Terima kasih kerana melawat Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan menjadikan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Kaedah imunologi dan spektrometri jisim baharu untuk analisis kompleks oligosakarida berterusan dalam tungku jagung yang dirawat dengan AFEX.Biojisim lignoselulosa ialah alternatif yang mampan kepada bahan api fosil dan digunakan secara meluas untuk membangunkan bioteknologi untuk pengeluaran produk seperti makanan, makanan, bahan api dan bahan kimia.Kunci kepada teknologi ini ialah pembangunan proses kompetitif kos untuk menukar karbohidrat kompleks yang terdapat dalam dinding sel tumbuhan kepada gula ringkas seperti glukosa, xilosa dan arabinosa.Oleh kerana biojisim lignoselulosa sangat degil, ia mesti tertakluk kepada rawatan termokimia (cth, pengelupasan gentian ammonia (AFEX), asid cair (DA), cecair ionik (IL)) dan rawatan biologi (cth, hidrolisis enzimatik dan penapaian mikrob) dalam kombinasi untuk mendapatkan produk yang diingini..Walau bagaimanapun, apabila enzim kulat komersial digunakan dalam proses hidrolisis, hanya 75-85% daripada gula larut yang terbentuk adalah monosakarida, dan baki 15-25% adalah oligosakarida mudah larut, yang tidak selalu tersedia untuk mikroorganisma.Sebelum ini, kami telah berjaya mengasingkan dan menulenkan oligosakarida degil terlarut menggunakan gabungan karbon dan pemisahan bumi diatom dan kromatografi pengecualian saiz, dan juga menyiasat sifat perencatan enzim mereka.Kami telah mendapati bahawa oligosakarida yang mengandungi tahap pempolimeran (DP) penggantian asid uronik metilasi yang lebih tinggi adalah lebih sukar untuk diproses dengan campuran enzim komersial daripada DP rendah dan oligosakarida neutral.Di sini kami melaporkan penggunaan beberapa kaedah tambahan, termasuk pemprofilan glycan menggunakan antibodi monoklonal (mAbs) khusus untuk tumbuhan glycans biojisim untuk mencirikan ikatan glycan dalam dinding sel tumbuhan dan hidrolisat enzimatik, pengionan desorpsi laser berbantukan matriks, spektrometri jisim masa penerbangan..MALDI-TOF-MS) menggunakan puncak diagnostik bermaklumat struktur yang diperoleh melalui spektroskopi selepas pereputan sekunder ion negatif, kromatografi gas dan spektrometri jisim (GC-MS) untuk mencirikan ikatan oligosakarida dengan dan tanpa terbitan.Oleh kerana saiz oligosakarida yang kecil (DP 4–20), molekul ini sukar digunakan untuk pengikatan dan pencirian mAb.Untuk mengatasi masalah ini, kami menggunakan kaedah imobilisasi oligosakarida berasaskan konjugasi biotin baharu yang berjaya melabelkan majoriti oligosakarida larut DP rendah pada permukaan mikroplat, yang kemudiannya digunakan dalam sistem mAb throughput tinggi untuk analisis ligation tertentu.Kaedah baharu ini akan memudahkan pembangunan ujian glikome throughput tinggi yang lebih maju pada masa hadapan yang boleh digunakan untuk mengasingkan dan mencirikan oligosakarida yang terdapat dalam biomarker untuk tujuan diagnostik.
Biojisim lignoselulosa, terdiri daripada bahan pertanian, perhutanan, rumput dan kayu, merupakan bahan mentah yang berpotensi untuk pengeluaran produk berasaskan bio, termasuk makanan, makanan, bahan api dan prekursor kimia untuk menghasilkan produk bernilai lebih tinggi1.Karbohidrat (seperti selulosa dan hemiselulosa) yang terdapat dalam dinding sel tumbuhan didepolimerkan kepada monosakarida melalui pemprosesan kimia dan biotransformasi (seperti hidrolisis enzimatik dan penapaian mikrob).Pra-rawatan biasa termasuk pengembangan gentian ammonia (AFEX), asid cair (DA), cecair ionik (IL), dan letupan wap (SE), yang menggunakan gabungan bahan kimia dan haba untuk mengurangkan pengeluaran lignoselulosa dengan membuka dinding sel tumbuhan3,4.kedegilan bahan, 5. Hidrolisis enzimatik dijalankan pada beban pepejal yang tinggi menggunakan enzim yang mengandungi karbohidrat aktif komersial (CAZymes) dan penapaian mikrob menggunakan yis atau bakteria transgenik untuk menghasilkan bahan api dan bahan kimia berasaskan bio 6 .
