Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy egy frissített böngészőt használjon (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Új immunológiai és tömegspektrometriás módszerek az AFEX-szel előkezelt kukoricadara perzisztens oligoszacharidjainak komplex elemzésére. A lignocellulóz biomassza fenntartható alternatívát kínál a fosszilis tüzelőanyagokkal szemben, és széles körben használják biotechnológiák fejlesztésére olyan termékek előállításához, mint az élelmiszerek, takarmányok, üzemanyagok és vegyi anyagok. Ezen technológiák kulcsa a költséghatékony eljárások fejlesztése a növényi sejtfalakban jelenlévő komplex szénhidrátok egyszerű cukrokká, például glükózzá, xilózzá és arabinózzá alakítására. Mivel a lignocellulóz biomassza nagyon makacs, a kívánt termék előállításához termokémiai kezeléseknek (pl. ammóniás szálak hámlasztása (AFEX), híg savak (DA), ionos folyadékok (IL)) és biológiai kezeléseknek (pl. enzimes hidrolízis és mikrobiális fermentáció) kell alávetni kombinálva. Amikor azonban kereskedelmi forgalomban kapható gombaenzimeket használnak a hidrolízis folyamatában, a képződött oldható cukroknak csak 75-85%-a monoszacharid, a fennmaradó 15-25% pedig oldható, nehezen kezelhető oligoszacharid, amelyek nem mindig állnak rendelkezésre a mikroorganizmusok számára. Korábban sikeresen izoláltunk és tisztítottunk oldható, makacs oligoszacharidokat szén- és kovaföld-elválasztás, valamint méretkizárásos kromatográfia kombinációjával, valamint vizsgáltuk enzimgátló tulajdonságaikat is. Megállapítottuk, hogy a magasabb polimerizációs fokú (DP) metilezett uronsav-szubsztitúciókat tartalmazó oligoszacharidokat nehezebb feldolgozni kereskedelmi forgalomban kapható enzimkeverékekkel, mint az alacsony DP-értékű és semleges oligoszacharidokat. Itt számos további módszer alkalmazásáról számolunk be, beleértve a növényi biomassza glikánokra specifikus monoklonális antitestek (mAb) felhasználásával végzett glikánprofilozást a növényi sejtfalakban és enzimatikus hidrolizátumokban lévő glikánkötések jellemzésére, a mátrix-asszisztált lézerdeszorpciós ionizációt és a repülési idő tömegspektrometriát. A MALDI-TOF-MS) a negatív ionok másodlagos bomlása után spektroszkópiával kapott szerkezetinformatív diagnosztikai csúcsokat, gázkromatográfiát és tömegspektrometriát (GC-MS) használ az oligoszacharid kötések jellemzésére derivatizációval és anélkül. Az oligoszacharidok kis mérete (DP 4–20) miatt ezek a molekulák nehezen használhatók mAb-kötésre és jellemzésre. A probléma leküzdésére egy új, biotinkonjugáción alapuló oligoszacharid immobilizációs módszert alkalmaztunk, amely sikeresen megjelölte a mikrotiterlemez felületén található alacsony DP-értékű oldható oligoszacharidok többségét, majd ezeket nagy áteresztőképességű monoklonális antitest rendszerben használtuk specifikus ligációs analízishez. Ez az új módszer elősegíti a jövőben a fejlettebb, nagy áteresztőképességű glükózvizsgálatok fejlesztését, amelyek diagnosztikai célokra felhasználhatók a biomarkerekben jelen lévő oligoszacharidok izolálására és jellemzésére.
A mezőgazdasági, erdészeti, fű- és fás anyagokból álló lignocellulóz biomassza potenciális alapanyag bioalapú termékek, többek között élelmiszerek, takarmányok, üzemanyagok és kémiai prekurzorok előállításához, amelyek nagyobb értékű termékeket eredményeznek1. A növényi sejtfalakban jelen lévő szénhidrátok (például cellulóz és hemicellulóz) kémiai feldolgozással és biotranszformációval (például enzimes hidrolízissel és mikrobiális fermentációval) monoszacharidokká depolimerizálódnak. A gyakori előkezelések közé tartozik az ammóniaszál-expanzió (AFEX), a híg sav (DA), az ionos folyadék (IL) és a gőzrobbantás (SE), amelyek vegyszerek és hő kombinációját alkalmazzák a lignocellulóz termelésének csökkentésére a növényi sejtfalak megnyitásával3,4. az anyag makacssága, 5. Az enzimatikus hidrolízist nagy szilárdanyag-terhelés mellett, kereskedelmi forgalomban kapható aktív szénhidráttartalmú enzimek (CAZyme-ok) és transzgénikus élesztők vagy baktériumok felhasználásával végzett mikrobiális fermentációval végzik bioalapú üzemanyagok és vegyszerek előállítására6.
