Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Bitartean, laguntza jarraitua bermatzeko, gunea estilo eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
AFEX-ekin aldez aurretik tratatutako arto-soroan oligosakarido iraunkorren analisi konplexurako metodo immunologiko eta masibo-espektrometriko berriak. Lignozelulosazko biomasa erregai fosilen alternatiba jasangarria da eta asko erabiltzen da elikagaiak, pentsuak, erregaiak eta produktu kimikoak bezalako produktuak ekoizteko bioteknologiak garatzeko. Teknologia hauen gakoa landare-zelulen paretetan dauden karbohidrato konplexuak glukosa, xilosa eta arabinosa bezalako azukre sinple bihurtzeko kostu-lehiakorreko prozesuen garapena da. Lignozelulosazko biomasa oso erresistentea denez, tratamendu termokimikoen (adibidez, amoniako zuntzen esfoliazioa (AFEX), azido diluituak (DA), likido ionikoak (IL)) eta tratamendu biologikoen (adibidez, hidrolisi entzimatikoa eta hartzidura mikrobianoa) menpe jarri behar zaio konbinazio batean, nahi den produktua lortzeko. Hala ere, onddoen entzima komertzialak hidrolisi-prozesuan erabiltzen direnean, sortzen diren azukre disolbagarrien % 75-85 baino ez dira monosakaridoak, eta gainerako % 15-25a oligosakarido disolbagarri eta trataezinak dira, eta ez daude beti eskuragarri mikroorganismoentzat. Aurretik, oligosakarido temati disolbagarriak arrakastaz isolatu eta purifikatu ditugu karbono eta lur diatomeoen bereizketaren eta tamaina-esklusio kromatografiaren konbinazio bat erabiliz, eta baita haien entzimen inhibitzaile propietateak ere ikertu ditugu. Aurkitu dugu polimerizazio-maila (DP) handiagoa duten azido uroniko metilatutako ordezkapenak dituzten oligosakaridoak zailagoak direla entzima-nahasketa komertzialekin prozesatzen DP baxuko eta oligosakarido neutroak baino. Hemen beste hainbat metodoren erabileraren berri ematen dugu, besteak beste, landare-biomasaren glikanoetarako espezifikoak diren antigorputz monoklonalak (mAb) erabiliz glikanoen profilaketa, landare-zelulen hormetako eta hidrolizatu entzimatikoetako glikanoen loturak karakterizatzeko, matrizearen bidezko laser desortzio-ionizazioa, hegaldi-denboraren masa-espektrometria. MALDI-TOF-MS-k ioi negatiboen bigarren mailako desintegrazioaren ondoren espektroskopia bidez lortutako egitura-informatiboak diren gailur diagnostikoak erabiltzen ditu, gas-kromatografia eta masa-espektrometria (GC-MS) oligosakaridoen loturak deribatizazioarekin eta gabe karakterizatzeko. Oligosakaridoen tamaina txikia dela eta (DP 4–20), molekula hauek zailak dira mAb loturarako eta karakterizaziorako erabiltzea. Arazo hau gainditzeko, biotina konjugazioan oinarritutako oligosakaridoen immobilizazio metodo berri bat aplikatu genuen, mikroplakaren gainazalean DP baxuko oligosakarido disolbagarri gehienak arrakastaz markatu zituena, eta ondoren, metodo hori mAb sistema batean erabili zen ligadura-analisi espezifikorako. Metodo berri honek etorkizunean glikoma-analisi aurreratuagoen garapena erraztuko du, biomarkatzaileetan dauden oligosakaridoak diagnostiko-helburuetarako isolatzeko eta karakterizatzeko erabil daitezkeenak.
Lignozelulosazko biomasa, nekazaritza, basogintza, belar eta egurrezko materialez osatua, produktu biologikoak ekoizteko lehengai potentziala da, besteak beste, elikagaiak, pentsuak, erregaiak eta aitzindari kimikoak, balio handiagoa duten produktuak ekoizteko1. Landare-zelulen paretetan dauden karbohidratoak (zelulosa eta hemizelulosa, adibidez) monosakaridoetan despolimerizatzen dira prozesamendu kimiko eta bioeraldaketaren bidez (hala nola, hidrolisi entzimatikoa eta hartzidura mikrobianoa). Aurretratamendu ohikoenen artean, amoniako zuntz-hedapena (AFEX), azido diluitua (DA), likido ionikoa (IL) eta lurrun-leherketa (SE) daude, eta hauek produktu kimikoen eta beroaren konbinazioa erabiltzen dute lignozelulosa-ekoizpena murrizteko, landare-zelulen paretak irekiz3,4. materiaren burugogortasuna, 5. Hidrolisi entzimatikoa solido-karga handiarekin egiten da, karbohidratoak dituzten entzima aktibo komertzialak (CAZymes) erabiliz, eta hartzidura mikrobianoa legamia edo bakterio transgenikoak erabiliz, erregai eta produktu kimiko biologikoak ekoizteko 6.
