Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів та JavaScript.
Нові імунологічні та мас-спектрометричні методи для комплексного аналізу стійких олігосахаридів у кукурудзяних стеблах, попередньо оброблених AFEX. Лігноцелюлозна біомаса є стійкою альтернативою викопному паливу та широко використовується для розробки біотехнологій для виробництва таких продуктів, як продукти харчування, корми, паливо та хімікати. Ключем до цих технологій є розробка конкурентоспроможних за ціною процесів перетворення складних вуглеводів, присутніх у клітинних стінках рослин, на прості цукри, такі як глюкоза, ксилоза та арабіноза. Оскільки лігноцелюлозна біомаса дуже стійка, її необхідно піддавати термохімічній обробці (наприклад, ексфоліації аміачних волокон (AFEX), розведеним кислотам (DA), іонним рідинам (IL)) та біологічній обробці (наприклад, ферментативному гідролізу та мікробній ферментації) у поєднанні для отримання бажаного продукту. Однак, коли в процесі гідролізу використовуються комерційні грибкові ферменти, лише 75-85% утворених розчинних цукрів є моносахаридами, а решта 15-25% - це розчинні, важкорозчинні олігосахариди, які не завжди доступні для мікроорганізмів. Раніше ми успішно виділили та очистили розчинні стійкі олігосахариди, використовуючи комбінацію розділення на вуглеці та діатомових землях та ексклюзивної хроматографії, а також дослідили їхні інгібіторні властивості щодо ферментів. Ми виявили, що олігосахариди, що містять метильовані уронові кислотні заміщення з вищим ступенем полімеризації (DP), важче обробляти комерційними сумішами ферментів, ніж олігосахариди з низьким DP та нейтральні олігосахариди. Тут ми повідомляємо про використання кількох додаткових методів, включаючи профілювання гліканів з використанням моноклональних антитіл (mAb), специфічних до гліканів рослинної біомаси, для характеристики гліканових зв'язків у клітинних стінках рослин та ферментативних гідролізатах, матрично-асистовану лазерну десорбційну іонізацію, часопролітну мас-спектрометрію. MALDI-TOF-MS) використовує структурно-інформативні діагностичні піки, отримані за допомогою спектроскопії після вторинного розпаду негативних іонів, газову хроматографію та мас-спектрометрію (GC-MS) для характеристики олігосахаридних зв'язків з дериватизацією та без неї. Через малий розмір олігосахаридів (DP 4–20) ці молекули важко використовувати для зв'язування та характеристики mAb. Щоб подолати цю проблему, ми застосували новий метод іммобілізації олігосахаридів на основі біотинової кон'югації, який успішно мітив більшість низькорозчинних олігосахаридів з низьким DP на поверхні мікропланшета, який потім був використаний у високопродуктивній системі mAb для специфічного лігаційного аналізу. Цей новий метод сприятиме розробці більш просунутих високопродуктивних глікомних аналізів у майбутньому, які можна буде використовувати для виділення та характеристики олігосахаридів, присутніх у біомаркерах, з діагностичною метою.
Лігноцелюлозна біомаса, що складається з сільськогосподарських, лісових, трав'янистих та деревних матеріалів, є потенційною сировиною для виробництва біологічних продуктів, включаючи харчові продукти, корми, паливо та хімічні прекурсори для отримання продуктів з вищою вартістю1. Вуглеводи (такі як целюлоза та геміцелюлоза), присутні в клітинних стінках рослин, деполімеризуються в моносахариди шляхом хімічної обробки та біотрансформації (таких як ферментативний гідроліз та мікробна ферментація). Звичайні попередні обробки включають розширення аміачних волокон (AFEX), розведену кислоту (DA), іонну рідину (IL) та паровий вибух (SE), які використовують комбінацію хімічних речовин та тепла для зменшення виробництва лігноцелюлози шляхом розкриття клітинних стінок рослин3,4. стійкість речовини,5. Ферментативний гідроліз проводиться при високому навантаженні твердих речовин з використанням комерційних ферментів, що містять активні вуглеводи (CAZymes), та мікробної ферментації з використанням трансгенних дріжджів або бактерій для виробництва біологічних палив та хімікатів6.
CAZymes у комерційних ферментах складаються зі складної суміші ферментів, які синергічно розщеплюють складні вуглеводно-цукрові зв'язки з утворенням моносахаридів2,7. Як ми повідомляли раніше, складна мережа ароматичних полімерів лігніну з вуглеводами робить їх дуже важкорозщеплюваними, що призводить до неповного перетворення цукру, накопичуючи 15-25% статевих олігосахаридів, які не утворюються під час ферментативного гідролізу попередньо обробленої біомаси. Це поширена проблема з різними методами попередньої обробки біомаси. Деякі причини цього вузького місця включають інгібування ферментів під час гідролізу, або відсутність або низький рівень необхідних ферментів, необхідних для розриву цукрових зв'язків у рослинній біомасі. Розуміння складу та структурних характеристик цукрів, таких як цукрові зв'язки в олігосахаридах, допоможе нам покращити перетворення цукру під час гідролізу, зробивши біотехнологічні процеси конкурентоспроможними за вартістю з продуктами, отриманими з нафти.
