ຂອບໃຈທີ່ທ່ານເຂົ້າມາຢ້ຽມຊົມ Nature.com. ໂປຣແກຣມທ່ອງເວັບລຸ້ນທີ່ທ່ານກຳລັງໃຊ້ຢູ່ນັ້ນຮອງຮັບ CSS ໄດ້ຈຳກັດ. ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ໂປຣແກຣມທ່ອງເວັບທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼື ປິດໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer). ໃນລະຫວ່າງນີ້, ເພື່ອຮັບປະກັນການຮອງຮັບຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາຈະສະແດງຜົນເວັບໄຊທ໌ໂດຍບໍ່ມີຮູບແບບ ແລະ JavaScript.
ວິທີການທາງດ້ານພູມຕ້ານທານ ແລະ ມວນສານແບບໃໝ່ ສຳລັບການວິເຄາະແບບສະລັບສັບຊ້ອນຂອງໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ຄົງຢູ່ໃນຕົ້ນສາລີທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວລ່ວງໜ້າດ້ວຍ AFEX. ຊີວະມວນລິກໂນເຊລລູໂລສເປັນທາງເລືອກທີ່ຍືນຍົງແທນເຊື້ອໄຟຟອດຊິວ ແລະ ຖືກນຳໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງເພື່ອພັດທະນາເຕັກໂນໂລຊີຊີວະພາບສຳລັບການຜະລິດຜະລິດຕະພັນເຊັ່ນ: ອາຫານ, ອາຫານສັດ, ເຊື້ອໄຟ ແລະ ສານເຄມີ. ກຸນແຈສຳຄັນຂອງເຕັກໂນໂລຊີເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນການພັດທະນາຂະບວນການທີ່ມີການແຂ່ງຂັນດ້ານຕົ້ນທຶນ ສຳລັບການປ່ຽນຄາໂບໄຮເດຣດທີ່ຊັບຊ້ອນທີ່ມີຢູ່ໃນຝາເຊລພືດໃຫ້ກາຍເປັນນ້ຳຕານງ່າຍໆເຊັ່ນ: ນ້ຳຕານກລູໂຄສ, ໄຊໂລສ ແລະ ອາຣາບິໂນສ. ເນື່ອງຈາກຊີວະມວນລິກໂນເຊລລູໂລສມີຄວາມແຂງແກ່ນຫຼາຍ, ມັນຕ້ອງໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍຄວາມຮ້ອນທາງເຄມີ (ເຊັ່ນ: ການຂັດເສັ້ນໃຍແອມໂມເນຍ (AFEX), ກົດເຈືອຈາງ (DA), ນ້ຳໄອອອນ (IL)) ແລະ ການປິ່ນປົວທາງຊີວະພາບ (ເຊັ່ນ: ການໄຮໂດຣໄລຊິດດ້ວຍເອນໄຊມ໌ ແລະ ການໝັກຈຸລິນຊີ) ຮ່ວມກັນເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຜະລິດຕະພັນທີ່ຕ້ອງການ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເມື່ອໃຊ້ເອນໄຊມ໌ເຊື້ອລາທາງການຄ້າໃນຂະບວນການໄຮໂດຣໄລຊິດ, ມີພຽງແຕ່ 75-85% ຂອງນ້ຳຕານທີ່ລະລາຍໄດ້ທີ່ເກີດຂຶ້ນແມ່ນໂມໂນແຊກຄາໄຣດ໌, ແລະ 15-25% ທີ່ເຫຼືອແມ່ນໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ລະລາຍບໍ່ໄດ້, ເຊິ່ງຈຸລິນຊີບໍ່ສາມາດເຂົ້າເຖິງໄດ້ສະເໝີໄປ. ກ່ອນໜ້ານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ແຍກ ແລະ ບໍລິສຸດໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣດ໌ທີ່ແຂງກະດ້າງທີ່ລະລາຍໄດ້ໂດຍໃຊ້ການປະສົມປະສານຂອງການແຍກຄາບອນ ແລະ ດິນໄດອາໂຕມເຊວ ແລະ ໂຄຣມາໂຕກຣາຟີ, ແລະ ຍັງໄດ້ສືບສວນຄຸນສົມບັດຍັບຍັ້ງເອນໄຊມ໌ຂອງມັນ. ພວກເຮົາໄດ້ພົບວ່າໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣດ໌ທີ່ມີລະດັບການໂພລີເມີໄຣເຊຊັນ (DP) ເມທິລເລດທີ່ສູງກວ່າແມ່ນຍາກທີ່ຈະປຸງແຕ່ງດ້ວຍສ່ວນປະສົມຂອງເອນໄຊມ໌ທາງການຄ້າກ່ວາໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣດ໌ DP ຕ່ຳ ແລະ ເປັນກາງ. ໃນທີ່ນີ້ພວກເຮົາລາຍງານການນຳໃຊ້ວິທີການເພີ່ມເຕີມຫຼາຍຢ່າງ, ລວມທັງການວິເຄາະ glycan ໂດຍໃຊ້ໂມໂນໂຄນແອນຕິບໍດີ (mAbs) ສະເພາະກັບ glycans ຊີວະມວນຂອງພືດເພື່ອອະທິບາຍລັກສະນະພັນທະ glycan ໃນຝາເຊວພືດ ແລະ ໄຮໂດຣໄລເຊດຂອງເອນໄຊມ໌, ໄອອອນໄນເຊຊັນທີ່ໃຊ້ເລເຊີຊ່ວຍໃນການດູດຊຶມ, ແມສຕຣິກສ໌-ສະເປກໂຕຣເມຕຣີ (MALDI-TOF-MS) ໃຊ້ຈຸດສູງສຸດການວິນິດໄສທີ່ໃຫ້ຂໍ້ມູນໂຄງສ້າງທີ່ໄດ້ຮັບຈາກສະເປກໂຕຣສະໂກປີຫຼັງຈາກການເສື່ອມສະພາບຂັ້ນສອງຂອງໄອອອນລົບ, ໂຄຣມາໂຕກຣາຟີແກັສ ແລະ ສະເປກໂຕຣເມຕຣີມວນສານ (GC-MS) ເພື່ອອະທິບາຍລັກສະນະພັນທະ oligosaccharide ທີ່ມີ ແລະ ບໍ່ມີການແຍກອະນຸພັນ. ເນື່ອງຈາກຂະໜາດນ້ອຍຂອງໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ (DP 4–20), ໂມເລກຸນເຫຼົ່ານີ້ຍາກທີ່ຈະໃຊ້ສຳລັບການຜູກມັດ ແລະ ການວິເຄາະລັກສະນະຂອງ mAb. ເພື່ອແກ້ໄຂບັນຫານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ນຳໃຊ້ວິທີການ immobilization ຂອງໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ອີງໃສ່ biotin conjugation ແບບໃໝ່ທີ່ຕິດສະຫຼາກສ່ວນໃຫຍ່ຂອງໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ລະລາຍໄດ້ DP ຕ່ຳຢູ່ເທິງໜ້າດິນຂອງ microplate ໄດ້ຢ່າງສຳເລັດຜົນ, ເຊິ່ງຫຼັງຈາກນັ້ນໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ໃນລະບົບ mAb ທີ່ມີປະລິມານສູງສຳລັບການວິເຄາະ ligation ສະເພາະ. ວິທີການໃໝ່ນີ້ຈະຊ່ວຍໃຫ້ການພັດທະນາການວິເຄາະ glycome ທີ່ມີປະລິມານສູງທີ່ກ້າວໜ້າໃນອະນາຄົດ ເຊິ່ງສາມາດນຳໃຊ້ເພື່ອແຍກ ແລະ ວິເຄາະລັກສະນະຂອງໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ມີຢູ່ໃນ biomarkers ເພື່ອຈຸດປະສົງການວິນິດໄສ.
ຊີວະມວນ Lignocellulosic, ປະກອບດ້ວຍວັດສະດຸກະສິກຳ, ປ່າໄມ້, ຫຍ້າ ແລະ ໄມ້, ເປັນວັດຖຸດິບທີ່ມີທ່າແຮງສຳລັບການຜະລິດຜະລິດຕະພັນຊີວະພາບ, ລວມທັງອາຫານ, ອາຫານສັດ, ເຊື້ອເພີງ ແລະ ສານຕັ້ງຕົ້ນທາງເຄມີເພື່ອຜະລິດຜະລິດຕະພັນທີ່ມີມູນຄ່າສູງກວ່າ1. ຄາໂບໄຮເດຣດ (ເຊັ່ນ cellulose ແລະ hemicellulose) ທີ່ມີຢູ່ໃນຝາເຊວພືດແມ່ນຖືກ depolymerized ເປັນ monosaccharides ໂດຍການປຸງແຕ່ງທາງເຄມີ ແລະ ການປ່ຽນຮູບທາງຊີວະພາບ (ເຊັ່ນ: ການ hydrolysis ດ້ວຍ enzymatic ແລະ ການໝັກຈຸລິນຊີ). ການປິ່ນປົວກ່ອນການປິ່ນປົວທົ່ວໄປປະກອບມີການຂະຫຍາຍເສັ້ນໃຍແອມໂມເນຍ (AFEX), ກົດເຈືອຈາງ (DA), ນ້ຳໄອອອນ (IL), ແລະ ການລະເບີດດ້ວຍໄອນ້ຳ (SE), ເຊິ່ງໃຊ້ການປະສົມປະສານຂອງສານເຄມີ ແລະ ຄວາມຮ້ອນເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການຜະລິດ lignocellulose ໂດຍການເປີດຝາເຊວພືດ3,4. ຄວາມແຂງກະດ້າງຂອງສານ, 5. ການ hydrolysis ດ້ວຍ enzymatic ແມ່ນປະຕິບັດຢູ່ໃນພາລະຂອງແຂງສູງໂດຍໃຊ້ enzymes ທີ່ມີຄາໂບໄຮເດຣດທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວທາງການຄ້າ (CAZymes) ແລະ ການໝັກຈຸລິນຊີໂດຍໃຊ້ເຊື້ອລາ ຫຼື ເຊື້ອແບັກທີເຣຍ transgenic ເພື່ອຜະລິດເຊື້ອເພີງ ແລະ ສານເຄມີທາງຊີວະພາບ6.
