Gratias tibi ago quod Nature.com invisisti. Versio navigatri quam uteris limitatam sustentationem CSS habet. Pro optima experientia, commendamus ut navigatro recentiore utaris (vel Modum Compatibilitatis in Internet Explorer deactivare). Interea, ut sustentationem continuam praestemus, situm sine stylis et JavaScript reddemus.
Novae methodi immunologicae et spectrometricae massae ad analysin complexam oligosaccharidorum persistentium in ramentis frumenti praetractatis cum AFEX. Biomassa lignocellulosica est alternativa sustinabilis combustibilibus fossilibus et late adhibetur ad biotechnologias evolvendas ad productionem productorum ut cibus, pabulum, combustibilia et chemica. Clavis harum technologiarum est progressus processuum sumptibus competitivorum ad convertendum carbohydrata complexa praesentia in parietibus cellularum plantarum in sacchara simplicia ut glucosum, xylosum et arabinosum. Quia biomassa lignocellulosica valde pertinax est, curationibus thermochemicis (e.g., exfoliatione fibrae ammoniae (AFEX), acida diluta (DA), liquores ionici (IL)) et curationibus biologicis (e.g., hydrolysis enzymatica et fermentatione microbica) in combinatione subiici debet ad productum desideratum obtinendum. Attamen, cum enzyma fungica commercialia in processu hydrolysis adhibentur, tantum 75-85% saccharorum solubilium formatorum sunt monosaccharida, et reliqua 15-25% sunt oligosaccharida solubilia, intractabilia, quae non semper microorganismis praesto sunt. Antehac, oligosaccharida pertinacia solubilia feliciter isolavimus et purificavimus, combinatione separationis carbonis et terrae diatomaceae necnon chromatographiae exclusionis magnitudinis utentes, et etiam proprietates eorum inhibitorias enzymorum investigavimus. Invenimus oligosaccharida continentia substitutiones acidi uronici methylati cum altiore gradu polymerizationis (DP) difficilius tractari cum mixturis enzymorum commercialibus quam oligosaccharida DP humilis et neutra. Hic usum plurium methodorum additionalium referimus, inter quas glycan profiling utens anticorporibus monoclonalibus (mAbs) specificis glycanis biomassae plantarum ad characterizandos nexus glycanorum in parietibus cellularum plantarum et hydrolysatis enzymaticis, ionizationem desorptionis laseris matrice adiuvatam, et spectrometriam massae temporis volatus. MALDI-TOF-MS utitur apicibus diagnosticis structurae informativis, spectroscopia post decompositionem secundariam ionum negativorum obtentis, chromatographia gasi et spectrometria massae (GC-MS) ad characterizandos nexus oligosaccharidarum cum et sine derivatione. Propter parvitatem oligosaccharidorum (DP 4-20), hae moleculae difficulter adhibentur ad ligationem et characterizationem anticorporum monoclonalium (mAb). Ad hanc difficultatem superandam, novam methodum immobilizationis oligosaccharidorum, biotini coniugatione fundatam, adhibuimus, quae plerosque oligosaccharidorum solubilium cum DP humili in superficie microlaminae feliciter notavit, quae deinde in systemate mAb altae capacitatis ad analysin ligationis specificae adhibita est. Haec nova methodus progressionem probationum glycomi altae capacitatis provectiorum in futuro facilitabit, quae ad oligosaccharida in biomarkers praesentia ad usus diagnosticos isolanda et characterizanda adhiberi possunt.
Biomassa lignocellulosica, ex materiis agriculturae, silviculturae, gramine et ligneis composita, est materia prima potentialis ad productionem productorum biologicorum, inter quae cibus, pabulum, combustibilia et praecursores chemici, ad producenda producta maioris pretii. Carbohydrata (ut cellulosa et hemicellulosa) in parietibus cellularum plantarum praesentia in monosaccharida depolymerizantur per processum chemicum et biotransformationem (ut hydrolysis enzymatica et fermentatio microbialis). Praeparationes communes includunt expansionem fibrae ammoniae (AFEX), acidum dilutum (DA), liquidum ionicum (IL), et explosionem vaporis (SE), quae combinationem chemicorum et caloris utuntur ad productionem lignocellulosae reducendam per aperitionem parium cellularum plantarum. 3,4. pertinaciam materiae. 5. Hydrolysis enzymatica perficitur cum onere solidorum alto utens enzymis commercialibus activis carbohydratorum continentibus (CAZymis) et fermentatione microbiali utens fermentis vel bacteriis transgenicis ad producenda combustibilia et chemica biologica.