Entzima komertzialetako CAZimak entzima nahasketa konplexu batez osatuta daude, eta hauek sinergikoki ebakitzen dituzte karbohidrato-azukre lotura konplexuak monosakaridoak sortzeko2,7. Lehenago jakinarazi dugun bezala, ligninaren eta karbohidratoen arteko polimero aromatikoen sare konplexuak oso trataezinak bihurtzen ditu, eta horrek azukre-bihurketa osatugabea dakar, aurretratatutako biomasaren hidrolisi entzimatikoan zehar sortzen ez diren sexu-oligosakaridoen % 15-25 metatuz. Hau arazo ohikoa da biomasaren aurretratamendu-metodo askotan. Oztopo honen arrazoietako batzuk hauek dira: hidrolisian zehar entzimen inhibizioa, edo landare-biomasan azukre-loturak hausteko beharrezkoak diren entzima esentzialen gabezia edo maila baxuak. Azukreen osaera eta ezaugarri estrukturalak ulertzeak, hala nola oligosakaridoetako azukre-loturak, azukre-bihurketa hobetzen lagunduko digu hidrolisian zehar, prozesu bioteknologikoak petroliotik eratorritako produktuekin kostu-lehiakorrak bihurtuz.
Karbohidratoen egitura zehaztea erronka bat da eta hainbat metodoren konbinazioa behar du, hala nola kromatografia likidoa (LC)11,12, erresonantzia magnetiko nuklearreko espektroskopia (NMR)13, elektroforesi kapilarra (CE)14,15,16 eta masa-espektrometria (MS)17. ,hemezortzi. MS metodoak, hala nola hegaldi-denboraren masa-espektrometria laser desortzioarekin eta matrizea erabiliz ionizazioarekin (MALDI-TOF-MS), metodo polifazetikoak dira karbohidratoen egiturak identifikatzeko. Duela gutxi, sodio ioien aduktoen talkak eragindako disoziazio (CID) tandem MS erabili izan da gehien oligosakaridoen atxikimendu-posizioei, konfigurazio anomerikoei, sekuentziei eta adarkatze-posizioei dagozkien hatz-markak identifikatzeko20, 21.
Glikanoen analisia tresna bikaina da karbohidratoen loturak sakonki identifikatzeko22. Metodo honek landare-zelulen hormako glikanoari zuzendutako antigorputz monoklonalak (mAb) erabiltzen ditu zunda gisa karbohidratoen lotura konplexuak ulertzeko. Mundu osoan 250 mAb baino gehiago daude eskuragarri, hainbat oligosakarido lineal eta adarkaturen aurka diseinatuta, hainbat sakarido erabiliz24. Hainbat mAb erabili dira landare-zelulen hormaren egitura, osaera eta aldaketak karakterizatzeko, landare-zelula motaren, organoaren, adinaren, garapen-etapenaren eta hazkuntza-ingurunearen arabera alde nabarmenak baitaude25,26. Duela gutxi, metodo hau erabili da landare- eta animalia-sistemetako besikula-populazioak eta glikanoen garraioan duten eginkizuna ulertzeko, markatzaile subzelularren, garapen-etaparen edo ingurumen-estimuluen arabera zehaztuta, eta jarduera entzimatikoa zehazteko. Identifikatu diren glikano eta xilanoen egitura desberdin batzuk hauek dira: pektina (P), xilanoa (X), mananoa (M), xiloglukanoak (XylG), lotura mistoko glukanoak (MLG), arabinoxilanoa (ArbX), galaktomananoa (GalG), azido glukuronikoa-arabinoxilanoa (GArbX) eta arabino-galaktanoa (ArbG)29.
Hala ere, ikerketa-ahalegin horiek guztiak izan arren, ikerketa gutxi batzuek baino ez dute arreta jarri oligosakaridoen metaketaren izaeran solido-karga handiko (HSL) hidrolisian zehar, oligosakaridoen askapena, oligomerismo-kateen luzeraren aldaketak hidrolisian zehar, DP baxuko hainbat polimero eta haien kurbak barne. banaketak 30,31,32. Bitartean, glikanoen analisia glikanoen egituraren analisi integrala egiteko tresna erabilgarria dela frogatu den arren, zaila da uretan disolbagarriak diren DP baxuko oligosakaridoak ebaluatzea antigorputz-metodoak erabiliz. 5-10 kDa baino gutxiagoko pisu molekularra duten DP oligosakarido txikiagoak ez dira ELISA plaketara lotzen 33, 34 eta garbitzen dira antigorputza gehitu aurretik.
Hemen, lehen aldiz, ELISA analisi bat erakusten dugu avidinaz estalitako plaketan, antigorputz monoklonalak erabiliz, oligosakarido errefraktario disolbagarrietarako biotinilazio prozedura urrats bakarrekoa glikomaren analisiarekin konbinatuz. Glikomaren analisirako gure ikuspegia MALDI-TOF-MS eta GC-MS oinarritutako analisi bidez balioztatu zen, azukre konposizio hidrolizatuen trimetilsilil (TMS) deribatizazioa erabiliz oligosakarido osagarrien loturen bidez. Ikuspegi berritzaile hau etorkizunean errendimendu handiko metodo gisa garatu daiteke eta aplikazio zabalagoa aurki dezake ikerketa biomedikoan35.
Entzimen eta antigorputzen itzulpen osteko aldaketek, hala nola glikosilazioak36, eragiten dute haien jarduera biologikoan. Adibidez, serumeko proteinen glikosilazioaren aldaketek zeregin garrantzitsua dute hanturazko artritisan, eta glikosilazioaren aldaketak markatzaile diagnostiko gisa erabiltzen dira37. Literaturan hainbat glikano erraz agertzen direla jakinarazi da hainbat gaixotasunetan, besteak beste, digestio-aparatuaren eta gibeleko hanturazko gaixotasun kronikoak, birusen infekzioak, obulutegiko, bularreko eta prostatako minbiziak38,39,40. Glikanoen egitura ulertzeak antigorputzetan oinarritutako glikano ELISA metodoak erabiliz konfiantza gehigarria emango du gaixotasunen diagnostikoan, MS metodo konplexuak erabili gabe.
