Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Нові імунологічні та мас-спектрометричні методи комплексного аналізу стійких олігосахаридів у кукурудзяній печі, попередньо обробленій AFEX.Лігноцелюлозна біомаса є стійкою альтернативою викопному паливу та широко використовується для розробки біотехнологій для виробництва продуктів харчування, кормів, палива та хімікатів.Ключем до цих технологій є розробка конкурентоспроможних процесів перетворення складних вуглеводів, присутніх у клітинних стінках рослин, у прості цукри, такі як глюкоза, ксилоза та арабіноза.Оскільки лігноцелюлозна біомаса є дуже стійкою, її необхідно піддавати термохімічній обробці (наприклад, відлущування волокон аміаком (AFEX), розбавленими кислотами (DA), іонними рідинами (IL)) та біологічним обробкам (наприклад, ферментативному гідролізу та мікробній ферментації) у комбінації для отримання бажаного продукту..Однак, коли комерційні грибні ферменти використовуються в процесі гідролізу, лише 75-85% утворених розчинних цукрів є моносахаридами, а решта 15-25% є розчинними, важкорозчинними олігосахаридами, які не завжди доступні для мікроорганізмів.Раніше ми успішно виділили та очистили розчинні стійкі олігосахариди, використовуючи комбінацію розділення вуглецю та діатомової землі та ексклюзійної хроматографії, а також досліджували їхні властивості інгібування ферментів.Ми виявили, що олігосахариди, які містять замінники метильованої уронової кислоти з вищим ступенем полімеризації (DP), важче обробляти комерційними сумішами ферментів, ніж олігосахариди з низьким DP і нейтральні олігосахариди.Тут ми повідомляємо про використання кількох додаткових методів, у тому числі профілювання гліканів з використанням моноклональних антитіл (mAbs), специфічних для гліканів біомаси рослин, для характеристики гліканових зв’язків у клітинних стінках рослин і ферментативних гідролізатах, іонізації лазерної десорбції за допомогою матриці, часпролітної мас-спектрометрії..MALDI-TOF-MS) використовує структурно-інформативні діагностичні піки, отримані за допомогою спектроскопії після вторинного розпаду негативних іонів, газової хроматографії та мас-спектрометрії (GC-MS) для характеристики олігосахаридних зв’язків з дериватизацією та без неї.Через малий розмір олігосахаридів (DP 4–20) ці молекули важко використовувати для зв’язування та характеристики mAb.Щоб подолати цю проблему, ми застосували новий метод іммобілізації олігосахаридів на основі кон’югації біотину, який успішно позначив більшість розчинних олігосахаридів з низьким вмістом DP на поверхні мікропланшету, який потім використовувався у високопродуктивній системі mAb для специфічного аналізу лігування.Цей новий метод у майбутньому сприятиме розробці більш досконалих високопродуктивних аналізів глікоми, які можна буде використовувати для виділення та характеристики олігосахаридів, присутніх у біомаркерах, для діагностичних цілей.
Лігноцелюлозна біомаса, що складається з сільськогосподарських, лісових, трав’яних і деревних матеріалів, є потенційною сировиною для виробництва біопродуктів, включаючи харчові продукти, корми, паливо та хімічні прекурсори для виробництва високоцінних продуктів1.Вуглеводи (такі як целюлоза та геміцелюлоза), присутні в клітинних стінках рослин, деполімеризуються в моносахариди шляхом хімічної обробки та біотрансформації (такої як ферментативний гідроліз та мікробна ферментація).Звичайні методи попередньої обробки включають розширення волокон аміаком (AFEX), розбавлену кислоту (DA), іонну рідину (IL) і паровий вибух (SE), які використовують комбінацію хімікатів і тепла для зменшення виробництва лігноцелюлози шляхом відкриття клітинних стінок рослин3,4.стійкість речовини, 5. Ферментативний гідроліз здійснюється при високому вмісті твердих речовин з використанням комерційних активних вуглеводовмісних ферментів (CAZymes) і мікробної ферментації з використанням трансгенних дріжджів або бактерій для виробництва біопалива та хімікатів 6 .
CAZymes у комерційних ферментах складаються зі складної суміші ферментів, які синергетично розщеплюють складні зв’язки вуглевод-цукор з утворенням моносахаридів2,7.Як ми повідомляли раніше, складна мережа ароматичних полімерів лігніну з вуглеводами робить їх дуже важкорозчинними, що призводить до неповного перетворення цукру, накопичуючи 15-25% статевих олігосахаридів, які не утворюються під час ферментативного гідролізу попередньо обробленої біомаси.Це поширена проблема з різними методами попередньої обробки біомаси.Деякі причини цього вузького місця включають інгібування ферментів під час гідролізу або відсутність або низький рівень основних необхідних ферментів, необхідних для розриву зв’язків цукру в рослинній біомасі.Розуміння складу та структурних характеристик цукрів, таких як цукрові зв’язки в олігосахаридах, допоможе нам покращити перетворення цукру під час гідролізу, зробивши біотехнологічні процеси економічно конкурентоспроможними з продуктами, отриманими з нафти.
