Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau melumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Kaedah imunologi dan spektrometri jisim baharu untuk analisis kompleks oligosakarida berterusan dalam jagung yang dirawat terlebih dahulu dengan AFEX. Biojisim lignoselulosa merupakan alternatif mampan kepada bahan api fosil dan digunakan secara meluas untuk membangunkan bioteknologi bagi pengeluaran produk seperti makanan, makanan ternakan, bahan api dan bahan kimia. Kunci kepada teknologi ini ialah pembangunan proses yang kompetitif kos untuk menukar karbohidrat kompleks yang terdapat dalam dinding sel tumbuhan kepada gula ringkas seperti glukosa, xilosa dan arabinosa. Oleh kerana biojisim lignoselulosa sangat degil, ia mesti tertakluk kepada rawatan termokimia (contohnya, pengelupasan gentian ammonia (AFEX), asid cair (DA), cecair ionik (IL)) dan rawatan biologi (contohnya, hidrolisis enzimatik dan penapaian mikrob) secara gabungan untuk mendapatkan produk yang diingini. Walau bagaimanapun, apabila enzim kulat komersial digunakan dalam proses hidrolisis, hanya 75-85% daripada gula larut yang terbentuk adalah monosakarida, dan baki 15-25% adalah oligosakarida larut dan sukar diuraikan, yang tidak selalu tersedia untuk mikroorganisma. Sebelum ini, kami telah berjaya mengasingkan dan menulenkan oligosakarida degil larut menggunakan gabungan kromatografi pemisahan dan pengecualian saiz karbon dan tanah diatom, dan juga mengkaji sifat perencatan enzimnya. Kami mendapati bahawa oligosakarida yang mengandungi penggantian asid uronik termetilasi tahap pempolimeran (DP) yang lebih tinggi adalah lebih sukar untuk diproses dengan campuran enzim komersial berbanding oligosakarida DP rendah dan neutral. Di sini kami melaporkan penggunaan beberapa kaedah tambahan, termasuk profil glikan menggunakan antibodi monoklonal (mAb) khusus untuk glikan biojisim tumbuhan untuk mencirikan ikatan glikan dalam dinding sel tumbuhan dan hidrolisat enzimatik, pengionan desorpsi laser berbantukan matriks, spektrometri jisim masa penerbangan. . MALDI-TOF-MS) menggunakan puncak diagnostik bermaklumat struktur yang diperoleh melalui spektroskopi selepas pereputan sekunder ion negatif, kromatografi gas dan spektrometri jisim (GC-MS) untuk mencirikan ikatan oligosakarida dengan dan tanpa derivatisasi. Disebabkan saiz oligosakarida yang kecil (DP 4–20), molekul-molekul ini sukar digunakan untuk pengikatan dan pencirian mAb. Untuk mengatasi masalah ini, kami menggunakan kaedah imobilisasi oligosakarida berasaskan konjugasi biotin baharu yang berjaya melabelkan sebahagian besar oligosakarida larut DP rendah pada permukaan mikroplat, yang kemudiannya digunakan dalam sistem mAb daya pemprosesan tinggi untuk analisis ligasi khusus. Kaedah baharu ini akan memudahkan pembangunan ujian glikom daya pemprosesan tinggi yang lebih maju pada masa hadapan yang boleh digunakan untuk mengasingkan dan mencirikan oligosakarida yang terdapat dalam biomarker untuk tujuan diagnostik.
Biojisim lignoselulosa, yang terdiri daripada bahan pertanian, perhutanan, rumput dan berkayu, merupakan bahan mentah yang berpotensi untuk pengeluaran produk berasaskan bio, termasuk makanan, makanan ternakan, bahan api dan prekursor kimia untuk menghasilkan produk bernilai lebih tinggi1. Karbohidrat (seperti selulosa dan hemiselulosa) yang terdapat dalam dinding sel tumbuhan dinyahpolimerkan menjadi monosakarida melalui pemprosesan kimia dan biotransformasi (seperti hidrolisis enzimatik dan penapaian mikrob). Pra-rawatan biasa termasuk pengembangan gentian ammonia (AFEX), asid cair (DA), cecair ionik (IL), dan letupan stim (SE), yang menggunakan gabungan bahan kimia dan haba untuk mengurangkan pengeluaran lignoselulosa dengan membuka dinding sel tumbuhan3,4. kedegilan jirim, 5. Hidrolisis enzimatik dijalankan pada beban pepejal yang tinggi menggunakan enzim yang mengandungi karbohidrat aktif komersial (CAZymes) dan penapaian mikrob menggunakan yis atau bakteria transgenik untuk menghasilkan bahan api dan bahan kimia berasaskan bio6.