Aurreko ikerketak erakutsi zuen oligosakarido tematiak hidrolizatu gabe jarraitzen zutela aurretratamenduaren eta hidrolisi entzimatikoaren ondoren (1. irudia). Aurretik argitaratutako lanean, ikatz aktibatu bidezko fase solidoko erauzketa metodo bat garatu genuen AFEX-ekin aurretratatutako arto-soro hidrolizatutik (ACSH)8 oligosakaridoak isolatzeko. Hasierako erauzketa eta bereizketaren ondoren, oligosakaridoak gehiago frakzionatu ziren tamaina-esklusio kromatografia bidez (SEC) eta pisu molekularraren arabera bildu ziren. Aurretratamendu desberdinetatik askatutako azukre-monomeroak eta oligomeroak azukrearen konposizioaren analisi bidez aztertu ziren. Aurretratamendu-metodo desberdinen bidez lortutako azukre-oligomeroen edukia alderatzean, oligosakarido tematien presentzia arazo ohikoa da biomasa monosakarido bihurtzean eta azukre-errendimenduan gutxienez % 10-15eko eta baita % 18ko murrizketa ere ekar dezake. Metodo hau oligosakarido-frakzioen ekoizpen handiagoa eskala handian egiteko erabiltzen da. Sortzen den ACH eta pisu molekular desberdineko ondorengo frakzioak erabili ziren lan honetan oligosakaridoen karakterizaziorako material esperimental gisa.
Aurretratamenduaren eta hidrolisi entzimatikoaren ondoren, oligosakarido iraunkorrak hidrolizatu gabe geratu ziren. Hemen (A) oligosakaridoen bereizketa metodo bat dago, non oligosakaridoak AFEX-ekin aurrez tratatutako arto-soroaren hidrolizatutik (ACSH) isolatzen diren, ikatz aktibatu eta lur diatomeozko ohe bat erabiliz; (B) Oligosakaridoen bereizketa metodoa. Oligosakaridoak tamaina-esklusio kromatografiaren (SEC) bidez bereizi ziren gehiago; (C) Aurretratamendu desberdinetatik askatutako sakarido monomeroak eta oligomeroak (azido diluitua: DA, likido ionikoa: IL eta AFEX). Hidrolisi entzimatikoaren baldintzak: % 25eko solido-karga handia (p/p) (gutxi gorabehera % 8ko glukano-karga), 96 orduko hidrolisia, 20 mg/g entzima komertzialeko karga (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 erlazioa) eta (D) AFEX-ekin aurrez tratatutako arto-sorotik (ACS) askatutako glukosa, xilosa eta arabinosaren azukre-monomeroak eta oligomeroak.
Glikanoen analisia tresna erabilgarria dela frogatu da biomasa solidoko hondakinetatik isolatutako erauzkinetan glikanoen egitura-analisi integrala egiteko. Hala ere, uretan disolbagarriak diren sakaridoak gutxiegi ordezkatuta daude metodo tradizional hau erabiliz41, pisu molekular baxuko oligosakaridoak zailak baitira ELISA plaketan immobilizatzen eta antigorputza gehitu aurretik garbitzen baitira. Hori dela eta, antigorputzen lotura eta karakterizaziorako, biotinilazio-metodo bakarreko bat erabili zen oligosakarido disolbagarri eta ez-konformeak avidinaz estalitako ELISA plaketan estaltzeko. Metodo hau aurretik ekoitzitako ACSH erabiliz eta bere pisu molekularrean (edo polimerizazio-mailan, DP) oinarritutako frakzio batekin probatu zen. Biotinilazio bakarrekoa erabili zen oligosakaridoen lotura-afinitatea handitzeko, biotina-LC-hidrazida karbohidratoaren mutur erreduzitzaileari gehituz (2. irudia). Disoluzioan, mutur erreduzitzailearen hemiazetal taldeak biotina-LC-hidrazida-ren hidrazida taldearekin erreakzionatzen du hidrazona lotura bat osatzeko. NaCNBH3 erreduzitzailearen aurrean, hidrazona lotura biotinilatutako azken produktu egonkor batera murrizten da. Azukrearen mutur erreduzitzailearen aldaketarekin, DP baxuko oligosakaridoen ELISA plaketara lotzea posible bihurtu zen, eta gure ikerketan hau avidinaz estalitako plaketan egin zen, glikanoei zuzendutako mAb-ak erabiliz.
Biotinilatutako oligosakaridoen ELISA bidezko antigorputz monoklonalen baheketa. Hemen (A) oligosakaridoen biotinilazioa eta ondorengo ELISA baheketa konbinatua glikanoei zuzendutako mAb-ekin NeutrAvidina estalitako plaketan eta (B) erreakzio-produktuen biotinilaziorako urrats bakarreko prozedura bat erakusten da.
Oligosakarido-konjugatutako antigorputzekin avidinaz estalitako plakak lehen eta bigarren mailako antigorputzetara gehitu eta argiarekiko eta denborarekiko sentikorra den ingurune batean garbitu ziren. Antigorputzen lotura amaitutakoan, TMB substratua gehitu plaka inkubatzeko. Erreakzioa azkenean azido sulfurikoarekin gelditu zen. Inkubatutako plakak ELISA irakurgailu bat erabiliz aztertu ziren antigorputz bakoitzaren lotura-indarra zehazteko eta antigorputz espezifikoen arteko lotura gurutzatua detektatzeko. Esperimentuaren xehetasunak eta parametroak ikusteko, ikusi dagokion "Materialak eta metodoak" atala.