Визначення структури вуглеводів є складним завданням і вимагає поєднання таких методів, як рідинна хроматографія (РХ)11,12, спектроскопія ядерного магнітного резонансу (ЯМР)13, капілярний електрофорез (СЕ)14,15,16 та мас-спектрометрія (МС)17., вісімнадцять.Методи МС, такі як часпролітна мас-спектрометрія з лазерною десорбцією та іонізацією за допомогою матриці (MALDI-TOF-MS), є універсальним методом ідентифікації вуглеводних структур.Останнім часом тандемна МС адуктів іонів натрію, викликана зіткненням, дисоціація (CID) найбільш широко використовувалася для ідентифікації відбитків пальців, що відповідають положенням приєднання олігосахаридів, аномерним конфігураціям, послідовностям і положенням розгалуження 20, 21.
Аналіз гліканів є чудовим інструментом для поглибленої ідентифікації вуглеводних зв’язків22.Цей метод використовує моноклональні антитіла (mAbs), спрямовані на глікан клітинної стінки рослин, як зонди для розуміння складних вуглеводних зв’язків.По всьому світу доступно понад 250 mAb, розроблених проти різних лінійних і розгалужених олігосахаридів з використанням різних сахаридів24.Кілька mAb широко використовувалися для характеристики структури, складу та модифікацій клітинної стінки рослини, оскільки існують значні відмінності залежно від типу клітини рослини, органу, віку, стадії розвитку та середовища росту25,26.Зовсім недавно цей метод використовувався для розуміння популяцій везикул у рослинних і тваринних системах і їхньої відповідної ролі в транспорті гліканів, що визначається субклітинними маркерами, стадіями розвитку або подразниками навколишнього середовища, а також для визначення ферментативної активності.Деякі з різних структур гліканів і ксиланів, які були ідентифіковані, включають пектин (P), ксилан (X), манан (M), ксилоглюкани (XylG), глюкани зі змішаними зв’язками (MLG), арабіноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкуронова кислота-арабіноксилан (GArbX) і арабіно-галактан (ArbG)29.
Однак, незважаючи на всі ці дослідницькі зусилля, лише кілька досліджень були зосереджені на природі накопичення олігосахаридів під час гідролізу з високим вмістом твердих речовин (HSL), включаючи вивільнення олігосахаридів, зміни довжини олігомерного ланцюга під час гідролізу, різні полімери з низьким DP та їхні криві.розподіли 30,31,32.Тим часом, хоча аналіз гліканів виявився корисним інструментом для всебічного аналізу структури гліканів, важко оцінити водорозчинні олігосахариди з низьким DP за допомогою методів антитіл.Менші DP-олігосахариди з молекулярною масою менше 5-10 кДа не зв’язуються з планшетами ELISA 33, 34 і змиваються перед додаванням антитіл.
Тут ми вперше демонструємо аналіз ELISA на планшетах, покритих авідином, з використанням моноклональних антитіл, поєднуючи одноетапну процедуру біотинілювання для розчинних тугоплавких олігосахаридів з аналізом глікоми.Наш підхід до аналізу глікоми підтверджено MALDI-TOF-MS та GC-MS аналізом комплементарних олігосахаридних зв’язків із використанням дериватізації гідролізованих цукрових композицій триметилсилілом (TMS).Цей інноваційний підхід може бути розроблений як високопродуктивний метод у майбутньому та знайти ширше застосування в біомедичних дослідженнях35.
Посттрансляційні модифікації ферментів і антитіл, такі як глікозилювання36, впливають на їх біологічну активність.Наприклад, зміни в глікозилюванні сироваткових білків відіграють важливу роль у запальному артриті, і зміни в глікозилюванні використовуються як діагностичні маркери37.У літературі повідомлялося, що різні глікани легко з’являються при різноманітних захворюваннях, включаючи хронічні запальні захворювання шлунково-кишкового тракту та печінки, вірусні інфекції, рак яєчників, молочної залози та простати38,39,40.Розуміння структури гліканів за допомогою методів ELISA на основі антитіл дасть додаткову впевненість у діагностиці захворювання без використання складних методів РС.
