Nature.com غا كىرگىنىڭىزگە رەھمەت. سىز ئىشلىتىۋاتقان تور كۆرگۈچنىڭ نەشرىدە CSS قوللاش چەكلىك. ئەڭ ياخشى تەجرىبە ئۈچۈن، يېڭىلانغان تور كۆرگۈچ ئىشلىتىشىڭىزنى (ياكى Internet Explorer دا ماسلىشىشچانلىق ھالىتىنى چەكلىشىڭىزنى) تەۋسىيە قىلىمىز. بۇ ئارىلىقتا، داۋاملىق قوللاشنى كاپالەتلەندۈرۈش ئۈچۈن، تور بېكەتنى ئۇسلۇب ۋە JavaScriptسىز كۆرسىتىمىز.
AFEX بىلەن ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغان كۆممىقوناق ئوچاقلىرىدىكى داۋاملىق ئولىگوساخارىدلارنى مۇرەككەپ تەھلىل قىلىش ئۈچۈن يېڭى ئىممۇنىتېت ۋە ماسسا سپېكترومېتىرىيەلىك ئۇسۇللار. لىگنوسېللۇلوزا بىئوماسساسى قېزىلما يېقىلغۇلارنىڭ ئىمكانقەدەر داۋاملىق ئالماشتۇرۇش ئۇسۇلى بولۇپ، يېمەكلىك، يەم-خەشەك، يېقىلغۇ ۋە خىمىيىلىك ماددىلار قاتارلىق مەھسۇلاتلارنى ئىشلەپچىقىرىش ئۈچۈن بىئو تېخنىكىلارنى تەرەققىي قىلدۇرۇشتا كەڭ قوللىنىلىدۇ. بۇ تېخنىكىلارنىڭ ئاچقۇچى ئۆسۈملۈك ھۈجەيرە دىۋارلىرىدا مەۋجۇت بولغان مۇرەككەپ كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنى گىليۇكوزا، كسىلوزا ۋە ئارابىنوزا قاتارلىق ئاددىي شېكەرلەرگە ئايلاندۇرۇش ئۈچۈن رىقابەت كۈچىگە ئىگە جەريانلارنى تەرەققىي قىلدۇرۇشتۇر. لىگنوسېللۇلوزا بىئوماسساسى ناھايىتى جاسارەتلىك بولغاچقا، ئۇنى ئىستەيدىغان مەھسۇلاتقا ئېرىشىش ئۈچۈن تېرموخىمىيىلىك بىر تەرەپ قىلىش (مەسىلەن، ئاممىياك تالاسىنى چىقىرىش (AFEX)، سۇيۇق كىسلاتالار (DA)، ئىئون سۇيۇقلۇقى (IL)) ۋە بىئولوگىيىلىك بىر تەرەپ قىلىش (مەسىلەن، ئېنزىملىق گىدرولىز ۋە مىكرو ئورگانىزم ئېچىتىش) بىلەن بىرلەشتۈرۈپ بىرلەشتۈرۈش كېرەك. قانداقلا بولمىسۇن، سودا زەمبۇرۇغ ئېنزىملىرى گىدرولىز جەريانىدا ئىشلىتىلگەندە، ھاسىل بولغان ئېرىيدىغان شېكەرنىڭ پەقەت 75-85% ى مونوساخارىدلار، قالغان 15-25% ى ئېرىيدىغان، ئېرىمەيدىغان ئولىگوساخارىدلار بولۇپ، ئۇلار ھەمىشە مىكرو ئورگانىزملار ئۈچۈن قولاي بولمايدۇ. بۇنىڭدىن ئىلگىرى، بىز كاربون ۋە دىئاتوم يەر ئايرىش ۋە چوڭ-كىچىكلىكىنى چىقىرىۋېتىش خروماتوگرافىيەسىنى بىرلەشتۈرۈپ، ئېرىيدىغان قەيسەر ئولىگوساخارىدلارنى مۇۋەپپەقىيەتلىك ئايرىپ، ساپلاشتۇردۇق، شۇنداقلا ئۇلارنىڭ ئېنزىمنى چەكلەش خۇسۇسىيىتىنى تەكشۈردۇق. بىز يۇقىرى دەرىجىلىك پولىمېرلىنىش (DP) مېتىللانغان ئۇرون كىسلاتا ئورنىنى ئالغان ئولىگوساخارىدلارنى تۆۋەن DP ۋە نېيترال ئولىگوساخارىدلارغا قارىغاندا سودا ئېنزىم ئارىلاشمىلىرى بىلەن بىر تەرەپ قىلىشنىڭ تېخىمۇ تەس ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق. بۇ يەردە بىز بىر قانچە قوشۇمچە ئۇسۇللارنىڭ قوللىنىلىشىنى دوكلات قىلىمىز، بۇنىڭ ئىچىدە ئۆسۈملۈك بىئوماسساسى گلىكانلىرىغا خاس مونوكلونال ئانتىتېلا (mAbs) ئارقىلىق گلىكان پروفىللاش، ئۆسۈملۈك ھۈجەيرە تاملىرىدىكى گلىكان باغلىنىشى ۋە ئېنزىملىق گىدرولىزاتلارنى خاراكتېرلەندۈرۈش، ماترىتسا ياردەملىك لازېر دېسوربسىيە ئىئونلاشتۇرۇش، ئۇچۇش ۋاقتى ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى قاتارلىقلار بار. . MALDI-TOF-MS) مەنپىي ئىئونلارنىڭ ئىككىنچى دەرىجىلىك پارچىلىنىشىدىن كېيىن سپېكتروسكوپىيە، گاز خروماتوگرافىيەسى ۋە ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى (GC-MS) ئارقىلىق ئېرىشكەن قۇرۇلما-ئۇچۇرلۇق دىئاگنوز چوققىلىرىنى ئىشلىتىپ، ئولىگوساخارىد باغلىنىشلىرىنى ھاسىل قىلىنغان ۋە ھاسىل قىلىنمىغان ھالەتتە خاراكتېرلەندۈرىدۇ. ئولىگوساخارىدلارنىڭ كىچىكلىكى (DP 4–20) سەۋەبىدىن، بۇ مولېكۇلالارنى mAb باغلىنىش ۋە خاراكتېرلەندۈرۈشتە ئىشلىتىش تەس. بۇ مەسىلىنى ھەل قىلىش ئۈچۈن، بىز مىكرو تاختا يۈزىدىكى تۆۋەن DP ئېرىيدىغان ئولىگوساخارىدلارنىڭ كۆپ قىسمىنى مۇۋەپپەقىيەتلىك بەلگىلەيدىغان يېڭى بىئوتىن بىرىكمىسىگە ئاساسلانغان ئولىگوساخارىد ئىممىكترونلاشتۇرۇش ئۇسۇلىنى قوللاندۇق، بۇ ئۇسۇل كېيىن يۇقىرى ئۆتكۈزۈشچانلىق mAb سىستېمىسىدا مەخسۇس باغلاش ئانالىزى ئۈچۈن ئىشلىتىلدى. بۇ يېڭى ئۇسۇل كەلگۈسىدە تېخىمۇ ئىلغار يۇقىرى ئۆتكۈزۈشچانلىق گلىكوم سىناقلىرىنى تەرەققىي قىلدۇرۇشقا ياردەم بېرىدۇ، بۇ ئۇسۇللار بىئو بەلگىلەردە بار بولغان ئولىگوساخارىدلارنى ئايرىپ چىقىش ۋە خاراكتېرلەندۈرۈشتە ئىشلىتىلىدۇ، بۇ ئۇسۇللار دىئاگنوز قويۇش مەقسىتىدە بىئو بەلگىلەردە بار بولغان ئولىگوساخارىدلارنى ئايرىپ چىقىش ۋە خاراكتېرلەندۈرۈشتە ئىشلىتىلىدۇ.
دېھقانچىلىق، ئورمانچىلىق، ئوت-چۆپ ۋە ياغاچ ماتېرىياللىرىدىن تەركىب تاپقان لىگنوسېللۇلوزا بىئوماسساسى يېمەكلىك، يەم-خەشەك، يېقىلغۇ ۋە خىمىيىلىك ئالدىنقى ماددىلار قاتارلىق بىئو ئاساستىكى مەھسۇلاتلارنى ئىشلەپچىقىرىشتا يۇقىرى قىممەتلىك مەھسۇلاتلارنى ئىشلەپچىقىرىش ئۈچۈن يوشۇرۇن خام ئەشيا ھېسابلىنىدۇ. ئۆسۈملۈك ھۈجەيرە تاملىرىدىكى كاربون سۇ بىر تەرەپ قىلىش ۋە بىئو ئۆزگەرتىش (مەسىلەن، ئېنزىملىق گىدرولىز ۋە مىكرو ئورگانىزم ئېچىتىش) ئارقىلىق مونوساخارىدلارغا دېپولىمېرلىنىدۇ. كۆپ ئۇچرايدىغان ئالدىن بىر تەرەپ قىلىش ئۇسۇللىرىغا ئاممىياك تالا كېڭىيىشى (AFEX)، سۇيۇق كىسلاتا (DA)، ئىئونلۇق سۇيۇقلۇق (IL) ۋە پار پارتىلىشى (SE) قاتارلىقلار كىرىدۇ، بۇلار ئۆسۈملۈك ھۈجەيرە تاملىرىنى ئېچىش ئارقىلىق لىگنوسېللۇلوزا ئىشلەپچىقىرىشنى ئازايتىش ئۈچۈن خىمىيىلىك ماددىلار ۋە ئىسسىقلىقنىڭ بىرىكمىسىنى ئىشلىتىدۇ. 3،4. ماددىلارنىڭ قەيسەرلىكى، 5. ئېنزىملىق گىدرولىز سودا ئاكتىپ كاربون سۇ بىرىكمىسى تەركىبىدىكى ئېنزىملار (CAZymes) ۋە ترانسگېنلىق خېمىر ياكى باكتېرىيە ئارقىلىق مىكرو ئورگانىزم ئېچىتىش ئارقىلىق يۇقىرى قاتتىق ماددىلار يۈكىدە ئېلىپ بېرىلىدۇ، بىئو ئاساستىكى يېقىلغۇ ۋە خىمىيىلىك ماددىلارنى ئىشلەپچىقىرىش ئۈچۈن ترانسگېنلىق خېمىر ياكى باكتېرىيەلەرنى ئىشلىتىدۇ.