CAZymae in enzymis commercialibus constant ex mixtura complexa enzymorum quae synergistice nexus complexos inter carbohydratos et saccharum scindunt ad monosaccharidos formandos2,7. Ut antea rettulimus, complexa retiacula polymerorum aromaticorum lignini cum carbohydratis ea valde difficilia tractabilia reddit, quod ad conversionem saccharorum imperfectam ducit, accumulando 15-25% oligosaccharidorum sexualium quae non producuntur per hydrolysim enzymaticam biomassae praetractatae. Hoc problema commune est cum variis methodis praetractationis biomassae. Inter causas huius angustiae sunt inhibitio enzymorum per hydrolysim, vel absentia vel gradus humiles enzymorum essentialium quae requiruntur ad nexus saccharorum in biomassa plantarum frangendos. Intellectus compositionis et proprietatum structuralium saccharorum, ut nexus saccharorum in oligosaccharidis, nobis adiuvabit ad conversionem saccharorum per hydrolysim emendandam, faciens processus biotechnologicos sumptibus cum productis ex petroleo derivatis competitivos.
Determinare structuram carbohydratorum difficile est et requirit combinationem methodorum, ut chromatographiam liquidam (LC)11,12, spectroscopiam resonantiae magneticae nuclearis (NMR)13, electrophoresis capillaris (CE)14,15,16 et spectrometriam massae (MS)17. ,duodeviginti. Methodi MS, ut spectrometria massae temporis volatus cum desorptione laseris et ionizatione utens matrice (MALDI-TOF-MS), sunt methodus versatilis ad structuras carbohydratorum identificandas. Nuper, spectrometria massae cum dissociatione collisionis inducta (CID) adductorum ionum natrii latissime adhibita est ad identificandas vestigia digitorum correspondentia positionibus adhaesionis oligosaccharidi, configurationibus anomericis, sequentiis, et positionibus ramificationis 20, 21.
Analysis glycanorum instrumentum optimum est ad profundam identificationem vinculorum carbohydratorum22. Haec methodus anticorpora monoclonalia (mAbs) ad glycanum parietis cellularis plantarum directa ut explorationes ad intellegendas nexus carbohydratorum complexos utitur. Plus quam 250 mAbs toto orbe terrarum praesto sunt, contra varia oligosaccharida linearia et ramosa designata utens variis saccharidis24. Plura mAbs late adhibita sunt ad structuram, compositionem et modificationes parietis cellularis plantarum describendam, cum differentiae significantes sint secundum genus cellulae plantarum, organum, aetatem, stadium evolutionis et ambitum crescentiae25,26. Recentius, haec methodus adhibita est ad intellegendas populationes vesicularum in systematibus plantarum et animalium et earum partes respectivas in transportatione glycanorum, ut determinatum est per indices subcellulares, stadia evolutionis vel stimuli ambientales, et ad determinandam actionem enzymaticam. Inter structuras glycanorum et xylanorum quae identificatae sunt sunt pectinum (P), xylanum (X), mannanum (M), xyloglucana (XylG), glucana cum vinculis mixtis (MLG), arabinoxylanum (ArbX), galactomannanum (GalG), acidum glucuronicum-arabinoxylanum (GArbX) et arabino-galactanum (ArbG).
Attamen, quamvis his omnibus investigationibus factis, pauca tantum studia in naturam accumulationis oligosaccharidorum per hydrolysim oneris solidorum magni (HSL) intenta sunt, inter quas emissio oligosaccharidorum, mutationes longitudinis catenae oligomericae per hydrolysim, varia polymera DP humilis, et curvae distributiones eorum 30,31,32. Interea, quamquam analysis glycani instrumentum utile ad analysin comprehensivam structurae glycani probata est, difficile est oligosaccharida DP humilis solubilia in aqua methodis anticorporum aestimare. Oligosaccharida DP minora cum pondere moleculari minus quam 5-10 kDa non ad laminas ELISA 33, 34 ligant et abluuntur ante additionem anticorporis.
Hic primum demonstramus experimentum ELISA in laminis avidino obductis utens anticorporibus monoclonalibus, coniungentes processum biotinylationis unius gradus pro oligosaccharidis refractariis solubilibus cum analysi glycomi. Nostra methodus ad analysin glycomi validata est per analysin fundatam in MALDI-TOF-MS et GC-MS nexuum oligosaccharidorum complementariorum utens derivatione trimethylsilyl (TMS) compositionum saccharorum hydrolyzatorum. Haec methodus innovativa potest explicari ut methodus altae capacitatis in futuro et applicationem latiorem in investigatione biomedica invenire.
Mutationes post-translationales enzymorum et anticorporum, ut glycosylatio,36 activitatem eorum biologicam afficiunt. Exempli gratia, mutationes in glycosylatione proteinorum serorum partes magnas agunt in arthritide inflammatoria, et mutationes in glycosylatione ut indices diagnostici adhibentur37. Varii glycani in litteris relati sunt facile apparere in variis morbis, inter quos morbi inflammatorii chronici tractus gastrointestinalis et hepatis, infectiones virales, cancri ovarii, mammarum, et prostatae38,39,40. Intellectus structurae glycanorum utens methodis ELISA glycanorum fundatis in anticorporibus fiduciam additam in diagnosi morbi praebebit sine usu methodorum MS complexarum.