CAZymes dalam enzim komersial terdiri daripada campuran kompleks enzim yang secara sinergistik membelah ikatan karbohidrat-gula kompleks untuk membentuk monosakarida2,7.Seperti yang kami laporkan sebelum ini, rangkaian kompleks polimer aromatik lignin dengan karbohidrat menjadikannya sangat sukar dikawal, yang membawa kepada penukaran gula yang tidak lengkap, mengumpul 15-25% oligosakarida seks yang tidak dihasilkan semasa hidrolisis enzimatik biojisim yang telah dirawat.Ini adalah masalah biasa dengan pelbagai kaedah prarawatan biojisim.Beberapa sebab untuk kesesakan ini termasuk perencatan enzim semasa hidrolisis, atau ketiadaan atau tahap rendah enzim penting penting yang diperlukan untuk memecahkan ikatan gula dalam biojisim tumbuhan.Memahami komposisi dan ciri-ciri struktur gula, seperti ikatan gula dalam oligosakarida, akan membantu kami meningkatkan penukaran gula semasa hidrolisis, menjadikan proses bioteknologi bersaing kos dengan produk terbitan petroleum.
Penentuan struktur karbohidrat adalah mencabar dan memerlukan gabungan kaedah seperti kromatografi cecair (LC)11,12, spektroskopi resonans magnetik nuklear (NMR)13, elektroforesis kapilari (CE)14,15,16 dan spektrometri jisim (MS)17.,lapan belas.Kaedah MS seperti spektrometri jisim masa penerbangan dengan desorpsi laser dan pengionan menggunakan matriks (MALDI-TOF-MS) ialah kaedah serba boleh untuk mengenal pasti struktur karbohidrat.Baru-baru ini, Perlanggaran-Induced Dissociation (CID) tandem MS bahan tambah ion natrium telah digunakan secara meluas untuk mengenal pasti cap jari yang sepadan dengan kedudukan lampiran oligosakarida, konfigurasi anomerik, jujukan dan kedudukan cawangan 20, 21 .
Analisis Glycan ialah alat yang sangat baik untuk mengenal pasti ikatan karbohidrat yang mendalam22.Kaedah ini menggunakan antibodi monoklonal (mAbs) yang diarahkan untuk menanam glycan dinding sel sebagai probe untuk memahami hubungan karbohidrat kompleks.Lebih daripada 250 mAbs tersedia di seluruh dunia, direka terhadap pelbagai oligosakarida linear dan bercabang menggunakan pelbagai sakarida24.Beberapa mAb telah digunakan secara meluas untuk mencirikan struktur, komposisi, dan pengubahsuaian dinding sel tumbuhan, kerana terdapat perbezaan yang ketara bergantung pada jenis sel tumbuhan, organ, umur, peringkat perkembangan, dan persekitaran pertumbuhan25,26.Baru-baru ini, kaedah ini telah digunakan untuk memahami populasi vesikel dalam sistem tumbuhan dan haiwan dan peranan masing-masing dalam pengangkutan glycan seperti yang ditentukan oleh penanda subselular, peringkat perkembangan, atau rangsangan persekitaran, dan untuk menentukan aktiviti enzimatik.Beberapa struktur berbeza glycans dan xylans yang telah dikenal pasti termasuk pektin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), glucan ikatan campuran (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG) , asid glucuronic-arabinoxylan (GArbXga2) dan arabinoxylan (GArbX.29).
Walau bagaimanapun, di sebalik semua usaha penyelidikan ini, hanya beberapa kajian yang memberi tumpuan kepada sifat pengumpulan oligosakarida semasa hidrolisis beban pepejal tinggi (HSL), termasuk pelepasan oligosakarida, perubahan panjang rantai oligomerik semasa hidrolisis, pelbagai polimer DP rendah dan lengkungnya.pengagihan 30,31,32.Sementara itu, walaupun analisis glycan telah terbukti sebagai alat yang berguna untuk analisis komprehensif struktur glycan, adalah sukar untuk menilai oligosakarida DP rendah larut air menggunakan kaedah antibodi.Oligosakarida DP yang lebih kecil dengan berat molekul kurang daripada 5-10 kDa tidak terikat pada plat ELISA 33, 34 dan dihanyutkan sebelum penambahan antibodi.
Di sini, buat pertama kalinya, kami menunjukkan ujian ELISA pada plat bersalut avidin menggunakan antibodi monoklonal, menggabungkan prosedur biotinilasi satu langkah untuk oligosakarida refraktori larut dengan analisis glikome.Pendekatan kami terhadap analisis glikom telah disahkan oleh analisis berasaskan MALDI-TOF-MS dan GC-MS bagi kaitan oligosakarida pelengkap menggunakan derivatisasi trimetilsilil (TMS) bagi komposisi gula terhidrolisis.Pendekatan inovatif ini boleh dibangunkan sebagai kaedah pemprosesan tinggi pada masa hadapan dan mencari aplikasi yang lebih luas dalam penyelidikan bioperubatan35.
Pengubahsuaian selepas translasi enzim dan antibodi, seperti glikosilasi,36 menjejaskan aktiviti biologinya.Sebagai contoh, perubahan dalam glikosilasi protein serum memainkan peranan penting dalam artritis radang, dan perubahan dalam glikosilasi digunakan sebagai penanda diagnostik37.Pelbagai glycans telah dilaporkan dalam literatur untuk mudah muncul dalam pelbagai penyakit, termasuk penyakit radang kronik saluran gastrousus dan hati, jangkitan virus, ovari, payudara, dan kanser prostat38,39,40.Memahami struktur glycans menggunakan kaedah glycan ELISA berasaskan antibodi akan memberikan keyakinan tambahan dalam diagnosis penyakit tanpa menggunakan kaedah MS yang kompleks.
