоонун механизмдери жана кесепеттери бир топ татаал болот.
Ар кандай гликанга багытталган mAbs аныктоо диапазонун аныктоо үчүн эки коммерциялык олигосахарид колдонулган. Бул жерде олигосахарид концентрациясынын логарифмдик концентрациясы менен сызыктуу корреляциялар (A) mAb менен XHE жана (B) mAb менен A2XX үчүн Ленгмюр адсорбциялык үлгүлөрүн көрсөтөт. Тиешелүү эпитоптор анализде субстрат катары колдонулган коммерциялык олигосахариддердин түзүлүштөрүн көрсөтөт.
Гликанга багытталган моноклоналдык антителолорду колдонуу (гликокомикалык анализ же ELISA негизиндеги mAb скрининги) өсүмдүк биомассасын түзгөн негизги клетка дубалынын гликандарынын көпчүлүгүн терең мүнөздөө үчүн күчтүү курал болуп саналат. Бирок, классикалык гликан анализи клетка дубалынын чоңураак гликандарын гана мүнөздөйт, анткени көпчүлүк олигосахариддер ELISA плиталарында натыйжалуу иммобилизацияланбайт. Бул изилдөөдө AFEX менен алдын ала иштетилген жүгөрү стовери катуу заттардын жогорку курамында ферментативдик гидролизденген. Гидролизаттагы кайра иштетилбеген клетка дубалынын углеводдорунун курамын аныктоо үчүн кант анализи колдонулган. Бирок, гидролизаттардагы кичирээк олигосахариддердин mAb анализи баалабай калган жана ELISA плиталарындагы олигосахариддерди натыйжалуу иммобилизациялоо үчүн кошумча куралдар керек.
Бул жерде биз NeutrAvidin™ капталган пластинкаларында олигосахарид биотинилдөөсүн жана андан кийин ELISA скринингин айкалыштыруу менен mAb скрининги үчүн жаңы жана натыйжалуу олигосахарид иммобилизациялоо ыкмасын сунуштайбыз. Иммобилизацияланган биотинилдеген олигосахариддер антителого жетиштүү жакындыкты көрсөттү, бул кайра иштетилбеген олигосахариддерди тез жана натыйжалуу аныктоого мүмкүндүк берет. Массалык спектрометрияга негизделген бул өжөр олигосахариддердин курамын талдоо иммуноскринингге карата бул жаңы ыкманын натыйжаларын тастыктады. Ошентип, бул изилдөөлөр олигосахарид биотинилдөөсүн жана ELISA скринингин гликанга багытталган моноклоналдык антителолор менен айкалыштыруу олигосахариддердеги кайчылаш байланыштарды аныктоо үчүн колдонулушу мүмкүн экенин жана олигосахариддердин түзүлүшүн мүнөздөгөн башка биохимиялык изилдөөлөрдө кеңири колдонулушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Бул биотинге негизделген гликан профилдөө ыкмасы өсүмдүк биомассасындагы эрүүчү олигосахариддердин кайра жаралбаган углеводдук байланыштарын изилдөөгө жөндөмдүү биринчи отчет болуп саналат. Бул биомассанын айрым бөлүктөрүнүн биоотун өндүрүүдө эмне үчүн мынчалык өжөр экенин түшүнүүгө жардам берет. Бул ыкма гликом анализинин ыкмаларындагы маанилүү боштукту толтурат жана аны өсүмдүк олигосахариддеринен тышкары дагы кеңири субстраттарга жайылтат. Келечекте биз биотинилдөө үчүн робототехниканы колдонушубуз мүмкүн жана биз иштеп чыккан ыкманы ELISA аркылуу үлгүлөрдү жогорку өндүрүмдүүлүк менен анализдөө үчүн колдонушубуз мүмкүн.
Pioneer 33A14 гибриддик үрөндөрүнөн өстүрүлгөн жүгөрү саманы (ЖС) 2010-жылы Колорадо штатынын Рей шаарындагы Kramer Farms компаниясынан жыйналып алынган. Жер ээсинин уруксаты менен бул биомассаны изилдөө үчүн колдонсо болот. Үлгүлөр бөлмө температурасында кургак, нымдуулугу 6% дан аз болгон баштыктарда сакталган. Үлгүлөр бөлмө температурасында кургак, нымдуулугу 6% дан аз болгон баштыктарда сакталган. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае. Үлгүлөр бөлмө температурасында, сыдырмалуу баштыктарда <6% нымдуулукта кургак сакталган.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае с влажностью < 6%. Үлгүлөр сыдырма баштыктарда бөлмө температурасында, нымдуулук < 6% болгондо сакталат.Изилдөө жергиликтүү жана улуттук көрсөтмөлөргө ылайык жүргүзүлдү. Курамдык анализ NREL протоколун колдонуу менен жүргүзүлдү. Курамында 31,4% глюкан, 18,7% ксилан, 3,3% арабинан, 1,2% галактан, 2,2% ацетил, 14,3% лигнин, 1,7% белок жана 13,4% күл бар экени аныкталды.