A kereskedelmi forgalomban kapható enzimekben található CAZimek enzimek komplex keverékéből állnak, amelyek szinergikusan hasítják az összetett szénhidrát-cukor kötéseket, monoszacharidokat képezve2,7. Amint azt korábban beszámoltuk, a lignin aromás polimerjeinek szénhidrátokkal alkotott komplex hálózata rendkívül nehezen kezelhetővé teszi őket, ami hiányos cukorátalakításhoz vezet, és a nemi oligoszacharidok 15-25%-át felhalmozza, amelyek az előkezelt biomassza enzimatikus hidrolízise során nem keletkeznek. Ez egy gyakori probléma a különféle biomassza-előkezelési módszereknél. Ennek a szűk keresztmetszetnek néhány oka lehet az enzimgátlás a hidrolízis során, vagy a növényi biomasszában a cukorkötések felbontásához szükséges esszenciális enzimek hiánya vagy alacsony szintje. A cukrok összetételének és szerkezeti jellemzőinek, például az oligoszacharidokban lévő cukorkötéseknek a megértése segít nekünk a cukorátalakítás javításában a hidrolízis során, így a biotechnológiai folyamatok költséghatékonyabbak lesznek a kőolajszármazékokkal szemben.
A szénhidrátok szerkezetének meghatározása kihívást jelent, és olyan módszerek kombinációját igényli, mint a folyadékkromatográfia (LC)11,12, a mágneses magrezonancia spektroszkópia (NMR)13, a kapilláris elektroforézis (CE)14,15,16 és a tömegspektrometria (MS)17. ,tizennyolc. Az olyan MS-módszerek, mint a lézeres deszorpcióval és mátrix segítségével végzett repülési idő tömegspektrometria (MALDI-TOF-MS), sokoldalú módszert jelentenek a szénhidrátszerkezetek azonosítására. Az utóbbi időben a nátriumion-adduktumok ütközésindukált disszociációval (CID) végzett tandem MS-jét alkalmazzák legszélesebb körben az oligoszacharid kapcsolódási pozícióinak, anomer konfigurációinak, szekvenciáinak és elágazási pozícióinak megfelelő ujjlenyomatok azonosítására 20, 21.
A glikánanalízis kiváló eszköz a szénhidrátkötések mélyreható azonosítására22. Ez a módszer a növényi sejtfal glikánja ellen irányuló monoklonális antitesteket (mAb-kat) használ próbaként a komplex szénhidrátkötések megértéséhez. Világszerte több mint 250 mAb áll rendelkezésre, amelyeket különféle lineáris és elágazó oligoszacharidok ellen terveztek különféle szacharidok felhasználásával24. Számos mAb-t széles körben alkalmaztak a növényi sejtfal szerkezetének, összetételének és módosulásainak jellemzésére, mivel jelentős különbségek vannak a növényi sejttípustól, szervtől, kortól, fejlődési stádiumtól és növekedési környezettől függően25,26. Újabban ezt a módszert alkalmazzák növényi és állati rendszerekben a vezikulapopulációk és a glikántranszportban betöltött szerepük megértésére, amelyeket szubcelluláris markerek, fejlődési stádiumok vagy környezeti ingerek határoznak meg, valamint az enzimatikus aktivitás meghatározására. A glikánok és xilánok azonosított különböző szerkezetei közé tartozik a pektin (P), a xilán (X), a mannán (M), a xiloglükánok (XylG), a vegyes kötésű glükánok (MLG), az arabinoxilán (ArbX), a galaktomannán (GalG), a glükuronsav-arabinoxilán (GArbX) és az arabino-galaktán (ArbG)29.
Mindezen kutatási erőfeszítések ellenére azonban csak néhány tanulmány összpontosított a nagy szilárdanyag-terhelésű (HSL) hidrolízis során felhalmozódó oligoszacharidok természetére, beleértve az oligoszacharid felszabadulását, az oligomer lánchossz változásait a hidrolízis során, a különböző alacsony DP-értékű polimereket és azok görbéit. eloszlások 30,31,32. Eközben, bár a glikánanalízis hasznos eszköznek bizonyult a glikán szerkezetének átfogó elemzéséhez, nehéz a vízben oldódó, alacsony DP-értékű oligoszacharidokat antitest módszerekkel értékelni. A kisebb, 5-10 kDa-nál kisebb molekulatömegű DP-értékű oligoszacharidok nem kötődnek az ELISA lemezekhez 33, 34, és az antitest hozzáadása előtt lemosódnak.
Elsőként mutatunk be ELISA vizsgálatot avidinnel bevont lemezeken monoklonális antitestek felhasználásával, kombinálva az oldható, refrakter oligoszacharidok egylépéses biotinilezési eljárását a glikolízissel. A glikolízishez való megközelítésünket MALDI-TOF-MS és GC-MS alapú komplementer oligoszacharid kötések analízisével validáltuk, hidrolizált cukorösszetételek trimetilszilil (TMS) derivatizációjával. Ez az innovatív megközelítés a jövőben nagy áteresztőképességű módszerként fejleszthető, és szélesebb körben alkalmazható a biomedicinális kutatásokban35.
