Nature.com نى زىيارەت قىلغىنىڭىزغا رەھمەت.سىز ئىشلىتىۋاتقان توركۆرگۈچ نۇسخىسىنىڭ CSS قوللىشى چەكلىك.ئەڭ ياخشى تەجرىبە ئۈچۈن يېڭىلانغان تور كۆرگۈچنى ئىشلىتىشىڭىزنى تەۋسىيە قىلىمىز (ياكى Internet Explorer دىكى ماسلىشىشچان ھالەتنى چەكلەڭ).بۇ جەرياندا ، داۋاملىق قوللاشقا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ، تور بېكەتنى ئۇسلۇب ۋە JavaScript ئىشلەتمەيمىز.
AFEX بىلەن ئالدىن تەييارلانغان كۆممىقوناق ئوغۇتلىرىدىكى ئۈزلۈكسىز ئولىگوساخارىدلارنى مۇرەككەپ ئانالىز قىلىشنىڭ يېڭى ئىممۇنىتېت ۋە ئاممىۋى سپېكترىلىق ئۇسۇللىرى.Lignocellulosic بىيوماسسا تاشقا ئايلانغان يېقىلغۇنىڭ سىجىل تاللىشى بولۇپ ، يېمەكلىك ، يەم-خەشەك ، يېقىلغۇ ۋە خىمىيىلىك دورا قاتارلىق مەھسۇلاتلارنى ئىشلەپچىقىرىشتا بىئوتېخنىكا تەرەققىي قىلدۇرۇشتا كەڭ قوللىنىلىدۇ.بۇ تېخنىكىلارنىڭ ئاچقۇچى ئۆسۈملۈك ھۈجەيرە دىۋارىدا بار بولغان مۇرەككەپ كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنى گلۇكوزا ، شىلوزا ۋە ئارابىنوزا قاتارلىق ئاددىي شېكەرگە ئايلاندۇرۇشنىڭ تەننەرخى رىقابەت جەريانىنى تەرەققىي قىلدۇرۇش.كۆك قان تومۇر ئۆسمىسى ئىنتايىن جاھىل بولغاچقا ، چوقۇم ئىسسىقلىق خىمىيىلىك داۋالاش (مەسىلەن ، ئاممىياك تالاسى كۆيدۈرۈش (AFEX) ، سۇيۇق كىسلاتا (DA) ، ئىئون سۇيۇقلۇقى (IL)) ۋە بىئولوگىيىلىك داۋالاش (مەسىلەن ، فېرمېنتلىق گىدرولىز ۋە مىكروب ئېچىتىش) بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ ، لازىملىق مەھسۇلاتقا ئېرىشىشى كېرەك..قانداقلا بولمىسۇن ، گىدرولىز جەريانىدا سودا زەمبۇرۇغ فېرمېنتى ئىشلىتىلگەندە ، ھاسىل بولغان ئېرىشچان شېكەرنىڭ پەقەت% 75-85% مونوساخارىد ، قالغان% 15-25% ئېرىيدىغان ، ئاسان ئېرىشكىلى بولمايدىغان ئولىگوساخارىد بولۇپ ، مىكرو ئورگانىزملاردا ھەمىشە ئېرىشەلمەيدۇ.ئىلگىرى ، بىز كاربون ۋە دىئوتامىنلىق يەر ئايرىش ۋە چوڭ-كىچىكلىكىنى ئايرىۋېتىش خروموگرافىيەسىنى بىرلەشتۈرۈش ئارقىلىق مۇۋەپپەقىيەتلىك ھالدا ئېرىيدىغان جاھىل ئولىگوساخارىدنى ئايرىپ ۋە ساپلاشتۇردۇق ، شۇنداقلا ئۇلارنىڭ ئېنزىمنى تورمۇزلاش خۇسۇسىيىتىنى تەكشۈردۇق.بىز يۇقىرى دەرىجىدىكى پولىمېرلىشىش (DP) مېتىللانغان سۈيدۈك كىسلاتاسىنىڭ ئورنىنى ئالغان ئولىگوساخارىدنىڭ تۆۋەن DP ۋە نېيترال ئولىگوساخارىدلارغا قارىغاندا سودا ئېنزىم ئارىلاشمىسى بىلەن پىششىقلاپ ئىشلەشنىڭ قىيىنلىقىنى بايقىدۇق.بۇ يەردە بىز ئۆسۈملۈك ھۈجەيرىسىنىڭ تېمى ۋە فېرمېنتلىق گىدرولىزات ، ماترىسسا ياردەم قىلغان لازېر نۇرسىزلاندۇرۇش ئىئونىسىيىسى ، ئۇچۇش ۋاقتى ماسسىسى سپېكترومېتىرى قاتارلىق ئۆسۈملۈك بىئولوگىيىلىك گلىكانلارغا خاس بولغان يەككە يەككە ئانتىتېلا (mAbs) دىن پايدىلىنىپ گلىكان ئارخىپىنىڭ ئىشلىتىلىشىنى دوكلات قىلىمىز..MALDI-TOF-MS) مەنپىي ئىئون ، گاز خروموگرافىيىسى ۋە ئاممىۋى سپېكترومېتىرى (GC-MS) ئىككىلەمچى بۇزۇلغاندىن كېيىن سپېكتروسكوپ ئارقىلىق ئېرىشكەن قۇرۇلما خاراكتېرلىك ئۇچۇرغا دىئاگنوز قويۇش چوققىسىنى ئىشلىتىپ ، ئولىگوساخارىد رىشتىسىنى ھاسىل قىلغان ۋە ھاسىل قىلمىغان.ئولىگوساخارىد (DP 4–20) نىڭ كىچىكلىكى سەۋەبىدىن ، بۇ مولېكۇلالارنى mAb باغلاش ۋە خاراكتېرلەندۈرۈشتە ئىشلىتىش تەس.بۇ مەسىلىنى يېڭىش ئۈچۈن ، بىز يېڭى بىئوتىن بىرىكتۈرۈشنى ئاساس قىلغان ئولىگوساخارىدنى ھەرىكەتلەندۈرۈش ئۇسۇلىنى قوللاندۇق ، بۇ مىكرو ئېلېمېنتنىڭ تۆۋەن DP ئېرىتكۈچى ئولىگوساخارىدلارنىڭ كۆپ قىسمىغا مۇۋەپپەقىيەتلىك بەلگە چاپلىدى ، بۇ سىستېما يۇقىرى سۈرئەتلىك mAb سىستېمىسىدا ئالاھىدە سۇيۇقلۇق ئانالىزى ئۈچۈن ئىشلىتىلدى.بۇ يېڭى ئۇسۇل كەلگۈسىدە دىئاگنوز قويۇش مەقسىتىدە بىئولوگىيىلىك ماركا بار ئولىگوساخارىدلارنى ئايرىپ ۋە خاسلاشتۇرغىلى بولىدىغان تېخىمۇ ئىلغار يۇقىرى ئۈنۈملۈك گلىكومىيىلىك تەكشۈرۈشنىڭ تەرەققىياتىغا قۇلايلىق يارىتىدۇ.
Lignocellulosic بىيوماسسا دېھقانچىلىق ، ئورمانچىلىق ، ئوت-چۆپ ۋە ياغاچ ماتېرىياللاردىن تەركىب تاپقان بولۇپ ، يېمەكلىك ، يەم-خەشەك ، يېقىلغۇ ۋە خىمىيىلىك ئالدىنئالا قاتارلىق بىئولوگىيىلىك مەھسۇلاتلارنى ئىشلەپچىقىرىشتىكى يوشۇرۇن يەم-خەشەك ھېسابلىنىدۇ.ئۆسۈملۈك ھۈجەيرىسىنىڭ تېمىدىكى كاربون سۇ بىرىكمىلىرى (سېللۇلوزا ۋە قاندىكى سېللۇلوزاغا ئوخشاش) خىمىيىلىك پىششىقلاپ ئىشلەش ۋە بىئولوگىيىلىك ئۆزگىرىش ئارقىلىق مونوساخارىدقا ئايلىنىدۇ (فېرمېنتلىق گىدرولىز ۋە مىكروب ئېچىتىش دېگەندەك).كۆپ ئۇچرايدىغان ئالدىن داۋالاش ئۇسۇللىرى ئاممىياك تالاسىنىڭ كېڭىيىشى (AFEX) ، سۇيۇق كىسلاتا (DA) ، ئىئون سۇيۇقلۇقى (IL) ۋە پار پارتىلاش (SE) قاتارلىقلارنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، ئۇلار خىمىيىلىك ماددىلار بىلەن ئىسسىقلىقنى بىرلەشتۈرۈپ ئۆسۈملۈك ھۈجەيرىسىنىڭ تېمىنى ئېچىش ئارقىلىق لىنكوسېللوزا ئىشلەپچىقىرىشنى ئازايتىدۇ.ماددىنىڭ جاھىللىقى ، 5. فېرمېنتلىق گىدرولىز سودا ئاكتىپ كاربون سۇ بىرىكمىلىرى بار ئېنزىم (CAZymes) ۋە مىكروب ئېچىتىش ئارقىلىق گېنى يۆتكەلگەن ئېچىتقۇ ياكى باكتېرىيەدىن پايدىلىنىپ بىئولوگىيىلىك يېقىلغۇ ۋە خىمىيىلىك ماددىلارنى ئىشلەپ چىقىرىدۇ.