CAZymes ໃນເອນໄຊມ໌ທາງການຄ້າປະກອບດ້ວຍສ່ວນປະສົມທີ່ສັບສົນຂອງເອນໄຊມ໌ທີ່ຮ່ວມມືກັນຕັດພັນທະບັດຄາໂບໄຮເດຣດທີ່ສັບສົນ-ນ້ຳຕານເພື່ອສ້າງເປັນ monosaccharides2,7. ດັ່ງທີ່ພວກເຮົາໄດ້ລາຍງານມາກ່ອນໜ້ານີ້, ເຄືອຂ່າຍທີ່ສັບສົນຂອງໂພລີເມີອາໂຣມາຕິກຂອງ lignin ກັບຄາໂບໄຮເດຣດເຮັດໃຫ້ພວກມັນຍາກທີ່ຈະແກ້ໄຂໄດ້, ເຊິ່ງນຳໄປສູ່ການປ່ຽນນ້ຳຕານທີ່ບໍ່ສົມບູນ, ສະສົມ 15-25% ຂອງ sex oligosaccharides ທີ່ບໍ່ໄດ້ຜະລິດໃນລະຫວ່າງການ hydrolysis ຂອງຊີວະມວນທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວລ່ວງໜ້າດ້ວຍ enzymatic. ນີ້ແມ່ນບັນຫາທົ່ວໄປກັບວິທີການປິ່ນປົວລ່ວງໜ້າຂອງຊີວະມວນຕ່າງໆ. ເຫດຜົນບາງຢ່າງສຳລັບຄວາມແອອັດນີ້ລວມມີການຍັບຍັ້ງເອນໄຊມ໌ໃນລະຫວ່າງການ hydrolysis, ຫຼືການບໍ່ມີ ຫຼື ລະດັບຕໍ່າຂອງເອນໄຊມ໌ທີ່ຈຳເປັນທີ່ຈຳເປັນເພື່ອທຳລາຍພັນທະບັດນ້ຳຕານໃນຊີວະມວນຂອງພືດ. ການເຂົ້າໃຈອົງປະກອບ ແລະ ລັກສະນະໂຄງສ້າງຂອງນ້ຳຕານ, ເຊັ່ນພັນທະບັດນ້ຳຕານໃນ oligosaccharides, ຈະຊ່ວຍໃຫ້ພວກເຮົາປັບປຸງການປ່ຽນນ້ຳຕານໃນລະຫວ່າງການ hydrolysis, ເຮັດໃຫ້ຂະບວນການທາງຊີວະເຕັກໂນໂລຊີມີຄ່າໃຊ້ຈ່າຍທີ່ແຂ່ງຂັນກັບຜະລິດຕະພັນທີ່ໄດ້ມາຈາກນ້ຳມັນ.
ການກຳນົດໂຄງສ້າງຂອງຄາໂບໄຮເດຣດແມ່ນເປັນສິ່ງທ້າທາຍ ແລະ ຕ້ອງການການປະສົມປະສານຂອງວິທີການຕ່າງໆເຊັ່ນ: ໂຄຣມາໂຕກຣາຟີແຫຼວ (LC)11,12, ການວິເຄາະດ້ວຍສະເປກໂຕຣສະໂຄປີແມ່ເຫຼັກນິວເຄຼຍ (NMR)13, ການວິເຄາະດ້ວຍໄຟຟ້າ capillary electrophoresis (CE)14,15,16 ແລະ ການວິເຄາະດ້ວຍມວນສານ (MS)17. ,ສິບແປດ. ວິທີການ MS ເຊັ່ນ: ການວິເຄາະດ້ວຍມວນສານແບບເວລາບິນດ້ວຍການກຳຈັດດ້ວຍເລເຊີ ແລະ ການໄອອອນໄນເຊຊັນໂດຍໃຊ້ແມັດທຣິກ (MALDI-TOF-MS) ເປັນວິທີການທີ່ຫຼາກຫຼາຍສຳລັບການກຳນົດໂຄງສ້າງຄາໂບໄຮເດຣດ. ເມື່ອບໍ່ດົນມານີ້, ການວິເຄາະດ້ວຍການແຍກຕົວທີ່ເກີດຈາກການຊົນກັນ (CID) tandem MS ຂອງສານປະກອບໄອອອນໂຊດຽມໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງທີ່ສຸດໃນການກຳນົດລາຍນິ້ວມືທີ່ສອດຄ້ອງກັບຕຳແໜ່ງການຕິດຂອງໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣ, ການຕັ້ງຄ່າແບບອະໂນເມີຣິກ, ລຳດັບ ແລະ ຕຳແໜ່ງການແຕກກິ່ງ 20, 21.
ການວິເຄາະ glycan ເປັນເຄື່ອງມືທີ່ດີເລີດສຳລັບການລະບຸພັນທະບັດຄາໂບໄຮເດຣດຢ່າງເລິກເຊິ່ງ22. ວິທີການນີ້ໃຊ້ພູມຕ້ານທານ monoclonal (mAbs) ທີ່ມຸ້ງໄປຫາ glycan ຝາຈຸລັງພືດເປັນ probes ເພື່ອເຂົ້າໃຈການເຊື່ອມໂຍງຂອງຄາໂບໄຮເດຣດທີ່ສັບສົນ. ມີ mAbs ຫຼາຍກວ່າ 250 ທີ່ມີຢູ່ທົ່ວໂລກ, ຖືກອອກແບບມາຕໍ່ກັບ oligosaccharides ເສັ້ນຊື່ ແລະ ກິ່ງງ່າຕ່າງໆໂດຍໃຊ້ saccharides ຕ່າງໆ24. mAbs ຫຼາຍອັນໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງເພື່ອອະທິບາຍໂຄງສ້າງ, ອົງປະກອບ, ແລະ ການດັດແປງຂອງຝາຈຸລັງພືດ, ຍ້ອນວ່າມີຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສໍາຄັນຂຶ້ນກັບປະເພດຂອງຈຸລັງພືດ, ອະໄວຍະວະ, ອາຍຸ, ຂັ້ນຕອນການພັດທະນາ, ແລະ ສະພາບແວດລ້ອມການເຕີບໂຕ25,26. ບໍ່ດົນມານີ້, ວິທີການນີ້ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເຂົ້າໃຈປະຊາກອນ vesicle ໃນລະບົບພືດ ແລະ ສັດ ແລະ ບົດບາດຂອງພວກມັນໃນການຂົນສົ່ງ glycan ຕາມທີ່ກໍານົດໂດຍເຄື່ອງໝາຍ subcellular, ຂັ້ນຕອນການພັດທະນາ, ຫຼື ການກະຕຸ້ນສິ່ງແວດລ້ອມ, ແລະ ເພື່ອກໍານົດກິດຈະກໍາຂອງເອນໄຊມ. ບາງໂຄງສ້າງທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ glycans ແລະ xylans ທີ່ໄດ້ຖືກລະບຸລວມມີ pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), mixed bond glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) ແລະ arabino-galactan (ArbG)29.
ເຖິງຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ເຖິງວ່າຈະມີຄວາມພະຍາຍາມໃນການຄົ້ນຄວ້າທັງໝົດນີ້, ມີພຽງແຕ່ການສຶກສາຈຳນວນໜ້ອຍເທົ່ານັ້ນທີ່ໄດ້ສຸມໃສ່ລັກສະນະຂອງການສະສົມຂອງໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣໃນລະຫວ່າງການໄຮໂດຼໄລຊິດທີ່ມີທາດແຂງສູງ (HSL), ລວມທັງການປ່ອຍໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣ, ການປ່ຽນແປງຄວາມຍາວຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ໂອລິໂກເມີຣິກໃນລະຫວ່າງການໄຮໂດຼໄລຊິດ, ໂພລີເມີ DP ຕ່ຳຕ່າງໆ, ແລະເສັ້ນໂຄ້ງຂອງມັນ. ການແຈກຢາຍ 30,31,32. ໃນຂະນະດຽວກັນ, ເຖິງແມ່ນວ່າການວິເຄາະໄກແຄນໄດ້ພິສູດແລ້ວວ່າເປັນເຄື່ອງມືທີ່ເປັນປະໂຫຍດສຳລັບການວິເຄາະໂຄງສ້າງໄກແຄນທີ່ຄົບຖ້ວນ, ແຕ່ມັນຍາກທີ່ຈະປະເມີນໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣ DP ຕ່ຳທີ່ລະລາຍໃນນ້ຳໂດຍໃຊ້ວິທີການຕ້ານເຊື້ອ. ໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣ DP ຂະໜາດນ້ອຍກວ່າທີ່ມີນ້ຳໜັກໂມເລກຸນໜ້ອຍກວ່າ 5-10 kDa ບໍ່ຜູກມັດກັບແຜ່ນ ELISA 33, 34 ແລະຖືກລ້າງອອກກ່ອນການເພີ່ມພູມຕ້ານທານ.
ໃນທີ່ນີ້, ເປັນຄັ້ງທຳອິດ, ພວກເຮົາສາທິດການວິເຄາະ ELISA ໃນແຜ່ນເຄືອບດ້ວຍ avidin ໂດຍໃຊ້ monoclonal antibodies, ໂດຍລວມເອົາຂັ້ນຕອນ biotinylation ໜຶ່ງຂັ້ນຕອນສຳລັບ oligosaccharides ທີ່ທົນທານຕໍ່ນ້ຳຕານທີ່ລະລາຍດ້ວຍການວິເຄາະ glycome. ວິທີການຂອງພວກເຮົາໃນການວິເຄາະ glycome ໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໂດຍການວິເຄາະການເຊື່ອມໂຍງ oligosaccharide ເສີມໂດຍອີງໃສ່ MALDI-TOF-MS ແລະ GC-MS ໂດຍໃຊ້ອະນຸພັນ trimethylsilyl (TMS) ຂອງສ່ວນປະກອບນ້ຳຕານ hydrolyzed. ວິທີການທີ່ມີນະວັດຕະກຳນີ້ສາມາດພັດທະນາເປັນວິທີການທີ່ມີປະສິດທິພາບສູງໃນອະນາຄົດ ແລະ ພົບເຫັນການນຳໃຊ້ທີ່ກວ້າງຂວາງໃນການຄົ້ນຄວ້າທາງການແພດ35.