Az enzimek és antitestek poszttranszlációs módosításai, mint például a glikoziláció,36 befolyásolják biológiai aktivitásukat. Például a szérumfehérjék glikozilációjának változásai fontos szerepet játszanak a gyulladásos ízületi gyulladásban, és a glikoziláció változásait diagnosztikai markerekként használják37. Az irodalomban különféle glikánokról számoltak be, hogy könnyen megjelennek számos betegségben, beleértve a gyomor-bél traktus és a máj krónikus gyulladásos betegségeit, vírusfertőzéseket, petefészek-, emlő- és prosztatarákot38,39,40. A glikánok szerkezetének megértése antitest-alapú glikán ELISA módszerekkel további bizalmat biztosít a betegségek diagnosztizálásában komplex MS-módszerek alkalmazása nélkül.
Korábbi tanulmányunk kimutatta, hogy a makacs oligoszacharidok az előkezelés és az enzimes hidrolízis után sem hidrolizálódtak (1. ábra). Korábban publikált munkánkban egy aktív szénes szilárd fázisú extrakciós módszert fejlesztettünk ki oligoszacharidok izolálására AFEX-sel előkezelt kukoricaszár-hidrolizátumból (ACSH)8. A kezdeti extrakció és elválasztás után az oligoszacharidokat méretkizárásos kromatográfiával (SEC) tovább frakcionáltuk, és molekulatömeg szerint gyűjtöttük össze. A különböző előkezelésekből felszabaduló cukormonomereket és oligomereket cukorösszetétel-elemzéssel elemeztük. A különböző előkezelési módszerekkel kapott cukoroligomerek tartalmának összehasonlításakor a makacs oligoszacharidok jelenléte gyakori probléma a biomassza monoszacharidokká történő átalakításában, és a cukorhozam legalább 10-15%-os, sőt akár 18%-os (US) cukorhozam-csökkenéshez vezethet. Ezt a módszert az oligoszacharid-frakciók további nagymértékű előállítására használják. A kapott ACH-t és annak különböző molekulatömegű frakcióit kísérleti anyagként használtuk az oligoszacharidok jellemzésére ebben a munkában.
Az előkezelés és az enzimes hidrolízis után a perzisztens oligoszacharidok nem hidrolizáltak maradtak. Itt (A) egy oligoszacharid elválasztási módszert mutatunk be, amelyben az oligoszacharidokat AFEX-szel előkezelt kukoricakeményítő-hidrolizátumból (ACSH) izolálják aktív szén és kovaföld töltet alkalmazásával; (B) Az oligoszacharidok elválasztására szolgáló módszer. Az oligoszacharidokat méretkizárásos kromatográfiával (SEC) tovább választottuk szét; (C) Különböző előkezelésekből (híg sav: DA, ionos folyadék: IL és AFEX) felszabaduló szacharid monomerek és oligomerek. Enzimatikus hidrolízis körülményei: magas, 25% (t/t) szilárdanyag-tartalom (körülbelül 8% glükántartalom), 96 órás hidrolízis, 20 mg/g kereskedelmi forgalomban kapható enzimtartalom (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 arány) és (D) AFEX-szel előkezelt kukoricakeményítőből (ACS) felszabaduló cukor monomerek és glükóz, xilóz és arabinóz oligomerek.
A glikánanalízis hasznos eszköznek bizonyult a szilárd biomassza-maradékokból izolált kivonatokban található glikánok átfogó szerkezeti elemzéséhez. A vízben oldódó szacharidok azonban alulreprezentáltak ezzel a hagyományos módszerrel,41 mivel az alacsony molekulatömegű oligoszacharidokat nehéz immobilizálni az ELISA lemezeken, és az antitest hozzáadása előtt kimosódnak. Ezért az antitestkötéshez és jellemzéshez egylépéses biotinilezési módszert alkalmaztunk az oldható, nem kompatibilis oligoszacharidok avidinnel bevont ELISA lemezeken történő bevonására. Ezt a módszert a korábban előállított ACSH-val és a molekulatömegén (vagy polimerizációs fokán, DP) alapuló frakcióval teszteltük. Az egylépéses biotinilezést alkalmaztuk az oligoszacharid kötődési affinitásának növelésére biotin-LC-hidrazid hozzáadásával a szénhidrát redukáló végéhez (2. ábra). Oldatban a redukáló végén lévő hemiacetálcsoport reagál a biotin-LC-hidrazid hidrazidcsoportjával, hidrazonkötést képezve. A NaCNBH3 redukálószer jelenlétében a hidrazonkötés stabil biotinilezett végtermékké redukálódik. A cukorredukáló vég módosításával lehetővé vált az alacsony DP-értékű oligoszacharidok kötődése az ELISA lemezekhez, és tanulmányunkban ezt avidinnel bevont lemezeken, glikán-célzott monoklonális antitestek segítségével tettük meg.