Kajian terdahulu kami menunjukkan bahawa oligosakarida yang degil kekal tidak terhidrolisis selepas prarawatan dan hidrolisis enzimatik (Rajah 1).Dalam kerja kami yang diterbitkan sebelum ini, kami telah membangunkan kaedah pengekstrakan fasa pepejal arang aktif untuk mengasingkan oligosakarida daripada hidrolisis stover jagung (ACSH)8 yang dirawat sebelum dirawat AFEX.Selepas pengekstrakan dan pemisahan awal, oligosakarida dipecahkan lagi oleh kromatografi pengecualian saiz (SEC) dan dikumpulkan mengikut susunan berat molekul.Monomer gula dan oligomer yang dikeluarkan daripada pelbagai prarawatan telah dianalisis dengan analisis komposisi gula.Apabila membandingkan kandungan oligomer gula yang diperolehi melalui pelbagai kaedah prarawatan, kehadiran oligosakarida degil adalah masalah biasa dalam penukaran biojisim kepada monosakarida dan boleh menyebabkan pengurangan hasil gula sekurang-kurangnya 10-15% malah sehingga 18%.AS.Kaedah ini digunakan untuk pengeluaran pecahan oligosakarida berskala besar lagi.ACH yang terhasil dan pecahan seterusnya dengan berat molekul yang berbeza digunakan sebagai bahan eksperimen untuk pencirian oligosakarida dalam kerja ini.
Selepas prarawatan dan hidrolisis enzimatik, oligosakarida berterusan kekal tidak terhidrolisis.Di sini (A) ialah kaedah pengasingan oligosakarida di mana oligosakarida diasingkan daripada AFEX-pretreat corn stover hydrolyzate (ACSH) menggunakan lapisan karbon teraktif dan tanah diatom yang telah dipek;(B) Kaedah untuk pengasingan oligosakarida.Oligosakarida dipisahkan lagi dengan kromatografi pengecualian saiz (SEC);(C) Monomer sakarida dan oligomer yang dibebaskan daripada pelbagai prarawatan (asid cair: DA, cecair ionik: IL dan AFEX).Keadaan hidrolisis enzimatik: pemuatan pepejal yang tinggi sebanyak 25% (b/b) (kira-kira 8% pemuatan glukan), 96 jam hidrolisis, 20 mg/g pemuatan enzim komersial (nisbah Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) dan ( D) Monomer gula dan oligomer glukosa, xilosa dan arabinosa yang dibebaskan daripada AFEX presttreated AFEX).
Analisis Glycan telah terbukti sebagai alat yang berguna untuk analisis struktur menyeluruh glycans dalam ekstrak yang diasingkan daripada sisa biojisim pepejal.Walau bagaimanapun, sakarida larut air kurang diwakili menggunakan kaedah tradisional ini41 kerana oligosakarida berat molekul rendah sukar untuk tidak bergerak pada plat ELISA dan dibasuh sebelum penambahan antibodi.Oleh itu, untuk pengikatan dan pencirian antibodi, kaedah biotinilasi satu langkah telah digunakan untuk menyalut oligosakarida yang larut dan tidak patuh pada plat ELISA bersalut avidin.Kaedah ini telah diuji menggunakan ACSH kami yang dihasilkan sebelum ini dan pecahan berdasarkan berat molekulnya (atau tahap pempolimeran, DP).Biotinilasi satu langkah telah digunakan untuk meningkatkan pertalian mengikat oligosakarida dengan menambahkan biotin-LC-hidrazida pada hujung pengurangan karbohidrat (Rajah 2).Dalam larutan, kumpulan hemiacetal pada hujung pengurangan bertindak balas dengan kumpulan hidrazida biotin-LC-hidrazida untuk membentuk ikatan hidrazon.Dengan kehadiran agen pengurangan NaCNBH3, ikatan hidrazon dikurangkan kepada produk akhir terbiotinilasi yang stabil.Dengan pengubahsuaian akhir pengurangan gula, pengikatan oligosakarida DP rendah ke plat ELISA menjadi mungkin, dan dalam kajian kami ini dilakukan pada plat bersalut avidin menggunakan mAbs sasaran glycan.
Pemeriksaan antibodi monoklonal berdasarkan ELISA untuk oligosakarida terbiotinilasi.Di sini (A) gabungan biotinilasi oligosakarida dan pemeriksaan ELISA seterusnya dengan mAbs sasaran glycan pada plat bersalut NeutrAvidin dan (B) menunjukkan prosedur satu langkah untuk biotinilasi produk tindak balas.
Plat bersalut Avidin dengan antibodi terkonjugasi oligosakarida kemudian ditambah kepada antibodi primer dan sekunder dan dibasuh dalam medium sensitif cahaya dan masa.Selepas pengikatan antibodi selesai, tambah substrat TMB untuk mengeram plat.Tindak balas akhirnya dihentikan dengan asid sulfurik.Plat yang diinkubasi dianalisis menggunakan pembaca ELISA untuk menentukan kekuatan mengikat setiap antibodi untuk mengesan pautan silang khusus antibodi.Untuk butiran dan parameter percubaan, lihat bahagian "Bahan dan Kaedah" yang sepadan.