ການດັດແປງຫຼັງການແປຂອງເອນໄຊມ໌ ແລະ ພູມຕ້ານທານ, ເຊັ່ນ: glycosylation,36 ສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ກິດຈະກຳທາງຊີວະພາບຂອງມັນ. ຕົວຢ່າງ, ການປ່ຽນແປງຂອງ glycosylation ຂອງໂປຣຕີນໃນເລືອດມີບົດບາດສຳຄັນໃນພະຍາດຂໍ້ອັກເສບອັກເສບ, ແລະ ການປ່ຽນແປງຂອງ glycosylation ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນເຄື່ອງໝາຍການວິນິດໄສ37. glycans ຕ່າງໆໄດ້ຖືກລາຍງານໃນວັນນະຄະດີວ່າປາກົດຢູ່ໃນພະຍາດຕ່າງໆ, ລວມທັງພະຍາດອັກເສບຊໍາເຮື້ອຂອງລະບົບຍ່ອຍອາຫານ ແລະ ຕັບ, ການຕິດເຊື້ອໄວຣັດ, ມະເຮັງຮວຍໄຂ່, ມະເຮັງເຕົ້ານົມ, ແລະ ມະເຮັງຕ່ອມລູກໝາກ38,39,40. ການເຂົ້າໃຈໂຄງສ້າງຂອງ glycans ໂດຍໃຊ້ວິທີການ ELISA glycan ທີ່ອີງໃສ່ພູມຕ້ານທານຈະໃຫ້ຄວາມໝັ້ນໃຈເພີ່ມເຕີມໃນການວິນິດໄສພະຍາດໂດຍບໍ່ຕ້ອງໃຊ້ວິທີການ MS ທີ່ສັບສົນ.
ການສຶກສາກ່ອນໜ້ານີ້ຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ ໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ແຂງກະດ້າງຍັງຄົງບໍ່ຖືກໄຮໂດຣໄລສ໌ຫຼັງຈາກການປຸງແຕ່ງກ່ອນ ແລະ ການໄຮໂດຣໄລສ໌ດ້ວຍເອນໄຊມ໌ (ຮູບທີ 1). ໃນວຽກງານທີ່ເຜີຍແຜ່ກ່ອນໜ້ານີ້ຂອງພວກເຮົາ, ພວກເຮົາໄດ້ພັດທະນາວິທີການສະກັດເອົາຖ່ານແຂງທີ່ໃຊ້ຖ່ານກະຕຸ້ນເພື່ອແຍກໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ອອກຈາກໄຮໂດຣໄລສ໌ຂອງພືດສາລີທີ່ປຸງແຕ່ງກ່ອນດ້ວຍ AFEX (ACSH)8. ຫຼັງຈາກການສະກັດ ແລະ ການແຍກໃນເບື້ອງຕົ້ນ, ໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ໄດ້ຖືກແຍກສ່ວນຕື່ມອີກໂດຍໂຄຣມາໂຕກຣາຟີການຍົກເວັ້ນຂະໜາດ (SEC) ແລະ ເກັບກຳຕາມລຳດັບນ້ຳໜັກໂມເລກຸນ. ໂມໂນເມີນ້ຳຕານ ແລະ ໂອລິໂກເມີທີ່ປ່ອຍອອກມາຈາກການປິ່ນປົວກ່ອນຕ່າງໆໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍການວິເຄາະສ່ວນປະກອບນ້ຳຕານ. ເມື່ອປຽບທຽບປະລິມານຂອງໂອລິໂກເມີນ້ຳຕານທີ່ໄດ້ຮັບໂດຍວິທີການປິ່ນປົວກ່ອນຕ່າງໆ, ການມີໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ແຂງກະດ້າງແມ່ນບັນຫາທົ່ວໄປໃນການປ່ຽນຊີວະມວນໄປເປັນໂມໂນແຊກຄາໄຣດ໌ ແລະ ສາມາດນຳໄປສູ່ການຫຼຸດລົງຂອງຜົນຜະລິດນ້ຳຕານຢ່າງໜ້ອຍ 10-15% ແລະ ແມ່ນແຕ່ສູງເຖິງ 18%. ສະຫະລັດ. ວິທີການນີ້ຖືກນຳໃຊ້ສຳລັບການຜະລິດສ່ວນປະສົມໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ໃນຂະໜາດໃຫຍ່ຕື່ມອີກ. ACH ທີ່ໄດ້ຮັບ ແລະ ສ່ວນຕໍ່ໆມາຂອງມັນທີ່ມີນ້ຳໜັກໂມເລກຸນທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນວັດສະດຸທົດລອງສໍາລັບການລັກສະນະຂອງ oligosaccharides ໃນວຽກງານນີ້.
ຫຼັງຈາກການປະຕິບັດກ່ອນ ແລະ ການໄຮໂດຼໄລຊິດດ້ວຍເອນໄຊມ໌, ໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ຍັງຄົງຄ້າງຍັງຄົງບໍ່ໄຮໂດຼໄລຊິດ. ໃນທີ່ນີ້ (A) ແມ່ນວິທີການແຍກໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ຖືກແຍກອອກຈາກໄຮໂດຼໄລເຊດຂອງຖົ່ວດິນທີ່ປະຕິບັດກ່ອນ AFEX (ACSH) ໂດຍໃຊ້ຕຽງທີ່ບັນຈຸດ້ວຍຖ່ານກັມວິດ ແລະ ດິນໄດອາໂຕມເຊວ; (B) ວິທີການແຍກໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌. ໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ໄດ້ຖືກແຍກອອກຕື່ມອີກໂດຍໂຄຣມາໂຕກຣາຟີການຍົກເວັ້ນຂະໜາດ (SEC); (C) ໂມໂນເມີ ແລະ ໂອລິໂກເມີ ຊາກຄາໄຣດ໌ທີ່ປ່ອຍອອກມາຈາກການປະຕິບັດກ່ອນຕ່າງໆ (ກົດເຈືອຈາງ: DA, ນ້ຳໄອອອນ: IL ແລະ AFEX). ສະພາບການໄຮໂດຼໄລຊິດດ້ວຍເອນໄຊມ໌: ການໂຫຼດຂອງແຂງສູງ 25% (w/w) (ການໂຫຼດກລູແຄນປະມານ 8%), ການໄຮໂດຼໄລຊິດ 96 ຊົ່ວໂມງ, ການໂຫຼດເອນໄຊມ໌ທາງການຄ້າ 20 ມກ/ກ (ອັດຕາສ່ວນ Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) ແລະ (D) ໂມໂນເມີນ້ຳຕານ ແລະ ໂອລິໂກເມີຂອງກລູໂຄສ, ໄຊໂລສ ແລະ ອາຣາບິໂນສ ທີ່ປ່ອຍອອກມາຈາກຖົ່ວສາລີທີ່ຜ່ານການປຸງແຕ່ງລ່ວງໜ້າຂອງ AFEX (ACS).
ການວິເຄາະ glycan ໄດ້ພິສູດແລ້ວວ່າເປັນເຄື່ອງມືທີ່ເປັນປະໂຫຍດສຳລັບການວິເຄາະໂຄງສ້າງທີ່ສົມບູນແບບຂອງ glycans ໃນສານສະກັດທີ່ແຍກອອກມາຈາກສານເສດເຫຼືອຊີວະມວນແຂງ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, saccharides ທີ່ລະລາຍໃນນໍ້າແມ່ນມີໜ້ອຍໂດຍໃຊ້ວິທີການແບບດັ້ງເດີມນີ້41 ເພາະວ່າ oligosaccharides ນໍ້າໜັກໂມເລກຸນຕໍ່າຍາກທີ່ຈະເຮັດໃຫ້ບໍ່ເຄື່ອນທີ່ໃນແຜ່ນ ELISA ແລະຖືກລ້າງອອກກ່ອນການເພີ່ມພູມຕ້ານທານ. ດັ່ງນັ້ນ, ສໍາລັບການຜູກມັດແລະການກໍານົດຄຸນລັກສະນະຂອງພູມຕ້ານທານ, ວິທີການ biotinylation ຂັ້ນຕອນດຽວຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເຄືອບ oligosaccharides ທີ່ລະລາຍບໍ່ໄດ້, ບໍ່ສອດຄ່ອງໃນແຜ່ນ ELISA ທີ່ເຄືອບ avidin. ວິທີການນີ້ໄດ້ຖືກທົດສອບໂດຍໃຊ້ ACSH ທີ່ຜະລິດກ່ອນໜ້ານີ້ຂອງພວກເຮົາແລະສ່ວນໜຶ່ງໂດຍອີງໃສ່ນໍ້າໜັກໂມເລກຸນຂອງມັນ (ຫຼືລະດັບຂອງການໂພລີເມີໄລເຊຊັນ, DP). biotinylation ຂັ້ນຕອນດຽວໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເພີ່ມຄວາມຜູກພັນ oligosaccharide ໂດຍການເພີ່ມ biotin-LC-hydrazide ໃສ່ປາຍຫຼຸດຜ່ອນຂອງຄາໂບໄຮເດຣດ (ຮູບທີ 2). ໃນສານລະລາຍ, ກຸ່ມ hemiacetal ຢູ່ປາຍຫຼຸດຜ່ອນປະຕິກິລິຍາກັບກຸ່ມ hydrazide ຂອງ biotin-LC-hydrazide ເພື່ອສ້າງພັນທະ hydrazone. ໃນເວລາທີ່ມີຕົວແທນຫຼຸດຜ່ອນ NaCNBH3, ພັນທະ hydrazone ຈະຖືກຫຼຸດລົງເປັນຜະລິດຕະພັນສຸດທ້າຍ biotinylated ທີ່ໝັ້ນຄົງ. ດ້ວຍການດັດແປງຂອງປາຍຫຼຸດຜ່ອນນໍ້າຕານ, ການຜູກມັດຂອງ DP oligosaccharides ຕ່ໍາກັບແຜ່ນ ELISA ກາຍເປັນເປັນໄປໄດ້, ແລະໃນການສຶກສາຂອງພວກເຮົາສິ່ງນີ້ໄດ້ເຮັດຢູ່ໃນແຜ່ນເຄືອບ avidin ໂດຍໃຊ້ mAbs ເປົ້າຫມາຍ glycan.