Studium nostrum prius demonstravit oligosaccharida pertinacia post prae-tractationem et hydrolysim enzymaticam non hydrolyzata manere (Figura 1). In opere nostro antea edito, methodum extractionis phasis solidae carbonis activati ​​elaboravimus ad oligosaccharida ex hydrolyzato ​​stipulae frumenti prae-tractato AFEX (ACSH)8 isolanda. Post extractionem et separationem initialem, oligosaccharida ulterius per chromatographiam exclusionis magnitudinis (SEC) fractionata et secundum ordinem ponderis molecularis collecta sunt. Monomera et oligomera sacchari ex variis prae-tractationibus emissa per analysin compositionis sacchari analysata sunt. Cum contentum oligomerorum sacchari per varias methodos prae-tractationis obtentorum comparatur, praesentia oligosaccharidorum pertinacium problema commune est in conversione biomassae ad monosaccharida et ad reductionem in proventu sacchari saltem 10-15% et etiam usque ad 18% US ducere potest. Haec methodus ad ulteriorem productionem magnae scalae fractionum oligosaccharidorum adhibetur. ACH resultans et fractiones subsequentes cum diversis ponderibus molecularibus ut materia experimentalis ad characterizationem oligosaccharidorum in hoc opere adhibitae sunt.
Post praecurationem et hydrolysim enzymaticam, oligosaccharida persistentia non hydrolysata manebant. Hic est (A) methodus separationis oligosaccharidarum in qua oligosaccharida ex hydrolysato papulae maidis praecuratae cum AFEX (ACSH) isolantur, strato compacto carbonis activati ​​et terrae diatomaceae utens; (B) Methodus separationis oligosaccharidarum. Oligosaccharida ulterius separata sunt per chromatographiam exclusionis magnitudinis (SEC); (C) Monomera et oligomera saccharidarum ex variis praecurationibus emissa (acidum dilutum: DA, liquidum ionicum: IL et AFEX). Conditiones hydrolysis enzymaticae: onus solidorum magnum 25% (w/w) (onus glucani circiter 8%), hydrolysis 96 horarum, onus enzymi commercialis 20 mg/g (proportio Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) et (D) Monomera et oligomera saccharidarum glucosi, xylosi et arabinosi ex papula maidis praecurata cum AFEX (ACS) emissa.
Analysis glycanorum instrumentum utile ad analysin structuralem comprehensivam glycanorum in extractis ex residuis biomassae solidae isolatis probata est. Attamen, saccharida aquasolubilia hac methodo tradita subrepraesentantur, quia oligosaccharida ponderis molecularis humilis difficulter in laminis ELISA immobilizantur et ante additionem anticorporis eluuntur. Ergo, ad ligationem et characterizationem anticorporis, methodus biotinylationis unius gradus adhibita est ad oligosaccharida solubilia, non obsequentia, in laminis ELISA avidino obductis tegenda. Haec methodus probata est utens ACSH nostro antea producto et fractione secundum pondus moleculare (vel gradum polymerizationis, DP) fundata. Biotinylatio unius gradus adhibita est ad affinitatem ligationis oligosaccharidorum augendam addendo biotin-LC-hydrazidum ad finem reducentem carbohydrati (Fig. 2). In solutione, grex hemiacetalis ad finem reducentem cum grege hydrazidi biotin-LC-hydrazidi reagit ad vinculum hydrazoni formandum. Praesente agente reducente NaCNBH3, vinculum hydrazoni ad productum finale biotinylatur stabile reducitur. Modificatione extremitatis saccharo reducentis, coniunctio oligosaccharidorum DP humilis cum laminis ELISA possibilis facta est, et in nostro studio hoc factum est in laminis avidino obductis utens anticorporibus monoclonalibus glycano-directis.
Examen anticorporum monoclonalium in ELISA fundatum in oligosaccharidis biotinylatis. Hic (A) biotinylatio oligosaccharidorum et subsequens examinatio ELISA cum anticorporibus monoclonalibus glycano-directis in laminis NeutrAvidin obductis coniuncta est et (B) procedendi rationem uno gradu ad biotinylationem productorum reactionis ostendit.
Laminae avidino obductae cum anticorporibus oligosaccharido-coniugatis deinde anticorporibus primariis et secundariis additae sunt et in medio luci et tempori sensibili lavatae. Postquam ligatio anticorporis completa est, substratum TMB adde ad laminam incubandam. Reactio denique acido sulfurico interclusa est. Laminae incubatae per lectorem ELISA analysatae sunt ad robur ligationis cuiusque anticorporis determinandum ad nexus transversos anticorporum specificos detegendos. Pro singulis et parametris experimenti, vide sectionem correspondentem "Materiae et Methodi".