Наше попереднє дослідження показало, що стійкі олігосахариди залишаються негідролізованими після попередньої обробки та ферментативного гідролізу (рис. 1).У нашій раніше опублікованій роботі ми розробили метод твердофазної екстракції активованим вугіллям для виділення олігосахаридів із попередньо обробленого AFEX гідролізату кукурудзяного печі (ACSH)8.Після первинної екстракції та розділення олігосахариди далі фракціонували за допомогою ексклюзійної хроматографії (SEC) і збирали в порядку молекулярної маси.Мономери та олігомери цукру, вивільнені в результаті різних попередніх обробок, аналізували за допомогою аналізу складу цукру.При порівнянні вмісту олігомерів цукру, отриманих різними методами попередньої обробки, присутність стійких олігосахаридів є загальною проблемою при перетворенні біомаси на моносахариди і може призвести до зниження виходу цукру щонайменше на 10-15% і навіть до 18%.НАС.Цей метод використовується для подальшого великомасштабного виробництва олігосахаридних фракцій.Отриманий ACH і його подальші фракції з різною молекулярною масою були використані як експериментальний матеріал для характеристики олігосахаридів у цій роботі.
Після попередньої обробки та ферментативного гідролізу стійкі олігосахариди залишалися негідролізованими.Тут (A) — метод розділення олігосахаридів, у якому олігосахариди виділяють із попередньо обробленого AFEX гідролізату кукурудзяного печі (ACSH) за допомогою наповненого шару активованого вугілля та діатомової землі;(B) Метод розділення олігосахаридів.Олігосахариди далі розділяли ексклюзійною хроматографією (SEC);(C) Мономери та олігомери сахаридів, вивільнені в результаті різних попередніх обробок (розведена кислота: DA, іонна рідина: IL та AFEX).Умови ферментативного гідролізу: високе навантаження твердих речовин 25% (маса/маса) (приблизно 8% навантаження глюкану), 96 годин гідролізу, 20 мг/г комерційного навантаження ферменту (співвідношення Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) і (D) Цукрові мономери та олігомери глюкози, ксилози та арабінози, що вивільняються з кукурудзяної печі, попередньо обробленої AFEX ( ACS).
Аналіз гліканів виявився корисним інструментом для комплексного структурного аналізу гліканів в екстрактах, виділених із твердих залишків біомаси.Однак водорозчинні сахариди недостатньо представлені за допомогою цього традиційного методу41, оскільки олігосахариди з низькою молекулярною масою важко іммобілізувати на планшетах ELISA, і вони вимиваються перед додаванням антитіл.Таким чином, для зв’язування антитіл і визначення характеристик використовувався одноетапний метод біотинілювання для покриття розчинних, невідповідних олігосахаридів на вкритих авідином планшетах ELISA.Цей метод було перевірено з використанням раніше виготовленого нами ACSH і фракції на основі його молекулярної маси (або ступеня полімеризації, DP).Одноетапне біотинілювання було використано для підвищення афінності зв’язування олігосахаридів шляхом додавання біотин-LC-гідразиду до відновного кінця вуглеводу (рис. 2).У розчині напівацетальна група на відновлювальному кінці реагує з гідразидною групою біотин-LC-гідразиду з утворенням гідразонового зв’язку.У присутності відновника NaCNBH3 гідразоновий зв'язок відновлюється до стабільного біотинільованого кінцевого продукту.З модифікацією кінця, що знижує цукор, стало можливим зв’язування олігосахаридів з низьким вмістом DP у планшетах ELISA, і в нашому дослідженні це було зроблено на пластинах, покритих авідином, з використанням глікан-націлених моноклональних антитіл.
Скринінг моноклональних антитіл на основі ІФА на біотинільовані олігосахариди.Тут (A) комбіноване біотинілювання олігосахаридів і подальший скринінг ELISA з націленими на глікан моноклональними антителами на планшетах, покритих нейтравідином, і (B) показує одноетапну процедуру біотинілювання продуктів реакції.
Покриті авідином пластини з антитілами, кон’югованими з олігосахаридами, потім додавали до первинних і вторинних антитіл і промивали у чутливому до світла та часу середовищі.Після завершення зв’язування антитіл додайте субстрат TMB для інкубації планшета.Остаточно реакцію зупиняли сірчаною кислотою.Інкубовані планшети аналізували за допомогою пристрою для зчитування ELISA для визначення сили зв’язування кожного антитіла для виявлення специфічного для антитіла перехресного зшивання.Деталі та параметри експерименту дивіться у відповідному розділі «Матеріали та методи».
Ми демонструємо корисність цього нещодавно розробленого методу для конкретних застосувань, характеризуючи розчинні олігосахариди, присутні в ACSH, а також у сирих і очищених фракціях олігосахаридів, виділених з лігноцелюлозних гідролізатів.Як показано на малюнку 3, найпоширенішими епітоп-заміщеними ксиланами, ідентифікованими в ACSH за допомогою методів аналізу біоацильованого глікому, зазвичай є уронові (U) або метилуронові (MeU) і пектинові арабіногалактани.Більшість з них також були знайдені в нашому попередньому дослідженні аналізу гліканів негідролізованих твердих речовин (UHS)43.