ການກວດຄັດກອງພູມຕ້ານທານໂມໂນໂຄນໂດຍອີງໃສ່ ELISA ສຳລັບໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ປະກອບດ້ວຍໄບໂອຕິນ. ໃນທີ່ນີ້ (A) ການປະສົມປະສານການໄບໂອຕິນຂອງໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ ແລະ ການກວດຄັດກອງ ELISA ຕໍ່ມາດ້ວຍ mAbs ທີ່ແນໃສ່ໄກລີແຄນໃນແຜ່ນເຄືອບ NeutrAvidin ແລະ (B) ສະແດງໃຫ້ເຫັນຂັ້ນຕອນໜຶ່ງຂັ້ນຕອນສຳລັບການໄບໂອຕິນຂອງຜະລິດຕະພັນປະຕິກິລິຍາ.
ແຜ່ນທີ່ເຄືອບດ້ວຍ Avidin ທີ່ມີພູມຕ້ານທານທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ oligosaccharide ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນພູມຕ້ານທານຂັ້ນຕົ້ນ ແລະ ຂັ້ນສອງ ແລະ ລ້າງໃນສື່ກາງທີ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ແສງ ແລະ ເວລາ. ຫຼັງຈາກການຜູກມັດພູມຕ້ານທານສຳເລັດແລ້ວ, ໃຫ້ເພີ່ມຊັບສະເຕຣດ TMB ເພື່ອບົ່ມແຜ່ນ. ປະຕິກິລິຍາໄດ້ຢຸດລົງໃນທີ່ສຸດດ້ວຍກົດຊູນຟູຣິກ. ແຜ່ນທີ່ບົ່ມໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງອ່ານ ELISA ເພື່ອກຳນົດຄວາມແຮງຂອງການຜູກມັດຂອງພູມຕ້ານທານແຕ່ລະຊະນິດເພື່ອກວດຫາການເຊື່ອມໂຍງສະເພາະຂອງພູມຕ້ານທານ. ສຳລັບລາຍລະອຽດ ແລະ ພາລາມິເຕີຂອງການທົດລອງ, ເບິ່ງພາກສ່ວນທີ່ສອດຄ້ອງກັນ “ວັດສະດຸ ແລະ ວິທີການ”.
ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງປະໂຫຍດຂອງວິທີການທີ່ພັດທະນາໃໝ່ນີ້ສຳລັບການນຳໃຊ້ສະເພາະໂດຍການອະທິບາຍລັກສະນະຂອງໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣທີ່ລະລາຍໄດ້ທີ່ມີຢູ່ໃນ ACSH ເຊັ່ນດຽວກັນກັບໃນສ່ວນໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣດິບ ແລະ ບໍລິສຸດທີ່ແຍກອອກມາຈາກໄຮໂດຼໄລເຊດລີໂນເຊວລູໂລສ. ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບທີ 3, ໄຊແລນທີ່ທົດແທນດ້ວຍ epitope ທີ່ພົບເລື້ອຍທີ່ສຸດທີ່ລະບຸໃນ ACSH ໂດຍໃຊ້ວິທີການວິເຄາະ glycome ທາງຊີວະພາບມັກຈະເປັນ uronic (U) ຫຼື methyluronic (MeU) ແລະ pectic arabinogalactans. ສ່ວນໃຫຍ່ຂອງພວກມັນຍັງພົບເຫັນຢູ່ໃນການສຶກສາກ່ອນໜ້ານີ້ຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບການວິເຄາະ glycans ຂອງແຂງທີ່ບໍ່ໄດ້ໄຮໂດຼໄລເຊດ (UHS)43.
ການກວດຫາ epitopes oligosaccharide ທີ່ recalcitrant ໂດຍໃຊ້ monoclonal antibody ທີ່ມຸ້ງໄປຫາ glycan ຂອງຝາຈຸລັງ. ສ່ວນ "ເປັນກາງ" ແມ່ນສ່ວນ ACN ແລະສ່ວນ "ເປັນກົດ" ແມ່ນສ່ວນ FA. ສີແດງທີ່ສະຫວ່າງກວ່າໃນແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນຊີ້ບອກເຖິງປະລິມານ epitope ທີ່ສູງຂຶ້ນ, ແລະສີຟ້າທີ່ສະຫວ່າງກວ່າຊີ້ບອກເຖິງພື້ນຫຼັງທີ່ວ່າງເປົ່າ. ຄ່າສີໃນມາດຕາສ່ວນແມ່ນອີງໃສ່ຄ່າ OD ດິບສຳລັບສູດ N=2. epitopes ຫຼັກທີ່ຮັບຮູ້ໂດຍ antibodies ແມ່ນສະແດງຢູ່ເບື້ອງຂວາ.
ໂຄງສ້າງທີ່ບໍ່ແມ່ນເຊລລູໂລສເຫຼົ່ານີ້ບໍ່ສາມາດຖືກແຍກອອກໂດຍເຊລລູເລສ ແລະ ເຮມິເຊລລູເລສທີ່ພົບເລື້ອຍທີ່ສຸດໃນສ່ວນປະສົມຂອງເອນໄຊທາງການຄ້າທີ່ທົດສອບແລ້ວ, ເຊິ່ງປະກອບມີເອນໄຊທາງການຄ້າທີ່ໃຊ້ທົ່ວໄປທີ່ສຸດ. ດັ່ງນັ້ນ, ຕ້ອງມີເອນໄຊຊ່ວຍໃໝ່ສຳລັບການໄຮໂດຣໄລຊິດຂອງພວກມັນ. ຖ້າບໍ່ມີເອນໄຊເສີມທີ່ບໍ່ແມ່ນເຊລລູໂລສທີ່ຈຳເປັນ, ພັນທະທີ່ບໍ່ແມ່ນເຊລລູໂລສເຫຼົ່ານີ້ປ້ອງກັນການປ່ຽນເປັນໂມໂນແຊກຄາໄຣດ໌ຢ່າງສົມບູນ, ເຖິງແມ່ນວ່າໂພລີເມີນ້ຳຕານພໍ່ແມ່ຂອງພວກມັນຈະຖືກໄຮໂດຣໄລຊິດຢ່າງກວ້າງຂວາງເປັນຊິ້ນສ່ວນທີ່ສັ້ນກວ່າ ແລະ ລະລາຍໂດຍໃຊ້ສ່ວນປະສົມຂອງເອນໄຊທາງການຄ້າ.
ການສຶກສາເພີ່ມເຕີມກ່ຽວກັບການແຈກຢາຍສັນຍານ ແລະ ຄວາມແຮງຂອງການຜູກມັດຂອງມັນສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ epitopes ການຜູກມັດແມ່ນຕໍ່າກວ່າໃນສ່ວນປະກອບນ້ຳຕານ DP ສູງ (A, B, C, DP ສູງເຖິງ 20+) ກ່ວາໃນສ່ວນປະກອບ DP ຕ່ຳ (D, E, F, DP) ໃນ dimers) (ຮູບທີ 1). ຊິ້ນສ່ວນອາຊິດແມ່ນພົບເລື້ອຍໃນ epitopes ທີ່ບໍ່ແມ່ນ cellulose ກ່ວາຊິ້ນສ່ວນທີ່ເປັນກາງ. ປະກົດການເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບຮູບແບບທີ່ສັງເກດເຫັນໃນການສຶກສາກ່ອນໜ້ານີ້ຂອງພວກເຮົາ, ບ່ອນທີ່ DP ສູງ ແລະ ສ່ວນປະກອບອາຊິດມີຄວາມຕ້ານທານຕໍ່ການ hydrolysis ຂອງ enzymatic ຫຼາຍກວ່າ. ດັ່ງນັ້ນ, ການມີ epitopes glycan ທີ່ບໍ່ແມ່ນ cellulose ແລະ ການທົດແທນ U ແລະ MeU ສາມາດປະກອບສ່ວນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຕໍ່ຄວາມໝັ້ນຄົງຂອງ oligosaccharides. ຄວນສັງເກດວ່າປະສິດທິພາບການຜູກມັດ ແລະ ການກວດຈັບສາມາດເປັນບັນຫາສຳລັບ oligosaccharides DP ຕ່ຳ, ໂດຍສະເພາະຖ້າ epitope ແມ່ນ oligosaccharide dimeric ຫຼື trimeric. ສິ່ງນີ້ສາມາດທົດສອບໄດ້ໂດຍໃຊ້ oligosaccharides ທາງການຄ້າທີ່ມີຄວາມຍາວແຕກຕ່າງກັນ, ແຕ່ລະອັນມີພຽງແຕ່ epitope ດຽວທີ່ຜູກມັດກັບ mAb ສະເພາະ.
ດັ່ງນັ້ນ, ການນໍາໃຊ້ພູມຕ້ານທານສະເພາະໂຄງສ້າງໄດ້ເປີດເຜີຍບາງປະເພດຂອງພັນທະບັດ recalcitrant. ອີງຕາມປະເພດຂອງພູມຕ້ານທານທີ່ໃຊ້, ຮູບແບບການຜູກມັດທີ່ເໝາະສົມ, ແລະຄວາມເຂັ້ມແຂງຂອງສັນຍານທີ່ມັນຜະລິດ (ຫຼາຍທີ່ສຸດແລະຫນ້ອຍທີ່ສຸດ), ເອນໄຊມ໌ໃໝ່ສາມາດຖືກລະບຸແລະເພີ່ມເຄິ່ງປະລິມານໃສ່ສ່ວນປະສົມຂອງເອນໄຊມ໌ເພື່ອໃຫ້ glycoconversion ສົມບູນກວ່າ. ໂດຍການວິເຄາະ oligosaccharides ACSH ເປັນຕົວຢ່າງ, ພວກເຮົາສາມາດສ້າງຖານຂໍ້ມູນຂອງພັນທະບັດ glycan ສໍາລັບແຕ່ລະວັດສະດຸຊີວະມວນ. ຄວນສັງເກດຢູ່ທີ່ນີ້ວ່າຄວາມຄ້າຍຄືກັນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງພູມຕ້ານທານຄວນໄດ້ຮັບການພິຈາລະນາ, ແລະຖ້າຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງພວກມັນບໍ່ຮູ້, ສິ່ງນີ້ຈະສ້າງຄວາມຫຍຸ້ງຍາກບາງຢ່າງເມື່ອປຽບທຽບສັນຍານຂອງພູມຕ້ານທານທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. ນອກຈາກນັ້ນ, ການປຽບທຽບພັນທະບັດ glycan ອາດຈະເຮັດວຽກໄດ້ດີທີ່ສຸດລະຫວ່າງຕົວຢ່າງສໍາລັບພູມຕ້ານທານດຽວກັນ. ພັນທະບັດທີ່ແຂງກະດ້າງເຫຼົ່ານີ້ສາມາດເຊື່ອມຕໍ່ກັບຖານຂໍ້ມູນ CAZyme, ເຊິ່ງພວກເຮົາສາມາດລະບຸເອນໄຊມ໌, ເລືອກເອນໄຊມ໌ທີ່ເໝາະສົມແລະທົດສອບເອນໄຊມ໌ທີ່ທໍາລາຍພັນທະບັດ, ຫຼືພັດທະນາລະບົບຈຸລິນຊີເພື່ອສະແດງອອກເອນໄຊມ໌ເຫຼົ່ານີ້ເພື່ອນໍາໃຊ້ໃນ biorefineries44.
