Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
Nieuwe immunologische en massaspectrometrische methoden voor complexe analyse van persistente oligosacchariden in maïsstro, voorbehandeld met AFEX. Lignocellulosebiomassa is een duurzaam alternatief voor fossiele brandstoffen en wordt veelvuldig gebruikt voor de ontwikkeling van biotechnologieën voor de productie van producten zoals voedsel, veevoer, brandstoffen en chemicaliën. De sleutel tot deze technologieën ligt in de ontwikkeling van kostenefficiënte processen voor de omzetting van complexe koolhydraten in plantencelwanden in enkelvoudige suikers zoals glucose, xylose en arabinose. Omdat lignocellulosebiomassa zeer hardnekkig is, moet het worden onderworpen aan thermochemische behandelingen (bijv. ammoniakvezelexfoliatie (AFEX), verdunde zuren (DA), ionische vloeistoffen (IL)) en biologische behandelingen (bijv. enzymatische hydrolyse en microbiële fermentatie) in combinatie om het gewenste product te verkrijgen. Wanneer commerciële schimmelenzymen worden gebruikt in het hydrolyseproces, bestaat echter slechts 75-85% van de gevormde oplosbare suikers uit monosacchariden, terwijl de resterende 15-25% bestaat uit oplosbare, moeilijk afbreekbare oligosacchariden die niet altijd beschikbaar zijn voor micro-organismen. Eerder hebben we met succes oplosbare, hardnekkige oligosacchariden geïsoleerd en gezuiverd met behulp van een combinatie van scheiding met koolstof en diatomeeën en gelpermeatiechromatografie, en tevens hun enzymremmende eigenschappen onderzocht. We hebben vastgesteld dat oligosacchariden met een hogere polymerisatiegraad (DP) en gemethyleerde uronzuursubstituties moeilijker te verwerken zijn met commerciële enzymmengsels dan oligosacchariden met een lage DP en neutrale oligosacchariden. In dit artikel beschrijven we het gebruik van verschillende aanvullende methoden, waaronder glycaanprofilering met behulp van monoklonale antilichamen (mAbs) specifiek voor glycanen in plantaardige biomassa om glycaanbindingen in plantencelwanden en enzymatische hydrolysaten te karakteriseren, en matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. MALDI-TOF-MS maakt gebruik van structuurinformatieve diagnostische pieken, verkregen door spectroscopie na secundaire verval van negatieve ionen, gaschromatografie en massaspectrometrie (GC-MS), om oligosaccharidebindingen met en zonder derivatisatie te karakteriseren. Vanwege de kleine omvang van oligosacchariden (DP 4–20) zijn deze moleculen moeilijk te gebruiken voor mAb-binding en -karakterisering. Om dit probleem te overwinnen, hebben we een nieuwe, op biotineconjugatie gebaseerde immobilisatiemethode voor oligosacchariden toegepast. Deze methode labelde met succes de meeste oplosbare oligosacchariden met een lage DP op het oppervlak van de microplaat, die vervolgens werd gebruikt in een high-throughput mAb-systeem voor specifieke ligatieanalyse. Deze nieuwe methode zal de ontwikkeling van meer geavanceerde high-throughput glycome-assays in de toekomst vergemakkelijken, die kunnen worden gebruikt om oligosacchariden in biomarkers voor diagnostische doeleinden te isoleren en te karakteriseren.
Lignocellulosebiomassa, bestaande uit landbouw-, bosbouw-, gras- en houtachtig materiaal, is een potentiële grondstof voor de productie van biobased producten, waaronder voedsel, veevoer, brandstof en chemische voorlopers voor de productie van producten met een hogere waarde¹. Koolhydraten (zoals cellulose en hemicellulose) in plantencelwanden worden door chemische verwerking en biotransformatie (zoals enzymatische hydrolyse en microbiële fermentatie) gedepolymeriseerd tot monosacchariden. Veelgebruikte voorbehandelingen zijn onder andere ammoniakvezelexpansie (AFEX), verdund zuur (DA), ionische vloeistof (IL) en stoomexplosie (SE), waarbij een combinatie van chemicaliën en warmte wordt gebruikt om de lignocelluloseproductie te verminderen door de plantencelwanden te openen³,⁴. ⁵ Enzymatische hydrolyse wordt uitgevoerd met een hoge vaste-stofconcentratie met behulp van commerciële actieve koolhydraatbevattende enzymen (CAZymes) en microbiële fermentatie met behulp van transgene gisten of bacteriën om biobased brandstoffen en chemicaliën te produceren⁶.
CAZymes in commerciële enzymen bestaan ​​uit een complex mengsel van enzymen die synergetisch complexe koolhydraat-suikerbindingen splitsen om monosacchariden te vormen2,7. Zoals we eerder hebben gerapporteerd, maakt het complexe netwerk van aromatische polymeren van lignine met koolhydraten ze zeer moeilijk te verwerken, wat leidt tot onvolledige suikerconversie en de ophoping van 15-25% van de niet-geproduceerde oligosacchariden tijdens de enzymatische hydrolyse van de voorbehandelde biomassa. Dit is een veelvoorkomend probleem bij verschillende methoden voor biomassavoorbehandeling. Enkele oorzaken van dit knelpunt zijn enzymremming tijdens de hydrolyse, of de afwezigheid of lage concentraties van essentiële enzymen die nodig zijn om suikerbindingen in plantaardige biomassa te verbreken. Inzicht in de samenstelling en structurele kenmerken van suikers, zoals de suikerbindingen in oligosacchariden, zal ons helpen de suikerconversie tijdens hydrolyse te verbeteren, waardoor biotechnologische processen kosteneffectief kunnen worden ten opzichte van producten op basis van aardolie.