Kami menunjukkan kegunaan kaedah yang baru dibangunkan ini untuk aplikasi khusus dengan mencirikan oligosakarida larut yang terdapat dalam ACSH serta dalam pecahan oligosakarida mentah dan tulen yang diasingkan daripada hidrolisat lignoselulosa.Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, xylan yang digantikan epitope yang paling biasa dikenal pasti dalam ACSH menggunakan kaedah ujian glikome bioasilasi biasanya ialah uronik (U) atau metiluronik (MeU) dan arabinogalaktan pektik.Kebanyakannya juga ditemui dalam kajian terdahulu kami mengenai analisis glycans pepejal tidak terhidrolisis (UHS)43.
Pengesanan epitop oligosakarida yang keras menggunakan antibodi monoklonal yang diarahkan ke glycan dinding sel.Pecahan "neutral" ialah pecahan ACN dan pecahan "asid" ialah pecahan FA.Warna merah yang lebih terang pada peta haba menunjukkan kandungan epitop yang lebih tinggi, dan warna biru yang lebih cerah menunjukkan latar belakang kosong.Nilai warna pada skala adalah berdasarkan nilai OD mentah untuk formulasi N=2.Epitop utama yang dikenali oleh antibodi ditunjukkan di sebelah kanan.
Struktur bukan selulosa ini tidak boleh dibelah oleh selulase dan hemiselulasi yang paling biasa dalam campuran enzim komersial yang diuji, yang termasuk enzim komersial yang paling biasa digunakan.Oleh itu, enzim tambahan baru diperlukan untuk hidrolisisnya.Tanpa enzim aksesori bukan selulosa yang diperlukan, ikatan bukan selulosa ini menghalang penukaran lengkap kepada monosakarida, walaupun polimer gula induknya dihidrolisiskan secara meluas kepada serpihan yang lebih pendek dan dibubarkan menggunakan campuran enzim komersial.
Kajian lanjut mengenai pengedaran isyarat dan kekuatan ikatannya menunjukkan bahawa epitop pengikat adalah lebih rendah dalam pecahan gula DP tinggi (A, B, C, DP sehingga 20+) berbanding pecahan DP rendah (D, E, F, DP) dalam dimer) (Rajah 1).Serpihan asid lebih biasa dalam epitop bukan selulosa daripada serpihan neutral.Fenomena ini konsisten dengan corak yang diperhatikan dalam kajian terdahulu kami, di mana DP tinggi dan bahagian asid lebih tahan terhadap hidrolisis enzimatik.Oleh itu, kehadiran epitop glikan bukan selulosa dan penggantian U dan MeU boleh menyumbang kepada kestabilan oligosakarida.Perlu diingatkan bahawa kecekapan pengikatan dan pengesanan boleh menjadi masalah untuk oligosakarida DP rendah, terutamanya jika epitope adalah oligosakarida dimerik atau trimerik.Ini boleh diuji menggunakan oligosakarida komersial dengan panjang yang berbeza, setiap satu mengandungi hanya satu epitope yang mengikat kepada mAb tertentu.
Oleh itu, penggunaan antibodi khusus struktur mendedahkan jenis ikatan keras yang tertentu.Bergantung pada jenis antibodi yang digunakan, corak pengikatan yang sesuai, dan kekuatan isyarat yang dihasilkannya (paling banyak dan paling sedikit banyak), enzim baharu boleh dikenal pasti dan ditambah secara separuh kuantitatif kepada campuran enzim untuk penukaran gliko yang lebih lengkap.Mengambil analisis oligosakarida ACSH sebagai contoh, kita boleh mencipta pangkalan data ikatan glycan untuk setiap bahan biojisim.Perlu diingatkan di sini bahawa pertalian antibodi yang berbeza harus diambil kira, dan jika pertalian mereka tidak diketahui, ini akan mewujudkan kesukaran tertentu apabila membandingkan isyarat antibodi yang berbeza.Selain itu, perbandingan ikatan glycan mungkin berfungsi paling baik antara sampel untuk antibodi yang sama.Ikatan degil ini kemudiannya boleh dikaitkan dengan pangkalan data CAZyme, dari mana kita boleh mengenal pasti enzim, memilih enzim calon dan menguji enzim pemecah ikatan, atau membangunkan sistem mikrob untuk mengekspresikan enzim ini untuk digunakan dalam kilang penapisan bio44.