Cellic® CTec2 (138 мг белок/мл, партия VCNI 0001) - Novozymes (Франклинтон, Түндүк Каролина, АКШ) компаниясынан алынган целлюлазанын, β-глюкозидазанын жана Cellic® HTec2 (157 мг белок/мл, партия VHN00001) комплекстүү аралашмасы. Пектинди ажыратуучу ферменттердин комплекстүү аралашмасы болгон Multifect Pectinase® (72 мг белок/мл) DuPont Industrial Biosciences (Пало-Альто, Калифорния, АКШ) тарабынан белекке берилген. Ферменттин белок концентрациясы Кьелдаль азот анализин колдонуу менен белоктун курамын баалоо (жана белок эмес азоттун салымын кемитүү) аркылуу аныкталган (AOAC ыкмасы 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Итака, Нью-Йорк, АКШ). Диатомдуу жер 545 EMD Millipore (Billerica, MA) компаниясынан сатылып алынган. Активдештирилген көмүр (DARCO, 100 тор гранул), Avicel (PH-101), бук ксилан жана башка бардык химиялык заттар Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури) компаниясынан сатылып алынган.
AFEX алдын ала иштетүү GLBRCде (Биомассаны конверсиялоо изилдөө лабораториясы, MSU, Лансинг, MI, АКШ) жүргүзүлдү. Алдын ала иштетүү 140°C температурада 15 мүнөт бою жүргүзүлдү. 46 дат баспас болоттон жасалган үстүнкү кабаттагы реактордо (Parr Instruments Company) суусуз аммиактын биомассага 1:1 катышында 60% (салмак/салмак) жүктөм менен 46 мүнөт кармалды. Бул 30 мүнөткө созулду. Реактор 140°C температурага жеткирилип, аммиак тез бөлүнүп чыгып, биомассанын бөлмө температурасына тез кайтып келишине мүмкүндүк берди. AFEX алдын ала иштетилген жүгөрү бышыргычынын (ACS) курамы иштетилбеген жүгөрү бышыргычынын (UT-CS) курамына окшош болгон.
Олигосахариддерди ири масштабда өндүрүү үчүн баштапкы материал катары жогорку катуу заттар ACSH 25% (салмак/салмак) (болжол менен декстрандын жүктөмү 8%) даярдалган. ACSтин ферменттик гидролизи Cellic® Ctec2 10 мг белок/г глюкан (алдын ала иштетилген биомассада), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг белок/г глюкан жана Multifect Pectinase (Genencor Inc, АКШ) камтыган коммерциялык ферменттик аралашманы колдонуу менен жүргүзүлдү. Ферменттик гидролиз 3 литр жумушчу көлөмү, рН 4,8, 50°C жана 250 айн/мин болгон 5 литрлик биореактордо жүргүзүлдү. 96 саат бою гидролизден кийин, гидролизат гидролизденбеген катуу заттарды алып салуу үчүн 6000 айн/мин ылдамдыкта 30 мүнөт, андан кийин 14000 айн/мин ылдамдыкта 30 мүнөт центрифугалоо жолу менен чогултулган. Андан кийин гидролизат 0,22 мм чыпкалоочу стакан аркылуу стерилдүү чыпкалоодон өткөрүлгөн. Чыпкаланган гидролизат стерилдүү бөтөлкөлөрдө 4°C температурада сакталып, андан кийин көмүртек менен фракцияланган.
NREL лабораториялык анализ жол-жоболоруна ылайык экстракт негизиндеги биомасса үлгүлөрүнүн курамын талдоо: курамдык анализ үчүн үлгүлөрдү даярдоо (NREL/TP-510-42620) жана биомассадагы структуралык углеводдорду жана лигнинди аныктоо (NREL/TP-510 – 42618)47.
Гидролизат агымынын олигосахариддик анализи автоклав негизиндеги кислота гидролиз ыкмасын колдонуу менен 2 мл масштабда жүргүзүлдү. Гидролизат үлгүсүн 10 мл бурама капкактуу культуралык түтүккө 69,7 мкл 72% күкүрт кислотасы менен аралаштырып, 121 °C температурада стол үстүндө 1 саат инкубациялап, музда муздатып, жогорку натыйжалуу суюк хроматография (HPLC) флаконуна чыпкалаңыз. Олигосахариддердин концентрациясы кислота-гидролизделген үлгүдөгү жалпы кант концентрациясынан гидролизденбеген үлгүдөгү моносахариддердин концентрациясын кемитүү менен аныкталган.