ເພື່ອປະເມີນວິທີທີ່ວິທີການທາງດ້ານພູມຕ້ານທານເສີມວິທີການທາງເລືອກສຳລັບການວິເຄາະລັກສະນະ oligosaccharides ນ້ຳໜັກໂມເລກຸນຕ່ຳທີ່ມີຢູ່ໃນ lignocellulosic hydrolysates, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດ MALDI (ຮູບທີ 4, S1-S8) ແລະການວິເຄາະ saccharides ທີ່ມາຈາກ TMS ໂດຍອີງໃສ່ GC-MS ໃນແຜງດຽວກັນ (ຮູບທີ 5). MALDI ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປຽບທຽບວ່າການແຈກຢາຍມວນສານຂອງໂມເລກຸນ oligosaccharide ກົງກັບໂຄງສ້າງທີ່ຕັ້ງໃຈໄວ້ຫຼືບໍ່. ໃນຮູບທີ 4 ສະແດງໃຫ້ເຫັນ MS ຂອງອົງປະກອບທີ່ເປັນກາງ ACN-A ແລະ ACN-B. ການວິເຄາະ ACN-A ໄດ້ຢືນຢັນລະດັບຂອງນ້ຳຕານ pentose ຕັ້ງແຕ່ DP 4–8 (ຮູບທີ 4) ຫາ DP 22 (ຮູບທີ S1), ເຊິ່ງນ້ຳໜັກຂອງມັນສອດຄ່ອງກັບ MeU-xylan oligosaccharides. ການວິເຄາະ ACN-B ໄດ້ຢືນຢັນຊຸດ pentose ແລະ glucoxylan ກັບ DP 8-15. ໃນເອກະສານເສີມເຊັ່ນຮູບ S3, ແຜນທີ່ການແຈກຢາຍມວນສານທີ່ເປັນກົດ FA-C ສະແດງໃຫ້ເຫັນລະດັບຂອງນ້ຳຕານ pentose ທີ່ຖືກທົດແທນ (Me)U ທີ່ມີ DP ຂອງ 8-15 ທີ່ສອດຄ່ອງກັບ xylan ທີ່ຖືກທົດແທນທີ່ພົບໃນການກວດ mAb ທີ່ອີງໃສ່ ELISA. epitopes ແມ່ນສອດຄ່ອງກັນ.
ສະເປກຕຣຳ MALDI-MS ຂອງໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ລະລາຍບໍ່ໄດ້ ແລະ ບໍ່ສອດຄ່ອງກັນ ທີ່ມີຢູ່ໃນ ACS. ໃນທີ່ນີ້, (A) ສ່ວນປະສົມລະດັບນ້ຳໜັກຕ່ຳຂອງ ACN-A ທີ່ມີກົດຢູໂຣນິກທີ່ມີເມທິລແອດ (DP 4-8) ໄດ້ທົດແທນໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ກລູຄູຣອກຊີແລນ ແລະ (B) ໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ກລູຄາໄຣດ໌ກລູຄາໄຣດ໌ກລູຄາໄຣດ໌ກລູຄາໄຣດ໌ກລູຄາໄຣດ໌ກລູຄາໄຣດ໌ກລູຄາໄຣດ໌ກລູຄາໄຣດ໌ກລູຄາໄຣດ໌ (DP 8-15).
ການວິເຄາະສ່ວນປະກອບຂອງກາກໄຄນ໌ທີ່ເຫຼືອຂອງໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ທົນທານຕໍ່ຄວາມຮ້ອນ. ໃນທີ່ນີ້ (A) ສ່ວນປະກອບແຊກຄາໄຣດ໌ TMS ຂອງສ່ວນໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ຕ່າງໆທີ່ໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ການວິເຄາະ GC-MS. (B) ໂຄງສ້າງຂອງນ້ຳຕານທີ່ໄດ້ມາຈາກ TMS ຕ່າງໆທີ່ມີຢູ່ໃນໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌. ACN – ສ່ວນອາເຊໂຕໄນໄຕຣລທີ່ປະກອບດ້ວຍໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ທີ່ເປັນກາງ ແລະ FA – ສ່ວນກົດເຟຣູລິກທີ່ປະກອບດ້ວຍໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ກົດ.
ສະຫຼຸບທີ່ໜ້າສົນໃຈອີກອັນໜຶ່ງໄດ້ຖືກດຶງອອກມາຈາກການວິເຄາະ LC-MS ຂອງສ່ວນ oligosaccharide, ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບ S9 (ວິທີການສາມາດເຫັນໄດ້ໃນເອກະສານເສີມເອເລັກໂຕຣນິກ). ສ່ວນຂອງກຸ່ມ hexose ແລະ -OAc ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຊ້ຳແລ້ວຊ້ຳອີກໃນລະຫວ່າງການຜູກມັດສ່ວນ ACN-B. ການຄົ້ນພົບນີ້ບໍ່ພຽງແຕ່ຢືນຢັນການແຍກສ່ວນທີ່ສັງເກດເຫັນໃນການວິເຄາະ glycome ແລະ MALDI-TOF ເທົ່ານັ້ນ, ແຕ່ຍັງໃຫ້ຂໍ້ມູນໃໝ່ກ່ຽວກັບອະນຸພັນຄາໂບໄຮເດຣດທີ່ມີທ່າແຮງໃນຊີວະມວນ lignocellulosic ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວລ່ວງໜ້າ.
ພວກເຮົາຍັງໄດ້ປະຕິບັດການວິເຄາະສ່ວນປະກອບ glycan ຂອງສ່ວນປະກອບ oligosaccharide ໂດຍໃຊ້ TMS glycan derivatization. ໂດຍໃຊ້ GC-MS, ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດສ່ວນປະກອບຂອງນໍ້າຕານ neural (ບໍ່ແມ່ນອະນຸພັນ) ແລະນໍ້າຕານທີ່ເປັນກົດ (GluA ແລະ GalA) ໃນສ່ວນປະກອບ oligosaccharide (ຮູບທີ 5). ກົດ Glucuronic ພົບໃນສ່ວນປະກອບທີ່ເປັນກົດ C ແລະ D, ໃນຂະນະທີ່ກົດ galacturonic ພົບໃນສ່ວນປະກອບທີ່ເປັນກົດ A ແລະ B, ເຊິ່ງທັງສອງຢ່າງນີ້ແມ່ນສ່ວນປະກອບ DP ສູງຂອງນໍ້າຕານທີ່ເປັນກົດ. ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ບໍ່ພຽງແຕ່ຢືນຢັນຂໍ້ມູນ ELISA ແລະ MALDI ຂອງພວກເຮົາເທົ່ານັ້ນ, ແຕ່ຍັງສອດຄ່ອງກັບການສຶກສາກ່ອນໜ້ານີ້ຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບການສະສົມ oligosaccharide. ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາເຊື່ອວ່າວິທີການພູມຕ້ານທານທີ່ທັນສະໄໝໂດຍໃຊ້ biotinylation ຂອງ oligosaccharides ແລະການກວດ ELISA ຕໍ່ມາແມ່ນພຽງພໍທີ່ຈະກວດພົບ oligosaccharides recalcitrant ທີ່ລະລາຍໃນຕົວຢ່າງທາງຊີວະວິທະຍາຕ່າງໆ.
ເນື່ອງຈາກວິທີການກວດສອບ mAb ທີ່ອີງໃສ່ ELISA ໄດ້ຮັບການຢັ້ງຢືນໂດຍຫຼາຍວິທີການທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ພວກເຮົາຕ້ອງການສຳຫຼວດທ່າແຮງຂອງວິທີການປະລິມານໃໝ່ນີ້ຕື່ມອີກ. ສອງ oligosaccharides ທາງການຄ້າ, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ແລະ 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ໄດ້ຖືກຊື້ ແລະ ທົດສອບໂດຍໃຊ້ວິທີການ mAb ໃໝ່ທີ່ແນໃສ່ glycan ຂອງຝາຈຸລັງ. ຮູບທີ 6 ສະແດງໃຫ້ເຫັນສະຫະສຳພັນເສັ້ນຊື່ລະຫວ່າງສັນຍານຜູກມັດ biotinylated ແລະ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ log ຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ oligosaccharide, ເຊິ່ງແນະນຳຮູບແບບການດູດຊຶມ Langmuir ທີ່ເປັນໄປໄດ້. ໃນບັນດາ mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ແລະ CCRC-M151 ມີຄວາມສຳພັນກັບ XHE, ແລະ CCRC-M108, CCRC-M109, ແລະ LM11 ມີຄວາມສຳພັນກັບ A2XX ໃນຊ່ວງ 1 nm ຫາ 100 nano. ເນື່ອງຈາກມີພູມຕ້ານທານຈຳກັດໃນລະຫວ່າງການທົດລອງ, ການທົດລອງທີ່ຈຳກັດໄດ້ຖືກປະຕິບັດດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣແຕ່ລະອັນ. ຄວນສັງເກດວ່າບາງພູມຕ້ານທານມີປະຕິກິລິຍາແຕກຕ່າງກັນຫຼາຍຕໍ່ກັບໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣດຽວກັນກັບຊັບສະເຕຣດ, ອາດຈະເປັນຍ້ອນວ່າພວກມັນຜູກມັດກັບອີພິໂທບທີ່ແຕກຕ່າງກັນເລັກນ້ອຍ ແລະ ສາມາດມີຄວາມຜູກມັດທີ່ແຕກຕ່າງກັນຫຼາຍ. ກົນໄກ ແລະ ຜົນສະທ້ອນຂອງການລະບຸອີພິໂທບທີ່ຖືກຕ້ອງຈະມີຄວາມຊັບຊ້ອນຫຼາຍຂຶ້ນເມື່ອວິທີການ mAb ໃໝ່ຖືກນຳໃຊ້ກັບຕົວຢ່າງຕົວຈິງ.
ໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣດ໌ທາງການຄ້າສອງຊະນິດໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດຂອບເຂດການກວດຈັບຂອງ mAbs ທີ່ແນໃສ່ glycan ຕ່າງໆ. ໃນທີ່ນີ້, ຄວາມສໍາພັນເສັ້ນຊື່ກັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ log ຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣດ໌ຊີ້ບອກຮູບແບບການດູດຊຶມ Langmuir ສໍາລັບ (A) XHE ດ້ວຍ mAb ແລະ (B) A2XX ດ້ວຍ mAb. epitopes ທີ່ສອດຄ້ອງກັນຊີ້ບອກໂຄງສ້າງຂອງໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣດ໌ທາງການຄ້າທີ່ໃຊ້ເປັນ substrates ໃນການວິເຄາະ.
ການນໍາໃຊ້ພູມຕ້ານທານ monoclonal ທີ່ແນໃສ່ glycan (ການວິເຄາະ glycocomic ຫຼື ການກວດ mAb ທີ່ອີງໃສ່ ELISA) ເປັນເຄື່ອງມືທີ່ມີປະສິດທິພາບສໍາລັບການອະທິບາຍລັກສະນະຢ່າງເລິກເຊິ່ງຂອງ glycans ຝາຈຸລັງທີ່ສໍາຄັນສ່ວນໃຫຍ່ທີ່ປະກອບເປັນຊີວະມວນຂອງພືດ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ການວິເຄາະ glycan ແບບຄລາສສິກພຽງແຕ່ອະທິບາຍລັກສະນະ glycans ຝາຈຸລັງຂະໜາດໃຫຍ່ເທົ່ານັ້ນ, ຍ້ອນວ່າ oligosaccharides ສ່ວນໃຫຍ່ບໍ່ໄດ້ຖືກສະກັດກັ້ນຢ່າງມີປະສິດທິພາບໃນແຜ່ນ ELISA. ໃນການສຶກສານີ້, ຖົ່ວດິນທີ່ຜ່ານການປຸງແຕ່ງ AFEX ໄດ້ຖືກ hydrolyzed ໂດຍ enzymatic ໃນປະລິມານຂອງແຂງສູງ. ການວິເຄາະນໍ້າຕານໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດອົງປະກອບຂອງຄາໂບໄຮເດຣດຝາຈຸລັງ recalcitrant ໃນ hydrolyzate. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ການວິເຄາະ mAb ຂອງ oligosaccharides ຂະໜາດນ້ອຍກວ່າໃນ hydrolysates ຖືກປະເມີນຄ່າຕໍ່າເກີນໄປ, ແລະຕ້ອງມີເຄື່ອງມືເພີ່ມເຕີມເພື່ອເຮັດໃຫ້ oligosaccharides ຢູ່ໃນແຜ່ນ ELISA ເຄື່ອນໄຫວຢ່າງມີປະສິດທິພາບ.
ພວກເຮົາລາຍງານຢູ່ທີ່ນີ້ກ່ຽວກັບວິທີການ immobilization oligosaccharide ແບບໃໝ່ ແລະ ມີປະສິດທິພາບສຳລັບການກວດ mAb ໂດຍການລວມ biotinylation oligosaccharide ຕາມດ້ວຍການກວດ ELISA ໃນແຜ່ນເຄືອບ NeutrAvidin™. oligosaccharides biotinylated ທີ່ຖືກ immobilized ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມຜູກພັນທີ່ພຽງພໍສຳລັບພູມຕ້ານທານເພື່ອເຮັດໃຫ້ສາມາດກວດຫາ oligosaccharides recalcitrant ໄດ້ໄວ ແລະ ມີປະສິດທິພາບ. ການວິເຄາະອົງປະກອບຂອງ oligosaccharides ທີ່ແຂງກະດ້າງເຫຼົ່ານີ້ໂດຍອີງໃສ່ mass spectrometry ຢືນຢັນຜົນໄດ້ຮັບຂອງວິທີການໃໝ່ນີ້ໃນການ immunoscreening. ດັ່ງນັ້ນ, ການສຶກສາເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການລວມກັນຂອງ biotinylation oligosaccharide ແລະການກວດ ELISA ກັບ monoclonal antibodies ທີ່ແນໃສ່ glycan ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກວດຫາ crosslinks ໃນ oligosaccharides ແລະ ສາມາດນຳໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນການສຶກສາທາງຊີວະເຄມີອື່ນໆທີ່ສະແດງລັກສະນະໂຄງສ້າງຂອງ oligosaccharides.
ວິທີການວິເຄາະ glycan ທີ່ອີງໃສ່ biotin ນີ້ແມ່ນບົດລາຍງານທຳອິດທີ່ສາມາດສືບສວນພັນທະບັດຄາໂບໄຮເດຣດທີ່ບໍ່ສາມາດຄວບຄຸມໄດ້ຂອງ oligosaccharides ທີ່ລະລາຍໃນຊີວະມວນຂອງພືດ. ສິ່ງນີ້ຊ່ວຍໃຫ້ເຂົ້າໃຈວ່າເປັນຫຍັງບາງສ່ວນຂອງຊີວະມວນຈຶ່ງແຂງກະດ້າງຫຼາຍເມື່ອເວົ້າເຖິງການຜະລິດເຊື້ອໄຟຊີວະພາບ. ວິທີການນີ້ຕື່ມຊ່ອງຫວ່າງທີ່ສຳຄັນໃນວິທີການວິເຄາະ glycome ແລະຂະຫຍາຍການນຳໃຊ້ຂອງມັນໄປສູ່ຊັ້ນຮອງທີ່ກວ້າງຂວາງກວ່າ oligosaccharides ຂອງພືດ. ໃນອະນາຄົດ, ພວກເຮົາອາດຈະໃຊ້ຫຸ່ນຍົນສຳລັບການ biotinylation ແລະໃຊ້ວິທີການທີ່ພວກເຮົາໄດ້ພັດທະນາສຳລັບການວິເຄາະຕົວຢ່າງທີ່ມີຜົນຜະລິດສູງໂດຍໃຊ້ ELISA.
ຟາງສາລີ (CS) ທີ່ປູກຈາກເມັດພັນປະສົມ Pioneer 33A14 ໄດ້ຖືກເກັບກ່ຽວໃນປີ 2010 ຈາກຟາມ Kramer ໃນ Ray, Colorado. ດ້ວຍການອະນຸຍາດຈາກເຈົ້າຂອງທີ່ດິນ, ຊີວະມວນນີ້ສາມາດນຳໃຊ້ເພື່ອການຄົ້ນຄວ້າໄດ້. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນສະພາບແຫ້ງທີ່ມີຄວາມຊຸ່ມ < 6% ໃນຖົງຊິບລັອກໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນສະພາບແຫ້ງທີ່ມີຄວາມຊຸ່ມ < 6% ໃນຖົງຊິບລັອກໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນບ່ອນແຫ້ງທີ່ຄວາມຊຸ່ມຊື່ນ <6% ໃນຖົງຊິບທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. ຕົວຢ່າງຖືກເກັບໄວ້ໃນຖົງຊິບທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງທີ່ມີຄວາມຊຸ່ມຊື່ນ < 6%.ການສຶກສາໄດ້ປະຕິບັດຕາມແນວທາງຂອງທ້ອງຖິ່ນ ແລະ ລະດັບຊາດ. ການວິເຄາະສ່ວນປະກອບໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ໂປໂຕຄອນ NREL. ພົບວ່າສ່ວນປະກອບປະກອບດ້ວຍ 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% ໂປຣຕີນ ແລະ 13.4% ຂີ້ເທົ່າ.
Cellic® CTec2 (ໂປຣຕີນ 138 ມກ/ມລ, ລະຫັດຜະລິດ VCNI 0001) ເປັນສ່ວນປະສົມທີ່ສັບສົນຂອງ cellulase, β-glucosidase ແລະ Cellic® HTec2 (ໂປຣຕີນ 157 ມກ/ມລ, ລະຫັດຜະລິດ VHN00001) ຈາກ Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (ໂປຣຕີນ 72 ມກ/ມລ), ເຊິ່ງເປັນສ່ວນປະສົມທີ່ສັບສົນຂອງເອນໄຊມ໌ທີ່ທຳລາຍ pectin, ໄດ້ຮັບການບໍລິຈາກຈາກ DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງໂປຣຕີນຂອງເອນໄຊມ໌ໄດ້ຖືກກຳນົດໂດຍການປະເມີນປະລິມານໂປຣຕີນ (ແລະ ການຫັກສ່ວນປະກອບສ່ວນຂອງໄນໂຕຣເຈນທີ່ບໍ່ແມ່ນໂປຣຕີນ) ໂດຍໃຊ້ການວິເຄາະໄນໂຕຣເຈນ Kjeldahl (ວິທີການ AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). ດິນໄດອາໂຕມເຊວ 545 ໄດ້ຊື້ມາຈາກ EMD Millipore (Billerica, MA). ຖ່ານກັມວິດ (DARCO, ເມັດ 100 mesh), Avicel (PH-101), ບີຊໄຊແລນ, ແລະ ສານເຄມີອື່ນໆທັງໝົດໄດ້ຊື້ມາຈາກ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
ການປະຕິບັດກ່ອນການປຸງແຕ່ງ AFEX ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ທີ່ GLBRC (ຫ້ອງທົດລອງຄົ້ນຄວ້າການປ່ຽນແປງຊີວະມວນ, MSU, Lansing, MI, ສະຫະລັດອາເມລິກາ). ການປະຕິບັດກ່ອນການປຸງແຕ່ງໄດ້ປະຕິບັດຢູ່ທີ່ 140°C ເປັນເວລາ 15 ນາທີ. ເວລາພັກອາໄສ 46 ທີ່ອັດຕາສ່ວນ 1:1 ຂອງແອມໂມເນຍບໍ່ມີນໍ້າຕໍ່ຊີວະມວນທີ່ການໂຫຼດ 60% (w/w) ໃນເຄື່ອງປະຕິກອນແບບຕັ້ງໂຕະທີ່ເຮັດດ້ວຍເຫຼັກສະແຕນເລດ (ບໍລິສັດ Parr Instruments). ໃຊ້ເວລາ 30 ນາທີ. ເຄື່ອງປະຕິກອນໄດ້ຖືກນຳມາທີ່ 140°C ແລະແອມໂມເນຍໄດ້ຖືກປ່ອຍອອກມາຢ່າງໄວວາ, ຊ່ວຍໃຫ້ຊີວະມວນກັບຄືນສູ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງໄດ້ຢ່າງໄວວາ. ສ່ວນປະກອບຂອງເຄື່ອງປຸງສາລີທີ່ປຸງແຕ່ງກ່ອນການປຸງແຕ່ງ (ACS) ຂອງ AFEX ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບເຄື່ອງປຸງສາລີທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (UT-CS).