Визначення структури вуглеводів є складним завданням і вимагає поєднання таких методів, як рідинна хроматографія (РХ)11,12, спектроскопія ядерного магнітного резонансу (ЯМР)13, капілярний електрофорез (КЕ)14,15,16 та мас-спектрометрія (МС)17. ,вісімнадцять. Методи МС, такі як часопролітна мас-спектрометрія з лазерною десорбцією та іонізацією з використанням матриці (MALDI-TOF-MS), є універсальним методом ідентифікації вуглеводних структур. Останнім часом для ідентифікації відбитків пальців, що відповідають положенням приєднання олігосахаридів, аномерним конфігураціям, послідовностям та положенням розгалуження 20, 21, найширше використовується тандемна МС з індукованою зіткненням дисоціацією (CID) аддуктів іонів натрію.
Аналіз гліканів є чудовим інструментом для поглибленої ідентифікації вуглеводних зв'язків22. Цей метод використовує моноклональні антитіла (mAb), спрямовані до глікану клітинної стінки рослин, як зонди для розуміння складних вуглеводних зв'язків. У світі доступно понад 250 mAb, розроблених проти різних лінійних та розгалужених олігосахаридів з використанням різних сахаридів24. Кілька mAb широко використовуються для характеристики структури, складу та модифікацій клітинної стінки рослин, оскільки існують значні відмінності залежно від типу клітини рослини, органу, віку, стадії розвитку та середовища росту25,26. Зовсім недавно цей метод використовувався для розуміння популяцій везикул у рослинних та тваринних системах та їх відповідної ролі в транспорті гліканів, що визначається субклітинними маркерами, стадіями розвитку або стимулами навколишнього середовища, а також для визначення ферментативної активності. Деякі з ідентифікованих різних структур гліканів та ксиланів включають пектин (P), ксилан (X), манан (M), ксилоглюкани (XylG), глюкани зі змішаними зв'язками (MLG), арабіноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкуронову кислоту-арабіноксилан (GArbX) та арабіно-галактан (ArbG)29.
Однак, незважаючи на всі ці дослідницькі зусилля, лише кілька досліджень зосереджувалися на природі накопичення олігосахаридів під час гідролізу з високим вмістом твердих речовин (HSL), включаючи вивільнення олігосахаридів, зміни довжини олігомерного ланцюга під час гідролізу, різні полімери з низьким вмістом твердих речовин та їх криві розподілу 30,31,32. Тим часом, хоча аналіз гліканів виявився корисним інструментом для комплексного аналізу структури гліканів, важко оцінити водорозчинні олігосахариди з низьким вмістом твердих речовин за допомогою методів антитіл. Менші олігосахариди з молекулярною масою менше 5-10 кДа не зв'язуються з планшетами ELISA 33, 34 та змиваються перед додаванням антитіл.
Тут ми вперше демонструємо аналіз ELISA на планшетах, покритих авідином, з використанням моноклональних антитіл, поєднуючи одностадійну процедуру біотинілювання для розчинних рефрактерних олігосахаридів з аналізом глікому. Наш підхід до аналізу глікому був валідований за допомогою аналізу комплементарних олігосахаридних зв'язків на основі MALDI-TOF-MS та GC-MS з використанням триметилсилільної (TMS) дериватизації гідролізованих цукрових композицій. Цей інноваційний підхід може бути розроблений як високопродуктивний метод у майбутньому та знайти ширше застосування в біомедичних дослідженнях35.
Посттрансляційні модифікації ферментів та антитіл, такі як глікозилювання,36 впливають на їхню біологічну активність. Наприклад, зміни в глікозилюванні білків сироватки крові відіграють важливу роль у запальному артриті, а зміни в глікозилюванні використовуються як діагностичні маркери37. У літературі повідомлялося про різні глікани, які легко проявляються при різних захворюваннях, включаючи хронічні запальні захворювання шлунково-кишкового тракту та печінки, вірусні інфекції, рак яєчників, молочної залози та передміхурової залози38,39,40. Розуміння структури гліканів за допомогою методів ІФА на основі антитіл забезпечить додаткову впевненість у діагностиці захворювань без використання складних методів МС.