Biotinilált oligoszacharidok ELISA-alapú monoklonális antitestek szűrése. Itt (A) az oligoszacharidok biotinilezésének és az azt követő ELISA-szűrésnek a kombinációja glikán-célzott monoklonális antitestekkel NeutrAvidin bevonatú lemezeken, és (B) a reakciótermékek biotinilezésének egylépéses eljárását mutatja be.
Az avidinnal bevont, oligoszachariddal konjugált antitesteket tartalmazó lemezeket ezután primer és szekunder antitestekhez adtuk, és fény- és időérzékeny közegben mostuk. Miután az antitestkötés befejeződött, TMB-szubsztrátot adtunk a lemezhez inkubálás céljából. A reakciót végül kénsavval állítottuk le. Az inkubált lemezeket ELISA-leolvasóval elemeztük, hogy meghatározzuk az egyes antitestek kötődési erősségét az antitest-specifikus keresztkötések kimutatása érdekében. A kísérlet részleteit és paramétereit lásd a megfelelő „Anyagok és módszerek” részben.
Az újonnan kifejlesztett módszer specifikus alkalmazásokban való hasznosságát az ACSH-ban, valamint a lignocellulóz hidrolizátumokból izolált nyers és tisztított oligoszacharid frakciókban jelen lévő oldható oligoszacharidok jellemzésével demonstráljuk. Amint a 3. ábra mutatja, a bioacilezett glikozid vizsgálati módszerekkel az ACSH-ban azonosított leggyakoribb epitóp-szubsztituált xilánok általában uronsav (U) vagy metiluronsav (MeU) és pektinsavas arabinogalaktánok. Legtöbbjüket a nem hidrolizált szilárd anyagok (UHS) glikánjainak elemzésével foglalkozó korábbi tanulmányunkban is megtaláltuk.43
Rekalcitráns oligoszacharid epitópok kimutatása a sejtfal glikánjára irányuló monoklonális antitesttel. A „semleges” frakció az ACN frakció, a „savas” frakció pedig az FA frakció. A hőtérképen az élénkebb vörös színek magasabb epitóptartalmat, az élénkebb kékek pedig üres hátteret jeleznek. A skálán látható színértékek az N=2 készítmények nyers OD-értékein alapulnak. Az antitestek által felismert fő epitópok a jobb oldalon láthatók.
Ezeket a nem-cellulóz szerkezeteket a tesztelt kereskedelmi enzimkeverékben található leggyakoribb cellulázok és hemicellulázok nem tudták hasítani, amely a leggyakrabban használt kereskedelmi enzimeket is tartalmazza. Ezért új segédenzimekre van szükség a hidrolízisükhöz. A szükséges nem-cellulóz segédenzimek nélkül ezek a nem-cellulóz kötések megakadályozzák a monoszacharidokká való teljes átalakulást, még akkor sem, ha az alapcukor polimerek rövidebb fragmensekké hidrolizálódnak, és kereskedelmi enzimkeverékekkel feloldódnak.
A jel eloszlásának és kötődési erősségének további vizsgálata azt mutatta, hogy a kötőepitópok alacsonyabbak voltak a magas DP-értékű cukorfrakciókban (A, B, C, DP akár 20+), mint az alacsony DP-értékű frakciókban (D, E, F, DP) a dimerekben) (1. ábra). A savas fragmensek gyakoribbak a nem-cellulóz epitópokban, mint a semleges fragmensekben. Ezek a jelenségek összhangban vannak a korábbi tanulmányunkban megfigyelt mintázattal, ahol a magas DP-értékű és savas részek jobban ellenálltak az enzimes hidrolízisnek. Ezért a nem-cellulóz glikán epitópok, valamint az U és MeU szubsztitúciók jelenléte nagymértékben hozzájárulhat az oligoszacharidok stabilitásához. Meg kell jegyezni, hogy a kötődési és detektálási hatékonyság problémás lehet az alacsony DP-értékű oligoszacharidok esetében, különösen, ha az epitóp dimer vagy trimer oligoszacharid. Ez különböző hosszúságú kereskedelmi forgalomban kapható oligoszacharidokkal tesztelhető, amelyek mindegyike csak egy epitópot tartalmaz, amely egy specifikus monoklonális antitesthez kötődik.
Így a szerkezetspecifikus antitestek használata bizonyos típusú makacs kötéseket tárt fel. Az alkalmazott antitest típusától, a megfelelő ligációs mintázattól és az általa előállított jel erősségétől (legtöbb és legkevésbé gyakori) függően új enzimek azonosíthatók és félkvantitatívan hozzáadhatók az enzimkeverékhez a teljesebb glikokonverzió érdekében. Az ACSH oligoszacharidok elemzését példaként véve, létrehozhatunk egy adatbázist az egyes biomassza-anyagok glikánkötéseiről. Itt meg kell jegyezni, hogy az antitestek eltérő affinitását figyelembe kell venni, és ha affinitásuk ismeretlen, ez bizonyos nehézségeket okoz a különböző antitestek jeleinek összehasonlításakor. Ezenkívül a glikánkötések összehasonlítása a legjobban ugyanazon antitest mintái között működhet. Ezeket a makacs kötéseket ezután összekapcsolhatjuk a CAZyme adatbázissal, amelyből azonosíthatjuk az enzimeket, kiválaszthatjuk a jelölt enzimeket és tesztelhetjük a kötésbontó enzimeket, vagy mikrobiális rendszereket fejleszthetünk ki ezen enzimek expressziójára biofinomítókban való felhasználásra44.
