Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te kunnen blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
Nieuwe immunologische en massaspectrometrische methoden voor de complexe analyse van persistente oligosachariden in maïsstro dat is voorbehandeld met AFEX. Lignocellulosebiomassa is een duurzaam alternatief voor fossiele brandstoffen en wordt veel gebruikt voor de ontwikkeling van biotechnologieën voor de productie van producten zoals voedsel, veevoer, brandstoffen en chemicaliën. De sleutel tot deze technologieën is de ontwikkeling van kosteneffectieve processen voor het omzetten van complexe koolhydraten in plantencelwanden in eenvoudige suikers zoals glucose, xylose en arabinose. Omdat lignocellulosebiomassa zeer hardnekkig is, moet deze worden onderworpen aan thermochemische behandelingen (bijv. ammoniakvezelexfoliatie (AFEX), verdunde zuren (DA), ionische vloeistoffen (IL)) en biologische behandelingen (bijv. enzymatische hydrolyse en microbiële fermentatie) in combinatie om het gewenste product te verkrijgen. Wanneer echter commerciële schimmelenzymen worden gebruikt in het hydrolyseproces, zijn slechts 75-85% van de gevormde oplosbare suikers monosachariden en de resterende 15-25% oplosbare, hardnekkige oligosachariden, die niet altijd beschikbaar zijn voor micro-organismen. Eerder hebben we met succes oplosbare, hardnekkige oligosachariden geïsoleerd en gezuiverd met behulp van een combinatie van koolstof- en diatomeeënaarde-scheiding en grootte-uitsluitingschromatografie, en ook hun enzymremmende eigenschappen onderzocht. We hebben ontdekt dat oligosachariden met een hogere polymerisatiegraad (DP) gemethyleerde uronzuursubstituties moeilijker te verwerken zijn met commerciële enzymmengsels dan lage DP en neutrale oligosachariden. Hier rapporteren we het gebruik van verschillende aanvullende methoden, waaronder glycaanprofilering met behulp van monoklonale antilichamen (mAbs) die specifiek zijn voor glycanen uit plantenbiomassa om glycaanbindingen in plantencelwanden en enzymatische hydrolysaten te karakteriseren, matrix-geassisteerde laserdesorptie-ionisatie, time-of-flight-massaspectrometrie. MALDI-TOF-MS) maakt gebruik van structuurinformatieve diagnostische pieken verkregen door spectroscopie na secundaire afbraak van negatieve ionen, gaschromatografie en massaspectrometrie (GC-MS) om oligosacharidebindingen met en zonder derivatisering te karakteriseren. Vanwege de kleine omvang van oligosachariden (DP 4–20) zijn deze moleculen moeilijk te gebruiken voor mAb-binding en -karakterisering. Om dit probleem te verhelpen, hebben we een nieuwe, op biotineconjugatie gebaseerde oligosacharide-immobilisatiemethode toegepast die met succes de meeste oplosbare oligosachariden met lage DP op het oppervlak van de microtiterplaat labelde. Deze methode werd vervolgens gebruikt in een high-throughput mAb-systeem voor specifieke ligatieanalyse. Deze nieuwe methode zal in de toekomst de ontwikkeling van geavanceerdere high-throughput glycome assays vergemakkelijken, die kunnen worden gebruikt om oligosachariden in biomarkers te isoleren en te karakteriseren voor diagnostische doeleinden.
Lignocellulosebiomassa, samengesteld uit landbouw-, bosbouw-, gras- en houtachtige materialen, is een potentiële grondstof voor de productie van biobased producten, waaronder voedsel, veevoer, brandstof en chemische precursors om producten met een hogere waarde te produceren1. Koolhydraten (zoals cellulose en hemicellulose) aanwezig in plantencelwanden worden gedepolymeriseerd tot monosachariden door chemische verwerking en biotransformatie (zoals enzymatische hydrolyse en microbiële fermentatie). Veelvoorkomende voorbehandelingen omvatten ammoniakvezelexpansie (AFEX), verdund zuur (DA), ionische vloeistof (IL) en stoomexplosie (SE), die een combinatie van chemicaliën en hitte gebruiken om de lignocelluloseproductie te verminderen door plantencelwanden te openen3,4. hardnekkigheid van materie, 5. Enzymatische hydrolyse wordt uitgevoerd bij een hoge vastestofbelasting met behulp van commerciële actieve koolhydraatbevattende enzymen (CAZymes) en microbiële fermentatie met behulp van transgene gisten of bacteriën om biobased brandstoffen en chemicaliën te produceren6.