CAZim dalam enzim komersial terdiri daripada campuran enzim kompleks yang secara sinergis memutuskan ikatan karbohidrat-gula kompleks untuk membentuk monosakarida2,7. Seperti yang kami laporkan sebelum ini, rangkaian kompleks polimer aromatik lignin dengan karbohidrat menjadikannya sangat sukar diatasi, yang membawa kepada penukaran gula yang tidak lengkap, mengumpul 15-25% oligosakarida seks yang tidak dihasilkan semasa hidrolisis enzimatik biojisim yang telah dirawat terlebih dahulu. Ini adalah masalah biasa dengan pelbagai kaedah rawatan awal biojisim. Beberapa sebab untuk kesesakan ini termasuk perencatan enzim semasa hidrolisis, atau ketiadaan atau tahap rendah enzim penting yang diperlukan untuk memutuskan ikatan gula dalam biojisim tumbuhan. Memahami komposisi dan ciri-ciri struktur gula, seperti ikatan gula dalam oligosakarida, akan membantu kita meningkatkan penukaran gula semasa hidrolisis, menjadikan proses bioteknologi berdaya saing kos dengan produk yang diperoleh daripada petroleum.
Menentukan struktur karbohidrat adalah mencabar dan memerlukan gabungan kaedah seperti kromatografi cecair (LC)11,12, spektroskopi resonans magnetik nuklear (NMR)13, elektroforesis kapilari (CE)14,15,16 dan spektrometri jisim (MS)17. ,lapan belas. Kaedah MS seperti spektrometri jisim masa penerbangan dengan penyahjerapan laser dan pengionan menggunakan matriks (MALDI-TOF-MS) adalah kaedah serba boleh untuk mengenal pasti struktur karbohidrat. Baru-baru ini, MS tandem Disosiasi Tersebab Perlanggaran (CID) bagi adukt ion natrium telah digunakan secara meluas untuk mengenal pasti cap jari yang sepadan dengan kedudukan pelekatan oligosakarida, konfigurasi anomerik, jujukan dan kedudukan percabangan 20, 21.
Analisis glikan merupakan alat yang sangat baik untuk pengenalpastian ikatan karbohidrat secara mendalam22. Kaedah ini menggunakan antibodi monoklonal (mAb) yang ditujukan kepada glikan dinding sel tumbuhan sebagai prob untuk memahami ikatan karbohidrat kompleks. Lebih daripada 250 mAb tersedia di seluruh dunia, direka bentuk terhadap pelbagai oligosakarida linear dan bercabang menggunakan pelbagai sakarida24. Beberapa mAb telah digunakan secara meluas untuk mencirikan struktur, komposisi dan pengubahsuaian dinding sel tumbuhan, kerana terdapat perbezaan yang ketara bergantung pada jenis sel tumbuhan, organ, umur, peringkat perkembangan dan persekitaran pertumbuhan25,26. Baru-baru ini, kaedah ini telah digunakan untuk memahami populasi vesikel dalam sistem tumbuhan dan haiwan dan peranan masing-masing dalam pengangkutan glikan seperti yang ditentukan oleh penanda subselular, peringkat perkembangan atau rangsangan persekitaran dan untuk menentukan aktiviti enzimatik. Beberapa struktur glikan dan xilan berbeza yang telah dikenal pasti termasuk pektin (P), xilan (X), mannan (M), xiloglukan (XylG), glukan ikatan campuran (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomanan (GalG), asid glukuronik-arabinoksilan (GArbX) dan arabino-galaktan (ArbG)29.
Walau bagaimanapun, meskipun terdapat semua usaha penyelidikan ini, hanya beberapa kajian yang menumpukan pada sifat pengumpulan oligosakarida semasa hidrolisis beban pepejal tinggi (HSL), termasuk pembebasan oligosakarida, perubahan panjang rantai oligomerik semasa hidrolisis, pelbagai polimer DP rendah, dan lengkungnya. taburan 30,31,32. Sementara itu, walaupun analisis glikan telah terbukti menjadi alat yang berguna untuk analisis komprehensif struktur glikan, adalah sukar untuk menilai oligosakarida DP rendah larut air menggunakan kaedah antibodi. Oligosakarida DP yang lebih kecil dengan berat molekul kurang daripada 5-10 kDa tidak terikat pada plat ELISA 33, 34 dan dihanyutkan sebelum penambahan antibodi.
Di sini, buat pertama kalinya, kami menunjukkan ujian ELISA pada plat bersalut avidin menggunakan antibodi monoklonal, menggabungkan prosedur biotinilasi satu langkah untuk oligosakarida refraktori larut dengan analisis glikom. Pendekatan kami terhadap analisis glikom telah disahkan oleh analisis berasaskan MALDI-TOF-MS dan GC-MS bagi ikatan oligosakarida pelengkap menggunakan derivatisasi trimetilsilil (TMS) bagi komposisi gula terhidrolisis. Pendekatan inovatif ini boleh dibangunkan sebagai kaedah daya pemprosesan tinggi pada masa hadapan dan menemui aplikasi yang lebih luas dalam penyelidikan bioperubatan35.
Pengubahsuaian pasca-translasi enzim dan antibodi, seperti glikosilasi,36 mempengaruhi aktiviti biologi mereka. Contohnya, perubahan dalam glikosilasi protein serum memainkan peranan penting dalam artritis radang, dan perubahan dalam glikosilasi digunakan sebagai penanda diagnostik37. Pelbagai glikan telah dilaporkan dalam kesusasteraan mudah muncul dalam pelbagai penyakit, termasuk penyakit radang kronik saluran gastrousus dan hati, jangkitan virus, kanser ovari, payudara dan prostat38,39,40. Memahami struktur glikan menggunakan kaedah ELISA glikan berasaskan antibodi akan memberikan keyakinan tambahan dalam diagnosis penyakit tanpa menggunakan kaedah MS yang kompleks.