Наше попереднє дослідження показало, що стійкі олігосахариди залишаються негідролізованими після попередньої обробки та ферментативного гідролізу (Рисунок 1). У нашій раніше опублікованій роботі ми розробили метод твердофазної екстракції активованим вугіллям для виділення олігосахаридів з гідролізату кукурудзяної стружки (ACSH)8, попередньо обробленого AFEX. Після початкової екстракції та розділення олігосахариди були додатково фракціоновані за допомогою ексклюзивної хроматографії (SEC) та зібрані в порядку молекулярної маси. Мономери та олігомери цукру, вивільнені з різних попередніх обробок, були проаналізовані за допомогою аналізу складу цукру. При порівнянні вмісту олігомерів цукру, отриманих різними методами попередньої обробки, присутність стійких олігосахаридів є поширеною проблемою при перетворенні біомаси на моносахариди та може призвести до зниження виходу цукру щонайменше на 10-15% і навіть до 18%. Цей метод використовується для подальшого великомасштабного виробництва фракцій олігосахаридів. Отриманий ACH та його наступні фракції з різними молекулярними масами були використані як експериментальний матеріал для характеристики олігосахаридів у цій роботі.
Після попередньої обробки та ферментативного гідролізу стійкі олігосахариди залишалися негідролізованими. Тут (A) – метод розділення олігосахаридів, за якого олігосахариди виділяють з гідролізату кукурудзяних стільників (ACSH), попередньо обробленого AFEX, з використанням ущільненого шару активованого вугілля та діатомової землі; (B) Метод розділення олігосахаридів. Олігосахариди додатково розділяли за допомогою хроматографії виключення за розміром (SEC); (C) Мономери та олігомери цукру, вивільнені з різних попередніх обробок (розведена кислота: DA, іонна рідина: IL та AFEX). Умови ферментативного гідролізу: високе завантаження твердих речовин 25% (мас./мас.) (приблизно 8% завантаження глюканом), 96 годин гідролізу, завантаження комерційного ферменту 20 мг/г (співвідношення Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) та (D) Цукрові мономери та олігомери глюкози, ксилози та арабінози, вивільнені з попередньо оброблених AFEX кукурудзяних стільників (ACS).
Аналіз гліканів виявився корисним інструментом для комплексного структурного аналізу гліканів в екстрактах, виділених із залишків твердої біомаси. Однак водорозчинні сахариди недостатньо представлені за допомогою цього традиційного методу41, оскільки низькомолекулярні олігосахариди важко іммобілізувати на планшетах ELISA та вимиваються перед додаванням антитіл. Тому для зв'язування та характеристики антитіл був використаний одностадійний метод біотинілювання для покриття розчинними, несумісними олігосахаридами планшетів ELISA, покритих авідином. Цей метод був протестований з використанням нашого раніше виробленого ACSH та фракції на основі його молекулярної маси (або ступеня полімеризації, DP). Одностадійне біотинілювання було використано для підвищення спорідненості зв'язування олігосахаридів шляхом додавання біотин-LC-гідразиду до відновлювального кінця вуглеводу (рис. 2). У розчині напівацетальна група на відновлювальному кінці реагує з гідразидною групою біотин-LC-гідразиду, утворюючи гідразоновий зв'язок. У присутності відновлювача NaCNBH3 гідразоновий зв'язок відновлюється до стабільного біотинільованого кінцевого продукту. Завдяки модифікації цукровідновлювального кінця стало можливим зв'язування олігосахаридів з низьким DP з планшетами ELISA, і в нашому дослідженні це було зроблено на планшетах, покритих авідином, з використанням глікан-таргетованих моноклональних антитіл.
Скринінг моноклональних антитіл на біотинільовані олігосахариди методом ІФА. Тут (А) показано комбіноване біотинілювання олігосахаридів та подальший скринінг методом ІФА з використанням глікан-спрямованих моноклональних антитіл на пластинах, покритих NeutrAvidin, а (B) показано одностадійну процедуру біотинілювання продуктів реакції.
Потім планшети, покриті авідином, з антитілами, кон'югованими з олігосахаридом, додавали до первинних та вторинних антитіл та промивали у світло- та часочутливому середовищі. Після завершення зв'язування антитіл додавали субстрат TMB для інкубації планшета. Реакцію остаточно зупиняли сірчаною кислотою. Інкубовані планшети аналізували за допомогою ELISA-рідера для визначення міцності зв'язування кожного антитіла з метою виявлення специфічного для антитіл зшивання. Детальніше про експеримент та параметри дивіться у відповідному розділі «Матеріали та методи».
Ми демонструємо корисність цього нещодавно розробленого методу для конкретних застосувань, характеризуючи розчинні олігосахариди, присутні в ACSH, а також у неочищених та очищених фракціях олігосахаридів, виділених з лігноцелюлозних гідролізатів. Як показано на рисунку 3, найпоширенішими епітоп-заміщеними ксиланами, ідентифікованими в ACSH за допомогою методів аналізу біоацильованого глікому, зазвичай є уронові (U) або метилуронові (MeU) та пектинові арабіногалактани. Більшість з них також були виявлені в нашому попередньому дослідженні аналізу гліканів негідролізованих твердих речовин (UHS)43.