Het bepalen van de structuur van koolhydraten is een uitdaging en vereist een combinatie van methoden zoals vloeistofchromatografie (LC)11,12, nucleaire magnetische resonantiespectroscopie (NMR)13, capillaire elektroforese (CE)14,15,16 en massaspectrometrie (MS)17. ,achttien. MS-methoden zoals time-of-flight massaspectrometrie met laserdesorptie en ionisatie met behulp van een matrix (MALDI-TOF-MS) zijn een veelzijdige methode voor het identificeren van koolhydraatstructuren. Recentelijk is Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS van natriumionadducten het meest gebruikt om vingerafdrukken te identificeren die overeenkomen met oligosaccharide-aanhechtingsposities, anomere configuraties, sequenties en vertakkingsposities 20, 21.
Glycaananalyse is een uitstekend hulpmiddel voor de diepgaande identificatie van koolhydraatverbindingen22. Deze methode maakt gebruik van monoklonale antilichamen (mAbs) gericht tegen glycanen in de plantencelwand als probes om complexe koolhydraatverbindingen te begrijpen. Wereldwijd zijn er meer dan 250 mAbs beschikbaar, ontworpen tegen verschillende lineaire en vertakte oligosacchariden met behulp van diverse sacchariden24. Verschillende mAbs zijn op grote schaal gebruikt om de structuur, samenstelling en modificaties van de plantencelwand te karakteriseren, aangezien er aanzienlijke verschillen zijn afhankelijk van het plantenceltype, orgaan, leeftijd, ontwikkelingsstadium en groeiomgeving25,26. Meer recentelijk is deze methode gebruikt om vesikelpopulaties in planten- en dierensystemen te begrijpen en hun respectievelijke rollen in glycaantransport, zoals bepaald door subcellulaire markers, ontwikkelingsstadia of omgevingsstimuli, en om enzymatische activiteit te bepalen. Enkele van de verschillende structuren van glycanen en xylanen die zijn geïdentificeerd, zijn onder andere pectine (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucanen (XylG), gemengde bindingsglucanen (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronzuur-arabinoxylan (GArbX) en arabino-galactaan (ArbG)29.
Ondanks al deze onderzoeksinspanningen hebben slechts enkele studies zich echter gericht op de aard van de accumulatie van oligosacchariden tijdens hydrolyse met een hoge vaste stofbelasting (HSL), inclusief de vrijgave van oligosacchariden, veranderingen in de lengte van oligomere ketens tijdens hydrolyse, verschillende polymeren met een lage polymerisatiegraad (DP) en hun verdelingscurven 30,31,32. Hoewel glycaananalyse een nuttig instrument is gebleken voor een uitgebreide analyse van de glycaanstructuur, is het moeilijk om wateroplosbare oligosacchariden met een lage DP te evalueren met behulp van antilichaammethoden. Oligosacchariden met een lagere DP en een moleculair gewicht van minder dan 5-10 kDa binden niet aan ELISA-platen 33, 34 en worden weggewassen vóór de toevoeging van antilichamen.
Hier demonstreren we voor het eerst een ELISA-assay op met avidine gecoate platen met behulp van monoklonale antilichamen, waarbij een éénstaps biotinyleringsprocedure voor oplosbare refractaire oligosacchariden wordt gecombineerd met glycoomanalyse. Onze benadering van glycoomanalyse werd gevalideerd door MALDI-TOF-MS en GC-MS-gebaseerde analyse van complementaire oligosaccharideverbindingen met behulp van trimethylsilyl (TMS)-derivatizatie van gehydrolyseerde suikersamenstellingen. Deze innovatieve aanpak kan in de toekomst worden ontwikkeld tot een high-throughput-methode en breder worden toegepast in biomedisch onderzoek35.
Posttranslationele modificaties van enzymen en antilichamen, zoals glycosylering,36 beïnvloeden hun biologische activiteit. Veranderingen in de glycosylering van serumproteïnen spelen bijvoorbeeld een belangrijke rol bij inflammatoire artritis, en veranderingen in glycosylering worden gebruikt als diagnostische markers37. In de literatuur is beschreven dat verschillende glycanen gemakkelijk voorkomen bij diverse ziekten, waaronder chronische ontstekingsziekten van het maag-darmkanaal en de lever, virale infecties, eierstok-, borst- en prostaatkanker38,39,40. Inzicht in de structuur van glycanen met behulp van op antilichamen gebaseerde glycan-ELISA-methoden zal de zekerheid bij de diagnose van ziekten vergroten zonder gebruik te maken van complexe MS-methoden.