Kajian kami sebelum ini menunjukkan bahawa oligosakarida degil kekal tidak terhidrolisis selepas prarawatan dan hidrolisis enzimatik (Rajah 1). Dalam kajian kami yang diterbitkan sebelum ini, kami membangunkan kaedah pengekstrakan fasa pepejal arang teraktif untuk mengasingkan oligosakarida daripada hidrolisat jagung yang telah dirawat AFEX (ACSH)8. Selepas pengekstrakan dan pemisahan awal, oligosakarida dipecahkan lagi melalui kromatografi pengecualian saiz (SEC) dan dikumpulkan mengikut susunan berat molekul. Monomer dan oligomer gula yang dibebaskan daripada pelbagai prarawatan dianalisis melalui analisis komposisi gula. Apabila membandingkan kandungan oligomer gula yang diperoleh melalui pelbagai kaedah prarawatan, kehadiran oligosakarida degil merupakan masalah biasa dalam penukaran biojisim kepada monosakarida dan boleh menyebabkan pengurangan hasil gula sekurang-kurangnya 10-15% dan sehingga 18%. AS. Kaedah ini digunakan untuk penghasilan pecahan oligosakarida berskala besar selanjutnya. ACH yang terhasil dan pecahan berikutnya dengan berat molekul yang berbeza telah digunakan sebagai bahan eksperimen untuk pencirian oligosakarida dalam kajian ini.
Selepas prarawatan dan hidrolisis enzimatik, oligosakarida yang berterusan kekal tidak terhidrolisis. Di sini (A) ialah kaedah pemisahan oligosakarida di mana oligosakarida diasingkan daripada hidrolisat jagung yang telah dirawat AFEX (ACSH) menggunakan lapisan karbon teraktif dan tanah diatom yang dibungkus; (B) Kaedah untuk pemisahan oligosakarida. Oligosakarida dipisahkan selanjutnya melalui kromatografi pengecualian saiz (SEC); (C) Monomer dan oligomer sakarida yang dibebaskan daripada pelbagai prarawatan (asid cair: DA, cecair ionik: IL dan AFEX). Keadaan hidrolisis enzimatik: pemuatan pepejal tinggi sebanyak 25% (b/b) (kira-kira 8% pemuatan glukan), hidrolisis 96 jam, pemuatan enzim komersial 20 mg/g (nisbah Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) dan (D) Monomer dan oligomer gula glukosa, xilosa dan arabinosa yang dibebaskan daripada jagung yang telah dirawat AFEX (ACS).
Analisis glikan telah terbukti menjadi alat yang berguna untuk analisis struktur glikan yang komprehensif dalam ekstrak yang diasingkan daripada sisa biojisim pepejal. Walau bagaimanapun, sakarida larut air kurang diwakili menggunakan kaedah tradisional ini41 kerana oligosakarida berat molekul rendah sukar untuk dilumpuhkan pada plat ELISA dan dihanyutkan sebelum penambahan antibodi. Oleh itu, untuk pengikatan dan pencirian antibodi, kaedah biotinilasi satu langkah telah digunakan untuk menyalut oligosakarida larut dan tidak patuh pada plat ELISA bersalut avidin. Kaedah ini telah diuji menggunakan ACSH yang dihasilkan sebelum ini dan pecahan berdasarkan berat molekulnya (atau darjah pempolimeran, DP). Biotinilasi satu langkah telah digunakan untuk meningkatkan afiniti pengikatan oligosakarida dengan menambahkan biotin-LC-hidrazida pada hujung pengurangan karbohidrat (Rajah 2). Dalam larutan, kumpulan hemiasetal pada hujung pengurangan bertindak balas dengan kumpulan hidrazida biotin-LC-hidrazida untuk membentuk ikatan hidrazon. Dengan kehadiran agen penurunan NaCNBH3, ikatan hidrazon dikurangkan kepada produk akhir biotinilasi yang stabil. Dengan pengubahsuaian hujung penurunan gula, pengikatan oligosakarida DP rendah pada plat ELISA menjadi mungkin, dan dalam kajian kami, ini dilakukan pada plat bersalut avidin menggunakan mAb yang disasarkan glikan.
Penyaringan antibodi monoklonal berdasarkan ELISA untuk oligosakarida biotinilasi. Di sini (A) gabungan biotinilasi oligosakarida dan penyaringan ELISA berikutnya dengan mAb sasaran glikan pada plat bersalut NeutrAvidin dan (B) menunjukkan prosedur satu langkah untuk biotinilasi produk tindak balas.
Plat bersalut Avidin dengan antibodi konjugasi oligosakarida kemudiannya ditambah kepada antibodi primer dan sekunder dan dibasuh dalam medium sensitif cahaya dan masa. Selepas pengikatan antibodi selesai, tambahkan substrat TMB untuk mengeram plat. Tindak balas akhirnya dihentikan dengan asid sulfurik. Plat yang diinkubasi dianalisis menggunakan pembaca ELISA untuk menentukan kekuatan pengikatan setiap antibodi bagi mengesan ikatan silang khusus antibodi. Untuk butiran dan parameter eksperimen, lihat bahagian yang sepadan "Bahan dan Kaedah".