Виявлення стійких олігосахаридних епітопів за допомогою моноклонального антитіла, спрямованого на глікан клітинної стінки. «Нейтральна» фракція – це фракція ACN, а «кисла» фракція – фракція FA. Яскравіші червоні кольори на тепловій карті вказують на вищий вміст епітопів, а яскравіші сині – на порожній фон. Значення кольорів на шкалі базуються на значеннях оптичної густини (OD) для рецептур N=2. Основні епітопи, що розпізнаються антитілами, показані праворуч.
Ці нецелюлозні структури не могли бути розщеплені найпоширенішими целюлазами та геміцелюлазами в тестованій комерційній суміші ферментів, яка включає найпоширеніші комерційні ферменти. Тому для їх гідролізу потрібні нові допоміжні ферменти. Без необхідних нецелюлозних допоміжних ферментів ці нецелюлозні зв'язки запобігають повному перетворенню на моносахариди, навіть якщо їхні батьківські цукрові полімери екстенсивно гідролізуються на коротші фрагменти та розчиняються за допомогою комерційних сумішей ферментів.
Подальше дослідження розподілу сигналу та сили його зв'язування показало, що епітопи зв'язування були нижчими у фракціях цукру з високим DP (A, B, C, DP до 20+), ніж у фракціях з низьким DP (D, E, F, DP) у димерах) (рис. 1). Кислотні фрагменти частіше зустрічаються в нецелюлозних епітопах, ніж у нейтральних фрагментах. Ці явища узгоджуються з картиною, що спостерігалася в нашому попередньому дослідженні, де високий DP та кислотні фрагменти були більш стійкими до ферментативного гідролізу. Отже, присутність нецелюлозних гліканових епітопів та замін U та MeU може значною мірою сприяти стабільності олігосахаридів. Слід зазначити, що ефективність зв'язування та виявлення може бути проблематичною для олігосахаридів з низьким DP, особливо якщо епітоп є димерним або тримерним олігосахаридом. Це можна перевірити за допомогою комерційних олігосахаридів різної довжини, кожен з яких містить лише один епітоп, що зв'язується зі специфічним mAb.
Таким чином, використання структурно-специфічних антитіл виявило певні типи стійких зв'язків. Залежно від типу використаного антитіла, відповідного шаблону лігування та сили сигналу, який воно виробляє (найбільш і найменш поширений), нові ферменти можна ідентифікувати та напівкількісно додати до суміші ферментів для більш повного глікоконверсії. Взявши за приклад аналіз олігосахаридів ACSH, ми можемо створити базу даних гліканових зв'язків для кожного біоматеріалу. Тут слід зазначити, що слід враховувати різну спорідненість антитіл, і якщо їхня спорідненість невідома, це створить певні труднощі при порівнянні сигналів різних антитіл. Крім того, порівняння гліканових зв'язків може найкраще працювати між зразками для одного й того ж антитіла. Ці стійкі зв'язки потім можна пов'язати з базою даних CAZyme, з якої ми можемо ідентифікувати ферменти, вибирати ферменти-кандидати та тестувати на ферменти, що розривають зв'язки, або розробляти мікробні системи для експресії цих ферментів для використання на біопереробних заводах44.
Щоб оцінити, як імунологічні методи доповнюють альтернативні методи характеристики низькомолекулярних олігосахаридів, присутніх у лігноцелюлозних гідролізатах, ми провели MALDI (рис. 4, S1-S8) та аналіз сахаридів, отриманих з TMS, на основі GC-MS на тій самій панелі (рис. 5) олігосахаридної частини. MALDI використовується для порівняння того, чи відповідає розподіл маси молекул олігосахаридів передбачуваній структурі. На рис. 4 показано MS нейтральних компонентів ACN-A та ACN-B. Аналіз ACN-A підтвердив діапазон пентозних цукрів від DP 4–8 (рис. 4) до DP 22 (рис. S1), ваги яких відповідають олігосахаридам MeU-ксилану. Аналіз ACN-B підтвердив ряд пентози та глюкоксилану з DP 8-15. У додаткових матеріалах, таких як Рисунок S3, карти розподілу маси кислотних фрагментів FA-C показують ряд пентозних цукрів, заміщених (Me)U, з DP 8-15, що узгоджується із заміщеними ксиланами, виявленими під час скринінгу моноклональних антитіл на основі ELISA. Епітопи є узгодженими.