Виявлення стійких олігосахаридних епітопів за допомогою моноклонального антитіла, спрямованого на глікан клітинної стінки.«Нейтральна» фракція — це фракція ACN, а «кисла» — це фракція FA.Яскравіші червоні кольори на тепловій карті вказують на вищий вміст епітопів, а яскравіші сині вказують на порожній фон.Значення кольору на шкалі базуються на необроблених значеннях ОП для складів N=2.Основні епітопи, розпізнані антитілами, показані праворуч.
Ці нецелюлозні структури не можуть бути розщеплені найпоширенішими целюлазами та геміцелюлазами у досліджуваній комерційній суміші ферментів, яка включає найбільш часто використовувані комерційні ферменти.Тому для їх гідролізу потрібні нові допоміжні ферменти.Без необхідних нецелюлозних додаткових ферментів ці нецелюлозні зв’язки запобігають повному перетворенню в моносахариди, навіть якщо їхні вихідні цукрові полімери екстенсивно гідролізуються на коротші фрагменти та розчиняються за допомогою комерційних сумішей ферментів.
Подальше дослідження розподілу сигналу та його сили зв’язування показало, що епітопи зв’язування були нижчими у фракціях цукру з високим вмістом DP (A, B, C, DP до 20+), ніж у фракціях з низьким вмістом DP (D, E, F, DP) у димерах) (рис. 1).Кислотні фрагменти частіше зустрічаються в нецелюлозних епітопах, ніж нейтральні фрагменти.Ці явища узгоджуються з картиною, що спостерігалася в нашому попередньому дослідженні, де висока DP і кислотні фрагменти були більш стійкими до ферментативного гідролізу.Таким чином, наявність нецелюлозних гліканових епітопів і замін U і MeU може значною мірою сприяти стабільності олігосахаридів.Слід зазначити, що ефективність зв’язування та виявлення може бути проблематичною для олігосахаридів з низьким DP, особливо якщо епітоп є димерним або тримерним олігосахаридом.Це можна перевірити за допомогою комерційних олігосахаридів різної довжини, кожен з яких містить лише один епітоп, який зв’язується з конкретним mAb.
Таким чином, використання структуроспецифічних антитіл виявило певні типи стійких зв'язків.Залежно від типу використовуваного антитіла, відповідного шаблону лігування та сили сигналу, який він виробляє (найбільший і найменш поширений), нові ферменти можуть бути ідентифіковані та додані напівкількісно до суміші ферментів для більш повного глікоконверсії.Взявши за приклад аналіз олігосахаридів ACSH, ми можемо створити базу даних гліканових зв’язків для кожного матеріалу біомаси.Тут слід зазначити, що слід враховувати різну афінність антитіл, і якщо їх афінність невідома, це створить певні труднощі при порівнянні сигналів різних антитіл.Крім того, порівняння гліканових зв’язків може найкраще працювати між зразками для того самого антитіла.Потім ці стійкі зв’язки можна пов’язати з базою даних CAZyme, з якої ми можемо ідентифікувати ферменти, вибрати ферменти-кандидати та перевірити ферменти, що розривають зв’язки, або розробити мікробні системи для експресії цих ферментів для використання на біорафінарних заводах44.
Щоб оцінити, як імунологічні методи доповнюють альтернативні методи характеристики низькомолекулярних олігосахаридів, присутніх у лігноцелюлозних гідролізатах, ми виконали MALDI (рис. 4, S1-S8) та аналіз отриманих з ТМС сахаридів на основі ГХ-МС на тій же панелі (рис. 5) олігосахаридної частини.MALDI використовується для порівняння того, чи відповідає розподіл маси молекул олігосахаридів запланованій структурі.На рис.4 показано МС нейтральних компонентів ACN-A і ACN-B.Аналіз ACN-A підтвердив діапазон цукрів пентози в діапазоні від DP 4–8 (рис. 4) до DP 22 (рис. S1), маси яких відповідають олігосахаридам MeU-ксилан.Аналіз ACN-B підтвердив серію пентози та глюкоксилану з DP 8-15.У додатковому матеріалі, такому як Рисунок S3, карти масового розподілу кислих фрагментів FA-C показують діапазон (Me)U заміщених пентозних цукрів із DP 8-15, які відповідають заміщеним ксиланам, виявленим у скринінгу mAb на основі ELISA.Епітопи узгоджені.