Metodo berri honen erabilgarritasuna erakusten dugu aplikazio espezifikoetarako, ACSH-n dauden oligosakarido disolbagarriak zein lignozelulosazko hidrolizatuetatik isolatutako oligosakarido frakzio gordin eta purifikatuetan daudenak karakterizatuz. 3. irudian erakusten den bezala, ACSH-n identifikatutako epitopo-ordezkatutako xilano ohikoenak, bioazilatutako glikoma-analisi metodoak erabiliz, normalean arabinogalaktano uronikoak (U) edo metiluronikoak (MeU) eta pektikoak dira. Gehienak hidrolizatu gabeko solidoen (UHS) glikanoen analisiari buruzko aurreko ikerketan ere aurkitu ziren43.
Zelula-hormako glikanoari zuzendutako antigorputz monoklonal bat erabiliz oligosakarido epitopo errekalzitranteen detekzioa. "Neutroa" frakzioa ACN frakzioa da eta "azidoa" frakzioa FA frakzioa. Bero-maparen gorri distiratsuenek epitopo eduki handiagoa adierazten dute, eta urdin distiratsuenek atzeko plano hutsa. Eskalako kolore-balioak N=2 formulazioetarako OD balio gordinenetan oinarritzen dira. Antigorputzek ezagutzen dituzten epitopo nagusiak eskuinean ageri dira.
Zelulosazkoak ez diren egitura hauek ezin izan zituzten zelulasa eta hemizelulasa ohikoenek zatitu probatutako entzima-nahasketa komertzialean, eta horrek entzima komertzial erabilienak barne hartzen ditu. Beraz, entzima laguntzaile berriak behar dira haien hidrolisirako. Beharrezko zelulosazkoak ez diren entzima osagarririk gabe, zelulosazkoak ez diren lotura hauek monosakarido bihurtzea eragozten dute, nahiz eta haien jatorrizko azukre-polimeroak zati laburragoetan hidrolizatu eta entzima-nahasketa komertzialak erabiliz disolbatu.
Seinaleen banaketaren eta lotura-indarraren azterketa gehiagok erakutsi zuen lotura-epitopoak DP handiko azukre-frakzioetan (A, B, C, DP 20+ arte) DP baxuko frakzioetan baino (D, E, F, DP) dimeroetan (1. irudia). Azido-zatiak ohikoagoak dira zelulosa ez diren epitopoetan zati neutroetan baino. Fenomeno hauek bat datoz aurreko ikerketan ikusitako ereduarekin, non DP handiko eta azido-zatiak erresistenteagoak ziren hidrolisi entzimatikoarekiko. Beraz, zelulosa ez diren glikano epitopoen eta U eta MeU ordezkapenen presentziak asko lagun dezake oligosakaridoen egonkortasunean. Kontuan izan behar da lotura- eta detekzio-eraginkortasuna arazo bat izan daitekeela DP baxuko oligosakaridoentzat, batez ere epitopoa oligosakarido dimerikoa edo trimerikoa bada. Hori luzera desberdineko oligosakarido komertzialak erabiliz probatu daiteke, bakoitzak mAb espezifiko bati lotzen zaion epitopo bakarra duelarik.
Horrela, egitura-espezifiko antigorputzen erabilerak lotura errekalzitrante mota batzuk agerian utzi zituen. Erabilitako antigorputz motaren, ligadura-eredu egokiaren eta sortzen duen seinalearen indarraren arabera (ugariena eta gutxien ugaria), entzima berriak identifikatu eta erdi-kuantitatiboki gehi daitezke entzima-nahasteari glikokonbertsio osoagoa lortzeko. ACSH oligosakaridoen analisia adibide gisa hartuta, glikano loturen datu-base bat sor dezakegu biomasa-material bakoitzerako. Hemen kontuan izan behar da antigorputzen afinitate desberdina kontuan hartu behar dela, eta haien afinitatea ezezaguna bada, zailtasun batzuk sortuko dituela antigorputz desberdinen seinaleak alderatzerakoan. Gainera, glikano loturen alderaketa hobekien funtziona dezake antigorputz beraren laginen artean. Lotura errekalzitrante hauek CAZyme datu-basera lotu daitezke, eta bertatik entzimak identifikatu, hautagai diren entzimak hautatu eta lotura-hausteko entzimak probatu ditzakegu, edo sistema mikrobianoak garatu entzima horiek adierazteko biofindegietan erabiltzeko44.
Lignozelulosazko hidrolizatuetan dauden pisu molekular baxuko oligosakaridoak karakterizatzeko metodo alternatiboak nola osatzen dituzten ebaluatzeko, MALDI (4. irudia, S1-S8) eta TMS-tik eratorritako sakaridoen analisia egin genuen GC-MS bidez, oligosakarido zati berean (5. irudia). MALDI erabiltzen da oligosakarido molekulen masa-banaketa egitura nahiarekin bat datorren alderatzeko. 4. irudian ACN-A eta ACN-B osagai neutroen MS erakusten da. ACN-A analisiak DP 4-8tik (4. irudia) DP 22ra (S1 irudia) bitarteko pentosa azukre sorta bat baieztatu zuen, eta horien pisuak MeU-xilano oligosakaridoei dagozkie. ACN-B analisiak pentosa eta glukoxilano serieak baieztatu zituen DP 8-15ekin. S3 irudia bezalako material osagarrian, FA-C zati azidoen masa banaketa mapek (Me)U ordezkatutako pentosa azukre sorta bat erakusten dute, 8-15eko DP dutenak, ELISA oinarritutako mAb baheketan aurkitutako xilano ordezkatuekin bat datozenak. Epitopoak koherenteak dira.