Uit ons eerdere onderzoek bleek dat hardnekkige oligosacchariden na voorbehandeling en enzymatische hydrolyse niet gehydrolyseerd werden (Figuur 1). In ons eerder gepubliceerde werk ontwikkelden we een extractiemethode met actieve kool (ACSH) om oligosacchariden te isoleren uit met AFEX voorbehandeld maïsstrohydrolysaat (ACSH)8. Na de initiële extractie en scheiding werden de oligosacchariden verder gefractioneerd door middel van size exclusion chromatografie (SEC) en verzameld op volgorde van moleculair gewicht. Suikermonomeren en oligomeren die vrijkwamen bij verschillende voorbehandelingen werden geanalyseerd door middel van suikersamenstellingsanalyse. Bij het vergelijken van het gehalte aan suikeroligomeren verkregen met verschillende voorbehandelingsmethoden, blijkt de aanwezigheid van hardnekkige oligosacchariden een veelvoorkomend probleem bij de omzetting van biomassa naar monosacchariden en kan dit leiden tot een vermindering van de suikeropbrengst met ten minste 10-15% en zelfs tot 18%. Deze methode wordt gebruikt voor de verdere grootschalige productie van oligosaccharidefracties. Het resulterende ACSH en de daaropvolgende fracties met verschillende moleculaire gewichten werden in dit werk gebruikt als experimenteel materiaal voor de karakterisering van oligosacchariden.
Na voorbehandeling en enzymatische hydrolyse bleven persistente oligosacchariden ongehydrolyseerd achter. Hier (A) is een methode voor de scheiding van oligosacchariden, waarbij oligosacchariden worden geïsoleerd uit met AFEX voorbehandeld maïsstrohydrolysaat (ACSH) met behulp van een gepakt bed van actieve kool en diatomeeënaarde; (B) Methode voor de scheiding van oligosacchariden. De oligosacchariden werden verder gescheiden door middel van size exclusion chromatografie (SEC); (C) Saccharidemonomeren en -oligomeren die vrijkomen na verschillende voorbehandelingen (verdund zuur: DA, ionische vloeistof: IL en AFEX). Enzymatische hydrolyseomstandigheden: hoge vaste stofbelasting van 25% (w/w) (ongeveer 8% glucaanbelasting), 96 uur hydrolyse, 20 mg/g commerciële enzymbelasting (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 verhouding) en (D) Suikermonomeren en -oligomeren van glucose, xylose en arabinose die vrijkomen uit met AFEX voorbehandeld maïsstro (ACS).
Glycaananalyse is een nuttig instrument gebleken voor een uitgebreide structurele analyse van glycanen in extracten geïsoleerd uit vaste biomassaresiduen. Wateroplosbare sacchariden zijn echter ondervertegenwoordigd bij deze traditionele methode⁴¹ omdat oligosacchariden met een laag moleculair gewicht moeilijk te immobiliseren zijn op ELISA-platen en worden weggewassen vóór de toevoeging van antilichamen. Daarom werd voor antilichaambinding en karakterisering een éénstaps biotinyleringsmethode gebruikt om oplosbare, niet-conforme oligosacchariden te coaten op met avidine gecoate ELISA-platen. Deze methode werd getest met onze eerder geproduceerde ACSH en een fractie op basis van het molecuulgewicht (of de polymerisatiegraad, DP). Eénstaps biotinylering werd gebruikt om de bindingsaffiniteit van oligosacchariden te verhogen door biotine-LC-hydrazide toe te voegen aan het reducerende uiteinde van het koolhydraat (Fig. 2). In oplossing reageert de hemiacetaalgroep aan het reducerende uiteinde met de hydrazidegroep van biotine-LC-hydrazide om een ​​hydrazonbinding te vormen. In aanwezigheid van het reductiemiddel NaCNBH3 wordt de hydrazonbinding gereduceerd tot een stabiel gebiotinyleerd eindproduct. Door de modificatie van het suikerreducerende uiteinde werd het mogelijk om oligosacchariden met een lage polymerisatiegraad aan ELISA-platen te binden. In ons onderzoek werd dit gedaan op met avidine gecoate platen met behulp van op glycanen gerichte monoklonale antilichamen.
Screening van monoklonale antilichamen op basis van ELISA voor gebiotinyleerde oligosacchariden. Hier (A) gecombineerde biotinylering van oligosacchariden en daaropvolgende ELISA-screening met op glycanen gerichte mAbs op met NeutrAvidin gecoate platen en (B) toont een éénstaps procedure voor de biotinylering van reactieproducten.
Aan avidine-gecoate platen met oligosaccharide-geconjugeerde antilichamen werden vervolgens primaire en secundaire antilichamen toegevoegd en gewassen in een licht- en tijdsgevoelig medium. Nadat de antilichaambinding voltooid was, werd TMB-substraat toegevoegd om de plaat te incuberen. De reactie werd ten slotte gestopt met zwavelzuur. De geïncubeerde platen werden geanalyseerd met een ELISA-lezer om de bindingssterkte van elk antilichaam te bepalen en zo antilichaamspecifieke kruisverbindingen te detecteren. Zie het betreffende hoofdstuk "Materialen en methoden" voor details en parameters van het experiment.