Utilitatem huius methodi nuper evolutae ad usus specificos demonstramus per oligosaccharida solubilia in ACSH praesentia, necnon in fractionibus oligosaccharidorum crudis et purificatis, ex hydrolysatis lignocellulosicis isolatis, describenda. Ut in Figura 3 demonstratur, xylana epitopo-substituta frequentissima, in ACSH per methodos bioacylatas glycomatis analysis identificata, plerumque sunt arabinogalactana uronica (U) vel methyluronica (MeU) et pectica. Pleraque eorum etiam in studio nostro priori de analysi glycanorum solidorum non-hydrolyzatorum (UHS) inventa sunt.
Detectio epitoporum oligosaccharidi recalcitrantium utens anticorpore monoclonali ad glycanum parietis cellularis directo. Fractio "neutra" est fractio ACN et fractio "acida" est fractio FA. Rubri clariores in mappa caloris maiorem contentum epitoporum indicant, et caerulei clariores fundum vacuum indicant. Valores colorum in scala in valoribus OD crudis pro formulis N=2 fundantur. Epitopia principalia ab anticorporibus agnita a dextra monstrantur.
Hae structurae non-cellulosae a cellulasis et hemicellulasis frequentissimis in mixtura enzymorum commerciali probata, quae enzyma commercialia frequentissime adhibita comprehendit, scindi non potuerunt. Quapropter, nova enzyma auxiliaria ad earum hydrolysim requiruntur. Sine necessariis enzymis accessoriis non-cellulosis, haec vincula non-cellulosa conversionem completam in monosaccharida impediunt, etiamsi polymeri sacchari parentales eorum late in fragmenta breviora hydrolyzantur et mixturis enzymorum commercialibus dissolvantur.
Studium ulterius distributionis signorum et roboris ligationis demonstravit epitopes ligationis minores esse in fractionibus saccharorum cum alto DP (A, B, C, DP usque ad 20+) quam in fractionibus cum humili DP (D, E, F, DP) in dimeris (Fig. 1). Fragmenta acidica frequentiora sunt in epitopibus non-cellulosicis quam in fragmentis neutris. Haec phaenomena congruunt cum exemplo observato in studio nostro priori, ubi DP altus et partes acidicae magis resistentes erant hydrolysi enzymaticae. Ergo, praesentia epitoporum glycanorum non-cellulosicorum et substitutionum U et MeU magnopere conferre possunt ad stabilitatem oligosaccharidorum. Notandum est efficaciam ligationis et detectionis problematicam esse posse pro oligosaccharidis cum humili DP, praesertim si epitopus est oligosaccharidum dimerum vel trimerum. Hoc probari potest utens oligosaccharidis commercialibus diversarum longitudinum, quorum unumquodque unum tantum epitopus continet qui ad specificum anticorpus monoclonale ligatur.
Itaque usus anticorporum structurae specificae certos typos vinculorum recalcitrantium revelavit. Pro genere anticorporis adhibiti, forma ligationis apta, et robore signi quod producit (plurimum et minimum abundantis), nova enzyma identificari et semi-quantitative mixturae enzymorum addi possunt ad glycoconversionem pleniorem. Exemplo analysis oligosaccharidorum ACSH sumpto, basim datorum vinculorum glycanorum pro singulis materiis biomassae creare possumus. Hic notandum est affinitatem diversam anticorporum in rationem duci debere, et si affinitas eorum ignota est, hoc certas difficultates creabit cum signa anticorporum diversorum comparantur. Praeterea, comparatio vinculorum glycanorum optime inter exempla pro eodem anticorpore fungi potest. Haec vincula pertinacia deinde cum basi datorum CAZyme coniungi possunt, ex qua enzyma identificare, enzyma candidata eligere et enzyma vincula frangentia explorare, vel systemata microbialia ad haec enzyma exprimenda ad usum in biorefineriis evolvere possumus.
Ad aestimandum quomodo methodi immunologicae methodos alternativas ad oligosaccharida ponderis molecularis humilis in hydrolysatis lignocellulosicis praesentia describenda compleant, MALDI (Fig. 4, S1-S8) et analysin saccharidorum ex TMS derivatorum, GC-MS in eadem parte oligosaccharidorum (Fig. 5) fundatam, perfecimus. MALDI adhibitus est ad comparandum utrum distributio massae molecularum oligosaccharidorum structurae intentae congruat. In figura 4 MS componentium neutrarum ACN-A et ACN-B ostenditur. Analysis ACN-A seriem saccharorum pentosorum a DP 4-8 (Fig. 4) ad DP 22 (Fig. S1) confirmavit, quorum pondera oligosaccharidis MeU-xylan respondent. Analysis ACN-B seriem pentosorum et glucoxylanorum cum DP 8-15 confirmavit. In materia supplementaria, ut Figura S3, tabulae distributionis massae partis acidae FA-C seriem saccharorum pentosorum (Me)U substitutorum cum DP 8-15 ostendunt, quae cum xylanis substitutis in examine anticorporum monoclonalium (mAb) fundato ELISA inventis congruunt. Epitopia congruunt.