Спектр MALDI-MS розчинних невідповідних олігосахаридів, присутніх в ACS.Тут (A) фракції низького діапазону маси ACN-A, що містять метильовану уронову кислоту (DP 4-8), заміщені глюкуроксилановими олігосахариди та (B) ACN-B ксилан і метильовані олігосахариди уронової кислоти, заміщені глюкуроксиланом (DP 8-15).
Аналіз складу гліканового залишку тугоплавких олігосахаридів.Тут (A) TMS сахаридна композиція різних фракцій олігосахаридів, отримана за допомогою аналізу GC-MS.(B) Структури різних отриманих з ТМС цукрів, присутніх в олігосахаридах.ACN – фракція ацетонітрилу, що містить нейтральні олігосахариди, і FA – фракція ферулової кислоти, що містить кислі олігосахариди.
Інший цікавий висновок був зроблений за допомогою РХ-МС аналізу фракції олігосахаридів, як показано на малюнку S9 (методи можна побачити в електронному додатковому матеріалі).Фрагменти груп гексози та -OAc неодноразово спостерігалися під час лігування фракції ACN-B.Це відкриття не тільки підтверджує фрагментацію, що спостерігається в аналізі глікоми та MALDI-TOF, але також надає нову інформацію про потенційні похідні вуглеводів у попередньо обробленій лігноцелюлозній біомасі.
Ми також провели аналіз гліканового складу олігосахаридних фракцій за допомогою дериватізації гліканів TMS.За допомогою ГХ-МС визначили склад нейронних (непохідних) і кислих цукрів (GluA і GalA) у фракції олігосахаридів (рис. 5).Глюкуронова кислота міститься в кислих компонентах C і D, тоді як галактуронова кислота міститься в кислих компонентах A і B, обидва з яких є компонентами з високим вмістом DP кислих цукрів.Ці результати не тільки підтверджують наші дані ELISA та MALDI, але також узгоджуються з нашими попередніми дослідженнями накопичення олігосахаридів.Тому ми вважаємо, що сучасних імунологічних методів із застосуванням біотинілювання олігосахаридів і подальшого скринінгу ELISA достатньо для виявлення розчинних стійких олігосахаридів у різних біологічних зразках.
Оскільки методи скринінгу mAb на основі ELISA були перевірені кількома різними методами, ми хотіли глибше вивчити потенціал цього нового кількісного методу.Два комерційних олігосахариди, ксилогексасахаридний олігосахарид (XHE) і 23-α-L-арабінофуранозил-ксилотріоза (A2XX), були придбані та протестовані з використанням нового підходу mAb, націленого на глікан клітинної стінки.На рисунку 6 показана лінійна кореляція між сигналом зв’язування біотинілованих речовин і логарифмом концентрації концентрації олігосахаридів, що свідчить про можливу модель адсорбції Ленгмюра.Серед mAb CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 і CCRC-M151 корелювали з XHE, а CCRC-M108, CCRC-M109 і LM11 корелювали з A2XX в діапазоні від 1 нм до 100 нано.Через обмежену доступність антитіл під час експерименту проводили обмежені експерименти з кожною концентрацією олігосахариду.Тут слід зазначити, що деякі антитіла дуже по-різному реагують на той самий олігосахарид як субстрат, ймовірно, через те, що вони зв’язуються з дещо різними епітопами та можуть мати дуже різну афінність зв’язування.Механізми та наслідки точної ідентифікації епітопу будуть набагато складнішими, коли новий підхід mAb буде застосовано до реальних зразків.
Для визначення діапазону виявлення різних моноклональних антитіл, націлених на глікан, використовували два комерційних олігосахариди.Тут лінійні кореляції з логарифмом концентрації концентрації олігосахаридів вказують на схеми адсорбції Ленгмюра для (A) XHE з mAb і (B) A2XX з mAb.Відповідні епітопи вказують на структури комерційних олігосахаридів, які використовуються як субстрати в аналізі.
Використання націлених на глікан моноклональних антитіл (глікокомний аналіз або скринінг mAb на основі ELISA) є потужним інструментом для поглибленої характеристики більшості основних гліканів клітинної стінки, які складають рослинну біомасу.Однак класичний аналіз гліканів характеризує лише більші глікани клітинної стінки, оскільки більшість олігосахаридів неефективно іммобілізуються на планшетах ELISA.У цьому дослідженні попередньо оброблена AFEX кукурудза була гідролізована ферментативно з високим вмістом твердих речовин.Аналіз цукру використовувався для визначення складу неподатливих вуглеводів клітинної стінки в гідролізаті.Однак аналіз mAb менших олігосахаридів у гідролізатах недооцінюється, і необхідні додаткові інструменти для ефективної іммобілізації олігосахаридів на планшетах ELISA.