سودا ئېنزىملىرىدىكى CAZymes مۇرەككەپ ئېنزىملارنىڭ ئارىلاشمىسىدىن تەركىب تاپقان بولۇپ، ئۇلار مۇرەككەپ كاربون سۇ بىرىكمىسى-شېكەر باغلىنىشىنى سىنگېرىكلىق ھالدا پارچىلاپ، مونوساخارىدلارنى ھاسىل قىلىدۇ2،7. ئىلگىرى خەۋەر قىلغىنىمىزدەك، لىگنىننىڭ كاربون سۇ بىرىكمىلىرى بىلەن بولغان مۇرەككەپ ئاروماتىك پولىمېر تورى ئۇلارنى ناھايىتى قىيىن قىلىدۇ، بۇ شېكەرنىڭ تولۇق ئايلىنىشىغا سەۋەب بولىدۇ، ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغان بىئوماسسانىڭ ئېنزىملىق گىدرولىز جەريانىدا ھاسىل بولمايدىغان جىنسىي ئولىگوساخارىدلارنىڭ %15-25 نى توپلايدۇ. بۇ ھەر خىل بىئوماسسا ئالدىن بىر تەرەپ قىلىش ئۇسۇللىرىدا كۆپ ئۇچرايدىغان مەسىلە. بۇ توسالغۇنىڭ بەزى سەۋەبلىرى گىدرولىز جەريانىدا ئېنزىمنىڭ چەكلىنىشى ياكى ئۆسۈملۈك بىئوماسساسىدىكى شېكەر باغلىنىشىنى ئۈزۈش ئۈچۈن زۆرۈر بولغان مۇھىم ئېنزىملارنىڭ يوقلۇقى ياكى تۆۋەن سەۋىيىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. ئولىگوساخارىدلاردىكى شېكەر باغلىنىشى قاتارلىق شېكەرلەرنىڭ تەركىبى ۋە قۇرۇلما ئالاھىدىلىكلىرىنى چۈشىنىش، گىدرولىز جەريانىدا شېكەر ئايلىنىشىنى ياخشىلاشقا ياردەم بېرىدۇ، بۇ بىئوتېخنىكا جەريانلىرىنى نېفىتتىن ئېلىنغان مەھسۇلاتلار بىلەن رىقابەت كۈچىگە ئىگە قىلىدۇ.
كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنىڭ قۇرۇلمىسىنى بېكىتىش قىيىن بولۇپ، سۇيۇقلۇق خروماتوگرافىيەسى (LC)11،12، يادرو ماگنىتلىق رېزونانس سپېكتروسكوپىيەسى (NMR)13، كاپىللار ئېلېكتروفورېزىسى (CE)14،15،16 ۋە ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى (MS)17 قاتارلىق ئۇسۇللارنى بىرلەشتۈرۈشنى تەلەپ قىلىدۇ. ،18. لازېر دېسوربسىيەسى ۋە ئىئونلاشتۇرۇش (MALDI-TOF-MS) ئارقىلىق ئۇچۇش ۋاقتى ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى قاتارلىق MS ئۇسۇللىرى كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنىڭ قۇرۇلمىسىنى ئېنىقلاشنىڭ كۆپ ئىقتىدارلىق ئۇسۇلى. يېقىندا، ناترىي ئىئون قوشۇمچە ماددىلىرىنىڭ سوقۇلۇش سەۋەبىدىن ئايرىلىشى (CID) ئىككىلەمچى MS ئۇسۇلى ئولىگوساخارىدنىڭ ئۇلىنىش ئورنى، ئانومېرلىق سەپلىمىسى، تەرتىپلىرى ۋە تارماقلىنىش ئورنى 20، 21 گە ماس كېلىدىغان بارماق ئىزلىرىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ئەڭ كەڭ قوللىنىلىۋاتىدۇ.
گلىكان ئانالىزى كاربون سۇ بىرىكمىلىرى باغلىنىشىنى چوڭقۇر ئېنىقلاش ئۈچۈن ئەلا قورال22. بۇ ئۇسۇل مۇرەككەپ كاربون سۇ بىرىكمىلىرى باغلىنىشىنى چۈشىنىش ئۈچۈن ئۆسۈملۈك ھۈجەيرە تېمى گلىكانغا قارىتىلغان مونوكلونال ئانتىتېلا (mAbs) نى سىناق قىلىپ ئىشلىتىدۇ. دۇنيا مىقياسىدا 250 دىن ئارتۇق mAbs بار بولۇپ، ئۇلار ھەر خىل ساخارىدلارنى ئىشلىتىپ ھەر خىل سىزىقلىق ۋە تارماقلانغان ئولىگوساخارىدلارغا قارشى لايىھەلەنگەن24. ئۆسۈملۈك ھۈجەيرە تېمىنىڭ قۇرۇلمىسى، تەركىبى ۋە ئۆزگىرىشىنى خاراكتېرلەندۈرۈشتە بىر قانچە mAbs كەڭ قوللىنىلدى، چۈنكى ئۆسۈملۈك ھۈجەيرە تىپى، ئەزا، ياش، تەرەققىيات باسقۇچى ۋە ئۆسۈش مۇھىتىغا ئاساسەن زور پەرقلەر بار25،26. يېقىندا، بۇ ئۇسۇل ئۆسۈملۈك ۋە ھايۋانات سىستېمىسىدىكى ۋېزىكۇلا توپلىنىشىنى ۋە ئۇلارنىڭ ھۈجەيرە ئاستى بەلگىلىرى، تەرەققىيات باسقۇچلىرى ياكى مۇھىت غىدىقلىغۇچىلىرى تەرىپىدىن بېكىتىلگەن گلىكان توشۇشتىكى رولىنى چۈشىنىش ۋە ئېنزىم پائالىيىتىنى بېكىتىشتە ئىشلىتىلدى. ئېنىقلانغان گلىكان ۋە كىسلاننىڭ ھەر خىل قۇرۇلمىلىرىدىن پېكتىن (P)، كىسلان (X)، ماننان (M)، كىسلوگلۇكانلار (XylG)، ئارىلاشما باغلىنىش گلۇكانلىرى (MLG)، ئەرەبىنوكسىلان (ArbX)، گالاكتوماننان (GalG)، گلۇكۇرون كىسلاتاسى-ئارابىنوكسىلان (GArbX) ۋە ئەرەبىنو-گالاكتان (ArbG) قاتارلىقلار بار.
قانداقلا بولمىسۇن، بۇ تەتقىقاتلارنىڭ ھەممىسىگە قارىماي، پەقەت بىر قانچە تەتقىقاتلا يۇقىرى قاتتىق جىسىم يۈكى (HSL) گىدرولىز جەريانىدا ئولىگوساخارىدنىڭ توپلىنىش خاراكتېرىگە مەركەزلەشكەن، بۇنىڭ ئىچىدە ئولىگوساخارىدنىڭ قويۇپ بېرىلىشى، گىدرولىز جەريانىدا ئولىگومېر زەنجىر ئۇزۇنلۇقىنىڭ ئۆزگىرىشى، ھەر خىل تۆۋەن DP پولىمېرلىرى ۋە ئۇلارنىڭ ئەگرى سىزىقلىرى بار. تارقىلىش 30،31،32. شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا، گلىكان ئانالىزى گلىكان قۇرۇلمىسىنى ئومۇميۈزلۈك ئانالىز قىلىش ئۈچۈن پايدىلىق قورال ئىكەنلىكى ئىسپاتلانغان بولسىمۇ، سۇدا ئېرىيدىغان تۆۋەن DP ئولىگوساخارىدلىرىنى ئانتىتېلا ئۇسۇلى ئارقىلىق باھالاش تەس. مولېكۇلا ئېغىرلىقى 5-10 kDa دىن تۆۋەن بولغان كىچىك DP ئولىگوساخارىدلىرى ELISA تاختىلىرىغا باغلانمايدۇ 33، 34 ۋە ئانتىتېلا قوشۇشتىن بۇرۇن يۇيۇلۇپ كېتىدۇ.
بۇ يەردە، بىز تۇنجى قېتىم مونوكلونال ئانتىتېلا ئىشلىتىپ، ئاۋىدىن بىلەن قاپلانغان تاختىلاردا ELISA سىنىقىنى كۆرسىتىپ، ئېرىيدىغان چىداملىق ئولىگوساخارىدلارنى بىر باسقۇچلۇق بىئوتىنلاشتۇرۇش جەريانىنى گلىكوم ئانالىزى بىلەن بىرلەشتۈردۇق. بىزنىڭ گلىكوم ئانالىزىغا بولغان ئۇسۇلىمىز MALDI-TOF-MS ۋە GC-MS ئاساسىدىكى گىدرولىزلانغان شېكەر تەركىبلىرىنى تىرىمېتىلسىل (TMS) ئارقىلىق ھاسىل قىلىش ئارقىلىق تولۇقلايدىغان ئولىگوساخارىد باغلىنىشىنى تەھلىل قىلىش ئارقىلىق دەلىللەندى. بۇ يېڭىلىق يارىتىش ئۇسۇلى كەلگۈسىدە يۇقىرى ئۈنۈملۈك ئۇسۇل سۈپىتىدە تەرەققىي قىلدۇرۇلۇپ، بىئومېدىتسىنا تەتقىقاتىدا كەڭ قوللىنىلىشى مۇمكىن35.