Untuk menilai bagaimana kaedah imunologi melengkapkan kaedah alternatif untuk mencirikan oligosakarida berat molekul rendah yang terdapat dalam hidrolisat lignoselulosa, kami melakukan MALDI (Rajah 4, S1-S8) dan analisis sakarida terbitan TMS berdasarkan GC-MS pada panel yang sama (Rajah 5) bahagian oligosakarida.MALDI digunakan untuk membandingkan sama ada taburan jisim molekul oligosakarida sepadan dengan struktur yang dimaksudkan.Pada rajah.4 menunjukkan MS komponen neutral ACN-A dan ACN-B.Analisis ACN-A mengesahkan julat gula pentosa antara DP 4–8 (Rajah 4) hingga DP 22 (Rajah S1), yang beratnya sepadan dengan oligosakarida MeU-xylan.Analisis ACN-B mengesahkan siri pentosa dan glukoksilan dengan DP 8-15.Dalam bahan tambahan seperti Rajah S3, peta taburan jisim bahagian berasid FA-C menunjukkan julat gula pentosa digantikan (Me)U dengan DP 8-15 yang konsisten dengan xylan digantikan yang terdapat dalam saringan mAb berasaskan ELISA.Epitop adalah konsisten.
Spektrum MALDI-MS bagi oligosakarida tidak patuh larut yang terdapat dalam ACS.Di sini, (A) pecahan julat berat rendah ACN-A yang mengandungi asid uronik metilasi (DP 4-8) menggantikan oligosakarida glukuroksilan dan (B) xylan ACN-B dan oligosakarida asid uronik metilasi digantikan dengan glucuroxylan (DP 8-15).
Analisis komposisi sisa glycan oligosakarida refraktori.Di sini (A) komposisi sakarida TMS pelbagai pecahan oligosakarida yang diperoleh menggunakan analisis GC-MS.(B) Struktur pelbagai gula yang berasal dari TMS yang terdapat dalam oligosakarida.ACN – pecahan asetonitril yang mengandungi oligosakarida neutral dan FA – pecahan asid ferulik yang mengandungi oligosakarida asid.
Satu lagi kesimpulan yang menarik telah dibuat daripada analisis LC-MS bagi pecahan oligosakarida, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah S9 (kaedah boleh dilihat dalam bahan tambahan elektronik).Serpihan kumpulan heksosa dan -OAc berulang kali diperhatikan semasa pengikatan pecahan ACN-B.Dapatan ini bukan sahaja mengesahkan pemecahan yang diperhatikan dalam analisis glikome dan MALDI-TOF, tetapi juga menyediakan maklumat baharu tentang potensi derivatif karbohidrat dalam biojisim lignoselulosa yang telah dirawat sebelum ini.
Kami juga melakukan analisis komposisi glycan bagi pecahan oligosakarida menggunakan derivatisasi glycan TMS.Menggunakan GC-MS, kami menentukan komposisi gula saraf (bukan derivatif) dan berasid (GluA dan GalA) dalam pecahan oligosakarida (Rajah 5).Asid glukuronik terdapat dalam komponen berasid C dan D, manakala asid galakturonik terdapat dalam komponen berasid A dan B, kedua-duanya adalah komponen DP tinggi gula berasid.Keputusan ini bukan sahaja mengesahkan data ELISA dan MALDI kami, tetapi juga konsisten dengan kajian terdahulu kami tentang pengumpulan oligosakarida.Oleh itu, kami percaya bahawa kaedah imunologi moden menggunakan biotinilasi oligosakarida dan pemeriksaan ELISA berikutnya adalah mencukupi untuk mengesan oligosakarida recalcitrant larut dalam pelbagai sampel biologi.
Memandangkan kaedah saringan mAb berasaskan ELISA telah disahkan oleh beberapa kaedah yang berbeza, kami ingin meneroka lebih lanjut potensi kaedah kuantitatif baharu ini.Dua oligosakarida komersial, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) dan 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), telah dibeli dan diuji menggunakan pendekatan mAb baharu yang menyasarkan glycan dinding sel.Rajah 6 menunjukkan korelasi linear antara isyarat pengikat biotinilasi dan kepekatan log kepekatan oligosakarida, mencadangkan model penjerapan Langmuir yang mungkin.Antara mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 dan CCRC-M151 berkorelasi dengan XHE, dan CCRC-M108, CCRC-M109 dan LM11 berkorelasi dengan A2XX dalam julat 1 nm hingga 100 nano.Oleh kerana ketersediaan antibodi yang terhad semasa eksperimen, eksperimen terhad dilakukan dengan setiap kepekatan oligosakarida.Perlu diingatkan di sini bahawa sesetengah antibodi bertindak balas dengan sangat berbeza kepada oligosakarida yang sama sebagai substrat, mungkin kerana ia mengikat epitop yang sedikit berbeza dan boleh mempunyai pertalian pengikatan yang sangat berbeza.Mekanisme dan implikasi pengenalpastian epitope yang tepat akan menjadi lebih kompleks apabila pendekatan mAb baharu digunakan pada sampel sebenar.
Dua oligosakarida komersial telah digunakan untuk menentukan julat pengesanan pelbagai mAb yang menyasarkan glycan.Di sini, korelasi linear dengan kepekatan log kepekatan oligosakarida menunjukkan corak penjerapan Langmuir untuk (A) XHE dengan mAb dan (B) A2XX dengan mAb.Epitop yang sepadan menunjukkan struktur oligosakarida komersial yang digunakan sebagai substrat dalam ujian.