Ми повідомляємо тут про новий та ефективний метод іммобілізації олігосахаридів для скринінгу mAb шляхом комбінування біотинілювання олігосахаридів з подальшим скринінгом ELISA на пластинах, покритих NeutrAvidin™.Іммобілізовані біотинільовані олігосахариди показали достатню спорідненість до антитіл, щоб забезпечити швидке та ефективне виявлення стійких олігосахаридів.Аналіз складу цих стійких олігосахаридів на основі мас-спектрометрії підтвердив результати цього нового підходу до імунокринінгу.Таким чином, ці дослідження демонструють, що комбінація біотинілювання олігосахаридів і скринінгу ELISA з моноклональними антитілами, націленими на глікан, може бути використана для виявлення зшивок в олігосахаридах і може широко застосовуватися в інших біохімічних дослідженнях, що характеризують структуру олігосахаридів.
Цей метод профілювання гліканів на основі біотину є першим звітом, який дозволяє досліджувати стійкі вуглеводні зв’язки розчинних олігосахаридів у рослинній біомасі.Це допомагає зрозуміти, чому деякі частини біомаси такі вперті, коли справа доходить до виробництва біопалива.Цей метод заповнює важливу прогалину в методах аналізу глікому та розширює його застосування на більш широкий спектр субстратів, крім рослинних олігосахаридів.У майбутньому ми можемо використовувати робототехніку для біотинілювання та використовувати розроблений нами метод для високопродуктивного аналізу зразків за допомогою ELISA.
Кукурудзяна солома (CS), вирощена з гібридного насіння Pioneer 33A14, була зібрана в 2010 році на фермах Kramer у Рей, штат Колорадо.З дозволу землевласника цю біомасу можна використовувати для досліджень. Зразки зберігалися сухими < 6% вологи в мішках на блискавці при кімнатній температурі. Зразки зберігалися сухими < 6% вологи в мішках на блискавці при кімнатній температурі. Образці зберігалися сухими при вологості < 6% в пакетах із застійно-молочною при кімнатній температурі. Зразки зберігали сухими при вологості <6% у пакетах на блискавці при кімнатній температурі.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образці зберігаються в пакетах із застійно-молочним при кімнатній температурі з вологістю < 6%. Зразки зберігаються в пакетах на блискавці при кімнатній температурі з вологістю < 6%.Дослідження відповідало місцевим і національним рекомендаціям.Аналіз складу проводили за допомогою протоколу NREL.Встановлено, що композиція містить 31,4% глюкану, 18,7% ксилану, 3,3% арабінану, 1,2% галактану, 2,2% ацетилу, 14,3% лігніну, 1,7% протеїну та 13,4% золи.
Cellic® CTec2 (138 мг білка/мл, лот VCNI 0001) — це складна суміш целюлази, β-глюкозидази та Cellic® HTec2 (157 мг білка/мл, лот VHN00001) від Novozymes (Франклінтон, Північна Кароліна, США)).Multifect Pectinase® (72 мг білка/мл), складна суміш ферментів, що розкладають пектин, була надана DuPont Industrial Biosciences (Пало-Альто, Каліфорнія, США).Концентрацію ферментного білка визначали шляхом оцінки вмісту білка (і віднімання внеску небілкового азоту) за допомогою аналізу азоту К’єльдаля (метод AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Діатоміт 545 був придбаний у EMD Millipore (Billerica, MA).Активоване вугілля (DARCO, гранули 100 меш), Avicel (PH-101), буковий ксилан та всі інші хімікати були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Миссурі).
Попередню обробку AFEX проводили в GLBRC (Дослідницька лабораторія біомаси, MSU, Лансінг, Мічиган, США).Попередню обробку проводили при 140°C протягом 15 хвилин.46 час перебування при співвідношенні безводного аміаку до біомаси 1:1 при завантаженні 60% (мас./мас.) у настільному реакторі періодичної дії з нержавіючої сталі (Parr Instruments Company).Це зайняло 30 хвилин.Реактор був нагрітий до 140°C, і аміак швидко виділявся, дозволяючи біомасі швидко повернутися до кімнатної температури.Склад попередньо обробленої кукурудзяної печі AFEX (ACS) був подібний до складу необробленої кукурудзяної печі (UT-CS).