ACS-n dauden oligosakarido disolbagarri eta ez-konformeen MALDI-MS espektroa. Hemen, (A) ACN-A pisu baxuko frakzioak, azido uroniko metilatuarekin (DP 4-8) ordezkatutako glukuroxilano oligosakaridoak dituztenak, eta (B) ACN-B xilanoa eta azido uroniko metilatuarekin (DP 8-15) ordezkatutako oligosakaridoak.
Oligosakarido errefraktarioen glikano hondarraren konposizioaren azterketa. Hemen (A) GC-MS analisi bidez lortutako hainbat oligosakarido frakzioren TMS sakaridoen konposizioa. (B) Oligosakaridoetan dauden TMStik eratorritako hainbat azukreren egiturak. ACN – oligosakarido neutroak dituen azetonitrilo frakzioa eta FA – azido oligosakaridoak dituen azido feruliko frakzioa.
Beste ondorio interesgarri bat atera zen oligosakarido frakzioaren LC-MS analisitik, S9 irudian erakusten den bezala (metodoak material osagarri elektronikoan ikus daitezke). Hexosa eta -OAc taldeen zatiak behin eta berriz ikusi ziren ACN-B frakzioaren ligaduran zehar. Aurkikuntza honek ez du bakarrik glikomaren eta MALDI-TOF analisietan ikusitako zatikatzea berresten, baizik eta informazio berria ere ematen du aurrez tratatutako lignozelulosazko biomasan dauden karbohidratoen deribatu potentzialei buruz.
Oligosakarido frakzioen glikanoen konposizioaren analisia ere egin genuen TMS glikanoen deribatizazioa erabiliz. GC-MS erabiliz, azukre neuronalen (ez-deribatuen) eta azidoen (GluA eta GalA) konposizioa zehaztu genuen oligosakarido frakzioan (5. irudia). Azido glukuronikoa C eta D osagai azidoetan aurkitzen da, eta azido galakturonikoa, berriz, A eta B osagai azidoetan, eta biak azukre azidoen DP handiko osagaiak dira. Emaitza hauek ez dituzte gure ELISA eta MALDI datuak berresten bakarrik, baita oligosakaridoen metaketaren aurreko ikerketekin bat datoz ere. Beraz, uste dugu oligosakaridoen biotinilazioa eta ondorengo ELISA baheketa erabiltzen dituzten metodo immunologiko modernoak nahikoak direla oligosakarido errezeltatzaile disolbagarriak hainbat lagin biologikotan detektatzeko.
ELISA oinarritutako mAb bahetze-metodoak hainbat metodo ezberdinen bidez balioztatu direnez, metodo kuantitatibo berri honen potentziala gehiago aztertu nahi izan dugu. Bi oligosakarido komertzial, xilohexasakarido oligosakaridoa (XHE) eta 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriosa (A2XX), erosi eta zelula-hormako glikanoari zuzendutako mAb ikuspegi berri bat erabiliz probatu ziren. 6. irudiak biotinilatutako lotura-seinalearen eta oligosakaridoen kontzentrazioaren logaritmoaren kontzentrazioaren arteko korrelazio lineal bat erakusten du, Langmuir adsorzio-eredu posible bat iradokiz. mAb-en artean, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 eta CCRC-M151 XHE-rekin korrelazionatu ziren, eta CCRC-M108, CCRC-M109 eta LM11 A2XX-rekin korrelazionatu ziren 1 nm eta 100 nano bitarteko tarte batean. Esperimentuan zehar antigorputzen eskuragarritasun mugatua zela eta, esperimentu mugatuak egin ziren oligosakarido-kontzentrazio bakoitzarekin. Kontuan izan behar da antigorputz batzuek oso modu ezberdinean erreakzionatzen dutela oligosakarido bera substratu gisa hartuta, ziurrenik epitopo apur bat desberdinetara lotzen direlako eta lotura-afinitate oso desberdinak izan ditzaketelako. Epitopoen identifikazio zehatzaren mekanismoak eta ondorioak askoz konplexuagoak izango dira mAb ikuspegi berria lagin errealetan aplikatzen denean.
Bi oligosakarido komertzial erabili ziren glikanoei zuzendutako hainbat mAb-ren detekzio-tartea zehazteko. Hemen, oligosakaridoen kontzentrazioaren logaritmoarekiko korrelazio linealek Langmuir adsorzio-ereduak adierazten dituzte (A) XHE mAb-rekin eta (B) A2XX mAb-rekin. Dagokien epitopoek analisian substratu gisa erabilitako oligosakarido komertzialen egiturak adierazten dituzte.
Glikanoei zuzendutako antigorputz monoklonalen erabilera (analisi glikokomikoa edo ELISA oinarritutako mAb baheketa) tresna indartsua da landare-biomasa osatzen duten zelula-hormako glikano nagusi gehienen karakterizazio sakona egiteko. Hala ere, glikanoen analisi klasikoak zelula-hormako glikano handiagoak bakarrik karakterizatzen ditu, oligosakarido gehienak ez baitira eraginkortasunez immobilizatzen ELISA plaketan. Ikerketa honetan, AFEX-ekin aurrez tratatutako arto-labana entzimatikoki hidrolizatu zen solido-eduki handiarekin. Azukreen analisia erabili zen hidrolizatuko zelula-hormako karbohidrato errekalzitranteen konposizioa zehazteko. Hala ere, hidrolizatuetako oligosakarido txikiagoen mAb analisia gutxietsi egiten da, eta tresna gehigarriak behar dira oligosakaridoak ELISA plaketan eraginkortasunez immobilizatzeko.