Spectrum MALDI-MS oligosaccharidorum solubilium non obsequentium in ACS praesentium. Hic, (A) fractiones ACN-A ponderis humilis continentes oligosaccharidos glucuroxylanos acido uronico methylato (DP 4-8) substitutos et (B) oligosaccharidos ACN-B xylanum et acidum uronico methylatum glucuroxylano (DP 8-15) substitutos.
Analysis compositionis residui glycani oligosaccharidorum refractariorum. Hic (A) Compositio saccharidorum TMS variarum fractionum oligosaccharidorum per analysin GC-MS obtenta. (B) Structurae variorum saccharorum TMS-derivatorum in oligosaccharidis praesentium. ACN – fractio acetonitrili oligosaccharida neutra continens et FA – fractio acidi ferulici oligosaccharida acida continens.
Alia conclusio interesting ex analysi LC-MS fractionis oligosaccharidi deducta est, ut in Figura S9 demonstratur (methodi in materia electronica supplementari videri possunt). Fragmenta hexosorum et gregum -OAc iterum atque iterum observata sunt durante ligatione fractionis ACN-B. Hoc inventum non solum fragmentationem in analysi glycomica et MALDI-TOF observatam confirmat, sed etiam novas informationes de potentialibus derivatis carbohydratorum in biomassa lignocellulosica praetractata praebet.
Etiam analysin compositionis glycanorum fractionum oligosaccharidorum per derivationem glycanorum TMS perfecimus. Utente GC-MS, compositionem saccharorum neuralium (non derivatorum) et acidorum (GluA et GalA) in fractione oligosaccharidorum determinavimus (Fig. 5). Acidum glucuronicum in componentibus acidis C et D invenitur, dum acidum galacturonicum in componentibus acidis A et B invenitur, quae ambae componentes alto DP saccharorum acidorum sunt. Haec eventa non solum nostra data ELISA et MALDI confirmant, sed etiam cum studiis nostris prioribus de accumulatione oligosaccharidorum congruunt. Quapropter credimus methodos immunologicas modernas biotinylationem oligosaccharidorum et subsequentem ELISA examinationem utentes sufficere ad oligosaccharida recalcitranta solubilia in variis exemplaribus biologicis detegenda.
Cum methodi examinandi anticorporum monoclonalium (mAb) in ELISA fundatae per varias methodos validatae sint, potentiam huius novae methodi quantitativae ulterius explorare voluimus. Duo oligosaccharida commercialia, xylohexasaccharidum oligosaccharidum (XHE) et 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriosum (A2XX), empta et probata sunt novo modo anticorporum monoclonalium glycanum parietis cellularis petente. Figura 6 correlationem linearem inter signum ligationis biotinylatum et concentrationem logarithmicam concentrationis oligosaccharidi ostendit, quod possibilem exemplar adsorptionis Langmuir suggerit. Inter anticorpora monoclonalia, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, et CCRC-M151 cum XHE correlaverunt, et CCRC-M108, CCRC-M109, et LM11 cum A2XX per intervallum ab 1 nm ad 100 nano correlaverunt. Propter limitatam anticorporum copiam per experimentum, limitata experimenta cum unaquaque concentratione oligosaccharidi peracta sunt. Hic notandum est nonnulla anticorpora ad eundem oligosaccharidum ut substratum valde aliter reagere, probabiliter quia ad epitopes paulo diversos se iungunt et affinitates ligationis valde diversas habere possunt. Mechanismi et implicationes accuratae identificationis epitoporum multo complexiores erunt cum nova methodus anticorporum monoclonalium ad exempla vera applicabitur.
Duo oligosaccharida mercatoria adhibita sunt ad ambitum detectionis variorum anticorporum monoclonalium (mAb) glycanos petentibus determinandum. Hic, correlationes lineares cum concentratione logarithmica oligosaccharidarum exemplaria adsorptionis Langmuir pro (A) XHE cum mAb et (B) A2XX cum mAb indicant. Epitopia correspondentia structuras oligosaccharidorum mercatoriorum ut substratorum in experimento adhibitorum indicant.