ACSH з високим вмістом твердих речовин 25% (мас./мас.) (приблизно 8% завантаження декстрану) готували як вихідний матеріал для великомасштабного виробництва олігосахаридів.Ферментативний гідроліз ACS проводили з використанням комерційної ферментної суміші Cellic® Ctec2 10 мг білка/г глюкану (у попередньо обробленій біомасі), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг білка/г глюкану та Multifect Pectinase (Genencor Inc, США).).), 5 мг білка/г декстрану.Ферментативний гідроліз проводили в 5-літровому біореакторі робочим об'ємом 3 л, рН 4,8, 50°С і 250 об/хв.Після гідролізу протягом 96 годин гідролізат збирали центрифугуванням при 6000 об/хв протягом 30 хвилин, а потім при 14000 об/хв протягом 30 хвилин для видалення негідролізованих твердих речовин.Потім гідролізат піддавали стерильній фільтрації через 0,22 мм фільтрувальний стакан.Відфільтрований гідролізат зберігали в стерильних пляшках при 4°C і потім фракціонували на вугіллі.
Аналіз складу зразків біомаси на основі екстракту згідно з процедурами лабораторного аналізу NREL: підготовка зразків для аналізу складу (NREL/TP-510-42620) та визначення структурних вуглеводів і лігніну в біомасі (NREL/TP-510 – 42618)47.
Олігосахаридний аналіз потоку гідролізату проводили в масштабі 2 мл, використовуючи метод кислотного гідролізу в автоклаві.Змішайте зразок гідролізату з 69,7 мкл 72% сірчаної кислоти в культуральній пробірці об’ємом 10 мл, що загвинчується, та інкубуйте протягом 1 години на столі при 121 °C, охолодіть на льоду та відфільтруйте у флакон високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ).Концентрацію олігосахаридів визначали шляхом віднімання концентрації моносахаридів у негідролізованому зразку із загальної концентрації цукру в кислотно-гідролізованому зразку.
Концентрації глюкози, ксилози та арабінози в біомасі, гідролізованій кислотою, аналізували за допомогою системи ВЕРХ Shimadzu, оснащеної автоматичним пробовідбірником, нагрівачем колонки, ізократичним насосом і детектором показника заломлення на колонці Bio-Rad Aminex HPX-87H.Колонку підтримували при 50°C і елюювали 0,6 мл/хв 5 мМ H2SO4 у воді.потік.
Супернатант гідролізату розбавляли та аналізували на вміст мономерів і олігосахаридів.Мономерні цукри, отримані після ферментативного гідролізу, аналізували за допомогою ВЕРХ, оснащеного колонкою Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P і колонкою з золою.Температуру колонки підтримували на рівні 80°С, як рухому фазу використовували воду зі швидкістю потоку 0,6 мл/хв.Олігосахариди визначали шляхом гідролізу в розведеній кислоті при 121°C за методами, описаними в ref.41, 48, 49.
Аналіз сахаридів проводили на сирих, попередньо оброблених AFEX і всіх негідролізованих залишках біомаси (включаючи виробництво серійних екстрактів клітинної стінки та їх скринінг mAb) за допомогою описаних раніше процедур 27, 43, 50, 51.Для аналізу глікому нерозчинні в спирті залишки матеріалу клітинних стінок рослин готують із залишків біомаси та піддають серійній екстракції за допомогою все більш агресивних реагентів, таких як оксалат амонію (50 мМ), карбонат натрію (50 мМ і 0,5% мас./об.), CON.(1М і 4М, обидва з 1% мас./об. борогідриду натрію) і кислий хлорит, як описано раніше52,53.Потім екстракти піддавали ELISA проти комплексної панелі mAb50, спрямованих на глікан клітинної стінки, і реакції зв’язування mAb представляли у вигляді теплової карти.МАТ, націлені на глікан клітинної стінки рослин, були придбані з лабораторних запасів (серії CCRC, JIM і MAC).
Одностадійне біотинілювання олігосахаридів.Кон'югацію вуглеводів з біотин-LC-гідразидом проводили за допомогою наступної процедури.Біотин-LC-гідразид (4,6 мг/12 мкмоль) розчиняли в диметилсульфоксиді (DMSO, 70 мкл) інтенсивним перемішуванням і нагріванням при 65°C протягом 1 хв.Додавали крижану оцтову кислоту (30 мкл) і суміш виливали в ціаноборгідрид натрію (6,4 мг/100 мкмоль) і повністю розчиняли після нагрівання при 65°C протягом приблизно 1 хвилини.Потім від 5 до 8 мкл реакційної суміші додавали до висушеного олігосахариду (1-100 нмоль) для отримання 10-кратного або більше молярного надлишку мітки над відновним кінцем.Реакцію проводили при 65°C протягом 2 годин, після чого зразки негайно очищали.Ціаноборгідрид натрію не використовувався в експериментах з маркування без відновлення, і зразки реагували при 65°C протягом 2,5 годин.