Kami menunjukkan kegunaan kaedah yang baru dibangunkan ini untuk aplikasi khusus dengan mencirikan oligosakarida larut yang terdapat dalam ACSH serta dalam pecahan oligosakarida mentah dan tulen yang diasingkan daripada hidrolisat lignoselulosa. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, xilan yang digantikan epitop yang paling biasa dikenal pasti dalam ACSH menggunakan kaedah ujian glikom bioasilasi biasanya uronik (U) atau metiluronik (MeU) dan arabinogalactan pektik. Kebanyakannya juga ditemui dalam kajian kami sebelum ini mengenai analisis glikan pepejal tidak terhidrolisis (UHS)43.
Pengesanan epitop oligosakarida dekalsitran menggunakan antibodi monoklonal yang ditujukan kepada glikan dinding sel. Pecahan "neutral" ialah pecahan ACN dan pecahan "berasid" ialah pecahan FA. Warna merah yang lebih terang pada peta haba menunjukkan kandungan epitop yang lebih tinggi, dan warna biru yang lebih terang menunjukkan latar belakang kosong. Nilai warna pada skala adalah berdasarkan nilai OD mentah untuk formulasi N=2. Epitop utama yang dikenali oleh antibodi ditunjukkan di sebelah kanan.
Struktur bukan selulosa ini tidak dapat dipecahkan oleh selulase dan hemiselulase yang paling biasa dalam campuran enzim komersial yang diuji, yang merangkumi enzim komersial yang paling biasa digunakan. Oleh itu, enzim tambahan baharu diperlukan untuk hidrolisisnya. Tanpa enzim aksesori bukan selulosa yang diperlukan, ikatan bukan selulosa ini menghalang penukaran lengkap kepada monosakarida, walaupun polimer gula induknya dihidrolisiskan secara meluas menjadi serpihan yang lebih pendek dan dilarutkan menggunakan campuran enzim komersial.
Kajian lanjut tentang taburan isyarat dan kekuatan pengikatannya menunjukkan bahawa epitop pengikatan adalah lebih rendah dalam pecahan gula DP tinggi (A, B, C, DP sehingga 20+) berbanding pecahan DP rendah (D, E, F, DP) dalam dimer) (Rajah 1). Serpihan asid lebih biasa dalam epitop bukan selulosa berbanding serpihan neutral. Fenomena ini selaras dengan corak yang diperhatikan dalam kajian kami sebelum ini, di mana DP tinggi dan bahagian asid lebih tahan terhadap hidrolisis enzimatik. Oleh itu, kehadiran epitop glikan bukan selulosa dan penggantian U dan MeU boleh menyumbang dengan ketara kepada kestabilan oligosakarida. Perlu diingatkan bahawa kecekapan pengikatan dan pengesanan boleh menjadi masalah untuk oligosakarida DP rendah, terutamanya jika epitop tersebut adalah oligosakarida dimerik atau trimerik. Ini boleh diuji menggunakan oligosakarida komersial dengan panjang yang berbeza, setiap satunya hanya mengandungi satu epitop yang mengikat pada mAb tertentu.
Oleh itu, penggunaan antibodi khusus struktur mendedahkan jenis ikatan dekalsitran tertentu. Bergantung pada jenis antibodi yang digunakan, corak ligasi yang sesuai, dan kekuatan isyarat yang dihasilkannya (paling banyak dan paling sedikit), enzim baharu boleh dikenal pasti dan ditambah secara separa kuantitatif kepada campuran enzim untuk glikokonversi yang lebih lengkap. Dengan mengambil analisis oligosakarida ACSH sebagai contoh, kita boleh mencipta pangkalan data ikatan glikan untuk setiap bahan biojisim. Perlu diingatkan di sini bahawa afiniti antibodi yang berbeza harus diambil kira, dan jika afiniti mereka tidak diketahui, ini akan mewujudkan kesukaran tertentu apabila membandingkan isyarat antibodi yang berbeza. Di samping itu, perbandingan ikatan glikan mungkin berfungsi dengan baik antara sampel untuk antibodi yang sama. Ikatan degil ini kemudiannya boleh dikaitkan dengan pangkalan data CAZyme, yang mana kita boleh mengenal pasti enzim, memilih enzim calon dan menguji enzim pemecah ikatan, atau membangunkan sistem mikrob untuk mengekspresikan enzim ini untuk digunakan dalam biorefineri44.
Untuk menilai bagaimana kaedah imunologi melengkapi kaedah alternatif bagi mencirikan oligosakarida berat molekul rendah yang terdapat dalam hidrolisat lignoselulosa, kami menjalankan MALDI (Rajah 4, S1-S8) dan analisis sakarida terbitan TMS berdasarkan GC-MS pada bahagian oligosakarida panel yang sama (Rajah 5). MALDI digunakan untuk membandingkan sama ada taburan jisim molekul oligosakarida sepadan dengan struktur yang dimaksudkan. Pada rajah 4 menunjukkan MS komponen neutral ACN-A dan ACN-B. Analisis ACN-A mengesahkan pelbagai gula pentosa antara DP 4–8 (Rajah 4) hingga DP 22 (Rajah S1), yang beratnya sepadan dengan oligosakarida MeU-xilan. Analisis ACN-B mengesahkan siri pentosa dan glukoksilan dengan DP 8-15. Dalam bahan tambahan seperti Rajah S3, peta taburan jisim bahagian berasid FA-C menunjukkan julat gula pentosa tersubstitusi (Me)U dengan DP 8-15 yang konsisten dengan xilan tersubstitusi yang terdapat dalam saringan mAb berasaskan ELISA. Epitop adalah konsisten.