We tonen het nut aan van deze nieuw ontwikkelde methode voor specifieke toepassingen door de oplosbare oligosacchariden te karakteriseren die aanwezig zijn in ACSH, evenals in ruwe en gezuiverde oligosaccharidefracties geïsoleerd uit lignocellulosehydrolysaten. Zoals weergegeven in figuur 3, zijn de meest voorkomende epitopen-gesubstitueerde xylanen die in ACSH worden geïdentificeerd met behulp van bioacylatieglycoomanalysemethoden meestal uronzuur (U) of methyluronzuur (MeU) en pectine-arabinogalactanen. De meeste daarvan werden ook gevonden in ons eerdere onderzoek naar de analyse van glycanen van niet-gehydrolyseerde vaste stoffen (UHS)43.
Detectie van moeilijk te detecteren oligosaccharide-epitopen met behulp van een monoklonaal antilichaam gericht tegen het celwandglycaan. De "neutrale" fractie is de ACN-fractie en de "zure" fractie is de FA-fractie. Heldere rode kleuren op de heatmap duiden op een hoger epitoopgehalte, en heldere blauwe kleuren op een blanco achtergrond. De kleurwaarden op de schaal zijn gebaseerd op ruwe OD-waarden voor formuleringen N=2. De belangrijkste door de antilichamen herkende epitopen worden rechts weergegeven.
Deze niet-cellulose structuren konden niet worden gesplitst door de meest voorkomende cellulases en hemicellulases in het geteste commerciële enzymmengsel, dat de meest gebruikte commerciële enzymen bevat. Daarom zijn nieuwe hulpenzymen nodig voor hun hydrolyse. Zonder de noodzakelijke niet-cellulose hulpenzymen voorkomen deze niet-cellulose bindingen een volledige omzetting naar monosacchariden, zelfs als hun oorspronkelijke suikerpolymeren uitgebreid worden gehydrolyseerd tot kortere fragmenten en opgelost met behulp van commerciële enzymmengsels.
Verder onderzoek naar de signaalverdeling en de bindingssterkte toonde aan dat de bindingsepitopen lager waren in suikerfracties met een hoge DP (A, B, C, DP tot 20+) dan in fracties met een lage DP (D, E, F, DP in dimeren) (Fig. 1). Zure fragmenten komen vaker voor in niet-cellulose-epitopen dan neutrale fragmenten. Deze verschijnselen komen overeen met het patroon dat we in ons eerdere onderzoek hebben waargenomen, waarbij hoge DP en zure groepen resistenter waren tegen enzymatische hydrolyse. De aanwezigheid van niet-cellulose-glycaan-epitopen en U- en MeU-substituties kan dus aanzienlijk bijdragen aan de stabiliteit van de oligosacchariden. Het is belangrijk op te merken dat de bindings- en detectie-efficiëntie problematisch kan zijn voor oligosacchariden met een lage DP, vooral als het epitoop een dimeer of trimeer oligosaccharide is. Dit kan worden getest met behulp van commerciële oligosacchariden van verschillende lengtes, die elk slechts één epitoop bevatten dat bindt aan een specifiek mAb.
Zo bracht het gebruik van structuurspecifieke antilichamen bepaalde hardnekkige bindingen aan het licht. Afhankelijk van het type antilichaam, het juiste ligatiepatroon en de sterkte van het signaal (meest en minst overvloedig), kunnen nieuwe enzymen worden geïdentificeerd en semi-kwantitatief aan het enzymmengsel worden toegevoegd voor een completere glycoconversie. Neem bijvoorbeeld de analyse van ACSH-oligosacchariden: we kunnen een database van glycaanbindingen creëren voor elk biomateriaal. Hierbij moet rekening worden gehouden met de verschillende affiniteiten van antilichamen. Als de affiniteit onbekend is, levert dit problemen op bij het vergelijken van de signalen van verschillende antilichamen. Bovendien werkt de vergelijking van glycaanbindingen tussen monsters voor hetzelfde antilichaam mogelijk het beste. Deze hardnekkige bindingen kunnen vervolgens worden gekoppeld aan de CAZyme-database, waarmee we enzymen kunnen identificeren, kandidaat-enzymen kunnen selecteren en kunnen testen op bindingsbrekende enzymen, of microbiële systemen kunnen ontwikkelen om deze enzymen tot expressie te brengen voor gebruik in bioraffinaderijen44.
Om te evalueren hoe immunologische methoden een aanvulling vormen op alternatieve methoden voor de karakterisering van oligosacchariden met een laag moleculair gewicht in lignocellulosehydrolysaten, hebben we MALDI (Fig. 4, S1-S8) en een analyse van TMS-afgeleide sacchariden uitgevoerd op basis van GC-MS op hetzelfde paneel (Fig. 5) oligosaccharidegedeelte. MALDI wordt gebruikt om te vergelijken of de massaverdeling van oligosaccharidemoleculen overeenkomt met de beoogde structuur. Figuur 4 toont de MS van de neutrale componenten ACN-A en ACN-B. De analyse van ACN-A bevestigde een reeks pentosesuikers met een polymerisatiegraad (DP) van 4-8 (Fig. 4) tot 22 (Fig. S1), waarvan de gewichten overeenkomen met MeU-xylan-oligosacchariden. De analyse van ACN-B bevestigde de pentose- en glucoxylanreeksen met een DP van 8-15. In aanvullend materiaal, zoals figuur S3, tonen FA-C-massaverdelingskaarten van zure groepen een reeks (Me)U-gesubstitueerde pentosesuikers met een DP van 8-15 die overeenkomen met de gesubstitueerde xylanen die gevonden zijn bij ELISA-gebaseerde mAb-screening. De epitopen zijn consistent.