گلىكوزلىنىش قاتارلىق ئېنزىملار ۋە ئانتىتېلالارنىڭ تەرجىمە جەريانىدىكى ئۆزگىرىشى36 ئۇلارنىڭ بىئولوگىيىلىك پائالىيىتىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ. مەسىلەن، قان زەردابى ئاقسىلىنىڭ گلىكوزلىنىشىدىكى ئۆزگىرىشلەر ياللۇغلىنىش ئارتىرىتىدا مۇھىم رول ئوينايدۇ، گلىكوزلىنىشتىكى ئۆزگىرىشلەر دىئاگنوز بەلگىسى سۈپىتىدە ئىشلىتىلىدۇ37. ئەدەبىياتلاردا ھەر خىل گلىكانلارنىڭ ئاشقازان-ئۈچەي يولى ۋە جىگەرنىڭ سۇرۇنكا ياللۇغلىنىش كېسەللىكلىرى، ۋىرۇسلۇق يۇقۇملىنىش، تۇخۇمدان، كۆكرەك ۋە پروستاتا راكى قاتارلىق ھەر خىل كېسەللىكلەردە ئاسانلا كۆرۈلىدىغانلىقى خەۋەر قىلىنغان38،39،40. ئانتىتېلا ئاساسلىق گلىكان ELISA ئۇسۇلى ئارقىلىق گلىكانلارنىڭ قۇرۇلمىسىنى چۈشىنىش مۇرەككەپ MS ئۇسۇللىرىنى ئىشلەتمەي تۇرۇپ كېسەللىك دىئاگنوزى قويۇشتا قوشۇمچە ئىشەنچ بېرىدۇ.
ئىلگىرىكى تەتقىقاتىمىزدا، قەيسەر ئولىگوساخارىدلارنىڭ ئالدىن بىر تەرەپ قىلىش ۋە ئېنزىملىق گىدرولىزدىن كېيىنمۇ گىدرولىزلانمىغانلىقى كۆرسىتىلدى (1-رەسىم). ئىلگىرى ئېلان قىلىنغان ئەسەرلىرىمىزدە، بىز AFEX بىلەن ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغان كۆممىقوناق پىشۇرۇش گىدرولىزاتى (ACSH)8 دىن ئولىگوساخارىدلارنى ئايرىۋېلىش ئۈچۈن ئاكتىپلاشتۇرۇلغان كۆمۈر قاتتىق باسقۇچلۇق ئايرىش ئۇسۇلىنى ئىجاد قىلدۇق. دەسلەپكى ئايرىش ۋە ئايرىشتىن كېيىن، ئولىگوساخارىدلار چوڭ-كىچىكلىكنى چىقىرىۋېتىش خروماتوگرافىيەسى (SEC) ئارقىلىق تېخىمۇ پارچىلىنىپ، مولېكۇلا ئېغىرلىقى تەرتىپى بويىچە توپلاندى. ھەر خىل ئالدىن بىر تەرەپ قىلىشتىن ئايرىلغان شېكەر مونومېرلىرى ۋە ئولىگومېرلار شېكەر تەركىبىنى تەھلىل قىلىش ئارقىلىق تەھلىل قىلىندى. ھەر خىل ئالدىن بىر تەرەپ قىلىش ئۇسۇللىرى ئارقىلىق ئېرىشكەن شېكەر ئولىگومېرلىرىنىڭ مىقدارىنى سېلىشتۇرغاندا، قەيسەر ئولىگوساخارىدلارنىڭ مەۋجۇتلۇقى بىئوماسسانىڭ مونوساخارىدلارغا ئايلىنىشىدا كۆپ ئۇچرايدىغان مەسىلە بولۇپ، شېكەر مىقدارىنىڭ كەم دېگەندە %10-15، ھەتتا %18 گىچە تۆۋەنلىشىگە ئېلىپ كېلىشى مۇمكىن. بۇ ئۇسۇل ئولىگوساخارىد پارچىلىرىنى تېخىمۇ كەڭ كۆلەمدە ئىشلەپچىقىرىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ. نەتىجىدە ھاسىل بولغان ACH ۋە ئۇنىڭدىن كېيىنكى ئوخشىمىغان مولېكۇلا ئېغىرلىقىدىكى كەسىرلەر بۇ ئەسەردە ئولىگوساخارىدلارنىڭ خاراكتېرىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن تەجرىبە ماتېرىيالى سۈپىتىدە ئىشلىتىلدى.
ئالدىن بىر تەرەپ قىلىش ۋە ئېنزىملىق گىدرولىزدىن كېيىن، داۋاملىق ئولىگوساخارىدلار گىدرولىزلانمىغان ھالەتتە قالدى. بۇ يەردە (A) ئولىگوساخارىد ئايرىش ئۇسۇلى بولۇپ، بۇ ئۇسۇلدا ئولىگوساخارىدلار ئاكتىپلاشتۇرۇلغان كاربون ۋە دىئاتوملۇق يەرنىڭ ئورالمىسى ئارقىلىق AFEX بىلەن ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغان كۆممىقوناق پىشۇرۇش گىدرولىزاتىدىن (ACSH) ئايرىۋېلىنىدۇ؛ (B) ئولىگوساخارىدلارنى ئايرىش ئۇسۇلى. ئولىگوساخارىدلار چوڭ-كىچىكلىكنى ئايرىش خروماتوگرافىيەسى (SEC) ئارقىلىق تېخىمۇ ئايرىلدى؛ (C) ھەر خىل ئالدىن بىر تەرەپ قىلىشتىن ئايرىلغان ساخارىد مونومېرلىرى ۋە ئولىگومېرلىرى (سۇيۇقلاندۇرۇلغان كىسلاتا: DA، ئىئونلۇق سۇيۇقلۇق: IL ۋە AFEX). ئېنزىملىق گىدرولىز شارائىتى: قاتتىق ماددىلارنىڭ مىقدارى %25 (w/w) (تەخمىنەن %8 گلۇكان مىقدارى) يۇقىرى، 96 سائەت گىدرولىز، 20 mg/g سودا ئېنزىم مىقدارى (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 نىسبىتى) ۋە (D) AFEX ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغان كۆممىقوناق ئوچاق (ACS) دىن قويۇپ بېرىلگەن گلۇكوزا، كسىلوزا ۋە ئەرەبىنوزانىڭ شېكەر مونومېرلىرى ۋە ئولىگومېرلىرى.
گلىكان ئانالىزى قاتتىق بىئوماسسا قالدۇقلىرىدىن ئايرىۋېلىنغان ئېكىستراكتلاردىكى گلىكانلارنىڭ ئومۇميۈزلۈك قۇرۇلما ئانالىزى ئۈچۈن پايدىلىق قورال ئىكەنلىكى ئىسپاتلاندى. قانداقلا بولمىسۇن، بۇ ئەنئەنىۋى ئۇسۇلدا سۇدا ئېرىيدىغان ساخارىدلار ئاز ئۇچرايدۇ41، چۈنكى تۆۋەن مولېكۇلا ئېغىرلىقتىكى ئولىگوساخارىدلارنى ELISA تاختىلىرىدا ھەرىكەتسىزلەندۈرۈش تەس، ھەمدە ئانتىتېلا قوشۇشتىن بۇرۇن يۇيۇلۇپ كېتىدۇ. شۇڭا، ئانتىتېلا باغلىنىشى ۋە خاراكتېرىنى بېكىتىش ئۈچۈن، ئاۋىدىن بىلەن قاپلانغان ELISA تاختىلىرىغا ئېرىيدىغان، ماس كەلمەيدىغان ئولىگوساخارىدلارنى قاپلاش ئۈچۈن بىر باسقۇچلۇق بىئوتىنلىنىش ئۇسۇلى قوللىنىلدى. بۇ ئۇسۇل ئىلگىرى ئىشلەپچىقىرىلغان ACSH ۋە ئۇنىڭ مولېكۇلا ئېغىرلىقىغا (ياكى پولىمېرلىنىش دەرىجىسى، DP) ئاساسەن بىر قىسىم ئىشلىتىپ سىناق قىلىندى. بىر باسقۇچلۇق بىئوتىنلىنىش كاربون سۇ بىرىكمىسىنىڭ قايتۇرۇش ئۇچىغا بىئوتىن-LC-گىدرازىد قوشۇش ئارقىلىق ئولىگوساخارىد باغلىنىشچانلىقىنى ئاشۇرۇش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى (2-رەسىم). ئېرىتمىدە، قايتۇرۇش ئۇچىدىكى يېرىم ئاتسېتال گۇرۇپپىسى بىئوتىن-LC-گىدرازىدنىڭ گىدرازىد گۇرۇپپىسى بىلەن رېئاكسىيە قىلىپ، گىدرازون باغلىنىشى ھاسىل قىلىدۇ. NaCNBH3 نى قايتۇرغۇچى ماددا بار بولغاندا، گىدرازون باغلىنىشى مۇقىم بىئوتىنلانغان ئاخىرقى مەھسۇلاتقا ئايلاندۇرۇلىدۇ. شېكەر قايتۇرغۇچى ئۇچىنى ئۆزگەرتىش ئارقىلىق، تۆۋەن DP ئولىگوساخارىدلارنى ELISA تاختىلىرىغا باغلاش مۇمكىن بولدى، بىزنىڭ تەتقىقاتىمىزدا بۇ گلىكان نىشانلىق mAbs ئىشلىتىپ ئاۋىدىن بىلەن قاپلانغان تاختىلاردا ئېلىپ بېرىلدى.
بىئوتىنلانغان ئولىگوساخارىدلارنى ELISA ئارقىلىق تەكشۈرۈش. بۇ يەردە (A) ئولىگوساخارىدلارنى بىرلەشتۈرۈپ بىئوتىنلاشتۇرۇش ۋە ئۇنىڭدىن كېيىنكى NeutrAvidin قاپلانغان تاختىلاردا گلىكان نىشانلانغان mAbs بىلەن ELISA تەكشۈرۈشى ۋە (B) رېئاكسىيە مەھسۇلاتلىرىنى بىئوتىنلاشتۇرۇشنىڭ بىر باسقۇچلۇق تەرتىپى كۆرسىتىلدى.