Spektrum MALDI-MS bagi oligosakarida tidak patuh larut yang terdapat dalam ACS. Di sini, (A) pecahan julat berat rendah ACN-A yang mengandungi oligosakarida glukuroksilan tersubstitusi asid uronik termetilasi (DP 4-8) dan (B) oligosakarida ACN-B xilan dan asid uronik termetilasi yang digantikan dengan glukuroksilan (DP 8-15).
Analisis komposisi residu glikan oligosakarida refraktori. Di sini (A) Komposisi sakarida TMS bagi pelbagai pecahan oligosakarida yang diperoleh menggunakan analisis GC-MS. (B) Struktur pelbagai gula terbitan TMS yang terdapat dalam oligosakarida. ACN – pecahan asetonitril yang mengandungi oligosakarida neutral dan FA – pecahan asid ferulik yang mengandungi oligosakarida asid.
Satu lagi kesimpulan menarik telah dibuat daripada analisis LC-MS bagi pecahan oligosakarida, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah S9 (kaedah boleh dilihat dalam bahan tambahan elektronik). Serpihan kumpulan heksosa dan -OAc telah diperhatikan berulang kali semasa ligasi pecahan ACN-B. Penemuan ini bukan sahaja mengesahkan pemecahan yang diperhatikan dalam analisis glikom dan MALDI-TOF, tetapi juga memberikan maklumat baharu tentang potensi derivatif karbohidrat dalam biojisim lignoselulosa yang telah dirawat terlebih dahulu.
Kami juga menjalankan analisis komposisi glikan bagi pecahan oligosakarida menggunakan derivatisasi glikan TMS. Menggunakan GC-MS, kami menentukan komposisi gula saraf (bukan terbitan) dan berasid (GluA dan GalA) dalam pecahan oligosakarida (Rajah 5). Asid glukuronik terdapat dalam komponen berasid C dan D, manakala asid galakturonik terdapat dalam komponen berasid A dan B, kedua-duanya merupakan komponen DP tinggi bagi gula berasid. Keputusan ini bukan sahaja mengesahkan data ELISA dan MALDI kami, tetapi juga konsisten dengan kajian pengumpulan oligosakarida kami sebelum ini. Oleh itu, kami percaya bahawa kaedah imunologi moden yang menggunakan biotinilasi oligosakarida dan saringan ELISA berikutnya adalah mencukupi untuk mengesan oligosakarida rekalsitran larut dalam pelbagai sampel biologi.
Oleh kerana kaedah penyaringan mAb berasaskan ELISA telah disahkan oleh beberapa kaedah yang berbeza, kami ingin meneroka lebih lanjut potensi kaedah kuantitatif baharu ini. Dua oligosakarida komersial, oligosakarida xylohexacharide (XHE) dan 23-α-L-arabinofuranosil-xylotriosa (A2XX), telah dibeli dan diuji menggunakan pendekatan mAb baharu yang menyasarkan glikan dinding sel. Rajah 6 menunjukkan korelasi linear antara isyarat pengikatan biotinilasi dan kepekatan log kepekatan oligosakarida, yang menunjukkan kemungkinan model penjerapan Langmuir. Antara mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, dan CCRC-M151 berkorelasi dengan XHE, dan CCRC-M108, CCRC-M109, dan LM11 berkorelasi dengan A2XX dalam julat 1 nm hingga 100 nano. Disebabkan ketersediaan antibodi yang terhad semasa eksperimen, eksperimen terhad telah dijalankan dengan setiap kepekatan oligosakarida. Perlu dinyatakan di sini bahawa sesetengah antibodi bertindak balas dengan sangat berbeza terhadap oligosakarida yang sama sebagai substrat, mungkin kerana ia mengikat epitop yang sedikit berbeza dan boleh mempunyai afiniti pengikatan yang sangat berbeza. Mekanisme dan implikasi pengenalpastian epitop yang tepat akan menjadi jauh lebih kompleks apabila pendekatan mAb baharu digunakan pada sampel sebenar.
Dua oligosakarida komersial telah digunakan untuk menentukan julat pengesanan pelbagai mAb penargetan glikan. Di sini, korelasi linear dengan kepekatan log kepekatan oligosakarida menunjukkan corak penjerapan Langmuir untuk (A) XHE dengan mAb dan (B) A2XX dengan mAb. Epitop yang sepadan menunjukkan struktur oligosakarida komersial yang digunakan sebagai substrat dalam ujian.