CAZymen in commerciële enzymen bestaan ​​uit een complexe mix van enzymen die synergetisch complexe koolhydraat-suikerbindingen verbreken om monosachariden te vormen2,7. Zoals we eerder meldden, maakt het complexe netwerk van aromatische polymeren van lignine met koolhydraten ze zeer onhandelbaar, wat leidt tot onvolledige suikeromzetting, waarbij 15-25% van de geslachtsoligosacchariden zich ophoopt die niet worden geproduceerd tijdens de enzymatische hydrolyse van de voorbehandelde biomassa. Dit is een veelvoorkomend probleem bij verschillende methoden voor biomassavoorbehandeling. Enkele redenen voor dit knelpunt zijn enzymremming tijdens hydrolyse, of de afwezigheid of lage concentraties van essentiële enzymen die nodig zijn om suikerbindingen in plantenbiomassa te verbreken. Inzicht in de samenstelling en structurele kenmerken van suikers, zoals de suikerbindingen in oligosachariden, zal ons helpen de suikeromzetting tijdens hydrolyse te verbeteren, waardoor biotechnologische processen qua kosten kunnen concurreren met producten op basis van aardolie.
Het bepalen van de structuur van koolhydraten is een uitdaging en vereist een combinatie van methoden zoals vloeistofchromatografie (LC)11,12, nucleaire magnetische resonantiespectroscopie (NMR)13, capillaire elektroforese (CE)14,15,16 en massaspectrometrie (MS)17. ,achttien. MS-methoden zoals time-of-flight-massaspectrometrie met laserdesorptie en ionisatie met behulp van een matrix (MALDI-TOF-MS) zijn een veelzijdige methode voor het identificeren van koolhydraatstructuren. Recentelijk is botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) tandem-MS van natriumionadducten het meest gebruikt om vingerafdrukken te identificeren die corresponderen met oligosacharide-aanhechtingsposities, anomere configuraties, sequenties en vertakkingsposities 20, 21.
Glycananalyse is een uitstekend hulpmiddel voor diepgaande identificatie van koolhydraatbindingen22. Deze methode maakt gebruik van monoklonale antilichamen (mAbs) gericht op glycanen in plantencelwanden als probes om complexe koolhydraatverbindingen te begrijpen. Wereldwijd zijn er meer dan 250 mAbs beschikbaar, ontworpen tegen diverse lineaire en vertakte oligosachariden met behulp van diverse sachariden24. Verschillende mAbs zijn veelvuldig gebruikt om de structuur, samenstelling en modificaties van de plantencelwand te karakteriseren, aangezien er significante verschillen zijn afhankelijk van het type plantencel, orgaan, leeftijd, ontwikkelingsstadium en groeiomgeving25,26. Recenter is deze methode gebruikt om vesikelpopulaties in planten- en dierensystemen en hun respectievelijke rollen in glycantransport te begrijpen, zoals bepaald door subcellulaire markers, ontwikkelingsstadia of omgevingsstimuli, en om de enzymatische activiteit te bepalen. Enkele van de verschillende structuren van glycanen en xylanen die zijn geïdentificeerd, zijn onder meer pectine (P), xylaan (X), mannan (M), xyloglucanen (XylG), gemengde gebonden glucanen (MLG), arabinoxylaan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronzuur-arabinoxylaan (GArbX) en arabino-galactaan (ArbG)29.
Ondanks al deze onderzoeksinspanningen hebben echter slechts enkele studies zich gericht op de aard van de accumulatie van oligosachariden tijdens hydrolyse met een hoge vastestoflading (HSL), inclusief de afgifte van oligosachariden, veranderingen in de lengte van de oligomere keten tijdens hydrolyse, verschillende polymeren met een lage DP en hun curven. distributies 30,31,32. Hoewel glycaananalyse een nuttig instrument is gebleken voor een uitgebreide analyse van de glycaanstructuur, is het moeilijk om wateroplosbare oligosachariden met een lage DP te evalueren met behulp van antilichaammethoden. Kleinere DP-oligosachariden met een molecuulgewicht van minder dan 5-10 kDa binden niet aan ELISA-platen 33, 34 en worden weggespoeld vóór de toevoeging van antilichamen.
Hier demonstreren we voor het eerst een ELISA-test op avidine-gecoate platen met behulp van monoklonale antilichamen, waarbij een eenstaps biotinyleringsprocedure voor oplosbare refractaire oligosachariden wordt gecombineerd met glycoomanalyse. Onze aanpak van glycoomanalyse werd gevalideerd door MALDI-TOF-MS en GC-MS-gebaseerde analyse van complementaire oligosacharideverbindingen met behulp van trimethylsilyl (TMS)-derivatisering van gehydrolyseerde suikersamenstellingen. Deze innovatieve aanpak kan in de toekomst worden ontwikkeld als een high-throughputmethode en bredere toepassing vinden in biomedisch onderzoek35.
Posttranslationele modificaties van enzymen en antilichamen, zoals glycosylering,36 beïnvloeden hun biologische activiteit. Veranderingen in de glycosylering van serumeiwitten spelen bijvoorbeeld een belangrijke rol bij inflammatoire artritis, en veranderingen in de glycosylering worden gebruikt als diagnostische markers37. In de literatuur is beschreven dat verschillende glycanen gemakkelijk voorkomen bij diverse ziekten, waaronder chronische ontstekingsziekten van het maag-darmkanaal en de lever, virale infecties, eierstok-, borst- en prostaatkanker38,39,40. Inzicht in de structuur van glycanen met behulp van antilichaamgebaseerde glycan-ELISA-methoden zal extra zekerheid bieden bij de diagnose van ziekten zonder het gebruik van complexe MS-methoden.