MALDI-MS-spectrum van oplosbare, niet-conforme oligosacchariden aanwezig in ACS. Hier: (A) ACN-A fracties met een laag gewichtsbereik die gemethyleerde uronzuur (DP 4-8) gesubstitueerde glucuroxylan-oligosacchariden bevatten en (B) ACN-B xylan- en gemethyleerde uronzuur-oligosacchariden gesubstitueerd met glucuroxylan (DP 8-15).
Analyse van de samenstelling van het glycaanresidu van refractaire oligosacchariden. Hier (A) TMS-saccharidesamenstelling van verschillende oligosaccharidefracties verkregen met behulp van GC-MS-analyse. (B) Structuren van verschillende TMS-afgeleide suikers die aanwezig zijn in oligosacchariden. ACN – acetonitrilfractie met neutrale oligosacchariden en FA – ferulazuurfractie met zure oligosacchariden.
Een andere interessante conclusie werd getrokken uit de LC-MS-analyse van de oligosaccharidefractie, zoals weergegeven in figuur S9 (de methoden zijn te vinden in het elektronisch aanvullend materiaal). Fragmenten van hexose- en -OAc-groepen werden herhaaldelijk waargenomen tijdens de ligatie van de ACN-B-fractie. Deze bevinding bevestigt niet alleen de fragmentatie die werd waargenomen in de glycoom- en MALDI-TOF-analyse, maar levert ook nieuwe informatie op over potentiële koolhydraatderivaten in voorbehandelde lignocellulosebiomassa.
We hebben ook de glycaansamenstelling van oligosaccharidefracties geanalyseerd met behulp van TMS-glycaanderivatizatie. Met behulp van GC-MS hebben we de samenstelling van neurale (niet-afgeleide) en zure suikers (GluA en GalA) in de oligosaccharidefractie bepaald (Fig. 5). Glucuronzuur wordt aangetroffen in de zure componenten C en D, terwijl galacturonzuur wordt aangetroffen in de zure componenten A en B, beide componenten met een hoge polymerisatiegraad (DP) van zure suikers. Deze resultaten bevestigen niet alleen onze ELISA- en MALDI-gegevens, maar zijn ook consistent met onze eerdere studies naar oligosaccharideaccumulatie. Daarom zijn wij van mening dat moderne immunologische methoden met biotinylering van oligosacchariden en daaropvolgende ELISA-screening voldoende zijn om oplosbare, moeilijk afbreekbare oligosacchariden in diverse biologische monsters te detecteren.
Aangezien ELISA-gebaseerde mAb-screeningmethoden al op verschillende manieren zijn gevalideerd, wilden we het potentieel van deze nieuwe kwantitatieve methode verder onderzoeken. Twee commerciële oligosacchariden, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) en 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), werden aangeschaft en getest met een nieuwe mAb-benadering gericht op de celwandglycanen. Figuur 6 toont een lineaire correlatie tussen het gebiotinyleerde bindingssignaal en de logaritmische concentratie van het oligosaccharide, wat wijst op een mogelijk Langmuir-adsorptiemodel. Van de mAbs correleerden CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 en CCRC-M151 met XHE, en CCRC-M108, CCRC-M109 en LM11 met A2XX over een bereik van 1 nm tot 100 nano. Vanwege de beperkte beschikbaarheid van antilichamen tijdens het experiment, werden er slechts een beperkt aantal experimenten uitgevoerd met elke oligosaccharideconcentratie. Het is belangrijk om hier op te merken dat sommige antilichamen heel verschillend reageren op hetzelfde oligosaccharide als substraat, vermoedelijk omdat ze binden aan enigszins verschillende epitopen en zeer uiteenlopende bindingsaffiniteiten kunnen hebben. De mechanismen en implicaties van nauwkeurige epitoopidentificatie zullen veel complexer zijn wanneer de nieuwe mAb-methode wordt toegepast op echte monsters.
Twee commerciële oligosacchariden werden gebruikt om het detectiebereik van verschillende op glycanen gerichte monoklonale antilichamen (mAbs) te bepalen. Hier geven lineaire correlaties met de logaritmische concentratie van de oligosaccharidenconcentratie Langmuir-adsorptiepatronen weer voor (A) XHE met mAb en (B) A2XX met mAb. De corresponderende epitopen geven de structuren weer van de commerciële oligosacchariden die als substraten in de test werden gebruikt.