Penggunaan antibodi monoklonal yang disasarkan glikan (analisis glikokomik atau saringan mAb berasaskan ELISA) merupakan alat yang ampuh untuk pencirian mendalam kebanyakan glikan dinding sel utama yang membentuk biojisim tumbuhan. Walau bagaimanapun, analisis glikan klasik hanya mencirikan glikan dinding sel yang lebih besar, kerana kebanyakan oligosakarida tidak diimobilisasi dengan cekap pada plat ELISA. Dalam kajian ini, jagung yang dirawat terlebih dahulu dengan AFEX telah dihidrolisis secara enzimatik pada kandungan pepejal yang tinggi. Analisis gula digunakan untuk menentukan komposisi karbohidrat dinding sel yang degil dalam hidrolisat. Walau bagaimanapun, analisis mAb bagi oligosakarida yang lebih kecil dalam hidrolisat dipandang rendah, dan alat tambahan diperlukan untuk melumpuhkan oligosakarida secara berkesan pada plat ELISA.
Kami melaporkan di sini kaedah imobilisasi oligosakarida yang baharu dan cekap untuk saringan mAb dengan menggabungkan biotinilasi oligosakarida diikuti dengan saringan ELISA pada plat bersalut NeutrAvidin™. Oligosakarida biotinilasi yang diimobilisasi menunjukkan afiniti yang mencukupi untuk antibodi bagi membolehkan pengesanan oligosakarida degil yang cepat dan cekap. Analisis komposisi oligosakarida degil ini berdasarkan spektrometri jisim mengesahkan keputusan pendekatan baharu ini terhadap imunosaringan. Oleh itu, kajian ini menunjukkan bahawa gabungan biotinilasi oligosakarida dan saringan ELISA dengan antibodi monoklonal yang disasarkan glikan boleh digunakan untuk mengesan ikatan silang dalam oligosakarida dan boleh digunakan secara meluas dalam kajian biokimia lain yang mencirikan struktur oligosakarida.
Kaedah pemprofilan glikan berasaskan biotin ini merupakan laporan pertama yang mampu menyiasat ikatan karbohidrat degil bagi oligosakarida larut dalam biojisim tumbuhan. Ini membantu memahami mengapa sesetengah bahagian biojisim begitu degil apabila melibatkan pengeluaran biobahan api. Kaedah ini mengisi jurang penting dalam kaedah analisis glikom dan memperluaskan aplikasinya kepada pelbagai substrat yang lebih luas melangkaui oligosakarida tumbuhan. Pada masa hadapan, kami mungkin menggunakan robotik untuk biotinilasi dan menggunakan kaedah yang telah kami bangunkan untuk analisis daya pemprosesan tinggi sampel menggunakan ELISA.
Jerami jagung (CS) yang ditanam daripada biji benih hibrid Pioneer 33A14 telah dituai pada tahun 2010 dari Kramer Farms di Ray, Colorado. Dengan kebenaran pemilik tanah, biojisim ini boleh digunakan untuk penyelidikan. Sampel disimpan kering pada kelembapan < 6% dalam beg zip-lock pada suhu bilik. Sampel disimpan kering pada kelembapan < 6% dalam beg zip-lock pada suhu bilik. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Sampel disimpan kering pada kelembapan <6% dalam beg berzip pada suhu bilik.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Sampel disimpan dalam beg zip pada suhu bilik dengan kelembapan < 6%.Kajian ini mematuhi garis panduan tempatan dan kebangsaan. Analisis komposisi telah dijalankan menggunakan protokol NREL. Komposisi tersebut didapati mengandungi 31.4% glukan, 18.7% xilan, 3.3% arabinan, 1.2% galaktan, 2.2% asetil, 14.3% lignin, 1.7% protein dan 13.4% abu.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) ialah campuran kompleks selulase, β-glukosidase dan Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) daripada Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), campuran kompleks enzim penguraian pektin, telah didermakan oleh DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Kepekatan protein enzim ditentukan dengan menganggarkan kandungan protein (dan menolak sumbangan nitrogen bukan protein) menggunakan analisis nitrogen Kjeldahl (kaedah AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Tanah diatom 545 telah dibeli daripada EMD Millipore (Billerica, MA). Karbon teraktif (DARCO, granul 100 mesh), Avicel (PH-101), bic xylan, dan semua bahan kimia lain telah dibeli daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Pra-rawatan AFEX telah dijalankan di GLBRC (Makmal Penyelidikan Penukaran Biojisim, MSU, Lansing, MI, USA). Pra-rawatan telah dijalankan pada suhu 140° C selama 15 minit. Masa kediaman 46 minit pada nisbah 1:1 ammonia anhidrus kepada biojisim pada pemuatan 60% (b/b) dalam reaktor kelompok atas meja keluli tahan karat (Parr Instruments Company). Ia mengambil masa 30 minit. Reaktor telah dipanaskan kepada 140°C dan ammonia dibebaskan dengan cepat, membolehkan biojisim kembali ke suhu bilik dengan cepat. Komposisi AFEX pra-rawatan jagung (ACS) adalah serupa dengan UT-CS.