ທາດແຂງສູງ ACSH 25% (w/w) (ປະມານ 8% ການໂຫຼດ dextran) ໄດ້ຖືກກະກຽມເປັນວັດສະດຸເລີ່ມຕົ້ນສຳລັບການຜະລິດ oligosaccharides ໃນຂະໜາດໃຫຍ່. ການ hydrolysis ດ້ວຍ enzymatic ຂອງ ACS ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ສ່ວນປະສົມຂອງ enzyme ທາງການຄ້າລວມທັງ Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (ໃນຊີວະມວນທີ່ຜ່ານການປຸງແຕ່ງແລ້ວ), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan, ແລະ Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg protein/g dextran. ການ hydrolysis ດ້ວຍ enzymatic ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນເຄື່ອງປະຕິກອນຊີວະພາບ 5 ລິດ ທີ່ມີປະລິມານການເຮັດວຽກ 3 ລິດ, pH 4.8, 50°C ແລະ 250 rpm. ຫຼັງຈາກການ hydrolysis ເປັນເວລາ 96 ຊົ່ວໂມງ, hydrolyzate ໄດ້ຖືກເກັບໂດຍການ centrifugation ທີ່ 6000 rpm ເປັນເວລາ 30 ນາທີ ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນທີ່ 14000 rpm ເປັນເວລາ 30 ນາທີ ເພື່ອກຳຈັດທາດແຂງທີ່ບໍ່ໄດ້ hydrolyzed. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ໄຮໂດຣໄລເຊດໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງແບບປອດເຊື້ອຜ່ານບີເກີກອງຂະໜາດ 0.22 ມມ. ໄຮໂດຣໄລເຊດທີ່ກັ່ນຕອງແລ້ວໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນຂວດປອດເຊື້ອທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນໄດ້ແຍກສ່ວນດ້ວຍຄາບອນ.
ການວິເຄາະສ່ວນປະກອບຂອງຕົວຢ່າງຊີວະມວນທີ່ອີງໃສ່ສານສະກັດຕາມຂັ້ນຕອນການວິເຄາະຫ້ອງທົດລອງ NREL: ການກະກຽມຕົວຢ່າງສຳລັບການວິເຄາະສ່ວນປະກອບ (NREL/TP-510-42620) ແລະ ການກຳນົດຄາໂບໄຮເດຣດໂຄງສ້າງ ແລະ ລິງນິນໃນຊີວະມວນ (NREL/TP-510 – 42618)47.
ການວິເຄາະໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ຂອງກະແສໄຮໂດຣໄລເຊດໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນລະດັບ 2 ມລ ໂດຍໃຊ້ວິທີການໄຮໂດຣໄລເຊດກົດທີ່ອີງໃສ່ເຄື່ອງອັດຄວາມຮ້ອນສູງ. ປະສົມຕົວຢ່າງໄຮໂດຣໄລເຊດກັບກົດຊູນຟູຣິກ 72% 69.7 µl ໃນທໍ່ເພາະເຊື້ອທີ່ມີຝາປິດສະກູ 10 ມລ ແລະ ບົ່ມເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງເທິງໂຕະທີ່ອຸນຫະພູມ 121°C, ເຮັດໃຫ້ເຢັນເທິງນ້ຳກ້ອນ ແລະ ກັ່ນຕອງໃສ່ຂວດໂຄຣມາໂຕກຣາຟີຂອງແຫຼວປະສິດທິພາບສູງ (HPLC). ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງໂອລິໂກແຊກຄາໄຣດ໌ໄດ້ຖືກກຳນົດໂດຍການຫັກຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງໂມໂນແຊກຄາໄຣດ໌ໃນຕົວຢ່າງທີ່ບໍ່ໄດ້ໄຮໂດຣໄລເຊດອອກຈາກຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງນ້ຳຕານທັງໝົດໃນຕົວຢ່າງທີ່ຖືກໄຮໂດຣໄລເຊດດ້ວຍກົດ.
ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງນ້ຳຕານກລູໂຄສ, ໄຊໂລສ, ແລະ ອາຣາບິໂນສ ໃນຊີວະມວນທີ່ຖືກໄຮໂດຣໄລສ໌ດ້ວຍກົດ ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ລະບົບ Shimadzu HPLC ທີ່ຕິດຕັ້ງດ້ວຍເຄື່ອງເກັບຕົວຢ່າງອັດຕະໂນມັດ, ເຄື່ອງເຮັດຄວາມຮ້ອນຖັນ, ປໍ້າໄອໂຊຄຣາຕີ, ແລະ ເຄື່ອງກວດຈັບດັດຊະນີການຫັກເຫໃນຖັນ Bio-Rad Aminex HPX-87H. ຖັນດັ່ງກ່າວໄດ້ຖືກຮັກສາໄວ້ທີ່ 50°C ແລະ ລະລາຍດ້ວຍ 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 ໃນນ້ຳ.
ສານລະລາຍນ້ຳໃຕ້ດິນທີ່ຖືກໄຮໂດຣໄລເຊດໄດ້ຖືກເຈືອຈາງ ແລະ ວິເຄາະຫາປະລິມານໂມໂນເມີ ແລະ ໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣ. ນ້ຳຕານໂມໂນເມີທີ່ໄດ້ຮັບຫຼັງຈາກການໄຮໂດຣໄລເຊດດ້ວຍເອນໄຊມ໌ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ HPLC ທີ່ມີຖັນ Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ແລະ ຖັນປ້ອງກັນຂີ້ເທົ່າ. ອຸນຫະພູມຖັນໄດ້ຖືກຮັກສາໄວ້ທີ່ 80°C, ນ້ຳໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນໄລຍະເຄື່ອນທີ່ທີ່ມີອັດຕາການໄຫຼ 0.6 ມລ/ນາທີ. ໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍການໄຮໂດຣໄລເຊດໃນກົດເຈືອຈາງທີ່ 121°C ຕາມວິທີການທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນເອກະສານອ້າງອີງ 41, 48, 49.
ການວິເຄາະ Saccharide ໄດ້ຖືກປະຕິບັດກ່ຽວກັບສິ່ງເສດເຫຼືອຊີວະມວນດິບ, AFEX ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວລ່ວງໜ້າ ແລະ ສິ່ງທີ່ບໍ່ໄດ້ໄຮໂດຣໄລສ໌ທັງໝົດ (ລວມທັງການຜະລິດສານສະກັດຈາກຜະໜັງເຊວຕໍ່ເນື່ອງ ແລະ ການກວດ mAb ຂອງມັນ) ໂດຍໃຊ້ຂັ້ນຕອນທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ 27, 43, 50, 51. ສຳລັບການວິເຄາະ glycome, ສິ່ງເສດເຫຼືອທີ່ບໍ່ລະລາຍໃນເຫຼົ້າຂອງວັດສະດຸຜະໜັງເຊວພືດແມ່ນຖືກກະກຽມຈາກສິ່ງເສດເຫຼືອຊີວະມວນ ແລະ ຖືກນຳໄປສະກັດຕໍ່ເນື່ອງດ້ວຍສານປະຕິກິລິຍາທີ່ຮຸນແຮງຂຶ້ນເຊັ່ນ: ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM ແລະ 0.5% w/v), CON. (1M ແລະ 4M, ທັງສອງມີ 1% w/v sodium borohydride) ແລະ acid chlorite ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ 52,53. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ສານສະກັດໄດ້ຖືກນຳໄປ ELISA ຕໍ່ກັບແຜງທີ່ສັບສົນຂອງ mAb50s ທີ່ມຸ້ງໄປຫາ glycan ຂອງຜະໜັງເຊວ, ແລະ ປະຕິກິລິຍາຜູກມັດ mAb ໄດ້ຖືກນຳສະເໜີເປັນແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນ. mAbs ທີ່ແນໃສ່ glycan ຂອງຜະໜັງເຊວພືດໄດ້ຖືກຊື້ມາຈາກສາງຫ້ອງທົດລອງ (ຊຸດ CCRC, JIM ແລະ MAC).
ການ biotinylation ຂັ້ນຕອນດຽວຂອງ oligosaccharides. ການລວມຕົວຂອງຄາໂບໄຮເດຣດກັບ biotin-LC-hydrazide ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປນີ້. Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) ໄດ້ຖືກລະລາຍໃນ dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) ໂດຍການຄົນຢ່າງແຮງ ແລະ ໃຫ້ຄວາມຮ້ອນທີ່ 65°C ເປັນເວລາ 1 ນາທີ. ກົດ glacial acetic (30 µl) ໄດ້ຖືກເພີ່ມ ແລະ ສ່ວນປະສົມດັ່ງກ່າວໄດ້ຖືກຖອກໃສ່ sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) ແລະ ລະລາຍໝົດຫຼັງຈາກໃຫ້ຄວາມຮ້ອນທີ່ 65°C ເປັນເວລາປະມານ 1 ນາທີ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈາກ 5 ຫາ 8 μl ຂອງສ່ວນປະສົມປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ oligosaccharide ແຫ້ງ (1-100 nmol) ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ໂມລເກີນ 10 ເທົ່າ ຫຼື ຫຼາຍກວ່ານັ້ນຂອງປ້າຍຊື່ທີ່ຢູ່ເທິງປາຍຫຼຸດຜ່ອນ. ປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກປະຕິບັດທີ່ 65°C ເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງ, ຫຼັງຈາກນັ້ນຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກເຮັດໃຫ້ບໍລິສຸດທັນທີ. ບໍ່ໄດ້ໃຊ້ໂຊດຽມໄຊຢາໂນໂບໂຣໄຮໄດຣດໃນການທົດລອງການຕິດສະຫຼາກໂດຍບໍ່ມີການຫຼຸດຜ່ອນ, ແລະຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປະຕິກິລິຍາຢູ່ທີ່ 65°C ເປັນເວລາ 2.5 ຊົ່ວໂມງ.