سودا ئېنزىملىرىدىكى CAZymes مۇرەككەپ بىرىكمە فېرمېنتتىن تەركىب تاپقان بولۇپ ، بىرىكمە بىرىكمە مۇرەككەپ كاربون سۇ بىرىكمىلىرى-شېكەر رىشتىنى بىرىكتۈرۈپ ، مونوساخارىدنى ھاسىل قىلىدۇ.بىز ئىلگىرى خەۋەر قىلغىنىمىزدەك ، كاربون سۇ بىرىكمىلىرى بىلەن لىگېننىڭ خۇشپۇراق پولىمېرلىرىنىڭ مۇرەككەپ تورى ئۇلارنى بىر تەرەپ قىلغىلى بولمايدىغان ھالەتكە كەلتۈرۈپ قويىدۇ ، بۇ شېكەرنىڭ تولۇق ئايلىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، ئالدىن تەييارلانغان بىئولوگىيىلىك فېرمېنتلىق گىدرولىز جەريانىدا ئىشلەپچىقىرىلمىغان جىنسىي ئولىگوساخارىدنىڭ% 15-25 نى يىغىدۇ.بۇ ھەر خىل بىئولوگىيىلىك ئالدىن تاللاش ئۇسۇللىرىدا كۆپ ئۇچرايدىغان مەسىلە.بۇ بوغۇشنىڭ بەزى سەۋەبلىرى گىدرولىز جەريانىدا ئېنزىمنىڭ چەكلىنىشى ياكى ئۆسۈملۈك بىيوماسسادىكى شېكەر رىشتىنى بۇزۇشقا ئېھتىياجلىق بولغان مۇھىم ئېنزىملارنىڭ يوقلۇقى ياكى تۆۋەن بولۇشى قاتارلىقلارنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.ئولىگوساخارىد تەركىبىدىكى شېكەر زايومى قاتارلىق شېكەرنىڭ تەركىبى ۋە قۇرۇلما ئالاھىدىلىكىنى چۈشىنىش بىزنىڭ گىدرولىز جەريانىدا شېكەرنىڭ ئايلىنىشىنى ياخشىلاپ ، نېفىتتىن ياسالغان مەھسۇلاتلار بىلەن بىئوتېخنىكا جەريانىنى تەننەرخ رىقابەت كۈچىگە ئىگە قىلىدۇ.
كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنىڭ تۈزۈلۈشىنى ئېنىقلاش قىيىن بولۇپ ، سۇيۇق خروموگرافىيە (LC) 11،12 ، يادرو ماگنىتلىق رېزونانىس سپېكتروسكوپى (NMR) 13 ، قىل قان تومۇر ئېلېكتىرو فورمىسى (CE) 14،15،16 ۋە ئاممىۋى سپېكترى (MS) 17 قاتارلىق ئۇسۇللارنى بىرلەشتۈرۈشنى تەلەپ قىلىدۇ.، ئون سەككىز.ماتىرىيال (MALDI-TOF-MS) ئارقىلىق لازېر نۇرسىزلاندۇرۇش ۋە ئىئونلاشتۇرۇش قاتارلىق ئۇچۇش ۋاقتىدىكى ماسسى سپېكترىغا ئوخشاش MS ئۇسۇللىرى كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنى پەرقلەندۈرۈشنىڭ كۆپ خىل ئۇسۇلى.يېقىندا ، ناترىي ئىئون خۇرۇچلىرىنىڭ سوقۇلۇش كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان پارچىلىنىشى (CID) ماس قەدەملىك MS ئەڭ كۆپ قوللىنىلىپ ، ئولىگوساخارىدنىڭ قوشۇمچە ئورنى ، نورمالسىز سەپلىمىسى ، تەرتىپى ۋە شاخلىنىش ئورنى 20 ، 21 گە ماس كېلىدۇ.
گىلىكان ئانالىزى كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنى چوڭقۇر پەرقلەندۈرۈشتىكى ئېسىل قورال.بۇ خىل ئۇسۇل مۇرەككەپ كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنى چۈشىنىشنى تەكشۈرۈش ئەسۋابى سۈپىتىدە ھۈجەيرە تېمى گلىكاننى ئۆسۈملۈككە يېتەكلەيدىغان يەككە ئانتىتېلا (mAbs) نى ئىشلىتىدۇ.250 mAbs دىن ئارتۇق دۇنيا مىقياسىدا بار ، ھەر خىل ساكارىدلار ئارقىلىق ھەر خىل سىزىقلىق ۋە شاخلانغان ئولىگوساخارىدلارغا قارشى لايىھەلەنگەن.بىر نەچچە mAbs ئۆسۈملۈك ھۈجەيرە تېمىنىڭ قۇرۇلمىسى ، تەركىبى ۋە ئۆزگىرىشىنى خاراكتېرلەندۈرۈشتە كەڭ قوللىنىلدى ، چۈنكى ئۆسۈملۈك ھۈجەيرىسىنىڭ تىپى ، ئەزاسى ، يېشى ، تەرەققىيات باسقۇچى ۋە ئۆسۈپ يېتىلىش مۇھىتىغا ئاساسەن زور پەرقلەر بار.يېقىندىن بۇيان ، بۇ ئۇسۇل ئۆسۈملۈك ۋە ھايۋانات سىستېمىسىدىكى قان تومۇر توپى ۋە ئۇلارنىڭ گلىكان تىرانسپورتىدىكى رولىنى كىچىك ھۈجەيرىلەر بەلگىسى ، تەرەققىيات باسقۇچى ياكى مۇھىتنىڭ غىدىقلىشى ئارقىلىق بەلگىلىگەن ۋە فېرمېنتلىق پائالىيەتنى ئېنىقلاشقا ئىشلىتىلىدۇ.ئېنىقلانغان گلىكان ۋە شىلاننىڭ ئوخشىمىغان قۇرۇلمىلىرىنىڭ بەزىلىرى پېكتىن (P) ، شىلان (X) ، ماننان (M) ، شىلوگلۇكان (XylG) ، ئارىلاشما گلۇكان (MLG) ، ئارابىنوكسىلان (ArbX) ، گالاكتوماننان (GalG) ، گلۇكوئورون كىسلاتاسى-ئەربىنوكسىلان (GArbX) ۋە ئەرەب-گالاكتان).
قانداقلا بولمىسۇن ، بۇ تەتقىقاتلارنىڭ ھەممىسىگە قارىماي ، پەقەت بىر نەچچە تەتقىقاتتا ئولىگوساخارىدنىڭ قويۇپ بېرىلىشى ، گىدرولىز جەريانىدا ئولىگومېرلىق زەنجىرنىڭ ئۇزۇنلۇقى ، ھەرخىل تۆۋەن DP پولىمېرلىرى ۋە ئەگرى سىزىق قاتارلىق يۇقىرى قاتتىقلىقتىكى يۈك (HSL) گىدرولىز جەريانىدا ئولىگوساخارىدنىڭ يىغىلىش خاراكتېرىگە مەركەزلەشتى.تارقىتىش 30,31,32.شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا ، گلىكان ئانالىزى گلىكان قۇرۇلمىسىنى ئەتراپلىق تەھلىل قىلىشنىڭ پايدىلىق قورالى ئىكەنلىكى ئىسپاتلانغان بولسىمۇ ، ئەمما ئانتىتېلا ئۇسۇلى ئارقىلىق سۇدا ئېرىشچان تۆۋەن DP ئولىگوساخارىدنى باھالاش تەس.مولېكۇلا ئېغىرلىقى 5-10 kDa دىن تۆۋەن بولغان كىچىك DP oligosaccharides ELISA تاختىسىنىڭ 33 ، 34 گە باغلانمايدۇ ھەمدە ئانتىتېلا قوشۇشتىن بۇرۇن يۇيۇلىدۇ.
بۇ يەردە بىز تۇنجى قېتىم يەككە ئانتىتېلادىن پايدىلىنىپ ئاۋىدىن بىلەن قاپلانغان تەخسىلەردە ELISA تەسۋىرىنى نامايان قىلىپ ، ئېرىشچان سۇندۇرغۇچى ئولىگوساخارىدنىڭ ئېرىتىش رېئاكسىيىلىك ئولىگوساخارىدنىڭ بىر باسقۇچلۇق بىئوتىنلاشتۇرۇش جەريانىنى بىرلەشتۈردۇق.بىزنىڭ گلىكومنى ئانالىز قىلىش ئۇسۇلىمىز MALDI-TOF-MS ۋە GC-MS ھىدرولىزلانغان شېكەر تەركىبلىرىنىڭ ترىمېتىلسىلىن (TMS) ھاسىل قىلىش ئارقىلىق تولۇقلانغان ئولىگوساخارىد ئۇلىنىشىنى ئانالىز قىلىش ئارقىلىق دەلىللەندى.بۇ خىل يېڭىلىق يارىتىش ئۇسۇلىنى كەلگۈسىدە يۇقىرى ئۈنۈملۈك ئۇسۇل سۈپىتىدە تەرەققىي قىلدۇرغىلى ۋە بىئولوگىيىلىك داۋالاش تەتقىقاتىدا تېخىمۇ كەڭ قوللىنىشقا ئېرىشكىلى بولىدۇ.