Usus anticorporum monoclonalium glycano-directorum (analysis glycocomica vel perscrutatio anticorporum monoclonalium (mAb) per ELISA) instrumentum validum est ad profundam descriptionem plurimum glycanorum maiorum parietis cellularis quae biomassam plantarum constituunt. Attamen, analysis glycanorum classica tantum glycana maiora parietis cellularis describat, cum pleraque oligosaccharida non efficaciter in laminis ELISA immobilizentur. In hoc studio, stipulae frumenti praetractatae cum AFEX enzymatice hydrolyzatae sunt ad altam quantitatem solidorum. Analysis saccharorum adhibita est ad compositionem carbohydratorum recalcitrantium parietis cellularis in hydrolyzato ​​determinandam. Attamen, analysis mAb oligosaccharidorum minorum in hydrolysatis subaestimatur, et instrumenta addita necessaria sunt ad oligosaccharida in laminis ELISA efficaciter immobilizanda.
Hic novam et efficientem methodum immobilizationis oligosaccharidorum ad examinandum anticorpus monoclonales (mAb) referimus, per combinationem biotinylææ oligosaccharidorum deinde examinationis ELISA in laminis NeutrAvidin™ obductis. Oligosaccharida biotinylata immobilizata sufficientem affinitatem pro anticorpore demonstraverunt ad detectionem rapidam et efficientem oligosaccharidorum recalcitrantium permittendam. Analysis compositionis horum oligosaccharidorum pertinacium, fretus spectrometria massae, eventus huius novae methodi ad immunoexaminationem confirmavit. Itaque, hae investigationes demonstrant combinationem biotinylææ oligosaccharidorum et examinationis ELISA cum anticorporibus monoclonalibus glycano-directis adhiberi posse ad detegendas nexus transversales in oligosaccharidis et late applicari posse in aliis studiis biochemicis, quae structuram oligosaccharidorum describunt.
Haec methodus glycanorum profiling, biotino innixa, prima relatio est quae vincula carbohydratorum recalcitrantia oligosaccharidorum solubilium in biomassa plantarum investigare potest. Hoc adiuvat ad intelligendum cur quaedam partes biomassae tam pertinaces sint cum ad productionem biocombustibilis venit. Haec methodus lacunam magnam in methodis analysis glycomis implet et applicationem eius ad latiorem varietatem substratorum ultra oligosaccharida plantarum extendit. In futuro, robotica ad biotinylationem uti et methodum quam elaboravimus ad analysin magnae capacitatis exemplorum per ELISA uti possimus.
Stramen frumenti (CS), ex seminibus hybridis Pioneer 33A14 culta, anno 2010 ex Kramer Farms in Ray, Colorado, missum est. Cum venia domini agri, haec biomassa ad investigationes adhiberi potest. Exempla in saccis sigillatis, temperatura ambiente, sicca, cum humiditate < 6%. Exempla in saccis sigillatis, temperatura ambiente, sicca, cum humiditate < 6%. разцы ранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Exempla in saccis zippatis sicca ad temperaturam ambientem ad humiditatem <6% conservata sunt.< 6%< 6% разцы ранят в пакетах с астежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью <6%. Exempla in sacculis zippatis temperatura ambiente cum humiditate < 6% servantur.Studium praeceptis localibus et nationalibus obtemperavit. Analysis compositionis secundum protocollum NREL peracta est. Compositio inventa est continere 31.4% glucani, 18.7% xylani, 3.3% arabinani, 1.2% galactani, 2.2% acetylorum, 14.3% lignini, 1.7% proteini et 13.4% cineris.
Cellic® CTec2 (138 mg proteini/ml, lot VCNI 0001) est mixtura complexa cellulasi, β-glucosidasi et Cellic® HTec2 (157 mg proteini/ml, lot VHN00001) a Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg proteini/mL), mixtura complexa enzymorum pectinum degradantium, donata est a DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Concentrationes proteinorum enzymorum determinatae sunt aestimando contentum proteini (et subtrahendo contributionem nitrogenii non-proteini) utens analysi nitrogenii Kjeldahl (methodo AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Terra diatomacea 545 empta est ab EMD Millipore (Billerica, MA). Carbo activatus (DARCO, granula 100 mesh), Avicel (PH-101), xylanum fagi, et cetera omnia chemica a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) empta sunt.
Praecuratio AFEX apud GLBRC (Laboratorium Investigationis Conversionis Biomassae, MSU, Lansing, MI, USA) peracta est. Praecuratio ad 140° C per 15 minuta peracta est. Tempus residentiae 46 ad rationem 1:1 ammoniae anhydricae ad biomassam cum onere 60% (w/w) in reactore discontinuo chalybeo (Parr Instruments Company) aptato per mensam. Triginta minuta consumpsit. Reactor ad 140°C adductus est et ammonia celeriter emissa est, permittens biomassam celeriter ad temperaturam ambientem redire. Compositio pali frumenti AFEX praecurati (ACS) similis erat compositio pali frumenti non tractati (UT-CS).