Het gebruik van op glycanen gerichte monoklonale antilichamen (glycocomische analyse of ELISA-gebaseerde mAb-screening) is een krachtig instrument voor de diepgaande karakterisering van de meeste belangrijke celwandglycanen waaruit plantaardige biomassa bestaat. Klassieke glycaananalyse karakteriseert echter alleen grotere celwandglycanen, omdat de meeste oligosacchariden niet efficiënt op ELISA-platen kunnen worden geïmmobiliseerd. In deze studie werd AFEX-voorbehandeld maïsstro enzymatisch gehydrolyseerd bij een hoog gehalte aan vaste stoffen. Suikeranalyse werd gebruikt om de samenstelling van moeilijk afbreekbare celwandkoolhydraten in het hydrolysaat te bepalen. De mAb-analyse van kleinere oligosacchariden in hydrolysaten wordt echter onderschat en er zijn aanvullende methoden nodig om oligosacchariden effectief op ELISA-platen te immobiliseren.
We beschrijven hier een nieuwe en efficiënte methode voor de immobilisatie van oligosacchariden voor de screening van monoklonale antilichamen (mAb's). Deze methode combineert biotinylering van oligosacchariden met ELISA-screening op met NeutrAvidin™ gecoate platen. De geïmmobiliseerde gebiotinyleerde oligosacchariden vertoonden voldoende affiniteit voor het antilichaam, waardoor een snelle en efficiënte detectie van moeilijk te lokaliseren oligosacchariden mogelijk was. Analyse van de samenstelling van deze hardnekkige oligosacchariden met behulp van massaspectrometrie bevestigde de resultaten van deze nieuwe immunoscreeningmethode. Deze studies tonen aan dat de combinatie van oligosaccharidebiotinylering en ELISA-screening met op glycanen gerichte monoklonale antilichamen gebruikt kan worden om crosslinks in oligosacchariden te detecteren en breed toepasbaar is in andere biochemische studies die de structuur van oligosacchariden karakteriseren.
Deze op biotine gebaseerde glycaanprofileringsmethode is de eerste in zijn soort die de hardnekkige koolhydraatbindingen van oplosbare oligosacchariden in plantaardige biomassa kan onderzoeken. Dit helpt te begrijpen waarom sommige delen van biomassa zo moeilijk te verwerken zijn tot biobrandstoffen. Deze methode vult een belangrijke lacune in de glycoomanalyse en breidt de toepasbaarheid ervan uit naar een breder scala aan substraten, naast plantaardige oligosacchariden. In de toekomst zouden we robotica kunnen gebruiken voor biotinylering en de ontwikkelde methode kunnen inzetten voor snelle analyse van monsters met behulp van ELISA.
Maïsstro (CS) afkomstig van Pioneer 33A14 hybride zaden werd in 2010 geoogst bij Kramer Farms in Ray, Colorado. Met toestemming van de landeigenaar mag deze biomassa voor onderzoek worden gebruikt. De monsters werden droog bewaard (< 6% vocht) in afsluitbare zakjes bij kamertemperatuur. De monsters werden droog bewaard (< 6% vocht) in afsluitbare zakjes bij kamertemperatuur. Er is sprake van een lagere rente dan 6% op het gebied van de kredietwaardigheid температуре. De monsters werden droog bewaard bij een luchtvochtigheid van minder dan 6% in afsluitbare zakken bij kamertemperatuur.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Het gebruik van een product met een gemiddelde waarde van < 6%. De monsters worden bewaard in afsluitbare zakjes bij kamertemperatuur en een luchtvochtigheid van minder dan 6%.Het onderzoek voldeed aan de lokale en nationale richtlijnen. De samenstelling werd geanalyseerd volgens het NREL-protocol. De samenstelling bleek 31,4% glucaan, 18,7% xylan, 3,3% arabinaan, 1,2% galactaan, 2,2% acetyl, 14,3% lignine, 1,7% eiwit en 13,4% as te bevatten.
Cellic® CTec2 (138 mg eiwit/ml, lot VCNI 0001) is een complex mengsel van cellulase, β-glucosidase en Cellic® HTec2 (157 mg eiwit/ml, lot VHN00001) van Novozymes (Franklinton, NC, VS). Multifect Pectinase® (72 mg eiwit/ml), een complex mengsel van pectine-afbrekende enzymen, werd gedoneerd door DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, VS). De enzym-eiwitconcentraties werden bepaald door het eiwitgehalte te schatten (en de bijdrage van niet-eiwitstikstof af te trekken) met behulp van Kjeldahl-stikstofanalyse (AOAC-methode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, VS). Diatomeeënaarde 545 werd gekocht bij EMD Millipore (Billerica, MA). Geactiveerde koolstof (DARCO, korrels van 100 mesh), Avicel (PH-101), beukenxylan en alle andere chemicaliën werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
De AFEX-voorbehandeling werd uitgevoerd bij GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, VS). De voorbehandeling vond plaats bij 140 °C gedurende 15 minuten. De verblijftijd bedroeg 46 minuten bij een verhouding van 1:1 watervrije ammoniak tot biomassa met een belading van 60% (w/w) in een roestvrijstalen batchreactor (Parr Instruments Company). De reactor werd op 140 °C gebracht en de ammoniak werd snel vrijgegeven, waardoor de biomassa snel kon afkoelen tot kamertemperatuur. De samenstelling van het met AFEX voorbehandelde maïsstro (ACS) was vergelijkbaar met die van onbehandeld maïsstro (UT-CS).