Uit ons eerdere onderzoek bleek dat hardnekkige oligosachariden ongehydrolyseerd bleven na voorbehandeling en enzymatische hydrolyse (Figuur 1). In ons eerder gepubliceerde werk ontwikkelden we een extractiemethode met actieve kool in de vaste fase om oligosachariden te isoleren uit met AFEX voorbehandeld maïsstrohydrolysaat (ACSH)8. Na de eerste extractie en scheiding werden de oligosachariden verder gefractioneerd door middel van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en verzameld op volgorde van molecuulgewicht. Suikermonomeren en -oligomeren die vrijkwamen uit verschillende voorbehandelingen werden geanalyseerd met behulp van suikersamenstellingsanalyse. Bij vergelijking van het gehalte aan suikeroligomeren verkregen met verschillende voorbehandelingsmethoden, is de aanwezigheid van hardnekkige oligosachariden een veelvoorkomend probleem bij de omzetting van biomassa in monosachariden en kan leiden tot een vermindering van de suikeropbrengst van ten minste 10-15% en zelfs tot 18%. VS. Deze methode wordt gebruikt voor verdere grootschalige productie van oligosacharidefracties. Het resulterende ACH en de daaropvolgende fracties met verschillende molecuulgewichten werden in dit werk gebruikt als experimenteel materiaal voor de karakterisering van oligosachariden.
Na voorbehandeling en enzymatische hydrolyse bleven persistente oligosachariden ongehydrolyseerd. Hier is (A) een oligosacharide-scheidingsmethode waarin oligosachariden worden geïsoleerd uit AFEX-voorbehandeld maïsstrohydrolysaat (ACSH) met behulp van een gepakt bed van actieve kool en diatomeeënaarde; (B) Methode voor scheiding van oligosachariden. De oligosachariden werden verder gescheiden door middel van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC); (C) Saccharidemonomeren en oligomeren die vrijkomen uit verschillende voorbehandelingen (verdund zuur: DA, ionische vloeistof: IL en AFEX). Enzymatische hydrolyse-omstandigheden: hoge vastestofbelading van 25% (w/w) (ongeveer 8% glucanbelading), 96 uur hydrolyse, 20 mg/g commerciële enzymbelading (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1-verhouding) en (D) Suikermonomeren en oligomeren van glucose, xylose en arabinose die vrijkomen uit AFEX-voorbehandeld maïsstro (ACS).
Glycananalyse is een nuttig hulpmiddel gebleken voor een uitgebreide structurele analyse van glycanen in extracten geïsoleerd uit vaste biomassaresiduen. Wateroplosbare sachariden zijn echter ondervertegenwoordigd met deze traditionele methode41, omdat oligosachariden met een laag moleculair gewicht moeilijk te immobiliseren zijn op ELISA-platen en worden uitgewassen vóór de toevoeging van antilichamen. Daarom werd voor antilichaambinding en -karakterisering een eenstaps biotinyleringsmethode gebruikt om oplosbare, niet-conforme oligosachariden op avidine-gecoate ELISA-platen te coaten. Deze methode werd getest met ons eerder geproduceerde ACSH en een fractie op basis van het molecuulgewicht (of polymerisatiegraad, DP). Eenstaps biotinylering werd gebruikt om de oligosacharidebindingsaffiniteit te verhogen door biotine-LC-hydrazide toe te voegen aan het reducerende uiteinde van het koolhydraat (Fig. 2). In oplossing reageert de hemiacetaalgroep aan het reducerende uiteinde met de hydrazidegroep van biotine-LC-hydrazide om een ​​hydrazonbinding te vormen. In aanwezigheid van het reductiemiddel NaCNBH3 wordt de hydrazonbinding gereduceerd tot een stabiel gebiotinyleerd eindproduct. Door de modificatie van het suikerreducerende uiteinde werd binding van oligosachariden met een lage DP aan ELISA-platen mogelijk. In onze studie werd dit gedaan op avidine-gecoate platen met behulp van glycan-gerichte mAb's.
Screening van monoklonale antilichamen op basis van ELISA voor gebiotinyleerde oligosachariden. Hier (A) gecombineerde biotinylering van oligosachariden en daaropvolgende ELISA-screening met glycan-gerichte mAbs op NeutrAvidine-gecoate platen en (B) een eenstapsprocedure voor biotinylering van reactieproducten.
Avidine-gecoate platen met oligosaccharide-geconjugeerde antilichamen werden vervolgens toegevoegd aan primaire en secundaire antilichamen en gewassen in een licht- en tijdgevoelig medium. Nadat de antilichaambinding voltooid is, wordt TMB-substraat toegevoegd om de plaat te incuberen. De reactie werd uiteindelijk gestopt met zwavelzuur. De geïncubeerde platen werden geanalyseerd met een ELISA-lezer om de bindingssterkte van elk antilichaam te bepalen en antilichaamspecifieke crosslinking te detecteren. Zie de betreffende sectie "Materialen en methoden" voor details en parameters van het experiment.