MALDI-MS спектр розчинних несумісних олігосахаридів, присутніх в ACS. Тут (A) фракції ACN-A з низьким вмістом маси, що містять метильовані уронові кислоти (DP 4-8), заміщені глюкуроксилановими олігосахаридами, та (B) ксилан ACN-B та метильовані уронові кислоти, заміщені глюкуроксиланом (DP 8-15).
Аналіз складу гліканового залишку тугоплавких олігосахаридів. Тут (A) Склад сахаридів TMS різних фракцій олігосахаридів, отриманий за допомогою аналізу GC-MS. (B) Структури різних цукрів, отриманих з TMS, присутніх в олігосахаридах. ACN – фракція ацетонітрилу, що містить нейтральні олігосахариди, та FA – фракція ферулової кислоти, що містить кислі олігосахариди.
Ще один цікавий висновок було зроблено з аналізу LC-MS олігосахаридної фракції, як показано на рисунку S9 (методи можна побачити в додаткових електронних матеріалах). Фрагменти гексозних та -OAc груп неодноразово спостерігалися під час лігування фракції ACN-B. Це відкриття не лише підтверджує фрагментацію, що спостерігається в глікомі та MALDI-TOF аналізі, але й надає нову інформацію про потенційні вуглеводні похідні в попередньо обробленій лігноцелюлозній біомасі.
Ми також провели аналіз складу гліканів олігосахаридних фракцій за допомогою TMS-дериватизації гліканів. За допомогою ГХ-МС ми визначили склад нейронних (непохідних) та кислих цукрів (GluA та GalA) у фракції олігосахаридів (рис. 5). Глюкуронова кислота міститься в кислих компонентах C та D, тоді як галактуронова кислота міститься в кислих компонентах A та B, які є компонентами з високим DP кислих цукрів. Ці результати не лише підтверджують наші дані ELISA та MALDI, але й узгоджуються з нашими попередніми дослідженнями накопичення олігосахаридів. Тому ми вважаємо, що сучасні імунологічні методи з використанням біотинілювання олігосахаридів та подальшого скринінгу ELISA є достатніми для виявлення розчинних стійких олігосахаридів у різних біологічних зразках.
Оскільки методи скринінгу моноклональних антитіл на основі ELISA були валідовані кількома різними методами, ми хотіли б глибше дослідити потенціал цього нового кількісного методу. Два комерційні олігосахариди, ксилогексасахарид-олігосахарид (XHE) та 23-α-L-арабінофуранозил-ксилотріоза (A2XX), були придбані та протестовані з використанням нового підходу до моноклональних антитіл, спрямованого на глікан клітинної стінки. На рисунку 6 показано лінійну кореляцію між сигналом біотинільованого зв'язування та логарифмічною концентрацією олігосахариду, що свідчить про можливу модель адсорбції Ленгмюра. Серед моноклональних антитіл CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 та CCRC-M151 корелювали з XHE, а CCRC-M108, CCRC-M109 та LM11 корелювали з A2XX у діапазоні від 1 нм до 100 нано. Через обмежену доступність антитіл під час експерименту було проведено обмежену кількість експериментів з кожною концентрацією олігосахариду. Слід зазначити, що деякі антитіла дуже по-різному реагують на один і той самий олігосахарид як субстрат, ймовірно, тому, що вони зв'язуються з дещо різними епітопами та можуть мати дуже різну спорідненість до зв'язування. Механізми та наслідки точної ідентифікації епітопів будуть набагато складнішими, коли новий підхід моноклональних антитіл буде застосовано до реальних зразків.
Для визначення діапазону виявлення різних моноклональних антитіл, що націлюють глікани, було використано два комерційні олігосахариди. Тут лінійні кореляції з логарифмічною концентрацією олігосахариду вказують на картини адсорбції Ленгмюра для (A) XHE з моноклональним антитілом та (B) A2XX з моноклональним антитілом. Відповідні епітопи вказують на структури комерційних олігосахаридів, що використовуються як субстрати в аналізі.
Використання моноклональних антитіл, спрямованих на глікани (глікокомічний аналіз або скринінг моноклональних антитіл на основі ELISA), є потужним інструментом для поглибленої характеристики більшості основних гліканів клітинної стінки, що складають біомасу рослин. Однак класичний аналіз гліканів характеризує лише більші глікани клітинної стінки, оскільки більшість олігосахаридів неефективно іммобілізовані на планшетах ELISA. У цьому дослідженні попередньо оброблену AFEX кукурудзяну стебло було ферментативно гідролізовано при високому вмісті твердих речовин. Аналіз цукру використовувався для визначення складу стійких вуглеводів клітинної стінки в гідролізаті. Однак аналіз моноклональних антитіл менших олігосахаридів у гідролізатах недооцінений, і необхідні додаткові інструменти для ефективної іммобілізації олігосахаридів на планшетах ELISA.