Hemen aurkezten dugu oligosakaridoen immobilizazio metodo berritzaile eta eraginkor baten berri, oligosakaridoen biotinilazioa eta ondoren NeutrAvidin™ estalitako plaketan ELISA baheketa konbinatuz. Biotinilatutako oligosakarido immobilizatuek antigorputzarekiko afinitate nahikoa erakutsi zuten oligosakarido errekalzitranteen detekzio azkar eta eraginkorra ahalbidetzeko. Oligosakarido burugogor hauen konposizioaren analisiak, masa-espektrometrian oinarrituta, immunobaheketarako ikuspegi berri honen emaitzak berretsi zituen. Beraz, ikerketa hauek erakusten dute oligosakaridoen biotinilazioaren eta ELISA baheketaren konbinazioa, glikanoei zuzendutako antigorputz monoklonalekin, oligosakaridoetan lotura gurutzatuak detektatzeko erabil daitekeela eta oligosakaridoen egitura karakterizatzen duten beste ikerketa biokimiko batzuetan ere aplika daitekeela.
Biotinan oinarritutako glikanoen profilak egiteko metodo hau da landare-biomasan dauden oligosakarido disolbagarrien karbohidrato-lotura erresistenteak ikertzeko gai den lehen txostena. Horrek biomasaren zati batzuk zergatik diren hain erresistenteak ulertzen laguntzen du bioerregaien ekoizpenari dagokionez. Metodo honek glikomaren analisi-metodoetan dagoen hutsune garrantzitsu bat betetzen du eta bere aplikazioa landare-oligosakaridoez gaindiko substratu sorta zabalago batera zabaltzen du. Etorkizunean, robotika erabil dezakegu biotinilaziorako eta garatu dugun metodoa erabiliko dugu laginen analisi-errendimendu handikoetarako ELISA erabiliz.
Pioneer 33A14 hibrido hazietatik hazitako arto-lastoa (CS) 2010ean bildu zen Kramer Farms-etik, Ray-n, Coloradon. Lurraren jabearen baimenarekin, biomasa hau ikerketarako erabil daiteke. Laginak % 6ko hezetasunetik beherako egoeran gorde ziren zip ixteko poltsetan, giro-tenperaturan. Laginak % 6ko hezetasunetik beherako egoeran gorde ziren zip ixteko poltsetan, giro-tenperaturan. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнахп. Laginak giro-tenperaturan eta % 6tik beherako hezetasunean gorde ziren kremaileradun poltsetan, lehorrean.样品在室温下以干燥<% 6 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥<% 6 Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < %6. Laginak kremailera-poltsetan gordetzen dira giro-tenperaturan eta % 6tik beherako hezetasunarekin.Ikerketak tokiko eta nazioko jarraibideak bete zituen. Konposizio-analisia NREL protokoloa erabiliz egin zen. Konposizioak % 31,4 glukano, % 18,7 xilano, % 3,3 arabinano, % 1,2 galaktano, % 2,2 azetilo, % 14,3 lignina, % 1,7 proteina eta % 13,4 errauts zituela ikusi zen.
Cellic® CTec2 (138 mg proteina/ml, VCNI 0001 lotea) zelulasa, β-glukosidasa eta Cellic® HTec2 (157 mg proteina/ml, VHN00001 lotea) Novozymes-ena da (Franklinton, NC, AEB)). Multifect Pectinase® (72 mg proteina/mL), pektina degradatzen duten entzimen nahasketa konplexua, DuPont Industrial Biosciences-ek eman zuen (Palo Alto, CA, AEB). Entzima-proteinen kontzentrazioak proteina-edukia kalkulatuz (eta nitrogeno ez-proteinikoaren ekarpena kenduz) zehaztu ziren Kjeldahl nitrogeno-analisia erabiliz (AOAC 2001.11 metodoa, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, AEB). Diatoma-lurra 545 EMD Millipore-tik erosi zen (Billerica, MA). Ikatz aktibatua (DARCO, 100 sareko granuluak), Avicel (PH-101), pago-xilana eta gainerako produktu kimiko guztiak Sigma-Aldrich-etik (St. Louis, MO) erosi ziren.
AFEX aurretratamendua GLBRC-n (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, AEB) egin zen. Aurretratamendua 140 °C-tan egin zen 15 minutuz. 46 egoitza-denbora amoniako anhidroaren eta biomasaren arteko 1:1 erlazioan % 60ko (p/p) kargarekin altzairu herdoilgaitzezko mahai-gaineko erreaktore batean (Parr Instruments Company). 30 minutu behar izan ziren. Erreaktorea 140 °C-ra eraman zen eta amoniakoa azkar askatu zen, biomasa azkar giro-tenperaturara itzultzeko aukera emanez. AFEX aurretratatutako arto-soroaren (ACS) konposizioa tratatu gabeko arto-soroaren (UT-CS) antzekoa zen.