We demonstreren de bruikbaarheid van deze nieuw ontwikkelde methode voor specifieke toepassingen door de oplosbare oligosachariden te karakteriseren die aanwezig zijn in ACSH, evenals in ruwe en gezuiverde oligosacharidefracties geïsoleerd uit lignocellulosehydrolysaten. Zoals weergegeven in Figuur 3, zijn de meest voorkomende epitoopgesubstitueerde xylanen die in ACSH worden geïdentificeerd met behulp van bioacylated glycome assay-methoden meestal uronzuur (U) of methyluronzuur (MeU) en pectine-arabinogalactanen. De meeste hiervan werden ook gevonden in onze eerdere studie naar de analyse van glycanen van niet-gehydrolyseerde vaste stoffen (UHS)43.
Detectie van recalcitrante oligosacharide-epitopen met behulp van een monoklonaal antilichaam gericht tegen het celwandglycaan. De "neutrale" fractie is de ACN-fractie en de "zure" fractie is de FA-fractie. Helderder rood op de heatmap geeft een hoger epitoopgehalte aan, en helderder blauw geeft een blanco achtergrond aan. De kleurwaarden op de schaal zijn gebaseerd op ruwe OD-waarden voor formuleringen N=2. De belangrijkste epitopen die door de antilichamen worden herkend, worden rechts weergegeven.
Deze niet-cellulosestructuren konden niet worden gesplitst door de meest voorkomende cellulasen en hemicellulasen in het geteste commerciële enzymmengsel, dat de meest gebruikte commerciële enzymen bevat. Daarom zijn nieuwe hulpenzymen nodig voor hun hydrolyse. Zonder de benodigde niet-cellulose hulpenzymen verhinderen deze niet-cellulosebindingen een volledige omzetting naar monosachariden, zelfs als hun oorspronkelijke suikerpolymeren uitgebreid worden gehydrolyseerd tot kortere fragmenten en opgelost met behulp van commerciële enzymmengsels.
Verder onderzoek naar de signaalverdeling en de bindingssterkte ervan toonde aan dat bindingsepitopen lager waren in suikerfracties met een hoog DP-gehalte (A, B, C, DP tot 20+) dan in fracties met een laag DP-gehalte (D, E, F, DP in dimeren) (Fig. 1). Zure fragmenten komen vaker voor in niet-cellulose-epitopen dan in neutrale fragmenten. Deze verschijnselen komen overeen met het patroon dat werd waargenomen in onze eerdere studie, waar hoge DP- en zure groepen resistenter waren tegen enzymatische hydrolyse. Daarom kan de aanwezigheid van niet-cellulose-glycaanepitopen en U- en MeU-substituties sterk bijdragen aan de stabiliteit van de oligosachariden. Opgemerkt moet worden dat de bindings- en detectie-efficiëntie problematisch kunnen zijn voor oligosachariden met een laag DP-gehalte, vooral als het epitoop een dimerisch of trimerisch oligosacharide is. Dit kan worden getest met behulp van commerciële oligosachariden van verschillende lengtes, die elk slechts één epitoop bevatten dat aan een specifiek mAb bindt.
Het gebruik van structuurspecifieke antilichamen bracht dus bepaalde soorten hardnekkige bindingen aan het licht. Afhankelijk van het gebruikte type antilichaam, het geschikte ligatiepatroon en de sterkte van het signaal dat het produceert (meest en minst voorkomend), kunnen nieuwe enzymen worden geïdentificeerd en semi-kwantitatief aan het enzymmengsel worden toegevoegd voor een completere glycoconversie. Als we de analyse van ACSH-oligosacchariden als voorbeeld nemen, kunnen we een database van glycaanbindingen voor elk biomassamateriaal creëren. Hierbij moet rekening worden gehouden met de verschillende affiniteiten van antilichamen, en als hun affiniteit onbekend is, zal dit bepaalde moeilijkheden opleveren bij het vergelijken van de signalen van verschillende antilichamen. Bovendien werkt de vergelijking van glycaanbindingen mogelijk het beste tussen monsters voor hetzelfde antilichaam. Deze hardnekkige bindingen kunnen vervolgens worden gekoppeld aan de CAZyme-database, waaruit we enzymen kunnen identificeren, kandidaat-enzymen kunnen selecteren en kunnen testen op bindingsverbrekende enzymen, of microbiële systemen kunnen ontwikkelen om deze enzymen tot expressie te brengen voor gebruik in bioraffinaderijen.
Om te evalueren hoe immunologische methoden alternatieve methoden voor de karakterisering van oligosachariden met een laag moleculair gewicht in lignocellulosehydrolysaten aanvullen, hebben we MALDI (Fig. 4, S1-S8) en een analyse van TMS-afgeleide sachariden uitgevoerd op basis van GC-MS op hetzelfde oligosacharidedeel (Fig. 5). MALDI wordt gebruikt om te vergelijken of de massaverdeling van oligosacharidemoleculen overeenkomt met de beoogde structuur. Fig. 4 toont de MS van de neutrale componenten ACN-A en ACN-B. ACN-A-analyse bevestigde een reeks pentosesuikers variërend van DP 4–8 (Fig. 4) tot DP 22 (Fig. S1), waarvan de gewichten overeenkomen met MeU-xylaan-oligosachariden. ACN-B-analyse bevestigde de pentose- en glucoxylaanreeks met DP 8-15. In aanvullend materiaal zoals Figuur S3 tonen massaverdelingskaarten van de FA-C-zuurgroep een reeks (Me)U-gesubstitueerde pentosesuikers met een DP van 8-15, die consistent zijn met de gesubstitueerde xylanen die worden aangetroffen in ELISA-gebaseerde mAb-screening. De epitopen zijn consistent.