فېرمېنت ۋە ئانتىتېلانىڭ تەرجىمە قىلىنغاندىن كېيىنكى ئۆزگىرىشى ، مەسىلەن گلىكوزىللاش ، ئۇلارنىڭ بىئولوگىيىلىك پائالىيىتىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ.مەسىلەن ، قان زەردابى ئاقسىلىنىڭ گلىكوزىيىللىنىشىدىكى ئۆزگىرىش ياللۇغلىنىش خاراكتېرلىك بوغۇم ياللۇغىدا مۇھىم رول ئوينايدۇ ، گلىكوزىللاشنىڭ ئۆزگىرىشى دىئاگنوز بەلگىسى سۈپىتىدە ئىشلىتىلىدۇ.ئەدەبىياتتا ھەر خىل گىلىكانلارنىڭ ئاسانلا ئاشقازان-ئۈچەي يولى ۋە جىگەرنىڭ سوزۇلما خاراكتېرلىك ياللۇغلىنىش كېسەللىكلىرى ، ۋىرۇسلۇق يۇقۇملىنىش ، تۇخۇمدان ، كۆكرەك ۋە مەزى بېزى راكى قاتارلىق كۆپ خىل كېسەللىكلەردە ئاسان پەيدا بولىدىغانلىقى خەۋەر قىلىنغان.ئانتىتېلانى ئاساس قىلغان گلىكان ELISA ئۇسۇلىنى ئىشلىتىپ گلىكاننىڭ قۇرۇلمىسىنى چۈشىنىش مۇرەككەپ MS ئۇسۇللىرىنى قوللانماي تۇرۇپ ، كېسەلگە دىئاگنوز قويۇشقا قوشۇمچە ئىشەنچ بىلەن تەمىنلەيدۇ.
ئالدىنقى تەتقىقاتىمىزدا جاھىل ئولىگوساخارىدنىڭ ئالدىنئالا ۋە فېرمېنتلىق گىدرولىزدىن كېيىن سۇسىزلىنىپ قالغانلىقى كۆرسىتىلدى (1-رەسىم).ئىلگىرى ئېلان قىلىنغان خىزمىتىمىزدە ئاكتىپلانغان كۆمۈر قاتتىق فازا ئېلىش ئۇسۇلىنى تەتقىق قىلىپ چىقتۇق ، ئولىگوساخارىدنى AFEX ئالدىن تەييارلانغان كۆممىقوناق ئوچاق گىدرولىزات (ACSH) 8 دىن ئايرىپ چىقتۇق.دەسلەپكى قېزىش ۋە ئايرىشتىن كېيىن ، ئولىگوساخارىدلار چوڭلۇقتىكى چەكلەش خروموگرافىيىسى (SEC) تەرىپىدىن تېخىمۇ پارچىلىنىپ ، مولېكۇلا ئېغىرلىقى بويىچە يىغىۋېلىندى.ھەر خىل ئالدىنئالا قويۇپ بېرىلگەن شېكەر مونومېرلىرى ۋە ئولىگومېرلار شېكەر تەركىبىنى ئانالىز قىلىش ئارقىلىق تەھلىل قىلىنغان.ھەرخىل ئالدىن تاللاش ئۇسۇللىرى ئارقىلىق ئېرىشكەن شېكەر ئولىگومېرنىڭ مىقدارىنى سېلىشتۇرغاندا ، جاھىل ئولىگوساخارىدنىڭ بارلىقى بىئولوگىيىلىك ماددىنىڭ مونوساخارىدقا ئايلىنىشىدا كۆپ ئۇچرايدىغان مەسىلە بولۇپ ، شېكەر مەھسۇلات مىقدارىنىڭ كەم دېگەندە% 10-15 ، ھەتتا% 18 تۆۋەنلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.ئامېرىكا.بۇ ئۇسۇل ئولىگوساخارىد پارچىلىرىنى تېخىمۇ كەڭ كۆلەمدە ئىشلەپچىقىرىشقا ئىشلىتىلىدۇ.نەتىجىدە ھاسىل قىلىنغان ACH ۋە ئۇنىڭدىن كېيىنكى ئوخشىمىغان بۆلەكلەر ئوخشىمىغان مولېكۇلا ئېغىرلىقى بىلەن بۇ ئەسەردە ئولىگوساخارىدنىڭ ئالاھىدىلىكىنى تەجرىبە ماتېرىيالى قىلىپ ئىشلىتىلگەن.
ئالدىنئالا ۋە فېرمېنتلىق گىدرولىزدىن كېيىن ، ئىزچىل ئولىگوساخارىدلار سۇسىزلىنىپ قالدى.بۇ يەردە (A) ئولىگوساخارىدنى ئايرىش ئۇسۇلى بولۇپ ، ئولىگوساخارىدلار AFEX ئالدىن تەييارلانغان كۆممىقوناق ئوچاق گىدرولىزات (ACSH) دىن ئاكتىپلانغان كاربون ۋە دىئوموسسىمان تۇپراقنىڭ ئورالغان كارىۋىتى ئارقىلىق ئايرىۋېتىلىدۇ.(2) ئولىگوساخارىدنى ئايرىش ئۇسۇلى.ئولىگوساخارىدلار چوڭلۇقتىكى چەكلەش خروموگرافىيىسى (SEC) ئارقىلىق تېخىمۇ ئايرىلدى..فېرمېنتلىق گىدرولىزلىنىش شارائىتى: يۇقىرى قاتتىق دېتاللارنىڭ يۈكلىنىشى% 25 (w / w) (تەخمىنەن% 8 گلۇكان قاچىلاش) ، 96 سائەت گىدرولىز ، 20 mg / g سودا ئېنزىم قاچىلاش (Ctec2: Htec2: MP-2: 1: 1 نىسبىتى) ۋە (D) شېكەر مونومېرلىرى ۋە گلۇكوزا ، شىلوزا ۋە ئەربىنوزانىڭ AFEX ئالدىن پىششىقلاپ ئىشلەنگەن قوناق دۇكىنىدىن قويۇپ بېرىلگەن.
گىلىكان ئانالىزى قاتتىق بىئولوگىيىلىك قالدۇقلاردىن ئايرىپ ئېلىنغان جەۋھەرلەردىكى گلىكانلارنى ئەتراپلىق قۇرۇلمىلىق تەھلىل قىلىشنىڭ پايدىلىق قورالى ئىكەنلىكى ئىسپاتلاندى.قانداقلا بولمىسۇن ، سۇدا ئېرىيدىغان ساخارىدلار بۇ ئەنئەنىۋى ئۇسۇلنى ئىشلىتىپ ئىپادىلەنمەيدۇ 41 چۈنكى تۆۋەن مولېكۇلا ئېغىرلىقتىكى ئولىگوساخارىدلارنىڭ ELISA تاختىسىدا ھەرىكەتلىنىشى تەس بولۇپ ، ئانتىتېلا قوشۇلۇشتىن بۇرۇن يۇيۇلىدۇ.شۇڭلاشقا ، ئانتىتېلانى باغلاش ۋە خاراكتېرلەندۈرۈش ئۈچۈن ، ئاۋىدىن بىلەن قاپلانغان ELISA تاختىسىدىكى ئېرىيدىغان ، ماس كەلمەيدىغان ئولىگوساخارىدلارنى چاپلاش ئۈچۈن بىر باسقۇچلۇق بىئوتىنلاشتۇرۇش ئۇسۇلى قوللىنىلدى.بۇ ئۇسۇل ئىلگىرى ئىشلەپچىقىرىلغان ACSH ۋە ئۇنىڭ مولېكۇلا ئېغىرلىقى (ياكى پولىمېرلىشىش دەرىجىسى ، DP) گە ئاساسەن بىر بۆلەك ئارقىلىق سىناق قىلىنغان.بىر باسقۇچلۇق بىئوتىنلاشتۇرۇش كاربون سۇ بىرىكمىسىنىڭ تۆۋەنلىشىگە بىئوتىن- LC- گىدرازىد قوشۇش ئارقىلىق ئولىگوساخارىدنىڭ باغلىنىشچانلىقىنى ئاشۇرۇشقا ئىشلىتىلگەن (2-رەسىم).ھەل قىلىش چارىسىدە ، كېمەيتىش ئۇچىدىكى قان تومۇر گۇرۇپپىسى بىئوتىن- LC- گىدرازىد گىدرازىد گۇرۇپپىسى بىلەن ئىنكاس قايتۇرۇپ ، گىدرازون رىشتىسى ھاسىل قىلىدۇ.ئازايتقۇچى ۋاكالەتچى NaCNBH3 نىڭ ئالدىدا ، گىدرازون زايومى مۇقىم بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن ئاخىرقى مەھسۇلاتقا ئايلىنىدۇ.شېكەرنى تۆۋەنلىتىشنىڭ ئۆزگەرتىلىشىگە ئەگىشىپ ، تۆۋەن DP oligosaccharides نى ELISA پىلاستىنكىسىغا باغلاش مۇمكىن بولدى ، بىزنىڭ تەتقىقاتىمىزدا بۇ گىلكان نىشانلانغان mAbs ئارقىلىق ئاۋدىلىن بىلەن قاپلانغان تاختايلاردا ئېلىپ بېرىلدى.
بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن ئولىگوساخارىد ئۈچۈن ELISA نى ئاساس قىلغان يەككە ئانتىتېلانى تەكشۈرۈش.بۇ يەردە (A) ئولىگوساخارىدنىڭ بىئوتىن بىرىكتۈرۈلۈشى ۋە ئۇنىڭدىن كېيىنكى ELISA تەكشۈرۈشى NeutrAvidin سىرلانغان تەخسىلەردە گلىكان نىشانلانغان mAbs بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ ، (B) ئىنكاس مەھسۇلاتلىرىنىڭ بىئوتىن بىرىكتۈرۈشنىڭ بىر باسقۇچلۇق تەرتىپى كۆرسىتىلدى.