ئاۋىدىن بىلەن قاپلانغان، ئولىگوساخارىد بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن ئانتىتېلا قوشۇلغان تاختايلار ئاندىن بىرىنچى ۋە ئىككىنچى دەرىجىلىك ئانتىتېلاغا قوشۇلۇپ، يورۇقلۇق ۋە ۋاقىتقا سەزگۈر مۇھىتتا يۇيۇلدى. ئانتىتېلا باغلىنىشى تاماملانغاندىن كېيىن، تاختىنى ئىنكۇباتسىيە قىلىش ئۈچۈن TMB سۇبستراتىنى قوشۇڭ. رېئاكسىيە ئاخىرىدا سۇلفات كىسلاتاسى بىلەن توختىتىلدى. ئىنكۇباتسىيە قىلىنغان تاختايلار ELISA ئوقۇغۇچ ئارقىلىق تەھلىل قىلىنىپ، ھەر بىر ئانتىتېلانىڭ باغلىنىش كۈچىنى ئېنىقلاپ، ئانتىتېلاغا خاس كېسىشمە باغلىنىشنى بايقىدى. تەجرىبە تەپسىلاتى ۋە پارامېتىرلىرى ئۈچۈن، «ماتېرىياللار ۋە ئۇسۇللار» بۆلۈمىگە قاراڭ.
بىز ACSH دىكى ئېرىيدىغان ئولىگوساخارىدلارنى، شۇنداقلا لىگنوسېللۇلوزا گىدرولىزاتلىرىدىن ئايرىۋېلىنغان خام ۋە تازىلانغان ئولىگوساخارىد پارچىلىرىنى خاراكتېرلەشتۈرۈش ئارقىلىق بۇ يېڭى تەرەققىي قىلدۇرۇلغان ئۇسۇلنىڭ كونكرېت قوللىنىشچان پروگراممىلارغا پايدىلىقلىقىنى نامايان قىلىمىز. 3-رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك، بىئوئاتسىلاتلانغان گلىكوم تەكشۈرۈش ئۇسۇلى ئارقىلىق ACSH دا بايقالغان ئەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان ئېپىتوپ ئورنىنى ئالغان كىسلانلار ئادەتتە ئۇرون (U) ياكى مېتىلۇرون (MeU) ۋە پېكتىك ئەرەبىنوگالاكتانلاردۇر. ئۇلارنىڭ كۆپىنچىسى گىدرولىزلانمىغان قاتتىق ماددىلارنىڭ (UHS) گلىكانلىرىنى تەھلىل قىلىش توغرىسىدىكى ئىلگىرىكى تەتقىقاتىمىزدىمۇ بايقالغان43.
ھۈجەيرە تام گلىكانىغا قارىتىلغان مونوكلونال ئانتىتېلا ئارقىلىق ئىسراپ بولغان ئولىگوساخارىد ئېپىتوپلىرىنى بايقاش. «نېيترال» كەسپ ACN كەسپ، «كىسلاتالىق» كەسپ FA كەسپ. ئىسسىقلىق خەرىتىسىدىكى پارقىراق قىزىل رەڭلەر ئېپىتوپنىڭ يۇقىرى مىقدارىنى، پارقىراق كۆك رەڭلەر بولسا بوش ئارقا كۆرۈنۈشنى كۆرسىتىدۇ. ئۆلچەمدىكى رەڭ قىممىتى N=2 فورمۇلاسىنىڭ خام OD قىممىتىگە ئاساسلانغان. ئانتىتېلا تەرىپىدىن تونۇلغان ئاساسلىق ئېپىتوپلار ئوڭ تەرەپتە كۆرسىتىلدى.
بۇ سېللۇلوزا بولمىغان قۇرۇلمىلارنى سىناق قىلىنغان سودا ئېنزىم ئارىلاشمىسىدىكى ئەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان سېللۇلوزا ۋە گېمىسېللۇلازا پارچىلىيالمايدۇ، بۇنىڭ ئىچىدە ئەڭ كۆپ ئىشلىتىلىدىغان سودا ئېنزىملىرى بار. شۇڭا، ئۇلارنىڭ گىدرولىزى ئۈچۈن يېڭى ياردەمچى ئېنزىملار لازىم. زۆرۈر سېللۇلوزا بولمىغان قوشۇمچە ئېنزىملار بولمىسا، بۇ سېللۇلوزا بولمىغان باغلىنىشلار مونوساخارىدلارغا تولۇق ئايلىنىشنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ، ھەتتا ئۇلارنىڭ ئانا شېكەر پولىمېرلىرى كەڭ كۆلەمدە قىسقا پارچىلارغا گىدرولىزلىنىپ، سودا ئېنزىم ئارىلاشمىلىرى ئارقىلىق ئېرىتىلغان تەقدىردىمۇ.
سىگنال تارقىلىشى ۋە ئۇنىڭ باغلىنىش كۈچىنى تېخىمۇ چوڭقۇر تەتقىق قىلىش نەتىجىسىدە، باغلىنىش ئېپىتوپلىرىنىڭ يۇقىرى DP شېكەر پارچىلىرىدا (A، B، C، DP 20+ گىچە) تۆۋەن DP پارچىلىرىغا (D، E، F، DP) قارىغاندا تۆۋەن ئىكەنلىكى كۆرسىتىلدى (1-رەسىم). كىسلاتا پارچىلىرى نېيترال پارچىلارغا قارىغاندا سېللۇلوزا بولمىغان ئېپىتوپلاردا كۆپرەك ئۇچرايدۇ. بۇ ھادىسىلەر ئىلگىرىكى تەتقىقاتىمىزدا كۆزىتىلگەن ئەندىزە بىلەن ماس كېلىدۇ، يەنى يۇقىرى DP ۋە كىسلاتا پارچىلىرى ئېنزىملىق گىدرولىزغا تېخىمۇ چىداملىق. شۇڭلاشقا، سېللۇلوزا بولمىغان گلىكان ئېپىتوپلىرى ۋە U ۋە MeU ئالماشتۇرۇشلىرىنىڭ مەۋجۇتلۇقى ئولىگوساخارىدلارنىڭ مۇقىملىقىغا زور تۆھپە قوشالايدۇ. شۇنىڭغا دىققەت قىلىش كېرەككى، تۆۋەن DP ئولىگوساخارىدلىرى ئۈچۈن باغلىنىش ۋە بايقاش ئۈنۈمى مەسىلە بولۇشى مۇمكىن، بولۇپمۇ ئېپىتوپ دىمېر ياكى ئۈچ مېتىرلىق ئولىگوساخارىد بولسا. بۇنى ئوخشىمىغان ئۇزۇنلۇقتىكى سودا ئولىگوساخارىدلىرى ئارقىلىق سىناق قىلغىلى بولىدۇ، ھەر بىرى پەقەت مەلۇم بىر mAb غا باغلىنىدىغان بىر ئېپىتوپنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.
شۇڭا، قۇرۇلمىغا خاس ئانتىتېلا ئىشلىتىش ئارقىلىق بەزى خىلدىكى قارشىلىق كۆرسىتىدىغان باغلىنىشلار ئاشكارىلاندى. ئىشلىتىلگەن ئانتىتېلانىڭ تۈرى، ماس كېلىدىغان باغلىنىش شەكلى ۋە ئۇ پەيدا قىلغان سىگنالنىڭ كۈچلۈكلۈكىگە (ئەڭ كۆپ ۋە ئەڭ ئاز مىقداردا) ئاساسەن، يېڭى ئېنزىملارنى ئېنىقلاپ، تېخىمۇ تولۇق گلىكوكونۋېرسىيە قىلىش ئۈچۈن ئېنزىم ئارىلاشمىسىغا يېرىم مىقداردا قوشۇشقا بولىدۇ. مىسال قىلىپ ACSH ئولىگوساخارىدلىرىنى تەھلىل قىلىپ، ھەر بىر بىئوماسسا ماتېرىيالى ئۈچۈن گلىكان باغلىنىش سانلىق مەلۇمات ئامبىرى قۇرالايمىز. بۇ يەردە ئانتىتېلالارنىڭ ئوخشىمايدىغان يېقىنلىقىنى ئويلىشىش كېرەكلىكىنى، ئەگەر ئۇلارنىڭ يېقىنلىقى نامەلۇم بولسا، بۇ ئوخشىمىغان ئانتىتېلالارنىڭ سىگناللىرىنى سېلىشتۇرغاندا بەلگىلىك قىيىنچىلىقلارنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغانلىقىنى ئەسكەرتىش كېرەك. بۇنىڭدىن باشقا، گلىكان باغلىنىشلىرىنى سېلىشتۇرۇش ئوخشاش ئانتىتېلا ئۈچۈن ئەۋرىشكىلەر ئارىسىدا ئەڭ ياخشى ئىشلىشى مۇمكىن. ئاندىن بۇ قەيسەر باغلىنىشلارنى CAZyme سانلىق مەلۇمات ئامبىرىغا باغلىغىلى بولىدۇ، بۇ سانلىق مەلۇمات ئامبىرىدىن بىز ئېنزىملارنى ئېنىقلىيالايمىز، نامزات ئېنزىملارنى تاللاپ، باغلىنىشنى ئۈزىدىغان ئېنزىملارنى سىناق قىلالايمىز ياكى بۇ ئېنزىملارنى بىئو نېفىت زاۋۇتلىرىدا ئىشلىتىش ئۈچۈن ئىپادىلەيدىغان مىكروب سىستېمىسى تەرەققىي قىلدۇرالايمىز44.