MALDI-MS-spectrum van oplosbare, niet-conforme oligosachariden aanwezig in ACS. Hier (A) ACN-A fracties met een laag gewichtsbereik die gemethyleerd uronzuur (DP 4-8) bevatten, gesubstitueerde glucuroxylaan-oligosachariden en (B) ACN-B xylaan en gemethyleerd uronzuur-oligosachariden gesubstitueerd met glucuroxylaan (DP 8-15).
Analyse van de samenstelling van het glycaanresidu van refractaire oligosachariden. Hier (A) de TMS-sacharidesamenstelling van verschillende oligosacharidefracties verkregen met behulp van GC-MS-analyse. (B) Structuren van verschillende TMS-afgeleide suikers aanwezig in oligosachariden. ACN – acetonitrilfractie met neutrale oligosachariden en FA – ferulinezuurfractie met zure oligosachariden.
Een andere interessante conclusie werd getrokken uit de LC-MS-analyse van de oligosacharidefractie, zoals weergegeven in Figuur S9 (de methoden zijn te vinden in het elektronische supplement). Fragmenten van hexose- en -OAc-groepen werden herhaaldelijk waargenomen tijdens de ligatie van de ACN-B-fractie. Deze bevinding bevestigt niet alleen de fragmentatie die werd waargenomen in glycoom- en MALDI-TOF-analyse, maar biedt ook nieuwe informatie over potentiële koolhydraatderivaten in voorbehandelde lignocellulosebiomassa.
We hebben ook de glycaansamenstelling van oligosacharidefracties geanalyseerd met behulp van TMS-glycaanderivatisering. Met behulp van GC-MS hebben we de samenstelling van neurale (niet-afgeleide) en zure suikers (GluA en GalA) in de oligosacharidefractie bepaald (fig. 5). Glucuronzuur wordt aangetroffen in zure componenten C en D, terwijl galacturonzuur wordt aangetroffen in zure componenten A en B; beide componenten met een hoog DP-gehalte van zure suikers. Deze resultaten bevestigen niet alleen onze ELISA- en MALDI-gegevens, maar komen ook overeen met onze eerdere studies naar de accumulatie van oligosachariden. Daarom zijn wij van mening dat moderne immunologische methoden, met biotinylering van oligosachariden en daaropvolgende ELISA-screening, voldoende zijn om oplosbare, recalcitrante oligosachariden in verschillende biologische monsters te detecteren.
Omdat ELISA-gebaseerde mAb-screeningsmethoden met verschillende methoden zijn gevalideerd, wilden we het potentieel van deze nieuwe kwantitatieve methode verder onderzoeken. Twee commerciële oligosachariden, xylohexasaccharide oligosacharide (XHE) en 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), werden aangekocht en getest met behulp van een nieuwe mAb-benadering gericht op het celwandglycaan. Figuur 6 toont een lineaire correlatie tussen het gebiotinyleerde bindingssignaal en de logaritme van de oligosacharideconcentratie, wat wijst op een mogelijk Langmuir-adsorptiemodel. Van de mAb's correleerden CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 en CCRC-M151 met XHE, en CCRC-M108, CCRC-M109 en LM11 correleerden met A2XX over een bereik van 1 nm tot 100 nanometer. Vanwege de beperkte beschikbaarheid van antilichamen tijdens het experiment, werden er beperkte experimenten uitgevoerd met elke oligosacharideconcentratie. Hierbij moet worden opgemerkt dat sommige antilichamen zeer verschillend reageren op hetzelfde oligosacharide als substraat, vermoedelijk omdat ze aan licht verschillende epitopen binden en zeer verschillende bindingsaffiniteiten kunnen hebben. De mechanismen en implicaties van nauwkeurige epitoopidentificatie zullen veel complexer zijn wanneer de nieuwe mAb-aanpak wordt toegepast op echte monsters.
Twee commerciële oligosachariden werden gebruikt om het detectiebereik van verschillende glycan-targeting mAb's te bepalen. Hier duiden lineaire correlaties met de logaritme van de oligosacharideconcentratie op Langmuir-adsorptiepatronen voor (A) XHE met mAb en (B) A2XX met mAb. De corresponderende epitopen geven de structuren aan van de commerciële oligosachariden die als substraat in de assay zijn gebruikt.