Кислота гидролизденген биомассадагы глюкозанын, ксилозанын жана арабинозанын концентрациясы Bio-Rad Aminex HPX-87H колонкасындагы автосамплер, колонка жылыткычы, изократиялык насос жана сынуу көрсөткүчүнүн детектору менен жабдылган Shimadzu HPLC системасы аркылуу талданды. Колонна 50°C температурада кармалып, 0,6 мл/мин 5 мМ H2SO4 суу агымы менен элюцияланды.
Гидролизаттын үстүнкү катмары суюлтулуп, мономердин жана олигосахариддин курамына талданган. Ферментативдик гидролизден кийин алынган мономердик канттар Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P колонкасы жана күл коргоочу колонкасы менен жабдылган HPLC аркылуу талданган. Колоннанын температурасы 80°C температурада кармалып, суу 0,6 мл/мин агым ылдамдыгы менен кыймылдуу фаза катары колдонулган. Олигосахариддер 41, 48, 49 шилтемелеринде сүрөттөлгөн ыкмаларга ылайык 121°C температурада суюлтулган кислотада гидролиз аркылуу аныкталган.
Сахарид анализи чийки, AFEX алдын ала иштетилген жана гидролизденбеген бардык биомасса калдыктарында (сериялык клетка дубалынын экстракттарын өндүрүүнү жана алардын mAb скринингин кошо алганда) мурда сүрөттөлгөн 27, 43, 50, 51 процедураларын колдонуу менен жүргүзүлдү. Гликом анализи үчүн өсүмдүк клетка дубалынын материалынын спиртте эрибеген калдыктары биомасса калдыктарынан даярдалып, мурда сүрөттөлгөндөй, аммоний оксалат (50 мМ), натрий карбонаты (50 мМ жана 0,5% w/v), CON (1M жана 4M, экөө тең 1% w/v натрий борогидриди менен) жана кислота хлорити сыяктуу барган сайын агрессивдүү реагенттер менен сериялык экстракцияга дуушар болот52,53. Андан кийин экстракттар клетка дубалынын гликанына багытталган mAb50s комплекстүү панелине каршы ELISAга дуушар болду жана mAb байланыш реакциялары жылуулук картасы катары көрсөтүлдү. Өсүмдүктүн клетка дубалынын гликанына багытталган mAbs лабораториялык запастардан сатылып алынды (CCRC, JIM жана MAC сериялары).
Олигосахариддерди бир баскычтуу биотинилдөө. Углеводдорду биотин-LC-гидразид менен конъюгациялоо төмөнкү процедураны колдонуу менен жүргүзүлдү. Биотин-LC-гидразид (4,6 мг/12 мкмоль) диметилсульфоксидде (DMSO, 70 мкл) катуу аралаштыруу жана 65°C температурада 1 мүнөт ысытуу менен эритилген. Муз уксус кислотасы (30 мкл) кошулуп, аралашма натрий цианоборогидридине (6,4 мг/100 мкмоль) куюлуп, 65°C температурада болжол менен 1 мүнөт ысыткандан кийин толугу менен эриген. Андан кийин, калыбына келтирүүчү учунан этикетканын 10 эсе же андан көп молярдык ашыкчасын алуу үчүн кургатылган олигосахаридге (1-100 нмоль) реакция аралашмасынын 5тен 8 мклге чейинкиси кошулган. Реакция 65°C температурада 2 саат бою жүргүзүлгөн, андан кийин үлгүлөр дароо тазаланган. Маркировкалоо эксперименттеринде калыбына келтирилбестен натрий цианоборогидриди колдонулган эмес, ал эми үлгүлөр 65°C температурада 2,5 саат бою реакцияга киргизилген.
Биотинделген олигосахариддердин үлгүлөрүн ELISA менен каптоо жана жуу. Авидин менен капталган пластинанын ар бир кудугуна 25 мкл биотинделген үлгүлөр (ар бир концентрацияланган үлгүдөн 100 мкл 0,1 М Трис буфердик эритмесинин (TBS) 5 мл суюлтулган) кошулган. Контролдук кудуктар 0,1 М TBSде 10 мкг/мл концентрациясында 50 мкл биотин менен капталган. Бош өлчөөлөр үчүн каптоо катары деиондоштурулган суу колдонулган. Таблетка бөлмө температурасында караңгыда 2 саат инкубацияланган. Grenier flat 3A үчүн 11-программаны колдонуп, пластинаны 0,1 М TBSде 0,1% майсыздандырылган сүт менен 3 жолу жууңуз.
Негизги антителолорду кошуу жана жуу. Ар бир кудукка 40 мкл баштапкы антитело кошуңуз. Микропластинаны бөлмө температурасында караңгыда 1 саат инкубациялаңыз. Андан кийин плиталар Grenier Flat 3A үчүн 11-жуу программасын колдонуп, 0,1% сүт менен 0,1 мл TBSде 3 жолу жуулган.