ئىممۇنولوگىيەلىك ئۇسۇللارنىڭ لىگنوسېللۇلوزا گىدرولىزاتلىرىدىكى تۆۋەن مولېكۇلا ئېغىرلىقتىكى ئولىگوساخارىدلارنى خاراكتېرلەندۈرۈشتىكى باشقا ئۇسۇللارنى قانداق تولۇقلايدىغانلىقىنى باھالاش ئۈچۈن، بىز MALDI (4-رەسىم، S1-S8) ۋە GC-MS غا ئاساسلانغان TMS دىن ئېلىنغان ساخارىدلارنى ئوخشاش بىر تاختا (5-رەسىم) ئولىگوساخارىد قىسمىدا تەھلىل قىلدۇق. MALDI ئولىگوساخارىد مولېكۇلاسىنىڭ ماسسا تەقسىملىنىشىنىڭ مەقسەت قىلىنغان قۇرۇلمىغا ماس كېلىدىغان-كەلمەيدىغانلىقىنى سېلىشتۇرۇش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ. 4-رەسىمدە ACN-A ۋە ACN-B نېيترال تەركىبلىرىنىڭ MS ى كۆرسىتىلگەن. ACN-A ئانالىزى DP 4-8 (4-رەسىم) دىن DP 22 (S1-رەسىم) گىچە بولغان بىر قاتار پېنتوزا شېكىرىنى جەزملەشتۈردى، ئۇلارنىڭ ئېغىرلىقى MeU-كىسىلان ئولىگوساخارىدلىرىغا ماس كېلىدۇ. ACN-B ئانالىزى DP 8-15 بىلەن پېنتوزا ۋە گلۇكوكسىلان قاتارىنى جەزملەشتۈردى. S3-رەسىمگە ئوخشاش قوشۇمچە ماتېرىياللاردا، FA-C كىسلاتالىق بۆلەك ماسسا تەقسىمات خەرىتىسىدە DP قىممىتى 8-15 بولغان (Me)U ئورنى ئالماشتۇرۇلغان پېنتوزا شېكىرىنىڭ دائىرىسى كۆرسىتىلگەن بولۇپ، بۇلار ELISA ئاساسلىق mAb تەكشۈرۈشىدە بايقالغان ئورنى ئالماشتۇرۇلغان كىسلانلار بىلەن ماس كېلىدۇ. ئېپىتوپلار ماس كېلىدۇ.
ACS دا مەۋجۇت بولغان ئېرىشچان ماس كەلمەيدىغان ئولىگوساخارىدلارنىڭ MALDI-MS سپېكتىرى. بۇ يەردە، (A) مېتىللانغان ئۇرون كىسلاتاسى (DP 4-8) ئورنىدىن تۇرغان گلۇكۇروكسىلان ئولىگوساخارىدلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ACN-A تۆۋەن ئېغىرلىق دائىرىسىدىكى كەسىرلەر ۋە (B) گلۇكۇروكسىلان بىلەن ئورنىدىن تۇرغان ACN-B كىسلاتاسى ۋە مېتىللانغان ئۇرون كىسلاتاسى ئولىگوساخارىدلىرى (DP 8-15).
ئوققا چىداملىق ئولىگوساخارىدلارنىڭ گلىكان قالدۇقىنىڭ تەركىبىنى تەھلىل قىلىش. بۇ يەردە (A) GC-MS ئانالىزى ئارقىلىق قولغا كەلتۈرۈلگەن ھەر خىل ئولىگوساخارىد بۆلەكلىرىنىڭ TMS ساخارىد تەركىبى. (B) ئولىگوساخارىدلاردا مەۋجۇت بولغان ھەر خىل TMS دىن ئېلىنغان شېكەرلەرنىڭ قۇرۇلمىسى. ACN – نېيترال ئولىگوساخارىدلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئاتسېتونىترىل بۆلىكى ۋە FA – كىسلاتا ئولىگوساخارىدلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان فېرۇلىك كىسلاتا بۆلىكى.
S9-رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك، ئولىگوساخارىد پارچىسىنىڭ LC-MS ئانالىزىدىن يەنە بىر قىزىقارلىق نەتىجە چىقىرىلدى (ئۇسۇللارنى ئېلېكترونلۇق قوشۇمچە ماتېرىيالدىن كۆرۈۋالغىلى بولىدۇ). ACN-B پارچىسىنى باغلاش جەريانىدا گېكسوزا ۋە -OAc گۇرۇپپىلىرىنىڭ پارچىلىرى قايتا-قايتا كۆزىتىلدى. بۇ بايقاش پەقەت گلىكوم ۋە MALDI-TOF ئانالىزىدا كۆزىتىلگەن پارچىلىنىشنى جەزملەشتۈرۈپلا قالماي، يەنە ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغان لىگنوسېللۇلوزا بىئوماسسىسىدىكى كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنىڭ ھاسىلاتلىرى توغرىسىدا يېڭى ئۇچۇرلارنى بېرىدۇ.
بىز يەنە TMS گلىكان ھاسىل قىلىش ئۇسۇلى ئارقىلىق ئولىگوساخارىد پارچىلىرىنىڭ گلىكان تەركىبىنى تەھلىل قىلدۇق. GC-MS ئۇسۇلى ئارقىلىق، بىز ئولىگوساخارىد پارچىسىدىكى نېرۋا (تۈزۈلمىگەن) ۋە كىسلاتالىق شېكەرلەرنىڭ (GluA ۋە GalA) تەركىبىنى بېكىتتۇق (5-رەسىم). گلىكۇرون كىسلاتاسى C ۋە D كىسلاتالىق تەركىبلىرىدە، گالاكتۇرون كىسلاتاسى بولسا A ۋە B كىسلاتالىق تەركىبلىرىدە بولۇپ، بۇ ئىككىسى كىسلاتالىق شېكەرنىڭ يۇقىرى DP تەركىبلىرى. بۇ نەتىجىلەر پەقەت ELISA ۋە MALDI سانلىق مەلۇماتلىرىمىزنى جەزملەشتۈرۈپلا قالماي، يەنە ئولىگوساخارىدنىڭ توپلىنىشى توغرىسىدىكى ئىلگىرىكى تەتقىقاتلىرىمىز بىلەن ماس كېلىدۇ. شۇڭا، بىز ئولىگوساخارىدلارنىڭ بىئوتىنلىنىشى ۋە كېيىنكى ELISA تەكشۈرۈش ئۇسۇلىنى قوللانغان زامانىۋى ئىممۇنىتېت ئۇسۇللىرىنىڭ ھەر خىل بىئولوگىيىلىك ئەۋرىشكىلەردىكى ئېرىيدىغان قالدۇق ئولىگوساخارىدلارنى بايقاشقا يېتەرلىك دەپ قارايمىز.
ELISA ئاساسلىق mAb تەكشۈرۈش ئۇسۇللىرى بىر قانچە خىل ئۇسۇل ئارقىلىق دەلىللەنگەنلىكى ئۈچۈن، بىز بۇ يېڭى مىقدار ئۇسۇلىنىڭ يوشۇرۇن كۈچىنى تېخىمۇ چوڭقۇر تەتقىق قىلىشنى خالايمىز. ئىككى سودا ئولىگوساخارىدى، يەنى كسىلوھېكساسخارىد ئولىگوساخارىد (XHE) ۋە 23-α-L-ئارابىنوفۇرانوسىل-كسىلوترىئوزا (A2XX) سېتىۋېلىنىپ، ھۈجەيرە تام گلىكانىغا قارىتىلغان يېڭى mAb ئۇسۇلى ئارقىلىق سىناق قىلىندى. 6-رەسىمدە بىئوتىنلانغان باغلىنىش سىگنالى بىلەن ئولىگوساخارىدنىڭ لوگارىد قويۇقلۇقى ئوتتۇرىسىدىكى سىزىقلىق مۇناسىۋەت كۆرسىتىلدى، بۇ لاڭمۇئىر ئادسوربسىيە مودېلىنىڭ مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. mAbs ئىچىدە، CCRC-M137، CCRC-M138، CCRC-M147، CCRC-M148 ۋە CCRC-M151 XHE بىلەن، CCRC-M108، CCRC-M109 ۋە LM11 1 nm دىن 100 nano غىچە بولغان دائىرىدە A2XX بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولدى. تەجرىبە جەريانىدا ئانتىتېلانىڭ چەكلىك بولۇشى سەۋەبىدىن، ھەر بىر ئولىگوساخارىد قويۇقلۇقى بىلەن چەكلىك تەجرىبە ئېلىپ بېرىلدى. بۇ يەردە شۇنى ئەسكەرتىش كېرەككى، بەزى ئانتىتېلالار ئوخشاش ئولىگوساخارىدقا سۇبسترات سۈپىتىدە پۈتۈنلەي ئوخشىمايدىغان ئىنكاس قايتۇرىدۇ، بۇنىڭ سەۋەبى ئۇلارنىڭ ئازراق ئوخشىمايدىغان ئېپىتوپلارغا باغلىنىشى ۋە باغلىنىشچانلىقىنىڭ ناھايىتى ئوخشىماسلىقى بولۇشى مۇمكىن. يېڭى mAb ئۇسۇلى ھەقىقىي ئەۋرىشكىلەرگە قوللىنىلغاندا، ئېپىتوپنى توغرا ئېنىقلاش مېخانىزمى ۋە تەسىرى تېخىمۇ مۇرەككەپ بولىدۇ.
ئىككى سودا ئولىگوساخارىد ئىشلىتىلىپ، ھەر خىل گلىكان نىشانلىق mAb لارنىڭ بايقاش دائىرىسىنى بېكىتتى. بۇ يەردە، ئولىگوساخارىد قويۇقلۇقىنىڭ لوگارىف قويۇقلۇقى بىلەن سىزىقلىق مۇناسىۋەت (A) mAb بىلەن XHE ۋە (B) mAb بىلەن A2XX ئۈچۈن لانگمۇئىر ئادسوربسىيە ئەندىزىسىنى كۆرسىتىدۇ. ماس كېلىدىغان ئېپىتوپلار سىناق جەريانىدا سۇبسترات سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن سودا ئولىگوساخارىدلىرىنىڭ قۇرۇلمىسىنى كۆرسىتىدۇ.