Pepejal tinggi ACSH 25% (b/b) (kira-kira 8% muatan dekstran) telah disediakan sebagai bahan permulaan untuk penghasilan oligosakarida berskala besar. Hidrolisis enzimatik ACS telah dilakukan menggunakan campuran enzim komersial termasuk Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glukan (dalam biojisim pra-rawatan), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glukan, dan Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg protein/g dekstran. Hidrolisis enzimatik telah dijalankan dalam bioreaktor 5 liter dengan isipadu kerja 3 liter, pH 4.8, 50°C dan 250 rpm. Selepas hidrolisis selama 96 jam, hidrolisis dikumpulkan melalui sentrifugasi pada 6000 rpm selama 30 minit dan kemudian pada 14000 rpm selama 30 minit untuk menyingkirkan pepejal yang tidak terhidrolisis. Hidrolisat tersebut kemudiannya ditapis secara steril melalui bikar penapis 0.22 mm. Hidrolisat yang telah ditapis disimpan dalam botol steril pada suhu 4° C dan kemudian dipecahkan pada karbon.
Analisis komposisi sampel biojisim berasaskan ekstrak mengikut prosedur analisis makmal NREL: penyediaan sampel untuk analisis komposisi (NREL/TP-510-42620) dan penentuan karbohidrat struktur dan lignin dalam biojisim (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analisis oligosakarida aliran hidrolisat telah dilakukan pada skala 2 ml menggunakan kaedah hidrolisis asid berasaskan autoklaf. Campurkan sampel hidrolisat dengan 69.7 µl asid sulfurik 72% dalam tiub kultur penutup skru 10 ml dan inkubasi selama 1 jam di atas meja pada suhu 121 °C, sejukkan di atas ais dan tapis ke dalam vial kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC). Kepekatan oligosakarida ditentukan dengan menolak kepekatan monosakarida dalam sampel yang tidak terhidrolisis daripada jumlah kepekatan gula dalam sampel yang terhidrolisis asid.
Kepekatan glukosa, xilosa, dan arabinosa dalam biojisim terhidrolisis asid telah dianalisis menggunakan sistem Shimadzu HPLC yang dilengkapi dengan autosampler, pemanas lajur, pam isokratik, dan pengesan indeks biasan pada lajur Bio-Rad Aminex HPX-87H. Lajur tersebut dikekalkan pada suhu 50°C dan dielusi dengan 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 dalam air.
Supernatan hidrolisat telah dicairkan dan dianalisis untuk kandungan monomer dan oligosakarida. Gula monomerik yang diperoleh selepas hidrolisis enzimatik telah dianalisis menggunakan HPLC yang dilengkapi dengan lajur Aminex HPX-87P Bio-Rad (Hercules, CA) dan lajur pelindung abu. Suhu lajur dikekalkan pada 80°C, air digunakan sebagai fasa bergerak dengan kadar aliran 0.6 ml/min. Oligosakarida ditentukan melalui hidrolisis dalam asid cair pada suhu 121°C mengikut kaedah yang diterangkan dalam rujukan 41, 48, 49.
Analisis sakarida telah dijalankan ke atas sisa biojisim mentah yang telah dirawat terlebih dahulu oleh AFEX dan semua sisa biojisim yang tidak dihidrolisis (termasuk penghasilan ekstrak dinding sel bersiri dan penyaringan mAbnya) menggunakan prosedur yang diterangkan sebelum ini 27, 43, 50, 51. Untuk analisis glikom, sisa bahan dinding sel tumbuhan yang tidak larut alkohol disediakan daripada sisa biojisim dan tertakluk kepada pengekstrakan bersiri dengan reagen yang semakin agresif seperti ammonium oksalat (50 mM), natrium karbonat (50 mM dan 0.5% b/v), CON. (1M dan 4M, kedua-duanya dengan 1% b/v natrium borohidrida) dan asid klorit seperti yang diterangkan sebelum ini 52,53. Ekstrak kemudiannya tertakluk kepada ELISA terhadap panel kompleks mAb50 yang diarahkan kepada glikan dinding sel, dan tindak balas pengikatan mAb dibentangkan sebagai peta haba. mAb yang menyasarkan glikan dinding sel tumbuhan telah dibeli daripada stok makmal (siri CCRC, JIM dan MAC).
Biotinilasi satu langkah oligosakarida. Konjugasi karbohidrat dengan biotin-LC-hidrazida dilakukan menggunakan prosedur berikut. Biotin-LC-hidrazida (4.6 mg/12 μmol) dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO, 70 μl) dengan mengacau dan memanaskan dengan kuat pada suhu 65° C selama 1 minit. Asid asetik glasial (30 µl) ditambah dan campuran dituang ke atas natrium sianoborohidrida (6.4 mg/100 µmol) dan dilarutkan sepenuhnya selepas memanaskan pada suhu 65° C selama kira-kira 1 minit. Kemudian, dari 5 hingga 8 μl campuran tindak balas ditambah kepada oligosakarida kering (1-100 nmol) untuk mendapatkan lebihan molar 10 kali ganda atau lebih label di atas hujung pengurangan. Tindak balas dijalankan pada suhu 65°C selama 2 jam, selepas itu sampel segera ditulenkan. Tiada natrium sianoborohidrida digunakan dalam eksperimen pelabelan tanpa pengurangan, dan sampel telah direaksikan pada 65° C selama 2.5 jam.