Annak értékelésére, hogy az immunológiai módszerek hogyan egészítik ki a lignocellulóz hidrolizátumokban jelen lévő kis molekulatömegű oligoszacharidok jellemzésére szolgáló alternatív módszereket, MALDI-t (4. ábra, S1-S8) és TMS-ből származó szacharidok GC-MS-alapú elemzését végeztük el ugyanazon a panelen (5. ábra) az oligoszacharid részen. A MALDI-t annak összehasonlítására használjuk, hogy az oligoszacharid molekulák tömegeloszlása ​​megfelel-e a kívánt szerkezetnek. A 4. ábra a semleges komponensek, az ACN-A és az ACN-B tömegspektrométerét mutatja. Az ACN-A elemzés megerősítette a pentóz cukrok DP 4-8-tól (4. ábra) DP 22-ig (S1. ábra) terjedő tartományát, amelyek súlya a MeU-xilán oligoszacharidoknak felel meg. Az ACN-B elemzés megerősítette a pentóz és glükoxilán sorozatot DP 8-15 értékkel. Az olyan kiegészítő anyagokban, mint az S3. ábra, az FA-C savas rész tömegeloszlási térképei a (Me)U-val szubsztituált pentózcukrok 8-15 DP-értékű tartományát mutatják, amelyek összhangban vannak az ELISA-alapú monoklonális antitest-szűrés során talált szubsztituált xilánokkal. Az epitópok konzisztensek.
Az ACS-ben jelen lévő oldható, nem kompatibilis oligoszacharidok MALDI-MS spektruma. Itt (A) ACN-A alacsony tömegtartományú frakciók, amelyek metilezett uronsavval (DP 4-8) szubsztituált glükuroxilán oligoszacharidokat tartalmaznak, és (B) ACN-B xilán és metilezett uronsav oligoszacharidok, amelyek glükuroxilánnal (DP 8-15) szubsztituáltak.
Tűzálló oligoszacharidok glikánmaradékának összetételének elemzése. Itt (A) Különböző oligoszacharid-frakciók TMS szacharid-összetétele, GC-MS analízissel meghatározva. (B) Különböző TMS-származékú cukrok szerkezete oligoszacharidokban. ACN – semleges oligoszacharidokat tartalmazó acetonitril-frakció és FA – savas oligoszacharidokat tartalmazó ferulinsav-frakció.
Egy másik érdekes következtetésre jutottak az oligoszacharid frakció LC-MS analíziséből, amint az az S9. ábrán látható (a módszerek az elektronikus kiegészítő anyagban láthatók). Az ACN-B frakció ligálása során ismételten hexóz és -OAc csoportok fragmentumait figyelték meg. Ez a megállapítás nemcsak a glikom és a MALDI-TOF analízis során megfigyelt fragmentációt erősíti meg, hanem új információkat is szolgáltat az előkezelt lignocellulóz biomasszában található potenciális szénhidrát-származékokról.
TMS glikán-származékképzéssel oligoszacharid-frakciók glikán-összetételének elemzését is elvégeztük. GC-MS segítségével meghatároztuk a neurális (nem származék) és savas cukrok (GluA és GalA) összetételét az oligoszacharid-frakcióban (5. ábra). A glükuronsav a C és D savas komponensekben található, míg a galakturonsav az A és B savas komponensekben, amelyek mindkettő a savas cukrok magas DP-értékű komponense. Ezek az eredmények nemcsak az ELISA és MALDI adatainkat erősítik meg, hanem összhangban vannak az oligoszacharid-felhalmozódásra vonatkozó korábbi vizsgálatainkkal is. Ezért úgy véljük, hogy az oligoszacharidok biotinilezését és az azt követő ELISA-szűrést alkalmazó modern immunológiai módszerek elegendőek az oldható, makacs oligoszacharidok kimutatására különböző biológiai mintákban.