گلىكانغا قارىتىلغان مونوكلونال ئانتىتېلا (گلىكوكومىك ئانالىز ياكى ELISA ئاساسلىق mAb تەكشۈرۈش) ئۆسۈملۈك بىئوماسسىسىنى تەشكىل قىلىدىغان ئاساسلىق ھۈجەيرە تام گلىكانلىرىنىڭ كۆپىنچىسىنى چوڭقۇر خاراكتېرلەندۈرۈشتىكى كۈچلۈك قورال. قانداقلا بولمىسۇن، كلاسسىك گلىكان ئانالىزى پەقەت چوڭراق ھۈجەيرە تام گلىكانلىرىنى خاراكتېرلەندۈرىدۇ، چۈنكى كۆپىنچە ئولىگوساخارىدلار ELISA تاختىلىرىدا ئۈنۈملۈك ھالدا ھەرىكەتسىزلەندۈرۈلمەيدۇ. بۇ تەتقىقاتتا، AFEX بىلەن ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغان كۆممىقوناق پىشۇرغۇچ يۇقىرى قاتتىق ماددىلار مىقدارىدا ئېنزىملىق گىدرولىز قىلىندى. شېكەر ئانالىزى گىدرولىزاتتىكى قايتا ئىشلىمەيدىغان ھۈجەيرە تام كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنىڭ تەركىبىنى بېكىتىشتە ئىشلىتىلدى. قانداقلا بولمىسۇن، گىدرولىزاتلاردىكى كىچىك ئولىگوساخارىدلارنىڭ mAb ئانالىزى كەم باھالانغان، شۇڭا ELISA تاختىلىرىدىكى ئولىگوساخارىدلارنى ئۈنۈملۈك ھالدا ھەرىكەتسىزلەندۈرۈش ئۈچۈن قوشۇمچە قوراللارغا ئېھتىياجلىق.
بىز بۇ يەردە NeutrAvidin™ قاپلانغان تاختىلاردا ئولىگوساخارىد بىئوتىنلىنىش ۋە ELISA تەكشۈرۈشنى بىرلەشتۈرۈش ئارقىلىق mAb تەكشۈرۈش ئۈچۈن يېڭى ۋە ئۈنۈملۈك ئولىگوساخارىد ئىمموبىللاشتۇرۇش ئۇسۇلىنى دوكلات قىلىمىز. ئىمموبىللاشتۇرۇلغان بىئوتىنلىنىش ئولىگوساخارىدلار ئانتىتېلاغا يېتەرلىك يېقىنلىق كۆرسەتتى، بۇ ئىسراپ بولغان ئولىگوساخارىدلارنى تېز ۋە ئۈنۈملۈك بايقاشقا شارائىت ھازىرلايدۇ. ماسسا سپېكترومېتىرىيەسىگە ئاساسەن بۇ قەيسەر ئولىگوساخارىدلارنىڭ تەركىبىنى تەھلىل قىلىش ئىممۇنىتېت تەكشۈرۈشنىڭ بۇ يېڭى ئۇسۇلىنىڭ نەتىجىسىنى جەزملەشتۈردى. شۇڭا، بۇ تەتقىقاتلار ئولىگوساخارىد بىئوتىنلىنىش ۋە ELISA تەكشۈرۈشنى گلىكان نىشانلىق مونوكلونال ئانتىتېلا بىلەن بىرلەشتۈرۈش ئولىگوساخارىدلاردىكى كېسىشمە باغلىنىشلارنى بايقاشقا ئىشلىتىشكە بولىدىغانلىقىنى ۋە ئولىگوساخارىدلارنىڭ قۇرۇلمىسىنى خاراكتېرلەندۈرىدىغان باشقا بىئوخىمىيىلىك تەتقىقاتلاردا كەڭ قوللىنىلىشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
بۇ بىئوتىن ئاساسلىق گلىكان پروفىللاش ئۇسۇلى ئۆسۈملۈك بىئوماسسىسىدىكى ئېرىيدىغان ئولىگوساخارىدلارنىڭ ئىسراپكار كاربون سۇ بىرىكمىلىرى باغلىنىشىنى تەكشۈرۈش ئىقتىدارىغا ئىگە تۇنجى دوكلات. بۇ بىئوماسسىسىنىڭ بەزى قىسىملىرىنىڭ بىئو يېقىلغۇ ئىشلەپچىقىرىشتا نېمىشقا بۇنچە قەيسەر ئىكەنلىكىنى چۈشىنىشكە ياردەم بېرىدۇ. بۇ ئۇسۇل گلىكوم ئانالىز ئۇسۇللىرىدىكى مۇھىم بوشلۇقنى تولدۇرۇپ، ئۇنىڭ قوللىنىلىشىنى ئۆسۈملۈك ئولىگوساخارىدلىرىدىن باشقا كەڭ دائىرىدىكى سۇبستراتلارغا كېڭەيتىدۇ. كەلگۈسىدە، بىز بىئوتىنلاشتۇرۇش ئۈچۈن روبوت تېخنىكىسىنى ئىشلىتىشىمىز ۋە ELISA ئارقىلىق ئەۋرىشكىلەرنى يۇقىرى ئۈنۈملۈك ئانالىز قىلىش ئۈچۈن تەرەققىي قىلدۇرغان ئۇسۇلىمىزدىن پايدىلىنىشىمىز مۇمكىن.
Pioneer 33A14 گىبرىد ئۇرۇقىدىن ئۆستۈرۈلگەن كۆممىقوناق سامىنى (CS) 2010-يىلى كولورادو شىتاتىنىڭ راي شەھىرىدىكى Kramer دېھقانچىلىق مەيدانىدىن يىغىۋېلىنغان. يەر ئىگىسىنىڭ رۇخسىتى بىلەن، بۇ بىئوماسسا تەتقىقات ئۈچۈن ئىشلىتىلىشى مۇمكىن. ئەۋرىشكىلەر قۇرغاق ھالەتتە، نەملىكى %6 تىن تۆۋەن بولغان، زىپلىق خالتىلارغا سېلىپ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا ساقلاندى. ئەۋرىشكىلەر قۇرغاق ھالەتتە، نەملىكى %6 تىن تۆۋەن بولغان، زىپلىق خالتىلارغا سېلىپ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا ساقلاندى. Об كانцы хранились сухим при влажности <6% в пакетх с застежкой-молнией при комнатной мае. ئەۋرىشكىلەر قۇرغاق ھالەتتە، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا، زىپپېرلىق خالتىلارغا سېلىپ، %6 تىن تۆۋەن نەملىكتە ساقلاندى.样品在室温下以干燥 <6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥 <6% Об كانцы хранят в пакетех с застежкой-молнией при комнатной зе с влажностью <6%. ئەۋرىشكىلەر زىپپېرلىق خالتىلارغا سېلىپ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا، نەملىك دەرىجىسى %6 تىن تۆۋەن بولغاندا ساقلىنىدۇ.بۇ تەتقىقات يەرلىك ۋە دۆلەت دەرىجىلىك يېتەكچى پىرىنسىپلارغا ئۇيغۇن كەلدى. تەركىب ئانالىزى NREL كېلىشىمى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. تەركىبتە %31.4 گلۇكان، %18.7 كىسلان، %3.3 ئەرەبىنان، %1.2 گالاكتان، %2.2 ئاتسېتىل، %14.3 لىگنىن، %1.7 ئاقسىل ۋە %13.4 كۈل بار ئىكەنلىكى بايقالدى.
Cellic® CTec2 (138 مىللىگرام ئاقسىل/مىللىلىتىر، تۈركۈم VCNI 0001) Novozymes (فىرانكلىنتون، شىمالىي كارولىنا، ئامېرىكا) دىن كەلگەن سېللۇلازا، β-گلۇكوزىدازا ۋە Cellic® HTec2 (157 مىللىگرام ئاقسىل/مىللىلىتىر، تۈركۈم VHN00001) نىڭ مۇرەككەپ ئارىلاشمىسى. پېكتىن پارچىلىغۇچى ئېنزىملارنىڭ مۇرەككەپ ئارىلاشمىسى بولغان Multifect Pectinase® (72 مىللىگرام ئاقسىل/مىللىلىتىر) DuPont Industrial Biosciences (پالو ئالتو، كالىفورنىيە، ئامېرىكا) تەرىپىدىن ئىئانە قىلىندى. ئېنزىم ئاقسىلىنىڭ قويۇقلۇقى Kjeldahl ئازوت ئانالىزى (AOAC ئۇسۇلى 2001.11، Dairy One Cooperative Inc.، ئىتاكا، نيۇ-يورك، ئامېرىكا) ئارقىلىق ئاقسىل مىقدارىنى مۆلچەرلەش (ۋە ئاقسىلسىز ئازوتنىڭ تۆھپىسىنى چىقىرىۋېتىش) ئارقىلىق بېكىتىلدى. دىئاتوما يەر 545 EMD Millipore (Billerica، MA) دىن سېتىۋېلىندى. ئاكتىپلاشتۇرۇلغان كاربون (DARCO، 100 تورلۇق دانچە)، ئاۋىسېل (PH-101)، بۇق دەرىخىدىن ياسالغان كىسىلان ۋە باشقا بارلىق خىمىيىلىك ماددىلار سىگما-ئالدرىچ (سانت لۇئىس، مىسسۇرى) دىن سېتىۋېلىندى.
AFEX ئالدىن بىر تەرەپ قىلىش GLBRC (بىئوماسسا ئۆزگەرتىش تەتقىقات تەجرىبىخانىسى، MSU، Lansing، MI، ئامېرىكا) دا ئېلىپ بېرىلدى. ئالدىن بىر تەرەپ قىلىش 140°C تېمپېراتۇرىدا 15 مىنۇت ئېلىپ بېرىلدى. 46 مىنۇت تۇرۇش ۋاقتى سۇسىز ئاممىياك بىلەن بىئوماسسانىڭ نىسبىتى 1:1 بولۇپ، %60 ​​(w/w) يۈكلەنگەن ھالدا داتلاشماس پولات ئۈستەل يۈزى رېئاكتورىدا (Parr Instruments شىركىتى) ئېلىپ بېرىلدى. بۇ 30 مىنۇت ۋاقىت ئالدى. رېئاكتور 140°C غا يەتكۈزۈلدى ۋە ئاممىياك تېز سۈرئەتتە قويۇپ بېرىلدى، بۇنىڭ بىلەن بىئوماسسا تېز سۈرئەتتە ئۆي تېمپېراتۇرىسىغا قايتىپ كەلدى. AFEX ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغان كۆممىقوناق ئوچاق (ACS) نىڭ تەركىبى بىر تەرەپ قىلىنمىغان كۆممىقوناق ئوچاق (UT-CS) نىڭ تەركىبىگە ئوخشايدۇ.