Ми представляємо новий та ефективний метод іммобілізації олігосахаридів для скринінгу моноклональних антитіл, що поєднує біотинілювання олігосахаридів з подальшим ELISA-скринінгом на пластинах, покритих NeutrAvidin™. Іммобілізовані біотинільовані олігосахариди показали достатню спорідненість до антитіла, що дозволяє швидко та ефективно виявляти стійкі олігосахариди. Аналіз складу цих стійких олігосахаридів на основі мас-спектрометрії підтвердив результати цього нового підходу до імуноскринінгу. Таким чином, ці дослідження демонструють, що поєднання біотинілювання олігосахаридів та ELISA-скринінгу з моноклональними антитілами, спрямованими на глікани, може бути використане для виявлення зшивок в олігосахаридах і може бути широко застосоване в інших біохімічних дослідженнях, що характеризують структуру олігосахаридів.
Цей метод профілювання гліканів на основі біотину є першим дослідженням, здатним дослідити стійкі вуглеводні зв'язки розчинних олігосахаридів у рослинній біомасі. Це допомагає зрозуміти, чому деякі частини біомаси настільки стійкі, коли справа доходить до виробництва біопалива. Цей метод заповнює важливу прогалину в методах аналізу гліконів та розширює його застосування на ширший спектр субстратів, окрім рослинних олігосахаридів. У майбутньому ми можемо використовувати робототехніку для біотинілювання та використовувати розроблений нами метод для високопродуктивного аналізу зразків за допомогою ELISA.
Кукурудзяна солома (КС), вирощена з гібридного насіння Pioneer 33A14, була зібрана у 2010 році на фермі Kramer у місті Рей, штат Колорадо. З дозволу землевласника цю біомасу можна використовувати для досліджень. Зразки зберігали сухими при вологості < 6% у пакетах із застібкою-блискавкою за кімнатної температури. Зразки зберігали сухими при вологості < 6% у пакетах із застібкою-блискавкою за кімнатної температури. Образці зберігалися сухими при вологості < 6% в пакетах із застійно-молочною при кімнатній температурі. Зразки зберігали сухими при вологості <6% у пакетах на блискавці за кімнатної температури.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образці зберігаються в пакетах із застійно-молочним при кімнатній температурі з вологістю < 6%. Зразки зберігають у пакетах із застібкою-блискавкою за кімнатної температури з вологістю < 6%.Дослідження відповідало місцевим та національним рекомендаціям. Аналіз складу було проведено за протоколом NREL. Було виявлено, що склад містить 31,4% глюкану, 18,7% ксилану, 3,3% арабінану, 1,2% галактану, 2,2% ацетилу, 14,3% лігніну, 1,7% білка та 13,4% золи.
Cellic® CTec2 (138 мг білка/мл, партія VCNI 0001) – це складна суміш целюлази, β-глюкозидази та Cellic® HTec2 (157 мг білка/мл, партія VHN00001) від Novozymes (Франклінтон, Північна Кароліна, США). Multifect Pectinase® (72 мг білка/мл), складна суміш ферментів, що розкладають пектин, була надана DuPont Industrial Biosciences (Пало-Альто, Каліфорнія, США). Концентрації білка у ферментах визначали шляхом оцінки вмісту білка (та віднімання внеску небілкового азоту) за допомогою аналізу азоту за К'єльдалем (метод AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ітака, Нью-Йорк, США). Діатомітову землю 545 було придбано у EMD Millipore (Біллеріка, Массачусетс). Активоване вугілля (DARCO, гранули 100 меш), Avicel (PH-101), буковий ксилан та всі інші хімікати були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі).
Попередню обробку AFEX проводили в GLBRC (Дослідницька лабораторія перетворення біомаси, MSU, Лансінг, Мічиган, США). Попередню обробку проводили при температурі 140°C протягом 15 хвилин. Час перебування становив 46 секунд при співвідношенні безводного аміаку до біомаси 1:1 та завантаженні 60% (мас./мас.) у настільному реакторі періодичної дії з нержавіючої сталі (Parr Instruments Company). Це зайняло 30 хвилин. Реактор нагріли до 140°C, і аміак швидко вивільнився, що дозволило біомасі швидко повернутися до кімнатної температури. Склад попередньо обробленої AFEX кукурудзяної стебла (ACS) був подібним до складу необробленої кукурудзяної стебла (UT-CS).