Een ACSH-biomassa met een hoog gehalte aan vaste stoffen van 25% (w/w) (ongeveer 8% dextran) werd bereid als uitgangsmateriaal voor de grootschalige productie van oligosacchariden. Enzymatische hydrolyse van ACSH werd uitgevoerd met behulp van een commercieel enzymmengsel bestaande uit Cellic® Ctec2 (10 mg eiwit/g glucaan in voorbehandelde biomassa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC) (5 mg eiwit/g glucaan) en Multifect Pectinase (Genencor Inc, VS). De enzymatische hydrolyse werd uitgevoerd in een bioreactor van 5 liter met een werkvolume van 3 liter, bij pH 4,8, 50 °C en 250 rpm. Na 96 uur hydrolyse werd het hydrolysaat verzameld door centrifugatie bij 6000 rpm gedurende 30 minuten en vervolgens bij 14000 rpm gedurende 30 minuten om niet-gehydrolyseerde vaste stoffen te verwijderen. Het hydrolysaat werd vervolgens steriel gefilterd door een filterbeker met een poriegrootte van 0,22 mm. Het gefilterde hydrolysaat werd bewaard in steriele flessen bij 4 °C en vervolgens gefractioneerd op actieve kool.
Analyse van de samenstelling van op extract gebaseerde biomassa-monsters volgens de laboratoriumanalyseprocedures van NREL: voorbereiding van monsters voor samenstellingsanalyse (NREL/TP-510-42620) en bepaling van structurele koolhydraten en lignine in biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosaccharide-analyse van de hydrolysaatstroom werd uitgevoerd op een schaal van 2 ml met behulp van een autoclaaf-gebaseerde zure hydrolysemethode. Meng het hydrolysaatmonster met 69,7 µl 72% zwavelzuur in een kweekbuisje van 10 ml met schroefdop en incubeer gedurende 1 uur op een werkblad bij 121 °C. Koel af op ijs en filtreer in een HPLC-flesje (high performance liquid chromatography). De concentratie oligosacchariden werd bepaald door de concentratie monosacchariden in het niet-gehydrolyseerde monster af te trekken van de totale suikerconcentratie in het zuur-gehydrolyseerde monster.
De concentraties glucose, xylose en arabinose in de zuurgehydrolyseerde biomassa werden geanalyseerd met behulp van een Shimadzu HPLC-systeem, uitgerust met een autosampler, kolomverwarmer, isocratische pomp en refractometerdetector op een Bio-Rad Aminex HPX-87H kolom. De kolomtemperatuur werd op 50 °C gehouden en de elutie vond plaats met een stroomsnelheid van 0,6 ml/min 5 mM H₂SO₄ in water.
Het hydrolysaat-supernatant werd verdund en geanalyseerd op monomeer- en oligosaccharidegehalte. Monomere suikers verkregen na enzymatische hydrolyse werden geanalyseerd met behulp van HPLC, uitgerust met een Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolom en een asfilterkolom. De kolomtemperatuur werd gehandhaafd op 80 °C, water werd gebruikt als mobiele fase met een stroomsnelheid van 0,6 ml/min. Oligosacchariden werden bepaald door hydrolyse in verdund zuur bij 121 °C volgens de methoden beschreven in referenties 41, 48 en 49.
Saccharide-analyse werd uitgevoerd op ruwe, met AFEX voorbehandelde en alle niet-gehydrolyseerde biomassa-residuen (inclusief de productie van seriële celwandextracten en de screening daarvan met mAb's) met behulp van eerder beschreven procedures 27, 43, 50, 51. Voor glycoomanalyse werden alcohol-onoplosbare residuen van plantaardig celwandmateriaal bereid uit biomassa-residuen en onderworpen aan seriële extractie met steeds agressievere reagentia zoals ammoniumoxalaat (50 mM), natriumcarbonaat (50 mM en 0,5% w/v), CON. (1M en 4M, beide met 1% w/v natriumborohydride) en zuurchloriet zoals eerder beschreven52,53. De extracten werden vervolgens onderworpen aan ELISA tegen een complex panel van mAb50's gericht tegen het celwandglycaan, en de mAb-bindingsreacties werden weergegeven als een heatmap. mAb's gericht tegen plantaardig celwandglycaan werden aangeschaft uit laboratoriumvoorraden (CCRC-, JIM- en MAC-serie).
Eénstaps biotinylering van oligosacchariden. De conjugatie van koolhydraten met biotine-LC-hydrazide werd uitgevoerd volgens de volgende procedure. Biotine-LC-hydrazide (4,6 mg/12 μmol) werd opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO, 70 μl) door krachtig roeren en verhitten gedurende 1 minuut bij 65 °C. IJsazijn (30 μl) werd toegevoegd en het mengsel werd over natriumcyanoborohydride (6,4 mg/100 μmol) gegoten en volledig opgelost na verhitting gedurende ongeveer 1 minuut bij 65 °C. Vervolgens werd 5 tot 8 μl van het reactiemengsel toegevoegd aan het gedroogde oligosaccharide (1-100 nmol) om een ​​10-voudige of grotere molaire overmaat van het label ten opzichte van het reducerende uiteinde te verkrijgen. De reactie werd gedurende 2 uur bij 65 °C uitgevoerd, waarna de monsters onmiddellijk werden gezuiverd. Bij de labelings experimenten zonder reductie werd geen natriumcyanoborohydride gebruikt en de monsters werden gedurende 2,5 uur bij 65 °C gereageerd.