Salutan ELISA dan pencucian sampel oligosakarida biotinilasi. 25 μl sampel biotinilasi (100 μl setiap sampel pekat yang dicairkan dalam 5 ml larutan penimbal Tris 0.1 M (TBS)) telah ditambah ke dalam setiap telaga plat bersalut avidin. Telaga kawalan disalut dengan 50 μl biotin pada kepekatan 10 μg/ml dalam 0.1 M TBS. Air deionisasi digunakan sebagai salutan untuk pengukuran kosong. Tablet diinkubasi selama 2 jam pada suhu bilik dalam keadaan gelap. Basuh plat 3 kali dengan susu skim 0.1% dalam 0.1 M TBS menggunakan program no. 11 untuk Grenier flat 3A.
Penambahan dan pencucian antibodi primer. Tambahkan 40 µl antibodi primer ke dalam setiap telaga. Inkubasi plat mikro selama 1 jam pada suhu bilik dalam keadaan gelap. Plat kemudian dibasuh 3 kali dengan susu 0.1% dalam 0.1M TBS menggunakan program pencucian #11 untuk Grenier Flat 3A.
Tambahkan antibodi sekunder dan basuh. Tambahkan 50 µl antibodi sekunder tikus/tikus (dicairkan 1:5000 dalam susu 0.1% dalam 0.1 M TBS) ke dalam setiap perigi. Inkubasi mikroplat selama 1 jam pada suhu bilik di tempat gelap. Mikroplat kemudian dibasuh 5 kali dengan susu 0.1% dalam 0.1 M TBS menggunakan program pencucian plat Grenier Flat 5A #12.
Menambah substrat. Tambahkan 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) ke substrat asas (dengan menambah 2 titis penimbal, 3 titis TMB, 2 titis hidrogen peroksida kepada 15 ml air ternyahion). Sediakan substrat TMB. dan vorteks sebelum digunakan). Inkubasi plat mikro pada suhu bilik selama 30 minit. Dalam keadaan gelap.
Lengkapkan langkah ini dan baca tablet tersebut. Tambahkan 50 µl 1 N asid sulfurik ke dalam setiap telaga dan catatkan penyerapan dari 450 hingga 655 nm menggunakan pembaca ELISA.
Sediakan larutan 1 mg/ml bagi analit ini dalam air tenyahion: arabinosa, rhamnosa, fukosa, xilosa, asid galakturonik (GalA), asid glukuronik (GlcA), manosa, glukosa, galaktosa, laktosa, N-asetilmannosamina (manNAc), N-asetilglukosamin (glcNAc), N-asetilgalaktosamin (galNAc), inositol (piawai dalaman). Dua piawai telah disediakan dengan menambah larutan gula 1 mg/mL yang ditunjukkan dalam Jadual 1. Sampel dibekukan dan diliofilisasi pada suhu -80° C sehingga semua air dikeluarkan (biasanya kira-kira 12-18 jam).
Tambahkan 100–500 µg sampel ke dalam tiub penutup skru pada neraca analitik. Catatkan jumlah yang ditambah. Adalah lebih baik untuk melarutkan sampel dalam kepekatan pelarut tertentu dan menambahkannya ke dalam tiub sebagai alikuot cecair. Gunakan 20 µl 1 mg/ml inositol sebagai piawai dalaman untuk setiap tiub sampel. Jumlah piawai dalaman yang ditambah ke dalam sampel mestilah sama dengan jumlah piawai dalaman yang ditambah ke dalam tiub piawai.
Tambahkan 8 ml metanol kontang ke dalam vial penutup skru. Kemudian, masukkan 4 ml larutan metanol HCl 3 N, tutup dan goncang. Proses ini tidak menggunakan air.
Tambahkan 500 µl larutan metanol 1 M HCl ke dalam sampel oligosakarida dan tiub TMS piawai. Sampel diinkubasi semalaman (168 jam) pada suhu 80° C. dalam blok terma. Keringkan produk metanolisis pada suhu bilik menggunakan manifold pengeringan. Tambahkan 200 µl MeOH dan keringkan sekali lagi. Proses ini diulang dua kali. Tambahkan 200 µl metanol, 100 µl piridina dan 100 µl anhidrida asetik ke dalam sampel dan gaul rata. Inkubasi sampel pada suhu bilik selama 30 minit. dan keringkan. Tambahkan 200 µl metanol dan keringkan sekali lagi.
Tambahkan 200 µl Tri-Sil dan panaskan tiub bertutup selama 20 minit. 80°C, kemudian sejukkan pada suhu bilik. Gunakan manifold pengeringan untuk mengeringkan sampel selanjutnya sehingga isipadu kira-kira 50 µl. Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa kami tidak membiarkan sampel kering sepenuhnya.
Tambahkan 2 ml heksana dan gaul rata dengan vorteks. Isi hujung pipet Pasteur (5-8 mm) dengan sekeping bulu kaca dengan memasukkan bulu kaca di atas pipet berdiameter 5-3/4 inci. Sampel disentrifugasi pada 3000 g selama 2 minit. Sebarang sisa yang tidak larut akan termendak. Keringkan sampel hingga 100-150 µl. Isipadu kira-kira 1 μl disuntik ke dalam GC-MS pada suhu awal 80 °C dan masa awal 2.0 minit (Jadual 2).