Високий вміст твердих речовин ACSH 25% (мас./мас.) (приблизно 8% завантаження декстрану) був отриманий як вихідний матеріал для великомасштабного виробництва олігосахаридів. Ферментативний гідроліз ACS проводили з використанням комерційної суміші ферментів, що включає Cellic® Ctec2 10 мг білка/г глюкану (у попередньо обробленій біомасі), Htec2 (Novozymes, Франклінтон, Північна Кароліна), 5 мг білка/г глюкану, та Multifect Pectinase (Genencor Inc, США). ), 5 мг білка/г декстрану. Ферментативний гідроліз проводили в 5-літровому біореакторі з робочим об'ємом 3 літри, pH 4,8, 50°C та 250 об/хв. Після гідролізу протягом 96 годин гідролізат збирали центрифугуванням при 6000 об/хв протягом 30 хвилин, а потім при 14000 об/хв протягом 30 хвилин для видалення негідролізованих твердих речовин. Потім гідролізат піддали стерильній фільтрації через фільтрувальний стаканчик з розміром отворів 0,22 мм. Відфільтрований гідролізат зберігали у стерильних пляшках при 4°C, а потім фракціонували на активованому вугіллі.
Аналіз складу зразків біомаси на основі екстрактів згідно з лабораторними процедурами аналізу NREL: підготовка зразків для аналізу складу (NREL/TP-510-42620) та визначення структурних вуглеводів і лігніну в біомасі (NREL/TP-510 – 42618)47.
Аналіз олігосахаридів потоку гідролізату проводили в масштабі 2 мл з використанням методу кислотного гідролізу в автоклаві. Зразок гідролізату змішали з 69,7 мкл 72% сірчаної кислоти в 10-мл пробірці для культури з гвинтовою кришкою та інкубували протягом 1 години на робочому столі при 121 °C, охолоджували на льоду та фільтрували у флакон для високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Концентрацію олігосахаридів визначали шляхом віднімання концентрації моносахаридів у негідролізованому зразку від загальної концентрації цукру у зразку, гідролізованому кислотою.
Концентрації глюкози, ксилози та арабінози в кислотно-гідролізованій біомасі аналізували за допомогою системи ВЕРХ Shimadzu, оснащеної автосамплером, нагрівачем колонки, ізократичним насосом та детектором показника заломлення на колонці Bio-Rad Aminex HPX-87H. Колонку підтримували при температурі 50°C та елюювали потоком 5 мМ H2SO4 у воді зі швидкістю 0,6 мл/хв.
Супернатант гідролізату розбавляли та аналізували на вміст мономерів та олігосахаридів. Мономерні цукри, отримані після ферментативного гідролізу, аналізували за допомогою ВЕРХ, оснащеної колонкою Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P та колонкою з захистом від золи. Температуру колонки підтримували на рівні 80°C, воду використовували як рухому фазу зі швидкістю потоку 0,6 мл/хв. Олігосахариди визначали гідролізом у розведеній кислоті при 121°C згідно з методами, описаними в посиланнях 41, 48, 49.
Аналіз сахаридів проводили на сирих, попередньо оброблених AFEX та всіх негідролізованих залишках біомаси (включаючи виробництво серійних екстрактів клітинних стінок та їх скринінг на моноклональні антитіла) з використанням раніше описаних процедур 27, 43, 50, 51. Для аналізу глікому спиртнерозчинні залишки матеріалу рослинних клітинних стінок готують із залишків біомаси та піддають серійній екстракції дедалі агресивнішими реагентами, такими як оксалат амонію (50 мМ), карбонат натрію (50 мМ та 0,5% мас./об.), CON. (1M та 4M, обидва з 1% мас./об. борогідриду натрію) та кислий хлорит, як описано раніше 52,53. Потім екстракти піддавали ELISA проти складної панелі моноклональних антитіл 50, спрямованих на глікан клітинної стінки, а реакції зв'язування моноклональних антитіл представляли у вигляді теплової карти. Моноклональні антитіла, спрямовані на глікан клітинної стінки рослин, були придбані з лабораторних запасів (серії CCRC, JIM та MAC).
Одностадійне біотинілювання олігосахаридів. Кон'югацію вуглеводів з біотин-LC-гідразидом проводили за такою процедурою. Біотин-LC-гідразид (4,6 мг/12 мкмоль) розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО, 70 мкл) шляхом енергійного перемішування та нагрівання при 65°C протягом 1 хвилини. Додавали крижану оцтову кислоту (30 мкл) і суміш виливали на ціаноборгідрид натрію (6,4 мг/100 мкмоль) і повністю розчиняли після нагрівання при 65°C протягом приблизно 1 хвилини. Потім до висушеного олігосахариду (1-100 нмоль) додавали від 5 до 8 мкл реакційної суміші для отримання 10-кратного або більше молярного надлишку мітки над відновлювальним кінцем. Реакцію проводили при 65°C протягом 2 годин, після чого зразки негайно очищали. У експериментах з мічення без відновлення не використовували ціаноборгідрид натрію, а зразки піддавали реакції при 65°C протягом 2,5 годин.