ІФА покриття та відмивання зразків біотинільованих олігосахаридів.25 мкл біотинільованих зразків (100 мкл кожного концентрованого зразка, розведеного в 5 мл 0,1 М трис-буферного розчину (TBS)) додавали в кожну лунку планшета, покритого авідином.Контрольні лунки покривали 50 мкл біотину в концентрації 10 мкг/мл в 0,1 М TBS.Деіонізовану воду використовували як покриття для холостих вимірювань.Планшет інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі в темряві.Промийте пластину 3 рази 0,1% знежиреним молоком у 0,1 М TBS за допомогою програми №.11 для Grenier flat 3A.
Додавання та відмивання первинних антитіл.Додайте 40 мкл первинного антитіла в кожну лунку.Інкубуйте мікропланшет протягом 1 години при кімнатній температурі в темряві.Потім планшети промивали 3 рази 0,1% молоком у 0,1М TBS, використовуючи програму промивання №11 для Grenier Flat 3A.
Додайте вторинне антитіло та промийте.Додайте 50 мкл вторинного антитіла миші/щура (розведеного 1:5000 у 0,1% молоці в 0,1 М TBS) до кожної лунки.Інкубуйте мікропланшет протягом 1 години при кімнатній температурі в темряві.Потім мікропланшети промивали 5 разів 0,1% молоком у 0,1 М TBS, використовуючи програму промивання планшетів Grenier Flat 5A №12.
Додавання субстрату.Додайте 50 мкл 3,3′,5,5′-тетраметилбензидину (ТМВ) до основного субстрату (додавши 2 краплі буфера, 3 краплі ТМВ, 2 краплі перекису водню до 15 мл деіонізованої води).Підготуйте субстрат TMB.і перемішайте перед використанням).Інкубуйте мікропланшет при кімнатній температурі протягом 30 хвилин.В темно.
Виконайте крок і прочитайте табличку.Додайте 50 мкл 1 н. сірчаної кислоти в кожну лунку та зафіксуйте абсорбцію від 450 до 655 нм за допомогою пристрою для зчитування ELISA.
Приготуйте 1 мг/мл розчинів цих аналітів у деіонізованій воді: арабінози, рамнози, фукози, ксилози, галактуронової кислоти (GalA), глюкуронової кислоти (GlcA), манози, глюкози, галактози, лактози, N-ацетилманнозаміну (manNAc), N-ацетилглюкозаміну.(glcNAc), N-ацетилгалактозамін (galNAc), інозит (внутрішній стандарт).Два стандарти готували шляхом додавання розчинів цукру 1 мг/мл, наведених у таблиці 1. Зразки заморожують і ліофілізують при -80°C до видалення всієї води (зазвичай приблизно 12-18 годин).
Додайте 100–500 мкг зразка в пробірки з кришкою, що загвинчується, на аналітичних вагах.Запишіть додану суму.Найкраще розчинити зразок у певній концентрації розчинника та додати його в пробірку як аліквоту рідини.Використовуйте 20 мкл інозиту 1 мг/мл як внутрішній стандарт для кожної пробірки зі зразком.Кількість внутрішнього стандарту, доданого до зразка, має бути такою ж, як кількість внутрішнього стандарту, доданого до стандартної пробірки.
Додайте 8 мл безводного метанолу у флакон із гвинтовою кришкою.Потім додають 4 мл 3 н. метанольного розчину HCl, закривають і струшують.У цьому процесі не використовується вода.
Додайте 500 мкл 1 М розчину HCl у метанолі до зразків олігосахаридів і стандартних пробірок TMS.Зразки інкубували протягом ночі (168 годин) при 80°C у термоблоці.Висушіть продукт метанолізу при кімнатній температурі за допомогою сушильної труби.Додайте 200 мкл MeOH і знову висушіть.Цей процес повторюється двічі.Додайте до зразка 200 мкл метанолу, 100 мкл піридину та 100 мкл оцтового ангідриду та добре перемішайте.Інкубуйте зразки при кімнатній температурі протягом 30 хвилин.і сушать.Додайте 200 мкл метанолу і знову висушіть.
Додайте 200 мкл Tri-Sil і закрийте пробірку нагріванням протягом 20 хвилин.80°C, потім охолоджують до кімнатної температури.Використовуйте сушильний колектор, щоб додатково висушити зразок до об’єму приблизно 50 мкл.Важливо відзначити, що ми не дозволили зразкам повністю висохнути.
Додайте 2 мл гексану та добре перемішайте на вортексі.Наповніть наконечники піпеток Пастера (5-8 мм) шматочком скловати, вставивши скловату на піпетку діаметром 5-3/4 дюйма.Зразки центрифугували при 3000 g протягом 2 хвилин.Будь-які нерозчинні залишки випадають в осад.Висушіть зразок до 100-150 мкл.Об’єм приблизно 1 мкл вводили в GC-MS при початковій температурі 80 °C і початковому часі 2,0 хвилини (таблиця 2).