ئولىگوساخارىد بىلەن بىرىكتۈرۈلگەن ئانتىتېلا بار ئاۋىدىن سىرلانغان تەخسىلەر ئاندىن دەسلەپكى ۋە ئىككىلەمچى ئانتىتېلاغا قوشۇلۇپ ، يېنىك ۋە ۋاقىتقا سەزگۈر ھالەتتە يۇيۇلدى.ئانتىتېلا باغلاش تاماملانغاندىن كېيىن ، TMB تارماق ئېلېمېنتىنى قوشۇپ تەخسىنى سىڭدۈرۈڭ.رېئاكسىيە ئاخىرى گۈڭگۈرت كىسلاتاسى بىلەن توختىتىلدى.يوشۇرۇن تەخسە ELISA ئوقۇغۇچ ئارقىلىق ئانالىز قىلىنىپ ، ھەر بىر ئانتىتېلانىڭ باغلىنىشچانلىقىنى ئېنىقلاپ ، ئانتىتېلاغا مۇناسىۋەتلىك ئۆز-ئارا باغلىنىشنى بايقىدى.سىناقنىڭ تەپسىلاتى ۋە پارامېتىرلىرىنى مۇناسىپ «ماتېرىيال ۋە ئۇسۇل» دىن كۆرۈڭ.
بىز ACSH دا بار بولغان ئېرىشچان ئولىگوساخارىدلارنى شۇنداقلا لىنكوكېللوسسىك گىدرولىزاتتىن ئايرىپ ئېلىنغان يىرىك ۋە ساپلاشتۇرۇلغان ئولىگوساخارىد پارچىلىرىنى خاسلاشتۇرۇش ئارقىلىق ئالاھىدە قوللىنىلغان بۇ يېڭى ئۇسۇلنىڭ قوللىنىشچانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىمىز.3-رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك ، ACSH دا بىئولوگىيىلىك ئوكسىدلانغان گىلوكوم تەكشۈرۈش ئۇسۇلىنى قوللانغان ئەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان ئېپتوپنىڭ ئورنىنى ئالغان شىلانلار ئادەتتە سۈيدۈك يولى (U) ياكى مېتىلورونىك (MeU) ۋە كۆكرەك ئارابىنوگالاكتانلىرىدۇر.ئۇلارنىڭ كۆپىنچىسى ئالدىنقى تەتقىقاتىمىزدا گىدرولىزلانمىغان قاتتىق ماددىلارنىڭ (UHS) گلىكاننى ئانالىز قىلىش تەتقىقاتىدىمۇ بايقالغان.
ھۈجەيرە دىۋارى گلىكانغا قارىتىلغان يەككە يەككە ئانتىتېلادىن پايدىلىنىپ قايتا ھاسىل بولىدىغان ئولىگوساخارىد ئېپوپىتىنى بايقاش.«نېيترال» بۆلەك ACN بۆلەك ، «كىسلاتالىق» بۆلەك بولسا FA قىسمى.ئىسسىقلىق خەرىتىسىدىكى تېخىمۇ ئوچۇق قىزىللار ئېپتوپنىڭ مىقدارىنىڭ يۇقىرىلىقىنى ، تېخىمۇ ئوچۇق كۆك رەڭنىڭ تەگلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.ئۆلچەمدىكى رەڭ قىممىتى N = 2 نىڭ خام ئەشيا قىممىتىگە ئاساسلانغان.ئانتىتېلا ئېتىراپ قىلغان ئاساسلىق ئېپتوپلار ئوڭ تەرەپتە كۆرسىتىلىدۇ.
بۇ خىل ھۈجەيرە بولمىغان قۇرۇلمىلارنى سىناق قىلىنغان سودا ئېنزىم ئارىلاشمىسىدىكى ئەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان سېللۇلوزا ۋە قاندىكى سېللۇلوزا بىلەن تازىلىغىلى بولمايدۇ ، بۇ ئەڭ كۆپ ئىشلىتىلىدىغان سودا ئېنزىمنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.شۇڭلاشقا ، ئۇلارنىڭ گىدرولىزلىشى ئۈچۈن يېڭى ياردەمچى فېرمېنتلار تەلەپ قىلىنىدۇ.زۆرۈر بولغان سېللۇلوزا بولمىغان قوشۇمچە فېرمېنت بولمىسا ، بۇ سېللۇلوزا بولمىغان زايوملار ئۇلارنىڭ ئانا شېكەر پولىمېرلىرى قىسقا پارچىلارغا گىدرولىزلىنىپ ، سودا ئېنزىم ئارىلاشمىسى ئارقىلىق ئېرىپ كەتكەن تەقدىردىمۇ ، مونوساخارىدقا تولۇق ئايلىنىشنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.
سىگنال تارقىتىش ۋە ئۇنىڭ باغلاش كۈچىنى يەنىمۇ ئىلگىرىلىگەن ھالدا تەتقىق قىلىش ئارقىلىق ، يۇقىرى دەرىجىدىكى DP شېكەر بۆلەكلىرىدە (A ، B ، C ، DP 20+ غىچە) باغلاش ئېپتوپىنىڭ تۆۋەن دەرىجىدىكى DP بۆلەكلىرىگە (D ، E ، F ، DP) تۆۋەنرەك ئىكەنلىكى كۆرسىتىلدى (1-رەسىم).كىسلاتا پارچىلىرى نېيترال پارچىلارغا قارىغاندا سېللۇلوزا بولمىغان ئېپتوپلاردا كۆپ ئۇچرايدۇ.بۇ ھادىسىلەر ئالدىنقى تەتقىقاتىمىزدا كۆزىتىلگەن ئەندىزە بىلەن بىردەك ، بۇ يەردە يۇقىرى DP ۋە كىسلاتالىق ماددىلار فېرمېنتلىق گىدرولىزغا قارشى تۇرالايدۇ.شۇڭلاشقا ، سېللۇلوزا بولمىغان گلىكان ئېپتوپى ۋە U ۋە MeU نىڭ ئورنىنىڭ بولۇشى ئولىگوساخارىدنىڭ مۇقىملىقىغا زور تۆھپە قوشىدۇ.دىققەت قىلىشقا تېگىشلىكى شۇكى ، تۆۋەن DP ئولىگوساخارىدنى باغلاش ۋە بايقاش ئۈنۈمى مەسىلە بولۇشى مۇمكىن ، بولۇپمۇ ئېپتوپ بولسا ۋاقىتسىز ياكى ئۈچ خىل ئولىگوساخارىد بولسا.بۇنى ئوخشىمىغان ئۇزۇنلۇقتىكى سودا ئولىگوساخارىدلىرى ئارقىلىق سىناق قىلىشقا بولىدۇ ، ھەر بىرىدە پەقەت بىرلا mAb بىلەن باغلىنىدىغان پەقەت بىرلا ئېپتوپ بار.
شۇڭا ، قۇرۇلمىغا خاس ئانتىتېلا ئىشلىتىش مەلۇم خىل قايتا-قايتا زايومنى ئاشكارىلىدى.ئىشلىتىلگەن ئانتىتېلانىڭ تۈرى ، مۇۋاپىق بولغان سۇغىرىش ئەندىزىسى ۋە ئۇ ئىشلەپچىقارغان سىگنالنىڭ كۈچلۈكلۈكىگە ئاساسەن (يېڭى ۋە ئەڭ ئاز) يېڭى فېرمېنتلارنى ئېنىقلاپ ، فېرمېنت ئارىلاشمىسىغا يېرىم مىقداردا قوشۇپ ، تېخىمۇ تولۇق گلىكوكون ئايلىنىش ئۈچۈن بولىدۇ.ACSH oligosaccharides نىڭ تەھلىلىنى مىسالغا ئالساق ، بىز ھەر بىر بىئولوگىيىلىك ماتېرىيال ئۈچۈن گلىكان زايومىنىڭ سانلىق مەلۇمات ئامبىرىنى قۇرالايمىز.بۇ يەردە دىققەت قىلىشقا تېگىشلىكى شۇكى ، ئانتىتېلانىڭ ئوخشىمىغان يېقىنلىقىنى نەزەرگە ئېلىش كېرەك ، ئەگەر ئۇلارنىڭ يېقىنلىقى نامەلۇم بولسا ، بۇ ئوخشىمىغان ئانتىتېلانىڭ سىگنالىنى سېلىشتۇرۇشتا بەلگىلىك قىيىنچىلىقلارنى پەيدا قىلىدۇ.ئۇنىڭدىن باشقا ، گلىكان زايومىنى سېلىشتۇرۇش ئوخشاش ئانتىتېلانىڭ ئەۋرىشكىسى ئارىسىدا ئەڭ ياخشى ئۈنۈم بېرىشى مۇمكىن.بۇ جاھىل زايوملارنى ئاندىن CAZyme سانلىق مەلۇمات ئامبىرىغا ئۇلىغىلى بولىدۇ ، بۇنىڭدىن بىز فېرمېنتنى پەرقلەندۈرەلەيمىز ، كاندىدات فېرمېنتنى تاللىيالايمىز ۋە زايومنى بۇزۇش فېرمېنتىنى سىناق قىلالايمىز ياكى مىكروب سىستېمىسىنى تەرەققىي قىلدۇرۇپ ، بۇ ئېنزىملارنى بىئولوگىيىلىك ئېنىقلاشتا ئىشلىتىمىز 44.