Покриття для ІФА та промивання зразків біотинільованих олігосахаридів. 25 мкл біотинільованих зразків (100 мкл кожного концентрованого зразка, розведеного в 5 мл 0,1 М буферного розчину Tris (TBS)) додавали до кожної лунки планшета, покритого авідином. Контрольні лунки покривали 50 мкл біотину в концентрації 10 мкг/мл у 0,1 М TBS. Деіонізовану воду використовували як покриття для холостих вимірювань. Планшет інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі в темряві. Промивали планшет 3 рази 0,1% знежиреним молоком у 0,1 М TBS, використовуючи програму № 11 для Grenier flat 3A.
Додавання та промивання первинних антитіл. Додайте 40 мкл первинних антитіл у кожну лунку. Інкубуйте мікропланшет протягом 1 години за кімнатної температури в темряві. Потім планшети промивали 3 рази 0,1% молоком у 0,1M TBS, використовуючи програму промивання №11 для Grenier Flat 3A.
Додайте вторинні антитіла та промийте. Додайте 50 мкл вторинних антитіл миші/щури (розведених 1:5000 у 0,1% молоці в 0,1 M TBS) до кожної лунки. Інкубуйте мікропланшет протягом 1 години за кімнатної температури в темряві. Потім мікропланшети промивали 5 разів 0,1% молоком у 0,1 M TBS, використовуючи програму промивання планшетів Grenier Flat 5A №12.
Додавання субстрату. Додайте 50 мкл 3,3′,5,5′-тетраметилбензидину (ТМБ) до базового субстрату (додавши 2 краплі буфера, 3 краплі ТМБ, 2 краплі перекису водню до 15 мл деіонізованої води). Підготуйте субстрат ТМБ та перемішайте на вортексі перед використанням. Інкубуйте мікропланшет при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. У темряві.
Виконайте крок і зчитайте планшет. Додайте 50 мкл 1 N сірчаної кислоти в кожну лунку та запишіть поглинання від 450 до 655 нм за допомогою ELISA-рідера.
Приготуйте розчини 1 мг/мл цих аналітів у деіонізованій воді: арабіноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактуронова кислота (GalA), глюкуронова кислота (GlcA), маноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманозамін (manNAc), N-ацетилглюкозамін (glcNAc), N-ацетилгалактозамін (galNAc), інозитол (внутрішній стандарт). Два стандарти були приготовані шляхом додавання розчинів цукру з концентрацією 1 мг/мл, наведених у таблиці 1. Зразки заморожують та ліофілізують при температурі -80°C до видалення всієї води (зазвичай близько 12-18 годин).
Додайте 100–500 мкг зразка до пробірок із загвинчуваною кришкою на аналітичних вагах. Запишіть додану кількість. Найкраще розчинити зразок у розчиннику певної концентрації та додати його в пробірку у вигляді рідкої аліквоти. Використовуйте 20 мкл інозитолу з концентрацією 1 мг/мл як внутрішній стандарт для кожної пробірки зі зразком. Кількість внутрішнього стандарту, доданого до зразка, має бути такою ж, як і кількість внутрішнього стандарту, доданого до стандартної пробірки.
Додайте 8 мл безводного метанолу у флакон з кришкою, що загвинчується. Потім додайте 4 мл 3 н. метанольного розчину HCl, закрийте кришкою та струсіть. У цьому процесі вода не використовується.
Додайте 500 мкл 1 M розчину HCl у метанолі до зразків олігосахаридів та стандартних пробірок TMS. Зразки інкубували протягом ночі (168 годин) при 80°C у термоблоці. Висушіть продукт метанолізу при кімнатній температурі за допомогою сушильного колектора. Додайте 200 мкл MeOH та знову висушіть. Цей процес повторюють двічі. Додайте 200 мкл метанолу, 100 мкл піридину та 100 мкл оцтового ангідриду до зразка та добре перемішайте. Інкубуйте зразки при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Додайте 200 мкл метанолу та знову висушіть.
Додайте 200 мкл Tri-Sil та нагрівайте пробірку з закритою кришкою протягом 20 хвилин. 80°C, потім охолодіть до кімнатної температури. Використовуйте сушильний колектор для подальшого висушування зразка до об'єму приблизно 50 мкл. Важливо зазначити, що ми не дозволили зразкам повністю висохнути.
Додайте 2 мл гексану та добре перемішайте, перемішуючи на вортексі. Наповніть кінчики піпеток Пастера (5-8 мм) шматочком скловати, вставивши скловату зверху піпетки діаметром 5-3/4 дюйма. Зразки центрифугували при 3000 g протягом 2 хвилин. Будь-які нерозчинні залишки осідали. Висушіть зразок до об'єму 100-150 мкл. Об'єм приблизно 1 мкл вводили в ГХ-МС при початковій температурі 80 °C та початковому часі 2,0 хвилини (Таблиця 2).