ACSH solidorum altorum 25% (w/w) (cum dextrano circiter 8%) ut materia initialis ad productionem oligosaccharoidorum magnae scalae parata est. Hydrolysis enzymatica ACS peracta est utens mixtura enzymatica commerciali, incluso Cellic® Ctec2 10 mg proteini/g glucani (in biomassa praetractata), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteini/g glucani, et Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg proteini/g dextrani. Hydrolysis enzymatica peracta est in bioreactore 5 litrorum cum volumine operativo 3 litrorum, pH 4.8, 50°C et 250 rpm. Post hydrolysim per 96 horas, hydrolysatum centrifugatione ad 6000 rpm per 30 minuta, deinde ad 14000 rpm per 30 minuta, collectum est ad solida non hydrolyzata removenda. Hydrolysatum deinde filtrationi sterili per poculum filtratorium 0.22 mm subiectum est. Hydrolysatum filtratum in ampullis sterilibus ad 4° C conservatum et deinde in carbone fractionatum est.
Analysis compositionis exemplorum biomassae extractis fundatae secundum rationes analyticas laboratorium NREL: praeparatio exemplorum ad analysin compositionis (NREL/TP-510-42620) et determinatio carbohydratorum structuralium et lignini in biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analysis oligosaccharidi fluminis hydrolyzati peracta est in scala 2 ml, methodo hydrolysis acida in autoclave utens. Misce exemplum hydrolyzati cum 69.7 µl acidi sulfurici 72% in tubo culturae cum operculo cochleato 10 ml et incuba per 1 h in mensa ad 121°C, refrigera in glacie et filtra in ampullam chromatographiae liquidae altae perfunctionis (HPLC). Concentratio oligosaccharidi determinata est subtrahendo concentrationem monosaccharidi in exemplo non hydrolyzato ​​a concentratione sacchari totali in exemplo acido hydrolyzato.
Concentrationes glucosii, xylosi, et arabinosi in biomassa acido hydrolysata analysatae sunt utens systemate Shimadzu HPLC instructo autosampler, calefactore columnae, antlia isocratica, et detectore indicis refractionis in columna Bio-Rad Aminex HPX-87H. Columna ad 50°C conservata est et eluita est cum 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 in fluxu aquae.
Supernatans hydrolyzati dilutum et de contento monomerorum et oligosaccharidorum analysatum est. Sacchara monomerica post hydrolysim enzymaticam obtenta per HPLC cum columna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P et columna "custodiae cineris" instructa analysata sunt. Temperatura columnae ad 80°C conservata est, aqua ut phasis mobilis cum fluxu 0.6 ml/min adhibita est. Oligosaccharida per hydrolysim in acido diluto ad 121°C determinata sunt secundum methodos in ref. 41, 48, 49 descriptas.
Analysis saccharidi in residuis biomassae crudis, prae-tractatis AFEX, et omnibus non-hydrolysatis (inclusa productione extractuum serialium parietis cellularis et eorum examine anticorporum monoclonalium) peracta est, utens proceduris antea descriptis 27, 43, 50, 51. Ad analysin glycomi, residua insolubilia in alcohole materiae parietis cellularis plantarum ex residuis biomassae praeparantur et extractioni seriali cum reagentibus magis ac magis aggressivis, ut ammonii oxalati (50 mM), natrii carbonas (50 mM et 0.5% w/v), CON. (1M et 4M, ambo cum 1% w/v natrii borohydrido) et acidi chloriti, ut antea descriptum 52, 53, subiciuntur. Extracta deinde ELISA contra complexum panellum anticorporum monoclonalium 50 ad glycanum parietis cellularis directorum subiecta sunt, et reactiones ligationis anticorporum monoclonalium ut mappa caloris repraesentatae sunt. Anticorpora monoclonalia glycanum parietis cellularis plantarum petentia ex copiis laboratorium (series CCRC, JIM, et MAC) empta sunt.
Biotinylatio oligosaccharidorum uno gradu. Coniugatio carbohydratorum cum biotino-LC-hydrazido hac methodo peracta est. Biotinum-LC-hydrazidum (4.6 mg/12 μmol) in dimethylsulfoxido (DMSO, 70 μl) dissolutum est per agitationem strenuam et calefactionem ad 65°C per 1 min. Acidum aceticum glaciale (30 µl) additum est et mixtura super cyanoborohydridum natricum (6.4 mg/100 µmol) infusa est et post calefactionem ad 65°C per circiter 1 min. plene dissoluta. Deinde, ab 5 ad 8 μl mixturae reactionis oligosaccharido siccato (1-100 nmol) additum est ut excessus 10-plicatus vel plus molaris notationis supra finem reducentem obtineretur. Reactio ad 65°C per 2 h peracta est, post quod exempla statim purificata sunt. Nullum natrii cyanoborohydridum in experimentis marcationis sine reductione adhibitum est, et exempla ad 65° C per 2.5 horas reacta sunt.