Het gebruik van glycaangerichte monoklonale antilichamen (glycocomische analyse of ELISA-gebaseerde mAb-screening) is een krachtig instrument voor diepgaande karakterisering van de meeste belangrijke celwandglycanen waaruit plantenbiomassa bestaat. Klassieke glycaananalyse karakteriseert echter alleen grotere celwandglycanen, aangezien de meeste oligosachariden niet efficiënt geïmmobiliseerd worden op ELISA-platen. In deze studie werd met AFEX voorbehandelde maïsstro enzymatisch gehydrolyseerd bij een hoog gehalte aan vaste stof. Suikeranalyse werd gebruikt om de samenstelling van recalcitrante celwandkoolhydraten in het hydrolysaat te bepalen. De mAb-analyse van kleinere oligosachariden in hydrolysaten wordt echter onderschat en er zijn aanvullende tools nodig om oligosachariden effectief te immobiliseren op ELISA-platen.
We beschrijven hier een nieuwe en efficiënte methode voor de immobilisatie van oligosacchariden voor mAb-screening, waarbij biotinylering van oligosacchariden wordt gecombineerd met ELISA-screening op met NeutrAvidin™ gecoate platen. De geïmmobiliseerde gebiotinyleerde oligosacchariden vertoonden voldoende affiniteit voor het antilichaam om snelle en efficiënte detectie van recalcitrante oligosacchariden mogelijk te maken. Analyse van de samenstelling van deze hardnekkige oligosacchariden met behulp van massaspectrometrie bevestigde de resultaten van deze nieuwe benadering van immunoscreening. Deze studies tonen dus aan dat de combinatie van biotinylering van oligosacchariden en ELISA-screening met glycaan-gerichte monoklonale antilichamen kan worden gebruikt om crosslinks in oligosacchariden te detecteren en breed kan worden toegepast in andere biochemische studies die de structuur van oligosacchariden karakteriseren.
Deze op biotine gebaseerde glycanprofileringsmethode is het eerste rapport dat de recalcitrante koolhydraatbindingen van oplosbare oligosachariden in plantaardige biomassa onderzoekt. Dit helpt te begrijpen waarom sommige delen van biomassa zo hardnekkig zijn als het gaat om biobrandstofproductie. Deze methode vult een belangrijke lacune in glycoomanalysemethoden en breidt de toepassing ervan uit naar een breder scala aan substraten dan alleen plantaardige oligosachariden. In de toekomst kunnen we robotica gebruiken voor biotinylering en de methode die we hebben ontwikkeld gebruiken voor high-throughput analyse van monsters met behulp van ELISA.
Maïsstro (CS) gekweekt uit Pioneer 33A14-hybridezaden werd in 2010 geoogst op Kramer Farms in Ray, Colorado. Met toestemming van de grondeigenaar mag deze biomassa voor onderzoek worden gebruikt. De monsters werden droog (< 6% vochtigheid) bewaard in hersluitbare zakken bij kamertemperatuur. De monsters werden droog (< 6% vochtigheid) bewaard in hersluitbare zakken bij kamertemperatuur. Er is sprake van een lagere rente dan 6% op het gebied van de kredietwaardigheid температуре. De monsters werden droog, bij een luchtvochtigheid van <6%, bewaard in zakken met ritssluiting bij kamertemperatuur.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Het gebruik van een product met een gemiddelde waarde van < 6%. De monsters worden bewaard in afsluitbare zakken bij kamertemperatuur en een vochtigheidsgraad van < 6%.De studie voldeed aan de lokale en nationale richtlijnen. De samenstellingsanalyse werd uitgevoerd volgens het NREL-protocol. De samenstelling bleek 31,4% glucaan, 18,7% xylaan, 3,3% arabinaan, 1,2% galactaan, 2,2% acetyl, 14,3% lignine, 1,7% eiwit en 13,4% as te bevatten.
Cellic® CTec2 (138 mg eiwit/ml, lotnummer VCNI 0001) is een complex mengsel van cellulase, β-glucosidase en Cellic® HTec2 (157 mg eiwit/ml, lotnummer VHN00001) van Novozymes (Franklinton, NC, VS). Multifect Pectinase® (72 mg eiwit/ml), een complex mengsel van pectine-afbrekende enzymen, werd gedoneerd door DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, VS). De eiwitconcentraties van de enzymen werden bepaald door het eiwitgehalte te schatten (en de bijdrage van niet-eiwitstikstof af te trekken) met behulp van Kjeldahl-stikstofanalyse (AOAC-methode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, VS). Diatomeeënaarde 545 werd gekocht bij EMD Millipore (Billerica, MA). Geactiveerde kool (DARCO, 100 mesh korrels), Avicel (PH-101), beukenxylaan en alle andere chemicaliën werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
De AFEX-voorbehandeling werd uitgevoerd bij GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, VS). De voorbehandeling vond plaats bij 140 °C gedurende 15 minuten. De verblijftijd bedroeg 46 minuten bij een 1:1-verhouding van watervrije ammoniak tot biomassa met een belasting van 60% (w/w) in een roestvrijstalen benchtop-batchreactor (Parr Instruments Company). De behandeling duurde 30 minuten. De reactortemperatuur werd verhoogd tot 140 °C en de ammoniak werd snel vrijgegeven, waardoor de biomassa snel terugkeerde naar kamertemperatuur. De samenstelling van met AFEX voorbehandeld maïsstro (ACS) was vergelijkbaar met die van onbehandeld maïsstro (UT-CS).