Penggunaan antibodi monoklonal sasaran glycan (analisis glikomik atau saringan mAb berasaskan ELISA) ialah alat yang berkuasa untuk pencirian mendalam bagi kebanyakan glycan dinding sel utama yang membentuk biojisim tumbuhan.Walau bagaimanapun, analisis glycan klasik hanya mencirikan glycan dinding sel yang lebih besar, kerana kebanyakan oligosakarida tidak dialihkan dengan cekap pada plat ELISA.Dalam kajian ini, stover jagung prarawatan AFEX telah dihidrolisiskan secara enzimatik pada kandungan pepejal yang tinggi.Analisis gula digunakan untuk menentukan komposisi karbohidrat dinding sel recalcitrant dalam hidrolisat.Walau bagaimanapun, analisis mAb bagi oligosakarida yang lebih kecil dalam hidrolisat adalah dipandang remeh, dan alat tambahan diperlukan untuk melumpuhkan oligosakarida secara berkesan pada plat ELISA.
Kami melaporkan di sini kaedah imobilisasi oligosakarida yang baru dan cekap untuk pemeriksaan mAb dengan menggabungkan biotinilasi oligosakarida diikuti dengan pemeriksaan ELISA pada plat bersalut NeutrAvidin™.Oligosakarida terbiotinilasi yang tidak bergerak menunjukkan pertalian yang mencukupi untuk antibodi untuk membolehkan pengesanan cepat dan cekap oligosakarida keras.Analisis komposisi oligosakarida degil ini berdasarkan spektrometri jisim mengesahkan keputusan pendekatan baru ini untuk pemeriksaan imun.Oleh itu, kajian ini menunjukkan bahawa gabungan biotinilasi oligosakarida dan pemeriksaan ELISA dengan antibodi monoklonal sasaran glycan boleh digunakan untuk mengesan pautan silang dalam oligosakarida dan boleh digunakan secara meluas dalam kajian biokimia lain yang mencirikan struktur oligosakarida.
Kaedah pemprofilan glycan berasaskan biotin ini merupakan laporan pertama yang mampu menyiasat ikatan karbohidrat yang keras bagi oligosakarida larut dalam biojisim tumbuhan.Ini membantu untuk memahami mengapa sesetengah bahagian biojisim sangat degil apabila ia berkaitan dengan pengeluaran biofuel.Kaedah ini mengisi jurang penting dalam kaedah analisis glikom dan memanjangkan penggunaannya kepada julat substrat yang lebih luas di luar oligosakarida tumbuhan.Pada masa hadapan, kami mungkin menggunakan robotik untuk biotinilasi dan menggunakan kaedah yang telah kami bangunkan untuk analisis sampel berkeupayaan tinggi menggunakan ELISA.
Jerami jagung (CS) yang ditanam daripada benih hibrid Pioneer 33A14 telah dituai pada tahun 2010 dari Ladang Kramer di Ray, Colorado.Dengan kebenaran pemilik tanah, biojisim ini boleh digunakan untuk penyelidikan. Sampel disimpan kering < 6% kelembapan dalam beg berzip kunci dalam suhu bilik. Sampel disimpan kering < 6% kelembapan dalam beg berzip kunci dalam suhu bilik. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Sampel disimpan kering pada kelembapan <6% dalam beg berzip pada suhu bilik.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Sampel disimpan dalam beg zip pada suhu bilik dengan kelembapan < 6%.Kajian ini mematuhi garis panduan tempatan dan nasional.Analisis komposisi dilakukan menggunakan protokol NREL.Komposisi tersebut didapati mengandungi 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galaktan, 2.2% asetil, 14.3% lignin, 1.7% protein dan 13. 4% abu.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) ialah campuran kompleks selulase, β-glucosidase dan Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) daripada Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), gabungan kompleks enzim merendahkan pektin, telah disumbangkan oleh DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Kepekatan protein enzim ditentukan dengan menganggarkan kandungan protein (dan menolak sumbangan nitrogen bukan protein) menggunakan analisis nitrogen Kjeldahl (kaedah AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Bumi diatom 545 telah dibeli daripada EMD Millipore (Billerica, MA).Karbon teraktif (DARCO, butir 100 mesh), Avicel (PH-101), xylan beech, dan semua bahan kimia lain telah dibeli daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Prarawatan AFEX telah dilakukan di GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Pra-rawatan telah dijalankan pada 140° C. selama 15 minit.46 masa tinggal pada nisbah 1:1 ammonia kontang kepada biojisim pada 60% (b/b) dimuatkan dalam reaktor kelompok atas bangku keluli tahan karat (Parr Instruments Company).Ia mengambil masa 30 minit.Reaktor telah dibawa ke 140°C dan ammonia dibebaskan dengan cepat, membolehkan biojisim kembali dengan cepat ke suhu bilik.Komposisi AFEX pra-rawatan jagung stover (ACS) adalah serupa dengan yang tidak dirawat jagung stover (UT-CS).