Mivel az ELISA-alapú monoklonális antitestek szűrési módszereit számos különböző módszerrel validálták, tovább szerettük volna vizsgálni ennek az új kvantitatív módszernek a lehetőségeit. Két kereskedelmi forgalomban kapható oligoszacharidot, a xilohexaszacharid oligoszacharidot (XHE) és a 23-α-L-arabinofuranozil-xilotriózt (A2XX) vásároltunk, és egy új, a sejtfal glikánját célzó monoklonális antitest megközelítéssel teszteltünk. A 6. ábra lineáris korrelációt mutat a biotinilezett kötőjel és az oligoszacharid koncentrációjának logaritmikus koncentrációja között, ami egy lehetséges Langmuir adszorpciós modellre utal. Az monoklonális antitestek közül a CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 és CCRC-M151 korrelált az XHE-vel, a CCRC-M108, CCRC-M109 és LM11 pedig az A2XX-szel 1 nm és 100 nano közötti tartományban. A kísérlet során rendelkezésre álló antitestek korlátozott elérhetősége miatt korlátozott kísérleteket végeztünk minden oligoszacharid koncentrációval. Meg kell jegyezni, hogy egyes antitestek nagyon eltérően reagálnak ugyanarra az oligoszacharidra, mint szubsztrátra, feltehetően azért, mert kissé eltérő epitópokhoz kötődnek, és nagyon eltérő kötődési affinitással rendelkezhetnek. A pontos epitóp-azonosítás mechanizmusai és következményei sokkal összetettebbek lesznek, ha az új monoklonális antitest-megközelítést valós mintákra alkalmazzák.
Két kereskedelmi forgalomban kapható oligoszacharidot használtunk a különféle glikán-célzó monoklonális antitestek kimutatási tartományának meghatározására. Itt az oligoszacharid-koncentráció logaritmikus koncentrációjával való lineáris korreláció a Langmuir-féle adszorpciós mintázatokat jelzi az (A) XHE és a (B) A2XX és a monoklonális antitestek esetében. A megfelelő epitópok a vizsgálatban szubsztrátként használt kereskedelmi forgalomban kapható oligoszacharidok szerkezetét jelzik.
A glikán-célzott monoklonális antitestek használata (glikokómiai analízis vagy ELISA-alapú monoklonális antitestek szűrése) hatékony eszköz a növényi biomasszát alkotó főbb sejtfal-glikánok mélyreható jellemzésére. A klasszikus glikánanalízis azonban csak a nagyobb sejtfal-glikánokat jellemzi, mivel a legtöbb oligoszacharid nem rögzül hatékonyan az ELISA lemezeken. Ebben a vizsgálatban AFEX-szel előkezelt kukoricadarát hidrolizáltak enzimatikusan magas szilárdanyag-tartalom mellett. A cukoranalízist a hidrolizátumban található makacs sejtfal-szénhidrátok összetételének meghatározására alkalmazták. A kisebb oligoszacharidok monoklonális antitest-analízise a hidrolizátumokban azonban alábecsült, és további eszközökre van szükség az oligoszacharidok ELISA lemezeken történő hatékony immobilizálásához.
Jelen tanulmányban egy új és hatékony oligoszacharid immobilizációs módszert ismertetünk monoklonális antitestek szűrésére, amely az oligoszacharid biotinilezést és az ELISA szűrést kombinálja NeutrAvidin™ bevonatú lemezeken. Az immobilizált biotinilezett oligoszacharidok kellő affinitást mutattak az antitest iránt ahhoz, hogy lehetővé tegyék a makacs oligoszacharidok gyors és hatékony kimutatását. Ezen makacs oligoszacharidok összetételének tömegspektrometriás elemzése megerősítette az immunszűrés ezen új megközelítésének eredményeit. Így ezek a tanulmányok azt mutatják, hogy az oligoszacharid biotinilezés és az ELISA szűrés kombinációja glikán-célzott monoklonális antitestekkel felhasználható az oligoszacharidokban lévő keresztkötések kimutatására, és széles körben alkalmazható más biokémiai vizsgálatokban, amelyek az oligoszacharidok szerkezetét jellemzik.
Ez a biotin alapú glikánprofilozási módszer az első olyan jelentés, amely képes vizsgálni az oldható oligoszacharidok makacs szénhidrátkötéseit a növényi biomasszában. Ez segít megérteni, hogy a biomassza egyes részei miért olyan makacsok a bioüzemanyag-termelés terén. Ez a módszer egy fontos hiányosságot pótol a glükózanalízis módszerekben, és kiterjeszti alkalmazását a növényi oligoszacharidokon túlmutató szubsztrátok szélesebb körére. A jövőben robotikát használhatunk biotinilézióhoz, és az általunk kifejlesztett módszert nagy áteresztőképességű minták ELISA-val történő elemzésére használhatjuk.
A Pioneer 33A14 hibrid magvaiból termesztett kukoricaszalmát (CS) 2010-ben takarították be a Colorado állambeli Ray-ben található Kramer Farms-ról. A földtulajdonos engedélyével ez a biomassza kutatási célokra felhasználható. A mintákat száraz, < 6% nedvességtartalmú, zipzáras tasakokban, szobahőmérsékleten tároltuk. A mintákat száraz, < 6% nedvességtartalmú, zipzáras tasakokban, szobahőmérsékleten tároltuk. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. A mintákat száraz helyen, <6% páratartalom mellett, cipzáras tasakokban, szobahőmérsékleten tároltuk.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. A mintákat cipzáras tasakokban, szobahőmérsékleten, 6%-nál kisebb páratartalom mellett tároljuk.A tanulmány megfelelt a helyi és országos irányelveknek. Az összetételi elemzést az NREL protokoll szerint végezték. Az összetétel 31,4% glükánt, 18,7% xilánt, 3,3% arabinánt, 1,2% galaktánt, 2,2% acetil-, 14,3% lignin-, 1,7% fehérjét és 13,4% hamut tartalmazott.