ACSH met een hoog vaste-stofgehalte van 25% (w/w) (ongeveer 8% dextranlading) werd bereid als uitgangsmateriaal voor grootschalige productie van oligosachariden. Enzymatische hydrolyse van ACS werd uitgevoerd met behulp van een commercieel enzymmengsel, waaronder Cellic® Ctec2 10 mg proteïne/g glucaan (in voorbehandelde biomassa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteïne/g glucaan en Multifect Pectinase (Genencor Inc, VS). ). ), 5 mg proteïne/g dextran. Enzymatische hydrolyse werd uitgevoerd in een bioreactor van 5 liter met een werkvolume van 3 liter, pH 4,8, 50 °C en 250 rpm. Na hydrolyse gedurende 96 uur werd het hydrolysaat verzameld door centrifugatie bij 6000 rpm gedurende 30 minuten en vervolgens bij 14000 rpm gedurende 30 minuten om niet-gehydrolyseerde vaste stoffen te verwijderen. Het hydrolysaat werd vervolgens steriel gefiltreerd door een filterbeker van 0,22 mm. Het gefilterde hydrolysaat werd bewaard in steriele flessen bij 4 °C en vervolgens gefractioneerd op koolstof.
Analyse van de samenstelling van biomassamonsters op basis van extracten volgens de laboratoriumanalyseprocedures van het NREL: voorbereiding van monsters voor samenstellingsanalyse (NREL/TP-510-42620) en bepaling van structurele koolhydraten en lignine in biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
De oligosaccharideanalyse van de hydrolysaatstroom werd uitgevoerd op een schaal van 2 ml met behulp van een zuurhydrolysemethode op autoclaafbasis. Meng het hydrolysaatmonster met 69,7 µl 72% zwavelzuur in een 10 ml kweekbuis met schroefdop en incubeer 1 uur op een tafelmodel bij 121 °C, koel af op ijs en filtreer in een HPLC-flesje (High Performance Liquid Chromatography). De concentratie oligosacchariden werd bepaald door de concentratie monosacchariden in het niet-gehydrolyseerde monster af te trekken van de totale suikerconcentratie in het zuur-gehydrolyseerde monster.
De glucose-, xylose- en arabinoseconcentraties in de zuurgehydrolyseerde biomassa werden geanalyseerd met behulp van een Shimadzu HPLC-systeem, uitgerust met een autosampler, kolomverwarmer, isocratische pomp en brekingsindexdetector, op een Bio-Rad Aminex HPX-87H kolom. De kolom werd op 50 °C gehouden en geëlueerd met 0,6 ml/min 5 mM H₂SO₂ in water.
De hydrolysaatsupernatant werd verdund en geanalyseerd op monomeer- en oligosacharidegehalte. De na enzymatische hydrolyse verkregen monomere suikers werden geanalyseerd met behulp van HPLC, uitgerust met een Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolom en een asbeschermingskolom. De kolomtemperatuur werd gehandhaafd op 80 °C, met water als mobiele fase met een stroomsnelheid van 0,6 ml/min. De oligosachariden werden bepaald door hydrolyse in verdund zuur bij 121 °C volgens de methoden beschreven in ref. 41, 48, 49.
Saccharideanalyse werd uitgevoerd op ruwe, met AFEX voorbehandelde en alle niet-gehydrolyseerde biomassaresten (inclusief de productie van seriële celwandextracten en hun mAb-screening) met behulp van eerder beschreven procedures 27, 43, 50, 51 . Voor glycoomanalyse worden in alcohol onoplosbare resten van plantencelwandmateriaal bereid uit biomassaresten en onderworpen aan seriële extractie met steeds agressievere reagentia zoals ammoniumoxalaat (50 mM), natriumcarbonaat (50 mM en 0,5% w/v), CON. (1 M en 4 M, beide met 1% w/v natriumboorhydride) en zuur chloriet zoals eerder beschreven52,53. De extracten werden vervolgens onderworpen aan ELISA tegen een complex panel van mAb50s gericht op het celwandglycaan, en de mAb-bindingsreacties werden gepresenteerd als een heatmap. mAbs gericht op plantencelwandglycaan werden gekocht uit laboratoriumvoorraden (CCRC-, JIM- en MAC-series).
Eénstaps biotinylering van oligosachariden. De conjugatie van koolhydraten met biotine-LC-hydrazide werd uitgevoerd met behulp van de volgende procedure. Biotine-LC-hydrazide (4,6 mg/12 μmol) werd opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO, 70 μl) door krachtig te roeren en gedurende 1 minuut te verwarmen op 65 °C. IJsazijn (30 µl) werd toegevoegd en het mengsel werd gegoten op natriumcyaanboorhydride (6,4 mg/100 µmol). Na ongeveer 1 minuut verwarmen op 65 °C loste het volledig op. Vervolgens werd 5 tot 8 μl van het reactiemengsel toegevoegd aan het gedroogde oligosacharide (1-100 nmol) om een ​​10-voudige of meer molaire overmaat van het label ten opzichte van het reducerende uiteinde te verkrijgen. De reactie werd gedurende 2 uur uitgevoerd bij 65 °C, waarna de monsters direct werden gezuiverd. Bij de labelingexperimenten werd geen natriumcyaanboorhydride gebruikt zonder reductie en de monsters werden gedurende 2,5 uur bij 65° C gereageerd.