ئىممۇنىتولوگىيەلىك ئۇسۇلنىڭ تۆۋەن دەرىجىدىكى مولېكۇلا ئېغىرلىقتىكى ئولىگوساخارىدنى لىمون ھۈجەيرىسىدىكى گىدرولىزدا ئىپادىلەشنىڭ باشقا ئۇسۇللارنى قانداق تولۇقلايدىغانلىقىنى باھالاش ئۈچۈن ، بىز MALDI (4-رەسىم ، S1-S8) ۋە ئوخشاش بىر تاختايدىكى GC-MS نى ئاساس قىلغان TMS ھاسىل قىلغان ساخارىدلارنى ئانالىز قىلدۇق (5-رەسىم).MALDI ئولىگوساخارىد مولېكۇلاسىنىڭ تۈركۈملەپ تارقىلىشىنىڭ كۆزلىگەن قۇرۇلمىغا ماس كېلىدىغان-كەلمەيدىغانلىقىنى سېلىشتۇرۇشقا ئىشلىتىلىدۇ.ئەنجۈر ئۈستىدە.4 بولسا ACN-A ۋە ACN-B نېيترال زاپچاسلىرىنىڭ MS نى كۆرسىتىدۇ.ACN-A تەھلىلى DP 4-8 (4-رەسىم) دىن DP 22 (S1 رەسىم) غىچە بولغان بىر قاتار پېنتوزا قەنتلىرىنى دەلىللىدى ، ئۇلارنىڭ ئېغىرلىقى MeU-xylan oligosaccharides بىلەن ماس كېلىدۇ.ACN-B تەھلىلى DP 8-15 بىلەن پېنتوزا ۋە گلۇكوكسىلان يۈرۈشلۈكلىرىنى دەلىللىدى.S3 رەسىمگە ئوخشاش قوشۇمچە ماتېرىياللاردا ، FA-C كىسلاتالىق ھەرىكەتچان ئاممىۋى تارقىتىش خەرىتىسىدە ELISA نى ئاساس قىلغان mAb تەكشۈرۈشىدە بايقالغان xylan بىلەن DP نىڭ 8-15 لىك بىر قاتار (Me) U ئالماشتۇرۇلغان پېنتوزا قەنتلىرى كۆرسىتىلدى.ئېپتوپلار بىردەك.
MALDI-MS سپېكترى ACS دا بار ئېرىيدىغان ماس كەلمەيدىغان ئولىگوساخارىد.بۇ يەردە ، (A) ACN-تەركىبىدە مېتىللانغان سۈيدۈك كىسلاتاسى (DP 4-8) بار بولغان تۆۋەن ئېغىرلىقتىكى بۆلەكلەر گلۇكوكورسىلان ئولىگوساخارىد ۋە (B) ACN-B xylan ۋە مېتىللانغان سۈيدۈك كىسلاتاسى ئولىگوساخارىدلار گلۇكوكسىلان (DP 8-15) نىڭ ئورنىنى ئالىدۇ.
سۇندۇرغۇچى ئولىگوساخارىدنىڭ گلىكان قالدۇقىنىڭ تەركىبىنى تەھلىل قىلىش.بۇ يەردە (A) GC-MS تەھلىلى ئارقىلىق ئېرىشكەن ھەر خىل ئولىگوساخارىد بۆلەكلىرىنىڭ TMS ساپارىد تەركىبى.(2) ئولىگوساخارىد تەركىبىدىكى ھەر خىل TMS ھاسىل قىلغان قەنتلەرنىڭ تۈزۈلۈشى.ACN - تەركىبىدە نېيترال ئولىگوساخارىد ۋە FA - كىسلاتالىق ئولىگوساخارىد بار فېرولىن كىسلاتاسى بار.
S9 رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك ، ئولىگوساخارىد بۆلۈمىنىڭ LC-MS ئانالىزىدىن يەنە بىر قىزىقارلىق يەكۈن چىقىرىلدى (ئېلېكترونلۇق قوشۇمچە ماتېرىيالدا ئۇسۇللارنى كۆرگىلى بولىدۇ).ACN-B بۆلەكلىرىنى باغلاش جەريانىدا ئالتە تەرەپلىك ۋە -OAc گۇرۇپپىسىنىڭ پارچىلىرى قايتا-قايتا كۆزىتىلدى.بۇ بايقاش گلۇكوم ۋە MALDI-TOF تەھلىلىدە كۆزىتىلگەن پارچىلىنىشنى ئىسپاتلاپلا قالماي ، يەنە ئالدىن ياسالغان كۆك قان ھۈجەيرىسىدىكى بىئولوگىيىلىك ئۆسۈملۈك كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنىڭ تۇغۇندى ماددىلىرى ھەققىدە يېڭى ئۇچۇرلار بىلەن تەمىنلەيدۇ.
بىز يەنە TMS گلىكان ھاسىل قىلىش ئارقىلىق ئولىگوساخارىد بۆلەكلىرىنىڭ گلىكان تەركىبىنى ئانالىز قىلدۇق.GC-MS نى ئىشلىتىپ ، ئولىگوساخارىد بۆلۈمىدىكى نېرۋا (ھاسىل بولمىغان) ۋە كىسلاتالىق قەنت (GluA ۋە GalA) نىڭ تەركىبىنى ئېنىقلىدۇق (5-رەسىم).گلۇكوئورون كىسلاتاسى C ۋە D كىسلاتالىق تەركىبلەردە ، گالاكتورون كىسلاتاسى A ۋە B كىسلاتالىق تەركىبلەردە بولىدۇ ، ھەر ئىككىسى كىسلاتالىق قەنتنىڭ DP تەركىبى يۇقىرى.بۇ نەتىجىلەر بىزنىڭ ELISA ۋە MALDI سانلىق مەلۇماتلىرىمىزنى ئىسپاتلاپلا قالماي ، بىزنىڭ ئىلگىرىكى ئولىگوساخارىد يىغىلىش تەتقىقاتى بىلەنمۇ ماس كېلىدۇ.شۇڭلاشقا ، بىز ھەرخىل بىئولوگىيىلىك ئەۋرىشكىلەردە ئېرىشچان قايتا ھاسىل بولىدىغان ئولىگوساخارىدلارنى بايقاشتا ئولىگوساخارىدلارنىڭ بىئوتىنلاشتۇرۇلۇشى ۋە كېيىنكى ELISA تەكشۈرۈشىدىن پايدىلىنىپ زامانىۋى ئىممۇنىتېت ئۇسۇللىرىنىڭ يېتەرلىك ئىكەنلىكىگە ئىشىنىمىز.
ELISA نى ئاساس قىلغان mAb تەكشۈرۈش ئۇسۇللىرى بىر قانچە ئوخشىمىغان ئۇسۇللار بىلەن دەلىللەنگەنلىكى ئۈچۈن ، بىز بۇ يېڭى مىقدارلاشتۇرۇش ئۇسۇلىنىڭ يوشۇرۇن كۈچى ئۈستىدە يەنىمۇ ئىزدىنىشنى ئويلىدۇق.Xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ۋە 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX) دىن ئىبارەت ئىككى خىل سودا خاراكتېرلىك ئولىگوساخارىد سېتىۋېلىنىپ ، ھۈجەيرە تام گلىكاننى نىشان قىلغان يېڭى mAb ئۇسۇلى ئارقىلىق سىناق قىلىندى.6-رەسىمدە بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن باغلىنىش سىگنالى بىلەن ئولىگوساخارىد قويۇقلۇقىنىڭ خاتىرى قويۇقلۇقى ئوتتۇرىسىدىكى تۈز سىزىقلىق باغلىنىش كۆرسىتىلدى ، بۇ بەلكىم Langmuir نىڭ سۈمۈرۈلۈش ئەندىزىسىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.MAbs ئىچىدە ، CCRC-M137 ، CCRC-M138 ، CCRC-M147 ، CCRC-M148 ۋە CCRC-M151 XHE بىلەن مۇناسىۋەتلىك ، CCRC-M108 ، CCRC-M109 ۋە LM11 A2XX بىلەن 1 nm دىن 100 نانو ئارىلىقىدا.تەجرىبە جەريانىدا ئانتىتېلانىڭ چەكلىك بولۇشى سەۋەبىدىن ، ھەر بىر ئولىگوساخارىد قويۇقلۇقى بىلەن چەكلىك تەجرىبە ئېلىپ بېرىلدى.بۇ يەردە دىققەت قىلىشقا تېگىشلىكى شۇكى ، بەزى ئانتىتېلالار ئوخشاش ئولىگوساخارىدقا ئوخشاش بىر خىل ئوخشىمىغان ئۇسۇلدا ئىنكاس قايتۇرىدۇ ، بۇ بەلكىم سەل ئوخشىمىغان ئېپتوپلارغا باغلانغانلىقى ۋە بىر-بىرىگە ئوخشىمايدىغان باغلىنىشچانلىقى بولۇشى مۇمكىن.يېڭى mAb ئۇسۇلى ھەقىقىي ئەۋرىشكىلەرگە قوللىنىلغاندا ، ئېپتوپنى توغرا پەرقلەندۈرۈشنىڭ مېخانىزىمى ۋە تەسىرى تېخىمۇ مۇرەككەپ بولىدۇ.
ئىككى خىل سودا ئولىگوساخارىد ھەر خىل گلىكان نىشانلىغان mAbs نىڭ بايقاش دائىرىسىنى ئېنىقلاشقا ئىشلىتىلگەن.بۇ يەردە ، ئولىگوساخارىد قويۇقلۇقىنىڭ قويۇقلۇقى بىلەن تۈز سىزىقلىق باغلىنىشلار (A) XHE نىڭ mAb بىلەن (B) A2XX نىڭ LangAbir نىڭ سۈمۈرۈلۈش ئەندىزىسىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.ماس كېلىدىغان ئېپتوپلار سودىدا ئولىگوساخارىدنىڭ قۇرۇلمىسىنى كۆرسىتىدۇ.