ການເຄືອບ ELISA ແລະ ການລ້າງຕົວຢ່າງຂອງໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣດ໌ທີ່ມີໄບໂອຕິນ. ຕົວຢ່າງໄບໂອຕິນ 25 μl (100 μl ຂອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ລະລາຍໃນ 5 ml ຂອງສານລະລາຍບັຟເຟີ Tris 0.1 M (TBS)) ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນແຕ່ລະບໍ່ຂອງແຜ່ນທີ່ເຄືອບດ້ວຍ avidin. ບໍ່ຄວບຄຸມໄດ້ຖືກເຄືອບດ້ວຍໄບໂອຕິນ 50 μl ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 10 μg/ml ໃນ 0.1 M TBS. ນ້ຳທີ່ບໍ່ມີໄອອອນຖືກໃຊ້ເປັນສານເຄືອບສຳລັບການວັດແທກແບບເປົ່າ. ເມັດຢາໄດ້ຖືກບົ່ມເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນຄວາມມືດ. ລ້າງແຜ່ນ 3 ຄັ້ງດ້ວຍນົມໄຂມັນຕ່ຳ 0.1% ໃນ 0.1 M TBS ໂດຍໃຊ້ໂປຣແກຣມເລກທີ 11 ສຳລັບ Grenier flat 3A.
ການເພີ່ມ ແລະ ການລ້າງພູມຕ້ານທານຂັ້ນຕົ້ນ. ຕື່ມພູມຕ້ານທານຂັ້ນຕົ້ນ 40 µl ໃສ່ແຕ່ລະບໍ່. ບົ່ມເຊື້ອຈຸລະພາກເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນຄວາມມືດ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈານໄດ້ຖືກລ້າງ 3 ຄັ້ງດ້ວຍນົມ 0.1% ໃນ TBS 0.1M ໂດຍໃຊ້ໂປຣແກຣມລ້າງ #11 ສຳລັບ Grenier Flat 3A.
ຕື່ມພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງ ແລະ ລ້າງ. ຕື່ມພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງຂອງໜູ/ໜູ 50 µl (ເຈືອຈາງ 1:5000 ໃນນົມ 0.1% ໃນ 0.1 M TBS) ໃສ່ແຕ່ລະບໍ່. ບົ່ມ microplate ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນຄວາມມືດ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, microplates ໄດ້ຖືກລ້າງ 5 ຄັ້ງດ້ວຍນົມ 0.1% ໃນ 0.1 M TBS ໂດຍໃຊ້ໂປຣແກຣມລ້າງແຜ່ນ Grenier Flat 5A #12.
ການເພີ່ມຊັ້ນຮອງພື້ນ. ຕື່ມ 50 µl ຂອງ 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ໃສ່ຊັ້ນຮອງພື້ນ (ໂດຍການຕື່ມ 2 ຢອດຂອງ buffer, 3 ຢອດຂອງ TMB, 2 ຢອດຂອງ hydrogen peroxide ໃສ່ນ້ຳ 15 ml ຂອງນ້ຳ deionized). ກະກຽມຊັ້ນຮອງພື້ນ TMB ແລະ vortex ກ່ອນການນຳໃຊ້). ບົ່ມ microplate ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 30 ນາທີ. ໃນຄວາມມືດ.
ເຮັດສຳເລັດຂັ້ນຕອນນີ້ ແລະ ອ່ານເມັດ. ຕື່ມກົດຊູນຟູຣິກ 1 N ຈຳນວນ 50 µl ໃສ່ແຕ່ລະບໍ່ ແລະ ບັນທຶກການດູດຊຶມຈາກ 450 ຫາ 655 nm ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງອ່ານ ELISA.
ກະກຽມສານລະລາຍ 1 ມກ/ມລ ຂອງສານວິເຄາະເຫຼົ່ານີ້ໃນນ້ຳທີ່ບໍ່ມີໄອອອນ: ອາຣາບິໂນສ, ຣາມໂນສ, ຟູໂຄສ, ໄຊໂລສ, ກົດກາແລັກຕູໂຣນິກ (GalA), ກົດກລູໂຄໂຣນິກ (GlcA), ມານໂນສ, ນ້ຳຕານກລູໂຄສ, ກາແລັກໂຕສ, ແລັກໂຕສ, N-ອາເຊຕິລມານໂນຊາມີນ (manNAc), N-ອາເຊຕິລກລູໂຄຊາມີນ (glcNAc), N-ອາເຊຕິລກາແລັກໂຕຊາມີນ (galNAc), ອີໂນຊິທອລ (ມາດຕະຖານພາຍໃນ). ສອງມາດຕະຖານໄດ້ຖືກກະກຽມໂດຍການເພີ່ມສານລະລາຍນ້ຳຕານ 1 ມກ/ມລ ທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຕາຕະລາງທີ 1. ຕົວຢ່າງຖືກແຊ່ແຂງ ແລະ ແຊ່ແຂງໃນອຸນຫະພູມ -80°C ຈົນກວ່ານ້ຳທັງໝົດຈະຖືກເອົາອອກ (ໂດຍປົກກະຕິແລ້ວປະມານ 12-18 ຊົ່ວໂມງ).
ຕື່ມຕົວຢ່າງ 100–500 µg ໃສ່ທໍ່ຝາປິດສະກູໃນເຄື່ອງຊັ່ງວິເຄາະ. ບັນທຶກປະລິມານທີ່ເພີ່ມເຂົ້າໄປ. ທາງທີ່ດີທີ່ສຸດແມ່ນລະລາຍຕົວຢ່າງໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສະເພາະຂອງຕົວລະລາຍ ແລະ ຕື່ມໃສ່ທໍ່ໃນຮູບແບບຂອງແຫຼວ. ໃຊ້ inositol 1 ມກ/ມລ 20 µl ເປັນມາດຕະຖານພາຍໃນສຳລັບແຕ່ລະທໍ່ຕົວຢ່າງ. ປະລິມານຂອງມາດຕະຖານພາຍໃນທີ່ເພີ່ມເຂົ້າໃນຕົວຢ່າງຕ້ອງຄືກັນກັບປະລິມານຂອງມາດຕະຖານພາຍໃນທີ່ເພີ່ມເຂົ້າໃນທໍ່ມາດຕະຖານ.
ຕື່ມເມທານອນທີ່ບໍ່ມີນ້ຳ 8 ມລ ລົງໃນຂວດທີ່ມີຝາປິດ. ຈາກນັ້ນຕື່ມສານລະລາຍເມທານອນ HCl 3 N ຈຳນວນ 4 ມລ, ປິດຝາໃຫ້ແໜ້ນ ແລະ ສັ່ນ. ຂະບວນການນີ້ບໍ່ໄດ້ໃຊ້ນ້ຳ.
ຕື່ມສານລະລາຍເມທານອນ HCl 1 M 500 µl ໃສ່ຕົວຢ່າງໂອລິໂກແຊັກຄາໄຣດ໌ ແລະ ທໍ່ TMS ມາດຕະຖານ. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກບົ່ມໄວ້ຄ້າງຄືນ (168 ຊົ່ວໂມງ) ທີ່ອຸນຫະພູມ 80°C ໃນບລັອກຄວາມຮ້ອນ. ເຮັດໃຫ້ຜະລິດຕະພັນເມທານອນແຫ້ງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງໂດຍໃຊ້ທໍ່ອົບແຫ້ງ. ຕື່ມ MeOH 200 µl ແລະ ອົບແຫ້ງອີກຄັ້ງ. ຂະບວນການນີ້ຖືກເຮັດຊ້ຳສອງຄັ້ງ. ຕື່ມເມທານອນ 200 µl, ໄພຣິດີນ 100 µl ແລະ ອາເຊຕິກແອນໄຮໄດຣດ 100 µl ໃສ່ຕົວຢ່າງ ແລະ ປະສົມໃຫ້ເຂົ້າກັນດີ. ບົ່ມຕົວຢ່າງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 30 ນາທີ. ແລະ ອົບແຫ້ງ. ຕື່ມເມທານອນ 200 µl ແລະ ອົບແຫ້ງອີກຄັ້ງ.
ຕື່ມ Tri-Sil 200 µl ແລະປິດຝາໃຫ້ຮ້ອນເປັນເວລາ 20 ນາທີ. ອົບໃນອຸນຫະພູມ 80°C, ຈາກນັ້ນເຮັດໃຫ້ເຢັນລົງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ. ໃຊ້ທໍ່ອົບແຫ້ງເພື່ອເຮັດໃຫ້ຕົວຢ່າງແຫ້ງຕື່ມອີກໃຫ້ມີປະລິມານປະມານ 50 µl. ສິ່ງສຳຄັນທີ່ຄວນສັງເກດແມ່ນພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ປ່ອຍໃຫ້ຕົວຢ່າງແຫ້ງໝົດ.
ຕື່ມ hexane 2 ml ແລະ ຄົນໃຫ້ເຂົ້າກັນດີໂດຍການປັ່ນ vortexing. ຕື່ມຂົນແກ້ວໃສ່ປາຍຂອງ pipette Pasteur (5-8 ມມ) ໂດຍການໃສ່ຂົນແກ້ວໃສ່ pipette ເສັ້ນຜ່າສູນກາງ 5-3/4 ນິ້ວ. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປั่นແຍກທີ່ 3000 g ເປັນເວລາ 2 ນາທີ. ສິ່ງເສດເຫຼືອທີ່ບໍ່ລະລາຍຈະຖືກຕົກຕະກອນ. ເຮັດໃຫ້ຕົວຢ່າງແຫ້ງເຖິງ 100-150 µl. ປະລິມານປະມານ 1 μl ໄດ້ຖືກສີດເຂົ້າໄປໃນ GC-MS ທີ່ອຸນຫະພູມເລີ່ມຕົ້ນ 80 °C ແລະເວລາເລີ່ມຕົ້ນ 2.0 ນາທີ (ຕາຕະລາງ 2).