يۇقىرى قاتتىق ماددىلار ACSH 25% (w/w) (تەخمىنەن 8% دېكستران يۈكى) چوڭ كۆلەمدە ئولىگوساخارىد ئىشلەپچىقىرىش ئۈچۈن باشلانغۇچ ماتېرىيال سۈپىتىدە تەييارلاندى. ACS نىڭ ئېنزىملىق گىدرولىزى Cellic® Ctec2 10 مىللىگرام ئاقسىل/g گلۇكان (ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغان بىئوماسسادا)، Htec2 (Novozymes، Franklinton، NC)، 5 مىللىگرام ئاقسىل/g گلۇكان ۋە Multifect Pectinase (Genencor Inc، ئامېرىكا) )، 5 مىللىگرام ئاقسىل/g دېكستران قاتارلىق سودا ئېنزىم ئارىلاشمىسى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. ئېنزىملىق گىدرولىز 3 لىتىرلىق، pH قىممىتى 4.8، 50°C ۋە 250 ئايلىنىش/مىنۇت بولغان 5 لىتىرلىق بىئورېئاكتوردا ئېلىپ بېرىلدى. 96 سائەت گىدرولىزلانغاندىن كېيىن، گىدرولىزلانمىغان قاتتىق ماددىلارنى چىقىرىۋېتىش ئۈچۈن 6000 ئايلىنىش/مىنۇتتا 30 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق يىغىۋېلىندى، ئاندىن 14000 ئايلىنىش/مىنۇتتا 30 مىنۇت گىدرولىزلانمىغان قاتتىق ماددىلار چىقىرىۋېتىلدى. ئاندىن گىدرولىزات 0.22 مىللىمېتىرلىق سۈزگۈچ ئىستاكان ئارقىلىق ستېرىل سۈزۈلدى. سۈزۈلگەن گىدرولىزات 4 سېلسىيە گرادۇستا ستېرىل بوتۇلكىلاردا ساقلىنىپ، ئاندىن كاربونغا پارچىلاندى.
NREL تەجرىبىخانىسى ئانالىز قىلىش تەرتىپلىرىگە ئاساسەن ئېكىستراكت ئاساسلىق بىئوماسسا ئەۋرىشكىلىرىنىڭ تەركىبىنى تەھلىل قىلىش: تەركىب ئانالىزى ئۈچۈن ئەۋرىشكىلەرنى تەييارلاش (NREL/TP-510-42620) ۋە بىئوماسسادىكى قۇرۇلمىلىق كاربون سۇ بىرىكمىلىرى ۋە لىگنىننى بېكىتىش (NREL/TP-510 – 42618)47.
گىدرولىزات ئېقىمىنىڭ ئولىگوساخارىد ئانالىزى 2 مىللىلىتىرلىق ئۆلچەمدە ئاپتوكلاۋ ئاساسلىق كىسلاتا گىدرولىز ئۇسۇلى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. گىدرولىزات ئەۋرىشكىسىنى 10 مىللىلىتىرلىق بۇرما قاپاقلىق مەدەنىيەت نەيچىسىگە 69.7 µl 72% لىك سۇلفات كىسلاتاسى بىلەن ئارىلاشتۇرۇپ، 121 سېلسىيە گرادۇستا ئۈستەل يۈزىدە 1 سائەت تۇرغۇزۇپ، مۇز ئۈستىدە سوۋۇتۇپ، يۇقىرى ئۈنۈملۈك سۇيۇقلۇق خروماتوگرافىيەسى (HPLC) بوتۇلكىسىغا سۈزۈڭ. ئولىگوساخارىدلارنىڭ قويۇقلۇقى كىسلاتا گىدرولىزات ئەۋرىشكىسىدىكى ئومۇمىي شېكەر قويۇقلۇقىدىن گىدرولىزاتلانمىغان ئەۋرىشكىدىكى مونوساخارىدلارنىڭ قويۇقلۇقىنى چىقىرىۋېتىش ئارقىلىق بېكىتىلدى.
كىسلاتالىق گىدرولىزلانغان بىئوماسسادىكى گلۇكوزا، كسىلوزا ۋە ئارابىنوزا قويۇقلۇقى Shimadzu HPLC سىستېمىسى ئارقىلىق ئانالىز قىلىندى، بۇ سىستېما ئاپتوماتىك ئۈلگە ئېلىش ئۈسكۈنىسى، ئىستون قىزىتقۇچ، ئىزوكراتىك پومپا ۋە سىنىش كۆرسەتكۈچىنى تەكشۈرگۈچ بىلەن تەمىنلەنگەن بولۇپ، Bio-Rad Aminex HPX-87H ئىستونىدىكى. ئىستون 50 سېلسىيە گرادۇستا ساقلىنىپ، 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 سۇ ئېقىمى بىلەن ئېلۇتسىيە قىلىندى.
گىدرولىزات ئۈستۈنكى قەۋىتى سۇيۇلدۇرۇلۇپ، مونومېر ۋە ئولىگوساخارىد مىقدارى ئانالىز قىلىندى. ئېنزىملىق گىدرولىزدىن كېيىن ئېرىشكەن مونومېر شېكىرى Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P تۈۋرۈكى ۋە كۈل قوغداش تۈۋرۈكى بىلەن تەمىنلەنگەن HPLC ئارقىلىق ئانالىز قىلىندى. تۈۋرۈكنىڭ تېمپېراتۇرىسى 80 سېلسىيە گرادۇستا ساقلاندى، سۇ ھەرىكەتچان باسقۇچ سۈپىتىدە 0.6 مىللىلىتىر/مىنۇت ئېقىم سۈرئىتى بىلەن ئىشلىتىلدى. ئولىگوساخارىدلار 41، 48، 49- پايدىلىنىش ماتېرىياللىرىدا بايان قىلىنغان ئۇسۇللارغا ئاساسەن 121 سېلسىيە گرادۇستا سۇيۇق كىسلاتادا گىدرولىز ئارقىلىق بېكىتىلدى.
ساخارىد ئانالىزى خام، AFEX ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغان ۋە بارلىق گىدرولىزلانمىغان بىئوماسسا قالدۇقلىرى (تۈرلۈك ھۈجەيرە تام ئېكىستراكتلىرىنى ئىشلەپچىقىرىش ۋە ئۇلارنىڭ mAb تەكشۈرۈشىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ) ئۈستىدە ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەن 27، 43، 50، 51 ئۇسۇللىرى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. گلىكوم ئانالىزى ئۈچۈن، ئۆسۈملۈك ھۈجەيرە تام ماتېرىيالىنىڭ ئىسپىرتتا ئېرىمەيدىغان قالدۇقلىرى بىئوماسسا قالدۇقلىرىدىن تەييارلىنىپ، ئىلگىرىكى تەسۋىرلەنگەندەك ئاممونىي ئوكسالات (50 mM)، ناترىي كاربونات (50 mM ۋە %0.5 w/v)، CON (1M ۋە 4M، ھەر ئىككىسى %1 w/v ناترىي بوروگىدرىد بىلەن) ۋە كىسلاتا خىلورىت قاتارلىق بارغانسېرى ئاكتىپلىشىۋاتقان رېئاگېنتلار بىلەن تۈرلۈك ئايرىشقا ئۇچرايدۇ52،53. ئاندىن ئېكىستراكتلار ھۈجەيرە تام گلىكانىغا قارىتىلغان مۇرەككەپ mAb50 تاختىسىغا قارشى ELISA غا ئۇچرىتىلدى، ھەمدە mAb باغلىنىش رېئاكسىيەسى ئىسسىقلىق خەرىتىسى سۈپىتىدە كۆرسىتىلدى. ئۆسۈملۈك ھۈجەيرە تام گلىكانىغا قارىتىلغان mAbلار تەجرىبىخانا زاپىسىدىن (CCRC، JIM ۋە MAC يۈرۈشلۈكلىرى) سېتىۋېلىندى.
ئولىگوساخارىدلارنىڭ بىر باسقۇچلۇق بىئوتىنلىنىشى. كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنى بىئوتىن-LC-گىدرازىد بىلەن بىرلەشتۈرۈش تۆۋەندىكى ئۇسۇل ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. بىئوتىن-LC-گىدرازىد (4.6 mg/12 μmol) دىمېتىل سۇلفوكسىد (DMSO, 70 μl) دا كۈچلۈك ئارىلاشتۇرۇش ۋە 65°C دا 1 مىنۇت قىزىتىش ئارقىلىق ئېرىتىلدى. مۇز ئاتسېتاتىك كىسلاتا (30 µl) قوشۇلۇپ، ئارىلاشما ناترىي سىيانوبوروگىدرىد (6.4 mg/100 μmol) غا قۇيۇلدى ۋە 65°C دا تەخمىنەن 1 مىنۇت قىزىتىلغاندىن كېيىن تولۇق ئېرىتىلدى. ئاندىن، قۇرۇتۇلغان ئولىگوساخارىدقا (1-100 nmol) 5 دىن 8 μl گىچە رېئاكسىيە ئارىلاشمىسى قوشۇلۇپ، بەلگە قايتۇرۇش ئۇچىدىن 10 ھەسسە ياكى ئۇنىڭدىنمۇ كۆپ مول مىقداردا ئېشىپ كەتتى. رېئاكسىيە 65°C دا 2 سائەت ئېلىپ بېرىلدى، ئۇنىڭدىن كېيىن ئەۋرىشكىلەر دەرھال تازىلىنىدى. بەلگە قويۇش تەجرىبىسىدە قايتا ئەسلىگە كەلتۈرۈلمىگەن ناترىي سىيانوبوروگىدرىد ئىشلىتىلمىدى، ئەۋرىشكىلەر 65 سېلسىيە گرادۇستا 2.5 سائەت رېئاكسىيە قىلىندى.