گلىكاننى نىشان قىلغان يەككە ئانتىتېلانى ئىشلىتىش (گلىكوكومىيىلىك ئانالىز ياكى ELISA نى ئاساس قىلغان mAb تەكشۈرۈش) ئۆسۈملۈك بىيوماسسانى تەشكىل قىلىدىغان ئاساسلىق ھۈجەيرە تام گىلىكانلىرىنى چوڭقۇر خاراكتېرلەندۈرۈشتىكى كۈچلۈك قورال.قانداقلا بولمىسۇن ، كلاسسىك گلىكان ئانالىزى پەقەت چوڭ ھۈجەيرە تام گىلىكانلىرىنىلا خاراكتېرلەندۈرىدۇ ، چۈنكى كۆپىنچە ئولىگوساخارىدلار ELISA تاختىسىدا ئۈنۈملۈك ھەرىكەتلەنمەيدۇ.بۇ تەتقىقاتتا ، AFEX ئالدىن تەييارلانغان كۆممىقوناق ئامبىرى يۇقىرى قاتتىق ماددىدا فېرمېنتلىق ھىدرولىزلانغان.شېكەر ئانالىزى ھىدرولىزاتتىكى قايتا ھاسىل بولىدىغان ھۈجەيرە تام كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنىڭ تەركىبىنى ئېنىقلاشقا ئىشلىتىلگەن.قانداقلا بولمىسۇن ، ھىدرولىزاتتىكى كىچىك ئولىگوساخارىدلارنىڭ mAb ئانالىزىغا سەل قارىلىدۇ ، ELISA تاختىسىدىكى ئولىگوساخارىدنى ئۈنۈملۈك ھەرىكەتلەندۈرۈش ئۈچۈن قوشۇمچە قوراللار لازىم.
بىز بۇ يەردە ئولىگوساخارىد بىئوتىنلاشنى بىرلەشتۈرۈش ئارقىلىق NeAbrAvidin ated قاپلانغان تەخسىلەردە ELISA تەكشۈرۈشىدىن كېيىن mAb تەكشۈرۈشنىڭ رومان ۋە ئۈنۈملۈك ئولىگوساخارىدنىڭ ھەرىكەتتىن ئۆتۈش ئۇسۇلىنى دوكلات قىلىمىز.ھەرىكەتلەندۈرۈلمىگەن بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن ئولىگوساخارىد ئانتىتېلاغا يېتەرلىك يېقىنلىقىنى كۆرسىتىپ ، قايتا ھاسىل بولغان ئولىگوساخارىدنى تېز ۋە ئۈنۈملۈك بايقىيالايدۇ.ئاممىۋى سپېكترومېتىرىيەنى ئاساس قىلغان بۇ جاھىل ئولىگوساخارىدلارنىڭ تەركىبىنى ئانالىز قىلىش ئىممۇنىتېتنى تەكشۈرۈشنىڭ بۇ يېڭى ئۇسۇلىنىڭ نەتىجىسىنى ئىسپاتلىدى.شۇڭا ، بۇ تەتقىقاتلار ئولىگوساخارىد بىئوتىنلاشتۇرۇش ۋە ELISA تەكشۈرۈشىنىڭ گلىكان نىشانلىق يەككە ئانتىتېلا بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ ، ئولىگوساخارىدنىڭ ئۆز-ئارا ئۇلىنىشىنى بايقاشقا ئىشلىتىلىدىغانلىقىنى ۋە ئولىگوساخارىدنىڭ قۇرۇلمىسىنى خاراكتېرلەندۈرىدىغان باشقا بىئو-خىمىيىلىك تەتقىقاتلاردا كەڭ قوللىنىلىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەردى.
بۇ بىئوتىننى ئاساس قىلغان گلىكان ئارخىپلاش ئۇسۇلى ئۆسۈملۈك بىيوماسسادىكى ئېرىشچان ئولىگوساخارىدلارنىڭ قايتا ھاسىل بولىدىغان كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنى تەكشۈرەلەيدىغان تۇنجى دوكلات.بۇ بىئولوگىيىلىك يېقىلغۇ ئىشلەپچىقىرىشقا كەلگەندە بەزى قىسىملارنىڭ نېمە ئۈچۈن جاھىللىقىنى چۈشىنىشكە ياردەم بېرىدۇ.بۇ ئۇسۇل گلىكومنى ئانالىز قىلىش ئۇسۇلىدىكى مۇھىم بوشلۇقنى تولدۇرۇپ ، ئۇنى ئۆسۈملۈك ئولىگوساخارىدتىن ھالقىپ تېخىمۇ كەڭ دائىرىدە كېڭەيتىدۇ.كەلگۈسىدە بىز ماشىنا ئادەملەرنى بىئوتىنلاشتۇرۇش ئۈچۈن ئىشلىتىشىمىز ۋە ELISA ئارقىلىق ئەۋرىشكىنى يۇقىرى ئۈنۈملۈك ئانالىز قىلىش ئۈچۈن بىز تەتقىق قىلغان ئۇسۇلنى ئىشلىتىشىمىز مۇمكىن.
Pioneer 33A14 ئارىلاشما ئۇرۇقىدىن ئۆستۈرۈلگەن كۆممىقوناق سامان (CS) 2010-يىلى كولورادو شىتاتىنىڭ راي شەھىرىدىكى كرامېر دېھقانچىلىق مەيدانىدىن يىغىۋېلىندى.يەر ئىگىسىنىڭ رۇخسىتى بىلەن بۇ بىيوماسسانى تەتقىقاتقا ئىشلىتىشكە بولىدۇ. ئەۋرىشكەلەر ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا زىپ قۇلۇپ خالتىلاردا قۇرۇق <6% نەملىك ساقلانغان. ئەۋرىشكەلەر ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا زىپ قۇلۇپ خالتىلاردا قۇرۇق <6% نەملىك ساقلانغان. Об كانцы хранились сухим при влажности <6% в пакетх с застежкой-молнией при комнатной мае. ئەۋرىشكە ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا سىيرىلما سومكىلاردا% 6 نەملىكتە قۇرۇق ساقلانغان.样品 在 室温 下 以 干燥 <6% 的 水分 储存 在 自封袋 中。样品 在 室温 下 以 干燥 <6% Об كانцы хранят в пакетх с застежкой-молнией при комнатной مانى с влажностью <6%. ئەۋرىشكە ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا نەملىك <6% بىلەن سىيرىلما خالتىدا ساقلىنىدۇ.بۇ تەتقىقات يەرلىك ۋە دۆلەتنىڭ كۆرسەتمىلىرىگە ئەمەل قىلدى.بىرىكمە ئانالىز NREL كېلىشىمىدىن پايدىلىنىپ ئېلىپ بېرىلدى.تەركىبىدە% 31.4 گلۇكان ،% 18.7 شىلان ،% 3.3 ئەرەبىستان ،% 1.2 گالاكتان ،% 2.2 ئاتسېتىل ،% 14.3 لىك لىگېن ،% 1.7 ئاقسىل ۋە% 13.4 كۈل بارلىقى بايقالغان.
Cellic® CTec2 (138 مىللىگىرام ئاقسىل / مىللىلىتىر ، VCNI 0001) سېللۇلوزا ، β- گلۇكوزىدازا ۋە Cellic® HTec2 (157 مىللىگىرام ئاقسىل / مىللىمېتىر ، VHN00001) نىڭ مۇرەككەپ ئارىلاشمىسى.Multifect Pectinase® (72 mg ئاقسىل / mL) ، پېكتىننى تۆۋەنلىتىدىغان ئېنزىمنىڭ مۇرەككەپ ئارىلاشمىسى ، DuPont سانائەت بىئولوگىيىسى (Palo Alto, CA, ئامېرىكا) ئىئانە قىلدى.فېرمېنت ئاقسىلنىڭ قويۇقلۇقى Kjeldahl ئازوت ئانالىزى (AOAC ئۇسۇلى 2001.11 ، سۈتچىلىك ھەمكارلىق كوپراتىپى شىركىتى ، ئىتالىيە ، نىيويورك ، ئامېرىكا) نىڭ تەركىبىدىكى ئاقسىلنىڭ مىقدارىنى مۆلچەرلەش (ۋە ئاقسىل بولمىغان ئازوتنىڭ تۆھپىسىنى ئېلىش) ئارقىلىق بېكىتىلدى.Diatomaceous earth 545 EMD Millipore (Billerica, MA) دىن سېتىۋېلىندى.ئاكتىپ كاربون (DARCO ، 100 تور دانچىسى) ، Avicel (PH-101) ، ھەرە شېلان ۋە باشقا بارلىق خىمىيىلىك ماددىلار سىگما-ئالدرىچ (سانت لۇئىس ، MO) دىن سېتىۋېلىندى.