Solido handiko ACSH % 25 (p/p) (gutxi gorabehera % 8ko dextrano karga) prestatu zen oligosakaridoen ekoizpen handian hasteko abiapuntu gisa. ACSren hidrolisi entzimatikoa entzima-nahasketa komertzial bat erabiliz egin zen, honako hauek barne: Cellic® Ctec2 10 mg proteina/g glukano (aurretratatutako biomasan), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteina/g glukano eta Multifect Pectinase (Genencor Inc, AEB). ), 5 mg proteina/g dextrano. Hidrolisi entzimatikoa 5 litroko bioerreaktore batean egin zen, 3 litroko lan-bolumenarekin, 4,8ko pHarekin, 50 °C-tan eta 250 rpm-tan. 96 orduz hidrolisiaren ondoren, hidrolizatua zentrifugazio bidez bildu zen 6000 rpm-tan 30 minutuz eta gero 14000 rpm-tan 30 minutuz hidrolizatu gabeko solidoak kentzeko. Ondoren, hidrolizatua 0,22 mm-ko iragazki-ontzi baten bidez iragazketa esterilizatu baten menpe jarri zen. Iragazitako hidrolizatua botila esteriletan gorde zen 4 °C-tan eta ondoren ikatz-hodian frakzionatu zen.
NREL laborategiko analisi-prozeduren araberako erauzkinetan oinarritutako biomasa-laginen konposizioaren azterketa: laginen prestaketa konposizio-analisirako (NREL/TP-510-42620) eta biomasan dauden karbohidrato estrukturalen eta ligninaren zehaztapena (NREL/TP-510 – 42618)47.
Hidrolizatu-jarioaren oligosakaridoen analisia 2 ml-ko eskalan egin zen, autoklabean oinarritutako azido hidrolisi metodo bat erabiliz. Nahastu hidrolizatu-lagina % 72ko azido sulfurikoko 69,7 µl-rekin 10 ml-ko torloju-tapoidun hazkuntza-hodi batean eta inkubatu ordu 1ez mahai-mahaian 121 °C-tan, hoztu izotzean eta iragazi errendimendu handiko kromatografia likido (HPLC) ontzi batean. Oligosakaridoen kontzentrazioa zehaztu zen hidrolizatu gabeko laginaren monosakaridoen kontzentrazioa azido-hidrolizatutako laginaren azukre-kontzentrazio osotik kenduz.
Azido hidrolizatutako biomasan glukosa, xilosa eta arabinosa kontzentrazioak Shimadzu HPLC sistema bat erabiliz aztertu ziren, laginketa automatikoa, zutabe-berogailua, ponpa isokratikoa eta errefrakzio-indizearen detektagailua zituena Bio-Rad Aminex HPX-87H zutabe batean. Zutabea 50 °C-tan mantendu zen eta 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 ur-fluxuan eluitu zen.
Hidrolizatuaren gainnadan dagoen likidoa diluitu eta monomero eta oligosakarido edukia aztertu zen. Hidrolisi entzimatikoaren ondoren lortutako azukre monomerikoak HPLC bidez aztertu ziren, Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P zutabe batekin eta errauts babes-zutabe batekin hornituta. Zutabearen tenperatura 80 °C-tan mantendu zen, ura fase mugikor gisa erabili zen 0,6 ml/min-ko emari-abiadurarekin. Oligosakaridoak azido diluituan hidrolisi bidez zehaztu ziren 121 °C-tan, 41, 48, 49 erreferentzietan deskribatutako metodoen arabera.
Sakaridoen analisia biomasa-hondakin gordinetan, AFEX bidez aurrez tratatutakoetan eta hidrolizatu gabekoetan egin zen (zelula-hormako erauzkin seriatuen ekoizpena eta haien mAb baheketa barne), aurretik deskribatutako prozedurak erabiliz 27, 43, 50, 51. Glikomaren analisirako, landare-zelulen hormako materialaren alkohol-disolbaezinak diren hondakinak biomasa-hondakinetatik prestatzen dira eta erauzketa seriatua egiten zaie erreaktibo gero eta oldarkorragoekin, hala nola amonio oxalatoa (50 mM), sodio karbonatoa (50 mM eta % 0,5 w/v), CON. (1M eta 4M, biak % 1 w/v sodio borohidruroarekin) eta klorito azidoa, aurretik deskribatu bezala 52,53. Ondoren, erauzkinak ELISA bidez aztertu ziren zelula-hormako glikanora zuzendutako mAb50en panel konplexu baten aurka, eta mAb lotura-erreakzioak mapa termiko gisa aurkeztu ziren. Landare-zelulen hormako glikanora zuzendutako mAb-ak laborategiko stocketatik erosi ziren (CCRC, JIM eta MAC serieak).
Oligosakaridoen biotinilazioa urrats bakarrean. Karbohidratoen biotina-LC-hidrazidarekin konjugazioa prozedura hau erabiliz egin zen. Biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) dimetil sulfoxidoan (DMSO, 70 μl) disolbatu zen, indarrez nahastuz eta 65 °C-tan minutuz berotuz. Azido azetiko glaziarra (30 µl) gehitu zen eta nahastea sodio zianoborohidruroaren (6,4 mg/100 µmol) gainean isuri zen eta guztiz disolbatu zen 65 °C-tan minutuz berotu ondoren. Ondoren, erreakzio-nahastearen 5 eta 8 μl artean gehitu ziren oligosakarido lehorrari (1-100 nmol), markatzailearen mutur erreduzitzailearen gainetik 10 aldiz edo gehiagoko gehiegizko molarra lortzeko. Erreakzioa 65 °C-tan egin zen 2 orduz, eta ondoren laginak berehala purifikatu ziren. Ez zen sodio zianoborohidrurorik erabili erredukziorik gabeko markatze-esperimentuetan, eta laginak 65 °C-tan erreakzionatu ziren 2,5 orduz.