Pepejal tinggi ACSH 25% (b/b) (kira-kira 8% pemuatan dextran) telah disediakan sebagai bahan permulaan untuk pengeluaran oligosakarida berskala besar.Hidrolisis enzimatik ACS dilakukan menggunakan campuran enzim komersial termasuk Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (dalam biojisim prarawatan), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan, dan Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg protein/g dekstran.Hidrolisis enzimatik telah dijalankan dalam bioreaktor 5 liter dengan isipadu kerja 3 liter, pH 4.8, 50°C dan 250 rpm.Selepas hidrolisis selama 96 jam, hidrolisis dikumpulkan secara sentrifugasi pada 6000 rpm selama 30 minit dan kemudian pada 14000 rpm selama 30 minit untuk mengeluarkan pepejal yang tidak terhidrolisis.Hidrolisat kemudiannya tertakluk kepada penapisan steril melalui bikar penapis 0.22 mm.Hidrolisat yang ditapis disimpan dalam botol steril pada suhu 4° C. dan kemudian difraksinasi pada karbon.
Analisis komposisi sampel biojisim berasaskan ekstrak mengikut prosedur analisis makmal NREL: penyediaan sampel untuk analisis komposisi (NREL/TP-510-42620) dan penentuan karbohidrat struktur dan lignin dalam biojisim (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analisis oligosakarida aliran hidrolisat dilakukan pada skala 2 ml menggunakan kaedah hidrolisis asid berasaskan autoklaf.Campurkan sampel hidrolisis dengan 69.7 µl asid sulfurik 72% dalam tiub kultur penutup skru 10 ml dan eramkan selama 1 jam di atas meja pada suhu 121 °C, sejukkan di atas ais dan tapis ke dalam botol kromatografi cecair prestasi tinggi (HPLC).Kepekatan oligosakarida ditentukan dengan menolak kepekatan monosakarida dalam sampel tidak terhidrolisis daripada jumlah kepekatan gula dalam sampel terhidrolisis asid.
Kepekatan glukosa, xilosa, dan arabinosa dalam biojisim terhidrolisis asid telah dianalisis menggunakan sistem HPLC Shimadzu yang dilengkapi dengan autosampler, pemanas lajur, pam isokratik, dan pengesan indeks biasan pada lajur Bio-Rad Aminex HPX-87H.Lajur dikekalkan pada 50°C dan dicairkan dengan 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 dalam air.aliran.
Supernatan hidrolisat telah dicairkan dan dianalisis untuk kandungan monomer dan oligosakarida.Gula monomerik yang diperoleh selepas hidrolisis enzimatik dianalisis oleh HPLC yang dilengkapi dengan lajur Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P dan lajur pelindung abu.Suhu lajur dikekalkan pada 80°C, air digunakan sebagai fasa bergerak dengan kadar alir 0.6 ml/min.Oligosakarida ditentukan oleh hidrolisis dalam asid cair pada 121 ° C mengikut kaedah yang diterangkan dalam rujukan.41, 48, 49.
Analisis sakarida dilakukan pada mentah, pra-rawatan AFEX dan semua sisa biojisim tidak terhidrolisis (termasuk pengeluaran ekstrak dinding sel bersiri dan saringan mAbnya) menggunakan prosedur yang diterangkan sebelumnya 27, 43, 50, 51 .Untuk analisis glikome, sisa tidak larut alkohol bahan dinding sel tumbuhan disediakan daripada sisa biojisim dan tertakluk kepada pengekstrakan bersiri dengan reagen yang semakin agresif seperti ammonium oksalat (50 mM), natrium karbonat (50 mM dan 0.5% w/v), CON.(1M dan 4M, kedua-duanya dengan 1% w/v natrium borohidrida) dan asid klorit seperti yang diterangkan sebelum ini52,53.Ekstrak kemudiannya tertakluk kepada ELISA terhadap panel kompleks mAb50s yang diarahkan ke glycan dinding sel, dan tindak balas pengikatan mAb dibentangkan sebagai peta haba.mAbs menyasarkan glycan dinding sel tumbuhan telah dibeli daripada stok makmal (siri CCRC, JIM dan MAC).
Biotinilasi satu langkah oligosakarida.Konjugasi karbohidrat dengan biotin-LC-hydrazide dilakukan menggunakan prosedur berikut.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) telah dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO, 70 μl) dengan mengacau dan memanaskan kuat pada 65° C. selama 1 minit.Asid asetik glasier (30 µl) telah ditambah dan campuran itu dituangkan ke atas natrium cyanoborohidrida (6.4 mg/100 µmol) dan dibubarkan sepenuhnya selepas dipanaskan pada 65° C. selama kira-kira 1 minit.Kemudian, daripada 5 hingga 8 μl campuran tindak balas telah ditambah kepada oligosakarida kering (1-100 nmol) untuk mendapatkan lebihan molar 10 kali ganda atau lebih pada label di atas hujung pengurangan.Tindak balas telah dijalankan pada 65 ° C selama 2 jam, selepas itu sampel telah disucikan dengan serta-merta.Tiada natrium sianoborohidrida digunakan dalam eksperimen pelabelan tanpa pengurangan, dan sampel telah bertindak balas pada 65° C. selama 2.5 jam.