Obductio et ablutio exemplorum oligosaccharidorum biotinylatorum per ELISA. 25 μl exemplorum biotinylatorum (100 μl cuiusque exempli concentrati diluti in 5 ml solutionis tamponis Tris 0.1 M (TBS)) in singulos puteos laminae avidino obductae additi sunt. Putei moderatores 50 μl biotini concentratione 10 μg/ml in 0.1 M TBS obducti sunt. Aqua deionizata ut obductio pro mensuris inanibus adhibita est. Tabella per 2 horas ad temperaturam ambientem in tenebris incubata est. Tabellam ter lava cum lacte exempto 0.1% in 0.1 M TBS utens programmate numero 11 pro Grenier plano 3A.
Additio et lavatio anticorporum primariorum. Adde 40 µl anticorporis primarii in singulos puteos. Incuba microlaminam per horam unam ad temperaturam ambientem in tenebris. Deinde laminae ter lavatae sunt lacte 0.1% in 0.1M TBS utens programmate lavationis #11 pro Grenier Flat 3A.
Anticorpus secundarium adde et lava. Adde 50 µl anticorporis secundarii muris/rattini (diluti 1:5000 in lacte 0.1% in 0.1 M TBS) in singulos puteos. Microlaminam per horam unam ad temperaturam ambientem in tenebris incuba. Deinde microlaminae quinquies lavatae sunt cum lacte 0.1% in 0.1 M TBS, utens programmate lavationis laminarum Grenier Flat 5A #12.
Substratum addendo. Adde 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidini (TMB) substrato basi (addendo 2 guttas solutionis tamponis, 3 guttas TMB, 2 guttas hydrogenii peroxidi ad 15 ml aquae deionizatae). Substratum TMB praepara et vortice agita ante usum). Microlaminam ad temperaturam ambientem per 30 minuta incuba. In tenebris.
Gradum perficite et tabulam legete. Addite 50 µl acidi sulfurici 1 N in singulos puteos et absorptionem ab 450 ad 655 nm lectore ELISA utendo notate.
Para solutiones 1 mg/ml harum analytarum in aqua deionizata: arabinosi, rhamnosi, fucosi, xylosi, acidi galacturonici (GalA), acidi glucuronici (GlcA), mannosi, glucosi, galactosi, lactosi, N-acetylmannosamini (manNAc), N-acetylglucosamini (glcNAc), N-acetylgalactosamini (galNAc), inositoli (norma interna). Duo normae praeparatae sunt addendo solutiones saccharo 1 mg/mL in Tabula 1 monstratas. Exempla congelantur et lyophilizantur ad -80° C donec omnis aqua remota sit (plerumque circiter 12-18 horas).
In statera analytica, 100–500 µg exempli in tubos operculis cochleatis adde. Quantitatem additam nota. Optimum est exemplum in certa concentratione solventis dissolvere et in tubum ut partem liquidam addere. 20 µl inositoli 1 mg/ml ut normam internam pro singulis tubis exempli adhibe. Quantitas normae internae ad exemplum addita eadem esse debet ac quantitas normae internae ad tubum normam addita.
Adde 8 ml methanoli anhydrici in ampullam operculo cochleato. Deinde 4 ml solutionis methanolicae HCl 3 N, operculo clausae et agitatae. Hoc processus aquam non adhibet.
Adde 500 µl solutionis methanoli 1 M HCl exemplaribus oligosaccharidis et tubulis TMS normalibus. Exempla per noctem (168 horas) ad 80° C in blocco thermali incubata sunt. Productum methanolysis temperatura ambiente utens canali siccatorio sicca. Adde 200 µl MeOH et iterum sicca. Hic processus bis repetitur. Adde 200 µl methanoli, 100 µl pyridini et 100 µl anhydridi acetici exemplari et bene misce. Exempla temperatura ambiente per 30 minuta incuba et sicca. Adde 200 µl methanoli et iterum sicca.
Adde 200 µl Tri-Sil et calefac tubum operculo clauso per 20 minuta ad 80°C, deinde refrigera ad temperaturam ambientem. Utere canali siccatorio ad ulterius siccandum exemplum ad volumen circiter 50 µl. Interest notare nos non permisisse exempla omnino siccari.
Adde 2 ml hexani et bene misce vortice. Imple apices pipettarum Pasteur (5-8 mm) frusto lanae vitreae, lanam vitream super pipettam 5-3/4 unciarum diametro inserendo. Exempla centrifugata sunt ad 3000 g per 2 minuta. Quaevis residua insolubilia praecipitantur. Exemplum ad 100-150 µl siccare. Volumen circiter 1 μl in GC-MS iniectum est temperatura initiali 80°C et tempore initiali 2.0 minutorum (Tabula 2).