Biotinilatutako oligosakaridoen laginen ELISA estaldura eta garbiketa. 25 μl biotinilatutako lagin (lagin kontzentratu bakoitzeko 100 μl 0,1 M-ko Tris buffer disoluzioko (TBS) 5 ml-tan diluituta) gehitu ziren avidinaz estalitako plakaren putzu bakoitzean. Kontrol-putzuak 50 μl biotinarekin estali ziren 10 μg/ml-ko kontzentrazioan 0,1 M-ko TBS-tan. Ur desionizatua erabili zen estaldura gisa neurketa hutsetarako. Tableta 2 orduz inkubatu zen giro-tenperaturan, iluntasunean. Garbitu plaka 3 aldiz % 0,1eko esne gaingabetuarekin 0,1 M-ko TBS-tan, 11. programa erabiliz Grenier laua 3A-rako.
Lehen mailako antigorputzen gehikuntza eta garbiketa. Gehitu 40 µl lehen mailako antigorputz putzu bakoitzean. Inkubatu mikroplaka ordubetez giro-tenperaturan eta iluntasunean. Ondoren, plakak 3 aldiz garbitu ziren % 0,1eko esnearekin 0,1M TBS-tan, Grenier Flat 3A-rako 11. garbiketa programa erabiliz.
Gehitu bigarren mailako antigorputza eta garbitu. Gehitu 50 µl sagu/arratoi bigarren mailako antigorputzen (% 0,1eko esnearekin 1:5000 diluitua 0,1 M TBS-tan) putzu bakoitzean. Inkubatu mikroplaka ordubetez giro-tenperaturan eta iluntasunean. Ondoren, mikroplakak 5 aldiz garbitu ziren % 0,1eko esnearekin 0,1 M TBS-tan, Grenier Flat 5A plaka-garbiketa programa #12 erabiliz.
Substratu bat gehitzea. Gehitu 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbentzidina (TMB) oinarrizko substratuari (2 tanta buffer, 3 tanta TMB eta 2 tanta hidrogeno peroxido gehituz 15 ml ur desionizatuari). Prestatu TMB substratua eta irabiatu erabili aurretik). Inkubatu mikroplaka giro-tenperaturan 30 minutuz. Iluntasunean.
Osatu urratsa eta irakurri tableta. Gehitu 50 µl 1 N azido sulfuriko putzu bakoitzean eta erregistratu absortzioa 450 eta 655 nm artean ELISA irakurgailu bat erabiliz.
Prestatu analito hauen 1 mg/ml-ko disoluzioak ur desionizatuan: arabinosa, ramnosa, fukosa, xilosa, azido galakturonikoa (GalA), azido glukuronikoa (GlcA), manosa, glukosa, galaktosa, laktosa, N-azetilmannosamina (manNAc), N-azetilglukosamina (glcNAc), N-azetilgalaktosamina (galNAc), inositola (barne-estandarra). Bi estandar prestatu ziren 1. taulan agertzen diren 1 mg/mL azukre-disoluzioak gehituz. Laginak izoztu eta -80 °C-tan liofilizatu ziren ura guztia kendu arte (normalean 12-18 ordu inguru).
Gehitu 100–500 µg lagin tapoidun hodietara balantza analitiko batean. Erregistratu gehitutako kantitatea. Hobe da lagina disolbatzaile-kontzentrazio espezifiko batean disolbatzea eta hodira likido-alikuota gisa gehitzea. Erabili 20 µl 1 mg/ml inositol barne-estandar gisa lagin-hodi bakoitzerako. Laginari gehitzen zaion barne-estandar kantitatea hodi estandarrari gehitzen zaion barne-estandar kantitate bera izan behar da.
Gehitu 8 ml metanol anhidro tapoi torlojudun botila batera. Ondoren, gehitu 4 ml 3 N HCl metanoliko disoluzio, estali eta astindu. Prozesu honek ez du urik erabiltzen.
Gehitu 500 µl 1 M HCl metanol disoluzio oligosakarido laginei eta TMS hodi estandarrei. Laginak gau osoan inkubatu ziren (168 ordu) 80 °C-tan bloke termiko batean. Lehortu metanolisi produktua giro-tenperaturan lehortze-kolektore bat erabiliz. Gehitu 200 µl MeOH eta lehortu berriro. Prozesu hau bi aldiz errepikatzen da. Gehitu 200 µl metanol, 100 µl piridina eta 100 µl anhidrido azetiko laginari eta nahastu ondo. Inkubatu laginak giro-tenperaturan 30 minutuz. Gehitu 200 µl metanol eta lehortu berriro.
Gehitu 200 µl Tri-Sil eta berotu hodia tapoiarekin 20 minutuz. 80°C-tan, eta ondoren hoztu giro-tenperaturara. Erabili lehortze-kolektore bat lagina gehiago lehortzeko, gutxi gorabehera 50 µl-ko bolumenera iritsi arte. Garrantzitsua da kontuan izatea ez ditugula laginak guztiz lehortzen utzi.
Gehitu 2 ml hexano eta nahastu ondo zurrunbiloaren bidez. Bete Pasteur pipeten puntak (5-8 mm) beira-artile zati batekin, beira-artilea 5-3/4 hazbeteko diametroko pipeta baten gainean sartuz. Laginak 3000 g-tan zentrifugatu ziren 2 minutuz. Hondakin disolbaezinak hauspeatu egiten dira. Lehortu lagina 100-150 µl-ra arte. Gutxi gorabehera 1 μl-ko bolumena injektatu zen GC-MS-an 80 °C-ko hasierako tenperaturan eta 2,0 minutuko hasierako denboran (2. taula).