ELISA-coating en -wassen van monsters van gebiotinyleerde oligosacchariden. Aan elk putje van de met avidine gecoate plaat werd 25 μl gebiotinyleerde monsters toegevoegd (100 μl van elk geconcentreerd monster verdund in 5 ml 0,1 M Tris-bufferoplossing (TBS)). Controleputjes werden gecoat met 50 μl biotine met een concentratie van 10 μg/ml in 0,1 M TBS. Gedemineraliseerd water werd gebruikt als coating voor blanco metingen. De plaat werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Was de plaat 3 keer met 0,1% magere melk in 0,1 M TBS met behulp van programma nr. 11 voor Grenier flat 3A.
Toevoeging en uitspoelen van primaire antilichamen. Voeg 40 µl primair antilichaam toe aan elk putje. Incubeer de microplaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. De platen werden vervolgens 3 keer gewassen met 0,1% melk in 0,1 M TBS met behulp van wasprogramma #11 voor Grenier Flat 3A.
Voeg secundaire antistof toe en was. Voeg 50 µl secundaire muis-/rat-antistof (verdund 1:5000 in 0,1% melk in 0,1 M TBS) toe aan elk putje. Incubeer de microplaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. De microplaten werden vervolgens 5 keer gewassen met 0,1% melk in 0,1 M TBS met behulp van Grenier Flat 5A plaatwasprogramma #12.
Substraat toevoegen. Voeg 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) toe aan het basissubstraat (door 2 druppels buffer, 3 druppels TMB en 2 druppels waterstofperoxide toe te voegen aan 15 ml gedemineraliseerd water). Bereid het TMB-substraat voor en vortex voor gebruik. Incubeer de microplaat 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
Voltooi de stap en lees de tablet af. Voeg 50 µl 1 N zwavelzuur toe aan elk putje en registreer de extinctie van 450 tot 655 nm met behulp van een ELISA-lezer.
Bereid oplossingen van 1 mg/ml van deze analyten in gedeïoniseerd water: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonzuur (GalA), glucuronzuur (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (interne standaard). Twee standaarden werden bereid door de in Tabel 1 weergegeven suikeroplossingen van 1 mg/ml toe te voegen. De monsters worden ingevroren en gelyofiliseerd bij -80 °C totdat al het water is verwijderd (meestal ongeveer 12-18 uur).
Voeg 100–500 µg monster toe aan reageerbuisjes met schroefdop op een analytische balans. Noteer de toegevoegde hoeveelheid. Het is het beste om het monster op te lossen in een oplosmiddel met een specifieke concentratie en dit als vloeibaar aliquot aan het buisje toe te voegen. Gebruik 20 µl inositol van 1 mg/ml als interne standaard voor elk monsterbuisje. De hoeveelheid interne standaard die aan het monster wordt toegevoegd, moet gelijk zijn aan de hoeveelheid interne standaard die aan het standaardbuisje wordt toegevoegd.
Voeg 8 ml watervrije methanol toe aan een flesje met schroefdop. Voeg vervolgens 4 ml 3 N methanolische HCl-oplossing toe, sluit het flesje af en schud het. Bij dit proces wordt geen water gebruikt.
Voeg 500 µl van een 1 M HCl-methanoloplossing toe aan de oligosaccharidemonsters en standaard TMS-buizen. De monsters werden een nacht (168 uur) bij 80 °C in een thermoblok geïncubeerd. Droog het methanolysproduct bij kamertemperatuur met behulp van een droogapparaat. Voeg 200 µl methanol toe en droog opnieuw. Dit proces wordt tweemaal herhaald. Voeg 200 µl methanol, 100 µl pyridine en 100 µl azijnzuuranhydride toe aan het monster en meng goed. Incubeer de monsters 30 minuten bij kamertemperatuur en droog ze. Voeg 200 µl methanol toe en droog opnieuw.
Voeg 200 µl Tri-Sil toe en verwarm het afgesloten buisje gedurende 20 minuten tot 80 °C, laat het vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Gebruik een droogverdeelstuk om het monster verder te drogen tot een volume van ongeveer 50 µl. Het is belangrijk op te merken dat we de monsters niet volledig hebben laten drogen.
Voeg 2 ml hexaan toe en meng goed door te vortexen. Vul de punten van Pasteurpipetten (5-8 mm) met een stukje glaswol door de glaswol bovenop een pipet met een diameter van 5-3/4 inch te plaatsen. De monsters werden gedurende 2 minuten gecentrifugeerd bij 3000 g. Eventuele onoplosbare residuen werden neergeslagen. Droog het monster tot 100-150 µl. Een volume van ongeveer 1 µl werd geïnjecteerd in de GC-MS bij een begintemperatuur van 80 °C en een begintijd van 2,0 minuten (Tabel 2).