ELISA-coating en wassen van monsters van gebiotinyleerde oligosachariden. 25 μl gebiotinyleerde monsters (100 μl van elk geconcentreerd monster verdund in 5 ml 0,1 M Tris-bufferoplossing (TBS)) werd toegevoegd aan elk putje van de met avidine gecoate plaat. Controleputjes werden gecoat met 50 μl biotine in een concentratie van 10 μg/ml in 0,1 M TBS. Gedeïoniseerd water werd gebruikt als coating voor blanco metingen. De tablet werd 2 uur bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Was de plaat 3 keer met 0,1% magere melk in 0,1 M TBS met behulp van programma nr. 11 voor Grenier flat 3A.
Toevoeging en wassen van primaire antilichamen. Voeg 40 µl primair antilichaam toe aan elke well. Incubeer de microtiterplaat 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. De platen werden vervolgens driemaal gewassen met 0,1% melk in 0,1 M TBS met behulp van wasprogramma #11 voor Grenier Flat 3A.
Voeg secundair antilichaam toe en was. Voeg 50 µl muis/rat secundair antilichaam (verdund 1:5000 in 0,1% melk in 0,1 M TBS) toe aan elke well. Incubeer de microtiterplaat 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. De microtiterplaten werden vervolgens 5 keer gewassen met 0,1% melk in 0,1 M TBS met behulp van Grenier Flat 5A plaatwasprogramma #12.
Substraat toevoegen. Voeg 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) toe aan het basissubstraat (voeg 2 druppels buffer, 3 druppels TMB en 2 druppels waterstofperoxide toe aan 15 ml gedemineraliseerd water). Bereid het TMB-substraat voor en vortex voor gebruik. Incubeer de microtiterplaat 30 minuten bij kamertemperatuur. In het donker.
Voltooi de stap en lees de tablet af. Voeg 50 µl 1 N zwavelzuur toe aan elk putje en registreer de absorptie van 450 tot 655 nm met een ELISA-lezer.
Bereid 1 mg/ml-oplossingen van deze analyten in gedemineraliseerd water: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonzuur (GalA), glucuronzuur (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (interne standaard). Twee standaarden werden bereid door de in tabel 1 weergegeven 1 mg/ml suikeroplossingen toe te voegen. Monsters worden ingevroren en gelyofiliseerd bij -80 °C totdat al het water is verwijderd (meestal ongeveer 12-18 uur).
Voeg 100-500 µg monster toe aan buisjes met schroefdop op een analytische balans. Noteer de toegevoegde hoeveelheid. Het is het beste om het monster op te lossen in een specifieke concentratie oplosmiddel en dit als een vloeistofaliquot aan het buisje toe te voegen. Gebruik 20 µl 1 mg/ml inositol als interne standaard voor elk buisje. De hoeveelheid interne standaard die aan het monster wordt toegevoegd, moet gelijk zijn aan de hoeveelheid interne standaard die aan het standaardbuisje wordt toegevoegd.
Voeg 8 ml watervrije methanol toe aan een flesje met schroefdop. Voeg vervolgens 4 ml 3 N methanolische HCl-oplossing toe, sluit af en schud. Bij dit proces wordt geen water gebruikt.
Voeg 500 µl 1 M HCl-methanoloplossing toe aan de oligosacharidemonsters en standaard TMS-buisjes. De monsters werden een nacht (168 uur) geïncubeerd bij 80 °C in een thermoblok. Droog het methanolyseproduct bij kamertemperatuur met behulp van een droogmanifold. Voeg 200 µl MeOH toe en droog opnieuw. Herhaal dit proces tweemaal. Voeg 200 µl methanol, 100 µl pyridine en 100 µl azijnzuuranhydride toe aan het monster en meng goed. Incubeer de monsters 30 minuten bij kamertemperatuur en droog ze. Voeg 200 µl methanol toe en droog opnieuw.
Voeg 200 µl Tri-Sil toe en verwarm het afgesloten buisje 20 minuten. Verwarm het tot 80 °C en laat het vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Gebruik een droogmanifold om het monster verder te drogen tot een volume van ongeveer 50 µl. Het is belangrijk om te weten dat we de monsters niet volledig hebben laten drogen.
Voeg 2 ml hexaan toe en meng goed door te vortexen. Vul de punten van pasteurpipetten (5-8 mm) met een stukje glaswol door de glaswol op een pipet met een diameter van 14,5 cm te plaatsen. De monsters werden 2 minuten gecentrifugeerd bij 3000 g. Onoplosbare resten werden neergeslagen. Droog het monster tot 100-150 µl. Een volume van ongeveer 1 µl werd in de GC-MS geïnjecteerd bij een begintemperatuur van 80 °C en een begintijd van 2,0 minuten (tabel 2).