AFEX ئالدىنئالا GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA) دا ئېلىپ بېرىلدى.ئالدىن داۋالاش 140 سېلسىيە گرادۇستا 15 مىنۇت ئېلىپ بېرىلدى.46 ئولتۇراقلىشىش ۋاقتى 1: 1 نىسبەتتە سۇسىز ئاممىياك بىلەن بىيوماسسانىڭ% 60 (w / w) داتلاشماس پولات ئورۇندۇق باتارېيە رېئاكتورىغا قاچىلانغان (Parr Instruments شىركىتى).بۇنىڭغا 30 مىنۇت ۋاقىت كەتتى.رېئاكتور 140 سېلسىيە گرادۇسقا ئېلىپ كېلىندى ۋە ئاممىياك تېز قويۇپ بېرىلدى ، بۇنىڭ بىلەن بىيوماسسا تېزلىكتە ئۆي تېمپېراتۇرىسىغا قايتىپ كەلدى.AFEX ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغان كۆممىقوناق ئامبىرى (ACS) نىڭ تەركىبى بىر تەرەپ قىلىنمىغان كۆممىقوناق ئامبىرى (UT-CS) بىلەن ئوخشاش ئىدى.
يۇقىرى قاتتىقلىقتىكى ACSH% 25 (w / w) (تەخمىنەن% 8 لىك دېكتران قاچىلاش) ئولىگوساخارىدنى كەڭ كۆلەمدە ئىشلەپچىقىرىشنىڭ باشلىنىش ماتېرىيالى سۈپىتىدە تەييارلانغان.ACS نىڭ ئېنزىملىق گىدرولىزلىنىشى Cellic® Ctec2 10 mg ئاقسىل / g گلۇكان (ئالدىن ياسالغان بىيوماسسادا) ، Htec2 (نوۋوزىم ، فىرانكلىنتون ، NC) ، 5 مىللىگىرام ئاقسىل / گ گلۇكان ۋە كۆپ ئىقتىدارلىق پېكتېنازا (ئامېرىكا گېنېنكور Inc) قاتارلىق سودا ئېنزىم ئارىلاشمىسى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى.).) ، 5 mg ئاقسىل / g dextran.فېرمېنتلىق گىدرولىز 5 لېتىرلىق بىئولوگىيىلىك ئېلېكتر ئېنېرگىيىسىدە ئېلىپ بېرىلغان بولۇپ ، خىزمەت مىقدارى 3 لىتىر ، pH 4.8 ، 50 ° C ۋە 250 rpm.گىدرولىز 96 سائەتتىن كېيىن ، گىدرولىزات 6000 rpm دە 30 مىنۇت ، ئاندىن 14000 rpm دە 30 مىنۇت مەركەزلەشتۈرۈپ يىغىۋېلىندى.ئاندىن گىدرولىزات 0.22 مىللىمېتىرلىق سۈزگۈچ تۇمشۇق ئارقىلىق سېرتسىيىلىك سۈزۈلۈشكە ئۇچرىغان.سۈزۈلگەن گىدرولىزات 4 سېلسىيە گرادۇسلۇق ستېرېل بوتۇلكىلاردا ساقلىنىپ ، ئاندىن كاربونغا بۆلۈندى.
NREL تەجرىبىخانىسىنىڭ ئانالىز تەرتىپى بويىچە جەۋھەرنى ئاساس قىلغان بىيوماسسا ئەۋرىشكىسىنىڭ تەركىبىنى تەھلىل قىلىش: تەركىبلەرنى ئانالىز قىلىش ئۈچۈن ئەۋرىشكە تەييارلاش (NREL / TP-510-42620) ۋە بىيوماسسادىكى قۇرۇلما كاربون سۇ بىرىكمىلىرى ۋە لىگېننى ئېنىقلاش (NREL / TP-510 - 42618) 47.
گىدرولىزات ئېقىمىنىڭ ئولىگوساخارىد ئانالىزى ئۆزلۈكىدىن ياسالغان كىسلاتا گىدرولىزلاش ئۇسۇلى ئارقىلىق 2 مىللىمېتىر كۆلەمدە ئېلىپ بېرىلدى.گىدرولىزات ئەۋرىشكىسىنى% 10 لىك بۇرمىلاش دورىسى مەدەنىيەت تۇرۇبىسىغا% 69.7 µl سۇلفات كىسلاتا بىلەن ئارىلاشتۇرۇپ ، 121 سېلسىيە گرادۇسلۇق ئورۇندۇقتا 1 سائەت سىڭدۈرۈپ ، مۇزدا سوۋۇتۇپ ، يۇقىرى ئىقتىدارلىق سۇيۇقلۇق خروموگرافىيە (HPLC) قاچىسىغا سۈزۈڭ.ئولىگوساخارىدنىڭ قويۇقلۇقى كىسلاتالىق گىدرولىزلانغان ئەۋرىشكە تەركىبىدىكى شېكەر قويۇقلۇقىدىن ھىدرولىزلانمىغان ئەۋرىشكە تەركىبىدىكى مونوساخارىدنىڭ قويۇقلۇقىنى ئېلىش ئارقىلىق بەلگىلىنىدۇ.
كىسلاتا گىدرولىزلانغان بىئولوگىيىلىك گلۇكوزا ، شىلوزا ۋە ئارابىنوزا قويۇقلۇقى Bio-Rad Aminex HPX-87H تۈۋرۈكىدە ئاپتوماتىك ھەيدەش ماشىنىسى ، تۈۋرۈك ئىسسىتىش ماشىنىسى ، ئىزوكرات پومپىسى ۋە سۇندۇرۇش كۆرسەتكۈچى تەكشۈرۈش ئۈسكۈنىسى ئورنىتىلغان Shimadzu HPLC سىستېمىسى ئارقىلىق تەھلىل قىلىنغان.بۇ تۈۋرۈك 50 سېلسىيە گرادۇسلۇق ھالەتتە ساقلانغان بولۇپ ، مىنۇتىغا 0.6 مىللىمېتىر / 5 mM H2SO4 سۇدا سۈزۈلگەن.flow.
گىدرولىزات خاسىيەتلىك ماددا سۇيۇقلاندۇرۇلۇپ ، مونومېر ۋە ئولىگوساخارىد تەركىبى ئۈچۈن ئانالىز قىلىنغان.فېرمېنتلىق گىدرولىزدىن كېيىن ئېرىشكەن مونومېرلىق قەنتلەر HPLC تەرىپىدىن Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P تۈۋرۈكى ۋە كۈل قوغدىغۇچى تۈۋرۈكى سەپلەنگەن.تۈۋرۈكنىڭ تېمپېراتۇرىسى 80 سېلسىيە گرادۇستا ساقلاندى ، سۇ يۆتكىلىش باسقۇچىدا مىنۇتىغا 0.6 مىللىمېتىر.ئولىگوساخارىد رېفستا تەسۋىرلەنگەن ئۇسۇللار بويىچە 121 سېلسىيە گرادۇسلۇق سۇيۇق كىسلاتادىكى گىدرولىز ئارقىلىق ئېنىقلانغان.41, 48, 49.
ساكخارىد ئانالىزى خام ، AFEX ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغان ۋە ھىدرولىزلانمىغان بىيوماسسا قالدۇقلىرى (تەرتىپلىك ھۈجەيرە تام جەۋھىرى ئىشلەپچىقىرىش ۋە ئۇلارنىڭ mAb تەكشۈرۈشىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ) ئۈستىدە ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەن 27 ، 43 ، 50 ، 51.گلىكومنى ئانالىز قىلىش ئۈچۈن ، ئۆسۈملۈك ھۈجەيرىسى تام ماتېرىيالىنىڭ ئىسپىرتتا ئېرىمەس قالدۇقلىرى بىيوماسسا قالدۇقىدىن تەييارلىنىپ ، ئاممونىي ئوكسالات (50 mM) ، ناترىي كاربونات (50 mM ۋە% 0.5 w / v) ، CON قاتارلىق كۈنسېرى كۈچىيىۋاتقان رېئاكتورلار بىلەن تەرتىپلىك ئايرىلىدۇ..ئاندىن بۇ جەۋھەرلەر ELISA نىڭ ھۈجەيرە تېمى گلىكانغا قارىتىلغان mAb50s نىڭ مۇرەككەپ تاختىسىغا ئۇچرىغان ، ھەمدە mAb باغلاش رېئاكسىيەسى ئىسسىقلىق خەرىتىسى سۈپىتىدە ئوتتۇرىغا قويۇلغان.mAbs ئۆسۈملۈك ھۈجەيرىسىنىڭ تام گىلىكاننى نىشانلىغان تەجرىبىخانا زاپىسىدىن سېتىۋېلىندى (CCRC, JIM ۋە MAC يۈرۈشلۈكى).
ئولىگوساخارىدلارنىڭ بىر باسقۇچلۇق بىئوتىنلىنىشى.كاربون سۇ بىرىكمىلىرىنىڭ بىئوتىن- LC- گىدرازىد بىلەن بىرىكىشى تۆۋەندىكى تەرتىپ ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى.بىئوتىن- LC- گىدرازىد (4.6 mg / 12 mmol) دىمېتىل سۇلفوكسىد (DMSO ، 70 مىللىمېتىر) دا كۈچلۈك قىزىتىش ۋە 65 سېلسىيە گرادۇستا 1 مىنۇت قىزىتىش ئارقىلىق ئېرىتىلدى.مۇزلۇق كىسلاتا كىسلاتاسى (30 µl) قوشۇلدى ۋە ئارىلاشما ناترىي سىئونوبوروھىدرىد (6.4 mg / 100 µmol) غا قۇيۇلدى ۋە 65 سېلسىيە گرادۇستا قىزىغاندىن كېيىن 1 مىنۇت ئەتراپىدا پۈتۈنلەي ئېرىپ كەتتى.ئاندىن ، قۇرۇتۇلغان ئولىگوساخارىد (1-100 nmol) غا 5 دىن 8 مىللىمېتىرغىچە بولغان رېئاكسىيە ئارىلاشمىسى قوشۇلۇپ ، بەلنىڭ كېمەيتىش ئۇچىدىكى ماركىنىڭ 10 ھەسسىسىگە ياكى ئۇنىڭدىنمۇ كۆپ قۇتۇبىغا ئېرىشىدۇ.بۇ رېئاكسىيە 65 سېلسىيە گرادۇستا 2 سائەت ئېلىپ بېرىلغاندىن كېيىن ، ئەۋرىشكە دەرھال ساپلاشتۇرۇلغان.بەلگە تەجرىبىسىدە ھېچقانداق ناترىي سىئونوبوروھىدرىد ئازايتىلمىغان ، ئەۋرىشكەلەر ° C 65 دە 2.5 سائەت ئىنكاس قىلىنغان.