A Cellic® CTec2 (138 mg fehérje/ml, sarzs VCNI 0001) celluláz, β-glükozidáz és Cellic® HTec2 (157 mg fehérje/ml, sarzs VHN00001) komplex keveréke a Novozymes-től (Franklinton, NC, USA)). A Multifect Pectinase® (72 mg fehérje/ml), egy pektint lebontó enzimek komplex keveréke, a DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) adományozta. Az enzimfehérje-koncentrációkat a fehérjetartalom becslésével (és a nem fehérje eredetű nitrogén hozzájárulásának kivonásával) határoztuk meg Kjeldahl-nitrogénanalízissel (AOAC módszer 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). A kovaföld 545-öt az EMD Millipore-tól (Billerica, MA) vásároltuk. Az aktív szenet (DARCO, 100 mesh granulátum), az Avicel-t (PH-101), a bükk xilánt és az összes többi vegyszert a Sigma-Aldrich-tól (St. Louis, MO) vásároltuk.
Az AFEX előkezelést a GLBRC-ben (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA) végezték. Az előkezelést 140 °C-on 15 percig végezték. 46 tartózkodási idő 1:1 vízmentes ammónia és biomassza aránynál, 60% (t/t) töltet mellett, rozsdamentes acélból készült, asztali szakaszos reaktorban (Parr Instruments Company). A folyamat 30 percig tartott. A reaktort 140 °C-ra melegítették, és az ammónia gyorsan felszabadult, lehetővé téve a biomassza gyors szobahőmérsékletűre való visszanyerését. Az AFEX előkezelt kukoricatörmelék (ACS) összetétele hasonló volt a kezeletlen kukoricatörmelék (UT-CS) összetételéhez.
Nagy mennyiségű oligoszacharid előállításához kiindulási anyagként 25% (t/t) nagy szilárdanyag-tartalmú ACSH-t (körülbelül 8% dextrántartalommal) készítettek. Az ACS enzimatikus hidrolízisét kereskedelmi forgalomban kapható enzimkeverékkel végezték, amely Cellic® Ctec2 10 mg fehérje/g glükánt (előkezelt biomasszában), Htec2-t (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg fehérjét/g glükánt és Multifect Pectinase-t (Genencor Inc, USA) tartalmazott. ). ), 5 mg fehérjét/g dextránt. Az enzimatikus hidrolízist egy 5 literes, 3 literes üzemi térfogatú bioreaktorban, pH 4,8-as értéken, 50°C-on és 250 fordulat/perc sebességgel végezték. 96 órás hidrolízis után a hidrolizátumot centrifugálással gyűjtötték össze 6000 fordulat/perc sebességgel 30 percig, majd 14000 fordulat/perc sebességgel 30 percig a nem hidrolizált szilárd anyagok eltávolítása érdekében. A hidrolizátumot ezután steril szűrésnek vetettük alá egy 0,22 mm-es szűrőpoháron keresztül. A szűrt hidrolizátumot steril palackokban 4 °C-on tároltuk, majd aktív szénen frakcionáltuk.
Kivonat alapú biomassza minták összetételének elemzése az NREL laboratóriumi elemzési eljárásai szerint: minták előkészítése összetétel-elemzéshez (NREL/TP-510-42620) és szerkezeti szénhidrátok és lignin meghatározása a biomasszában (NREL/TP-510 – 42618)47.
A hidrolizátum áram oligoszacharid-elemzését 2 ml-es mennyiségben, autokláv alapú savas hidrolízis módszerrel végeztük. A hidrolizátum mintát 69,7 µl 72%-os kénsavval kevertük össze egy 10 ml-es csavaros tetejű tenyésztőcsőben, majd 1 órán át inkubáltuk asztali edényben 121 °C-on, jégen hűtöttük, és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) üvegcsébe szűrtük. Az oligoszacharidok koncentrációját úgy határoztuk meg, hogy a nem hidrolizált mintában lévő monoszacharidok koncentrációját kivontuk a savas hidrolizált minta teljes cukorkoncentrációjából.
A savas hidrolizált biomasszában a glükóz-, xilóz- és arabinóz-koncentrációkat egy Shimadzu HPLC rendszerrel elemeztük, amely automata mintavevővel, oszlopfűtővel, izokratikus pumpával és refraktív index detektorral volt felszerelve egy Bio-Rad Aminex HPX-87H oszlopon. Az oszlopot 50°C-on tartottuk, és 0,6 ml/perc 5 mM H2SO4-gyel eluáltuk vízben.