ELISA ئارقىلىق بىئوتىنلانغان ئولىگوساخارىد ئەۋرىشكىلىرىنى يۇيۇش. ئاۋىدىن بىلەن قاپلانغان تەخسىنىڭ ھەر بىر قۇدۇقىغا 25 μl بىئوتىنلانغان ئەۋرىشكىلەر (ھەر بىر قويۇق ئەۋرىشكىدىن 100 μl 5 ml 0.1 M Tris بۇففېر ئېرىتمىسى (TBS) دا سۇيۇلدۇرۇلغان) قوشۇلدى. كونترول قۇدۇقلىرىغا 0.1 M TBS دا 10 μg/ml قويۇقلۇقتىكى 50 μl بىئوتىن چاپلاندى. بوش ئۆلچەش ئۈچۈن سىر سۈپىتىدە ئىئونسىزلاشتۇرۇلغان سۇ ئىشلىتىلدى. تەخسە ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا قاراڭغۇدا 2 سائەت تۇرغۇزۇلدى. Grenier flat 3A نىڭ 11-نومۇرلۇق پروگراممىسىنى ئىشلىتىپ، تەخسىنى 0.1 M TBS دا %0.1 مايسىز سۈت بىلەن 3 قېتىم يۇيۇڭ.
دەسلەپكى ئانتىتېلانى قوشۇش ۋە يۇيۇش. ھەر بىر قۇدۇققا 40 µl دەسلەپكى ئانتىتېلا قوشۇڭ. مىكرو تاختاينى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا قاراڭغۇ جايدا 1 سائەت تۇرغۇزۇڭ. ئاندىن تاختايلار Grenier Flat 3A نىڭ 11-نومۇرلۇق يۇيۇش پروگراممىسى ئارقىلىق 0.1M TBS دا %0.1 سۈت بىلەن 3 قېتىم يۇيۇلدى.
ئىككىنچى دەرىجىلىك ئانتىتېلا قوشۇپ يۇيۇڭ. ھەر بىر تۆشۈككە 50 µl چاشقان/كەلگەن ئىككىنچى دەرىجىلىك ئانتىتېلا (0.1 M TBS دا %0.1 سۈتتە 1:5000 سۇيۇلدۇرۇلغان) قوشۇڭ. مىكرو تاختاينى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا قاراڭغۇ جايدا 1 سائەت تۇرغۇزۇڭ. ئاندىن مىكرو تاختايلار Grenier Flat 5A 12-نومۇرلۇق تاختاي يۇيۇش پروگراممىسى ئارقىلىق %0.1 سۈتتە 0.1 M TBS سۇيۇقلۇقىدا 5 قېتىم يۇيۇلدى.
ئاساسىي سۇبسترات قوشۇش. ئاساسىي سۇبستراتقا 50 µl 3,3′,5,5′-تېترامېتىلبېنزىدىن (TMB) قوشۇڭ (15 مىللىلىتىر دېئونلاشتۇرۇلغان سۇغا 2 تامچە بۇفېر، 3 تامچە TMB، 2 تامچە ۋودورود پېروكسىد قوشۇش ئارقىلىق). TMB ئاساسىي سۇبستراتىنى تەييارلاڭ. ئىشلىتىشتىن بۇرۇن ئارىلاشتۇرۇڭ). مىكرو تاختاينى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 30 مىنۇت قويۇپ قويۇڭ. قاراڭغۇ جايدا.
بۇ قەدەمنى تاماملاپ، تاختاينى ئوقۇڭ. ھەر بىر قۇدۇققا 50 µl 1 N سۇلفات كىسلاتاسى قوشۇپ، ELISA ئوقۇغۇچ ئارقىلىق 450 دىن 655 نانومېتىرغىچە بولغان سۈمۈرگۈچلۈكنى خاتىرىلەڭ.
بۇ ئانالىز قىلىنىدىغان ماددىلارنىڭ 1 مىللىگرام/مىللىلىتىر ئېرىتمىسىنى دېئىئونلاشتۇرۇلغان سۇدا تەييارلاڭ: ئارابىنوز، رامنوز، فۇكوز، كسىلوز، گالاكتۇرون كىسلاتاسى (GalA)، گلۇكۇرون كىسلاتاسى (GlcA)، ماننوز، گلۇكوزا، گالاكتوزا، لاكتوزا، N-ئاتسېتىلماننوزامىن (manNAc)، N-ئاتسېتىلگىليۇكوزامىن. (glcNAc)، N-ئاتسېتىلگالاكتوزامىن (galNAc)، ئىنوزىتول (ئىچكى ئۆلچەم). 1-جەدۋەلدە كۆرسىتىلگەن 1 مىللىگرام/مىللىلىتىر شېكەر ئېرىتمىسىنى قوشۇش ئارقىلىق ئىككى ئۆلچەم تەييارلاندى. ئەۋرىشكىلەر -80°C تېمپېراتۇرىدا توڭلىتىلىدۇ ۋە لىئوفىللاشتۇرۇلىدۇ. سۇ پۈتۈنلەي چىقىرىۋېتىلگۈچە (ئادەتتە تەخمىنەن 12-18 سائەت).
100–500 µg ئەۋرىشكە قوشۇڭ، قاپاقلىق تۇرۇبىنى ئانالىزلىق تارازىغا قىستۇرۇڭ. قوشۇلغان مىقدارنى خاتىرىلەڭ. ئەۋرىشكەنى بەلگىلىك قويۇقلۇقتىكى ئېرىتكۈچىدە ئېرىتىپ، ئۇنى تۇرۇبىغا سۇيۇقلۇق شەكلىدە قوشۇش ئەڭ ياخشى. ھەر بىر ئەۋرىشكە تۇرۇبىسى ئۈچۈن ئىچكى ئۆلچەم سۈپىتىدە 20 µl 1 mg/ml ئىنوزىتول ئىشلىتىڭ. ئەۋرىشكە قوشۇلغان ئىچكى ئۆلچەم مىقدارى ئۆلچەملىك تۇرۇبىغا قوشۇلغان ئىچكى ئۆلچەم مىقدارى بىلەن ئوخشاش بولۇشى كېرەك.
بۇرمىلىق قاپاقلىق بوتۇلكىغا 8 مىللىلىتىر سۇسىز مېتانول قوشۇڭ. ئاندىن 4 مىللىلىتىر 3 N مېتانول HCl ئېرىتمىسىنى قۇيۇپ، قاپاقنى يېپىپ چايقىۋېتىڭ. بۇ جەرياندا سۇ ئىشلىتىلمەيدۇ.
ئولىگوساخارىد ئەۋرىشكىلىرى ۋە ئۆلچەملىك TMS تۇرۇبىسىغا 500 µl 1 M HCl مېتانول ئېرىتمىسى قوشۇڭ. ئەۋرىشكىلەر 80°C تېمپېراتۇرىدا بىر كېچە (168 سائەت) ئىسسىقلىق بۆلىكىدە ئىنكۇباتسىيە قىلىندى. مېتانولىزم مەھسۇلاتىنى قۇرۇتۇش كوللېكتورى ئارقىلىق ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا قۇرۇتۇڭ. 200 µl MeOH قوشۇپ يەنە قۇرۇتۇڭ. بۇ جەريان ئىككى قېتىم تەكرارلىنىدۇ. ئەۋرىشكە 200 µl مېتانول، 100 µl پىرىدىن ۋە 100 µl ئاتسېتاتىك ئانگىدرىد قوشۇپ ياخشى ئارىلاشتۇرۇڭ. ئەۋرىشكىلەرنى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 30 مىنۇت ئىنكۇباتسىيە قىلىڭ ۋە قۇرۇتۇڭ. 200 µl مېتانول قوشۇپ يەنە قۇرۇتۇڭ.
200 µl Tri-Sil قوشۇپ، ئۈستى يېپىق تۇرۇبىنى 20 مىنۇت قىزىتىڭ. 80°C تېمپېراتۇرىدا، ئاندىن ئۆي تېمپېراتۇرىسىغا سوۋۇتۇڭ. ئۈلگىنى تەخمىنەن 50 µl غىچە قۇرۇتۇش ئۈچۈن قۇرۇتۇش ئۈسكۈنىسىنى ئىشلىتىڭ. شۇنى ئەسكەرتىش كېرەككى، بىز ئۈلگىلەرنىڭ تولۇق قۇرۇپ كېتىشىگە يول قويمىدۇق.
2 مىللىلىتىر گېكسان قوشۇپ، ئارىلاشتۇرۇپ ياخشى ئارىلاشتۇرۇڭ. پاستېر پىپېتكىسىنىڭ ئۇچىنى (5-8 مىللىمېتىر) دىئامېتىرى 5-3/4 دىيۇملۇق پىپېتكىنىڭ ئۈستىگە ئەينەك يۇڭىنى قىستۇرۇپ، بىر پارچە ئەينەك يۇڭى بىلەن تولدۇرۇڭ. ئەۋرىشكىلەر 3000 گرامدا 2 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇلدى. ئېرىمەيدىغان قالدۇقلار چۆكمىگە چۈشىدۇ. ئەۋرىشكىنى 100-150 µl غىچە قۇرۇتۇڭ. تەخمىنەن 1 µl ھەجىمدىكى سۇ GC-MS غا 80 سېلسىيە گرادۇسلۇق دەسلەپكى تېمپېراتۇرىدا ۋە 2.0 مىنۇتلۇق دەسلەپكى ۋاقىتتا قۇيۇلدى (2-جەدۋەل).