ELISA سىر ۋە بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن ئولىگوساخارىد ئەۋرىشكىسىنى يۇيۇش.25 مىللىمېتىر بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن ئەۋرىشكە (ھەر بىر قويۇق ئەۋرىشكەنىڭ 100 مىللىمېتىر ، 0.1 M Tris بۇففېر ئېرىتمىسى (TBS) نىڭ 5 مىللىلېتىردا سۇيۇلدۇرۇلدى) ئاۋىدىن سىرلانغان تەخسىنىڭ ھەر بىر قۇدۇقىغا قوشۇلدى.كونترول قۇدۇقلىرى 0.1 M TBS دىكى 10 mg / ml قويۇقلۇقىدا 50 مىللىمېتىر بىئوتىن بىلەن سىرلانغان.دىئونلاشتۇرۇلغان سۇ قۇرۇق ئۆلچەش ئۈچۈن سىر سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن.بۇ تاختا كومپيۇتېر قاراڭغۇدا ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 2 سائەت سىلىندى.پروگرامما نومۇرى ئارقىلىق 0.1 M TBS دا% 0.1 ياغلانغان سۈت بىلەن تەخسىنى 3 قېتىم يۇيۇڭ.Grenier تەكشى 3A ئۈچۈن 11.
دەسلەپكى ئانتىتېلانى قوشۇش ۋە يۇيۇش.ھەر بىر قۇدۇققا 40 µl دەسلەپكى ئانتىتېلا قوشۇڭ.قاراڭغۇدا ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا مىكروپولاتنى 1 سائەت سىڭدۈرۈڭ.ئاندىن تەخسە Grenier Flat 3A ئۈچۈن 11-نومۇرلۇق يۇيۇش پروگراممىسى ئارقىلىق 0.1M TBS دا% 0.1 سۈت بىلەن 3 قېتىم يۇيۇلدى.
ئىككىلەمچى ئانتىتېلا قوشۇپ يۇيۇڭ.ھەر بىر قۇدۇققا 50 µl چاشقان / چاشقان ئىككىلەمچى ئانتىتېلا قوشۇڭ (0.1 M TBS دىكى% 0.1 سۈتتە 1: 5000 سۇيۇلدى).قاراڭغۇدا ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا مىكروپولاتنى 1 سائەت سىڭدۈرۈڭ.ئاندىن مىكرو تىپلىق Grenier Flat 5A تەخسە يۇيۇش پروگراممىسى # 0.1 ئارقىلىق 0.1 M TBS دىكى% 0.1 سۈت بىلەن 5 قېتىم يۇيۇلدى.
تارماق بالا قوشۇش.ئاساسى سۇ ئاستى قىسمىغا 50 µl 3,3 ′ ، 5،5 ′ تېترامېتىلبېنزىدىن (TMB) نى قوشۇڭ (15 مىللىمېتىر دىئونلانغان سۇغا 2 تامچە بۇففېر ، 3 تامچە TMB ، 2 تامچە ھىدروگېن ئوكسىد قوشۇش ئارقىلىق).TMB تارماق قىسمىنى تەييارلاڭ.ۋە ئىشلىتىشتىن بۇرۇن قاينام).مىكروپولاتنى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 30 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ.قاراڭغۇلۇقتا.
باسقۇچنى تاماملاپ تاختا كومپيۇتېرنى ئوقۇڭ.ھەر بىر قۇدۇققا 50 µl 1 N سۇلفات كىسلاتا قوشۇپ ، ELISA ئوقۇغۇچ ئارقىلىق 450 دىن 655 nm غىچە سۈمۈرۈلۈشنى خاتىرىلەڭ.
دىئونلانغان سۇدا بۇ ئانالىزنىڭ 1 مىللىگىرام / مىللىلېتىر ئېرىتمىسىنى تەييارلاڭ: ئارابىنوزا ، رامنوزا ، فۇكوزا ، شىلوزا ، گالاكتورون كىسلاتاسى (GalA) ، گلۇكوئورون كىسلاتاسى (GlcA) ، ماننوزا ، گلۇكوزا ، گالاكتوزا ، لاكتوزا ، N- ئاتسېتىلماننوزامىن (manNAc) ، N- ئاتسېتىلگلۇكوزامىن.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (ئىچكى ئۆلچەم).1-جەدۋەلدە كۆرسىتىلگەن 1 mg / mL شېكەر ئېرىتمىسىنى قوشۇش ئارقىلىق ئىككى ئۆلچەم تەييارلاندى.
ئانالىز تەڭپۇڭلۇقىدىكى دوپپا نەيچىسىگە 100-500 µg ئەۋرىشكە قوشۇڭ.قوشۇلغان سوممىنى خاتىرىلەڭ.ئەڭ ياخشىسى ئەۋرىشكىنى ئېرىتكۈچىنىڭ قويۇقلۇقىدا ئېرىتىپ ، ئۇنى سۇيۇقلۇق ئالكوك قىلىپ تۇرۇبىغا قوشۇش ئەڭ ياخشى.ھەر بىر ئەۋرىشكە نەيچىسى ئۈچۈن 20 µl 1 mg / ml ئىنوسىتولنى ئىچكى ئۆلچەم قىلىپ ئىشلىتىڭ.ئەۋرىشكە قوشۇلغان ئىچكى ئۆلچەمنىڭ مىقدارى چوقۇم ئۆلچەملىك تۇرۇبىغا قوشۇلغان ئىچكى ئۆلچەمنىڭ مىقدارى بىلەن ئوخشاش بولۇشى كېرەك.
بۇرمىلاش دورىسى قاچىسىغا 8 مىللىلېتىر سۇسىز مېتانول قوشۇڭ.ئاندىن 4 مىللىلېتىر 3 N. مېتانولىك HCl ئېرىتمىسى ، تۇتۇلۇپ سىلكىلىدۇ.بۇ جەريان سۇ ئىشلەتمەيدۇ.
ئولىگوساخارىد ئەۋرىشكىسى ۋە ئۆلچەملىك TMS تۇرۇبىسىغا 1 M HCl مېتانول ئېرىتمىسىنىڭ 500 µl نى قوشۇڭ.ئەۋرىشكەلەر بىر كېچىدىلا (168 سائەت) 80 سېلسىيە گرادۇسلۇق ئىسسىقلىق توسۇلۇپ قالدى.مېتانولىز مەھسۇلاتنى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا قۇرۇتۇش ئارقىلىق كۆپ قۇرۇتۇش كېرەك.200 µl MeOH نى قوشۇپ قايتا قۇرۇڭ.بۇ جەريان ئىككى قېتىم تەكرارلىنىدۇ.ئەۋرىشكە 200 µl مېتانول ، 100 µl پىرادىن ۋە 100 µl كىسلاتالىق ئانگىدرىدنى ئارىلاشتۇرۇپ ياخشى ئارىلاشتۇرۇڭ.ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا ئەۋرىشكە 30 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ.ۋە قۇرۇدى.200 µl مېتانولنى قوشۇپ قايتا قۇرۇڭ.
200 µl Tri-Sil ۋە ئىسسىقلىق قاپلانغان تۇرۇبىنى 20 مىنۇت قوشۇڭ.80 سېلسىيە گرادۇس ، ئاندىن ئۆينىڭ تېمپېراتۇرىسىغىچە سوۋۇدى.قۇرۇتقۇچنى ئىشلىتىپ ئەۋرىشكىنى تېخىمۇ 50 µl ئەتراپىدا قۇرۇتۇش كېرەك.دىققەت قىلىشقا تېگىشلىكى شۇكى ، بىز ئەۋرىشكەلەرنىڭ پۈتۈنلەي قۇرۇپ كېتىشىگە يول قويمىدۇق.
2 مىللىلېتىر ئالقاتنى قوشۇپ ، قاينام-تاشقىنلىق بىلەن ياخشى ئارىلاشتۇرۇڭ.5-3 / 4 ديۇملۇق دىئامېتىرى تۇرۇبىنىڭ ئۈستىگە ئەينەك يۇڭنى قىستۇرۇپ ، بىر پارچە ئەينەك يۇڭ بىلەن Pasteur تۇرۇبىسىنىڭ ئۇچىنى تولدۇرۇڭ.ئەۋرىشكەلەر 3000 گرامدا 2 مىنۇت مەركەزلەشتۈرۈلدى.ھەر قانداق ئېرىمەس قالدۇقلار چۆكۈپ كېتىدۇ.ئەۋرىشكىنى 100-150 µl غىچە قۇرۇڭ.ھەجىمى تەخمىنەن 1 مىللىمېتىر GC-MS غا دەسلەپكى تېمپېراتۇرا 80 سېلسىيە گرادۇس ، دەسلەپكى ۋاقىت 2.0 مىنۇتتا ئوكۇل قىلىندى (2-جەدۋەل).