Salutan ELISA dan pencucian sampel oligosakarida terbiotinilasi.25 μl sampel terbiotinilasi (100 μl setiap sampel pekat yang dicairkan dalam 5 ml larutan penimbal Tris (TBS) 0.1 M) telah ditambah pada setiap telaga plat bersalut avidin.Telaga kawalan disalut dengan 50 μl biotin pada kepekatan 10 μg/ml dalam 0.1 M TBS.Air ternyahion digunakan sebagai salutan untuk pengukuran kosong.Tablet diinkubasi selama 2 jam pada suhu bilik dalam gelap.Basuh pinggan 3 kali dengan susu skim 0.1% dalam 0.1 M TBS menggunakan program no.11 untuk Grenier flat 3A.
Penambahan dan pencucian antibodi primer.Tambahkan 40 µl antibodi primer pada setiap sumur.Inkubasi mikroplate selama 1 jam pada suhu bilik dalam gelap.Pinggan kemudian dibasuh 3 kali dengan susu 0.1% dalam 0.1M TBS menggunakan program cucian #11 untuk Grenier Flat 3A.
Tambah antibodi sekunder dan basuh.Tambah 50 µl antibodi sekunder tikus/tikus (dicairkan 1:5000 dalam susu 0.1% dalam 0.1 M TBS) ke setiap telaga.Inkubasi mikroplate selama 1 jam pada suhu bilik dalam gelap.Plat mikro kemudiannya dibasuh 5 kali dengan susu 0.1% dalam 0.1 M TBS menggunakan program pencuci pinggan Grenier Flat 5A #12.
Menambah substrat.Tambah 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ke substrat asas (dengan menambahkan 2 titis penimbal, 3 titis TMB, 2 titis hidrogen peroksida kepada 15 ml air ternyahion).Sediakan substrat TMB.dan pusaran sebelum digunakan).Inkubasi mikroplat pada suhu bilik selama 30 minit.Dalam gelap.
Lengkapkan langkah dan baca tablet.Tambah 50 µl asid sulfurik 1 N ke setiap telaga dan rekod penyerapan dari 450 hingga 655 nm menggunakan pembaca ELISA.
Sediakan 1 mg/ml larutan analit ini dalam air ternyahion: arabinosa, rhamnose, fukosa, xylose, asid galakturonik (GalA), asid glukuronik (GlcA), mannose, glukosa, galaktosa, laktosa, N-acetylmannosamine (manNAc), N-asetilglukosamin .(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (standard dalaman).Dua piawai telah disediakan dengan menambah 1 mg/mL larutan gula yang ditunjukkan dalam Jadual 1. Sampel dibekukan dan diliofilkan pada -80° C. sehingga semua air dikeluarkan (biasanya kira-kira 12-18 jam).
Tambah 100–500 µg sampel ke tiub penutup skru pada neraca analitik.Catatkan jumlah yang ditambah.Adalah lebih baik untuk melarutkan sampel dalam kepekatan tertentu pelarut dan menambahnya ke dalam tiub sebagai aliquot cecair.Gunakan 20 µl 1 mg/ml inositol sebagai piawai dalaman untuk setiap tiub sampel.Jumlah piawai dalaman yang ditambahkan pada sampel mestilah sama dengan jumlah piawai dalaman yang ditambahkan pada tiub piawai.
Tambah 8 ml metanol kontang ke dalam botol penutup skru.Kemudian 4 ml larutan HCl 3 N. metanol, ditutup dan digoncang.Proses ini tidak menggunakan air.
Tambah 500 µl larutan metanol HCl 1 M ke dalam sampel oligosakarida dan tiub TMS standard.Sampel diinkubasi semalaman (168 jam) pada 80° C. dalam blok haba.Keringkan produk metanolisis pada suhu bilik menggunakan manifold pengeringan.Tambah 200 µl MeOH dan keringkan semula.Proses ini diulang dua kali.Tambah 200 µl metanol, 100 µl piridin dan 100 µl anhidrida asetik ke dalam sampel dan gaul rata.Inkubasi sampel pada suhu bilik selama 30 minit.dan dikeringkan.Tambah 200 µl metanol dan keringkan semula.
Tambah 200 µl Tri-Sil dan tiub bertutup panas selama 20 minit.80°C, kemudian disejukkan ke suhu bilik.Gunakan manifold pengeringan untuk mengeringkan lagi sampel kepada isipadu kira-kira 50 µl.Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa kami tidak membenarkan sampel kering sepenuhnya.
Tambah 2 ml heksana dan gaul rata dengan vorteks.Isi hujung pipet Pasteur (5-8 mm) dengan sekeping bulu kaca dengan memasukkan bulu kaca di atas pipet berdiameter 5-3/4 inci.Sampel telah disentrifugasi pada 3000 g selama 2 minit.Sebarang sisa yang tidak larut dimendakkan.Keringkan sampel hingga 100-150 µl.Isipadu kira-kira 1 μl disuntik ke dalam GC-MS pada suhu awal 80 ° C dan masa awal 2.0 minit (Jadual 2).