Экинчилик антителону кошуп, жууп салыңыз. Ар бир кудукка 50 мкл чычкан/келемиш экинчилик антителосун (0,1% сүттө 0,1 M TBSде 1:5000 суюлтулган) кошуңуз. Микропластинаны бөлмө температурасында караңгыда 1 саат инкубациялаңыз. Андан кийин микропластиналар Grenier Flat 5A пластина жуугуч #12 программасын колдонуп, 0,1% сүт менен 0,1 M TBSде 5 жолу жуулган.
Субстрат кошуу. Негизги субстратка 50 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB) кошуңуз (15 мл деиондоштурулган сууга 2 тамчы буфер, 3 тамчы TMB, 2 тамчы суутек перекисин кошуу менен). TMB субстратын даярдаңыз. Колдонуудан мурун аралаштырыңыз). Микропластинканы бөлмө температурасында 30 мүнөт инкубациялаңыз. Караңгыда.
Кадамды аягына чыгарып, планшетти окуп чыгыңыз. Ар бир кудукка 50 мкл 1 Н күкүрт кислотасын кошуп, ELISA окугучун колдонуп, 450дөн 655 нмге чейинки абсорбцияны жазып алыңыз.
Бул аналиттердин 1 мг/мл эритмелерин деиондоштурулган сууда даярдаңыз: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактурон кислотасы (GalA), глюкурон кислотасы (GlcA), манноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманнозамин (manNAc), N-ацетилглюкозамин. (glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (ички стандарт). 1-таблицада көрсөтүлгөн 1 мг/мл кант эритмелерин кошуу менен эки стандарт даярдалган. Үлгүлөр -80°C температурада бардык суу алынып салынганга чейин (адатта 12-18 сааттай) тоңдурулуп, лиофилизацияланат.
Аналитикалык таразадагы капкак түтүкчөлөрүнө 100–500 мкг үлгү кошуңуз. Кошулган көлөмдү жазып алыңыз. Үлгүнү белгилүү бир концентрациядагы эриткичте эритип, аны түтүккө суюктук катары кошкон жакшы. Ар бир үлгү түтүкчөсү үчүн ички эталон катары 20 мкл 1 мг/мл инозитол колдонуңуз. Үлгүгө кошулган ички эталондун көлөмү стандарттык түтүккө кошулган ички эталондун көлөмүнө барабар болушу керек.
Бурама капкактуу флаконго 8 мл суусуз метанолду кошуңуз. Андан кийин 4 мл 3 Н метанолдук HCl эритмесин кошуп, капкагын жаап, чайкаңыз. Бул процессте суу колдонулбайт.
Олигосахарид үлгүлөрүнө жана стандарттуу TMS түтүктөрүнө 500 мкл 1 М HCl метанол эритмесин кошуңуз. Үлгүлөр 80°C температурада түнү бою (168 саат) термикалык блокто инкубацияланган. Метанолиз продуктусун бөлмө температурасында кургатуучу коллекторду колдонуп кургатыңыз. 200 мкл MeOH кошуп, кайра кургатыңыз. Бул процесс эки жолу кайталанат. Үлгүгө 200 мкл метанол, 100 мкл пиридин жана 100 мкл уксус ангидридин кошуп, жакшылап аралаштырыңыз. Үлгүлөрдү бөлмө температурасында 30 мүнөт инкубациялаңыз. жана кургатыңыз. 200 мкл метанол кошуп, кайра кургатыңыз.
200 мкл Tri-Sil кошуп, капкагы жабылган түтүктү 20 мүнөт ысытыңыз. 80°C, андан кийин бөлмө температурасына чейин муздатыңыз. Үлгүнү болжол менен 50 мкл көлөмгө чейин кургатуу үчүн кургатуучу коллекторду колдонуңуз. Белгилей кетүүчү нерсе, биз үлгүлөрдүн толугу менен кургашына жол берген жокпуз.
2 мл гексан кошуп, жакшылап аралаштырыңыз. Пастер пипеткаларынын (5-8 мм) учтарын айнек жүндү диаметри 5-3/4 дюйм болгон пипетканын үстүнө коюу менен айнек жүндүн бир бөлүгү менен толтуруңуз. Үлгүлөр 3000 г ылдамдыкта 2 мүнөт центрифугаланган. Эрибеген калдыктар чөкмөгө түшөт. Үлгүнү 100-150 мклге чейин кургатыңыз. GC-MSке болжол менен 1 мкл көлөмдөгү көлөм 80 °C баштапкы температурада жана баштапкы 2,0 мүнөт убакытта куюлган (2-таблица).