A hidrolizátum felülúszóját hígítottuk, és monomer- és oligoszacharid-tartalomra elemeztük. Az enzimes hidrolízis után kapott monomer cukrokat HPLC-vel elemeztük, Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P oszloppal és hamuvédő oszloppal felszerelve. Az oszlop hőmérsékletét 80°C-on tartottuk, mozgófázisként vizet használtunk 0,6 ml/perc áramlási sebességgel. Az oligoszacharidokat híg savban, 121°C-on hidrolízissel határoztuk meg a 41., 48., 49. hivatkozásokban leírt módszerek szerint.
A szacharidanalízist nyers, AFEX előkezelt és az összes nem hidrolizált biomassza-maradványon végezték (beleértve a sorozatos sejtfal-kivonatok előállítását és azok monoklonális antitestjeinek szűrését) a korábban leírt eljárások 27, 43, 50, 51 szerint. A glikogénanalízishez a növényi sejtfal anyag alkoholban oldhatatlan maradékait biomassza-maradványokból állítják elő, és sorozatos extrakciónak vetik alá egyre agresszívabb reagensekkel, például ammónium-oxaláttal (50 mM), nátrium-karbonáttal (50 mM és 0,5% w/v), CON.-nal (1M és 4M, mindkettő 1% w/v nátrium-bórhidriddel) és savklorittal, a korábban leírtak szerint 52,53. A kivonatokat ezután ELISA-vizsgálatnak vetették alá a sejtfal-glikánt célzó monoklonális antitestek komplex paneljével szemben, és az monoklonális antitestek kötődési reakcióit hőtérképként ábrázolták. A növényi sejtfal-glikánt célzó monoklonális antitesteket laboratóriumi készletekből (CCRC, JIM és MAC sorozat) vásárolták.
Oligoszacharidok egylépéses biotinilezése. A szénhidrátok biotin-LC-hidraziddal való konjugálását a következő eljárással végeztük. A biotin-LC-hidrazidot (4,6 mg/12 μmol) dimetil-szulfoxidban (DMSO, 70 μl) oldottuk erőteljes keverés és 65 °C-on 1 percig tartó melegítés közben. Jégecetet (30 µl) adtunk hozzá, és az elegyet nátrium-ciano-bórhidridre (6,4 mg/100 µmol) öntöttük, majd 65 °C-on körülbelül 1 percig tartó melegítés után teljesen feloldottuk. Ezután a reakcióelegy 5-8 μl-ét adtuk a szárított oligoszacharidhoz (1-100 nmol), hogy a jelölés 10-szeres vagy nagyobb moláris feleslegét kapjuk a redukáló véghez képest. A reakciót 65 °C-on 2 órán át végeztük, majd a mintákat azonnal tisztítottuk. A jelölési kísérletekben redukció nélkül nem használtunk nátrium-ciano-bórhidridet, és a mintákat 65 °C-on 2,5 órán át reagáltattuk.
Biotinilezett oligoszacharid minták ELISA bevonása és mosása. 25 μl biotinilezett mintát (mindegyik koncentrált mintából 100 μl-t 5 ml 0,1 M Tris pufferoldatban (TBS) hígítva) adtunk az avidinnel bevont lemez minden egyes kútjába. A kontroll kútakat 50 μl biotinnal vontuk be, 10 μg/ml koncentrációban, 0,1 M TBS-ben. A vak mérésekhez ioncserélt vizet használtunk bevonatként. A tablettát 2 órán át szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk. A lemezt háromszor mostuk 0,1%-os sovány tejjel 0,1 M TBS-ben a Grenier 3A síkhoz tartozó 11-es program segítségével.
Az elsődleges antitestek hozzáadása és mosása. Adjunk 40 µl elsődleges antitestet minden egyes kúthoz. Inkubáljuk a mikrotiterlemezt 1 órán át szobahőmérsékleten, sötétben. A lemezeket ezután háromszor mostuk 0,1%-os tejjel 0,1M TBS-ben, a Grenier Flat 3A 11-es mosóprogramját használva.
Adjunk hozzá másodlagos antitestet, és mossuk le. Adjunk 50 µl egér/patkány másodlagos antitestet (1:5000 arányban hígítva 0,1%-os tejben 0,1 M TBS-ben) minden egyes lyukhoz. Inkubáljuk a mikrotiterlemezt 1 órán át szobahőmérsékleten, sötétben. A mikrotiterlemezeket ezután ötször mostuk 0,1%-os tejjel 0,1 M TBS-ben, Grenier Flat 5A 12-es lemezmosó programmal.
Szubsztrát hozzáadása. Adjunk 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidint (TMB) az alapszubsztráthoz (2 csepp puffer, 3 csepp TMB és 2 csepp hidrogén-peroxid hozzáadásával 15 ml ioncserélt vízhez). Készítsük elő a TMB szubsztrátot, és használat előtt vortexeljük. Inkubáljuk a mikrotiterlemezt szobahőmérsékleten 30 percig, sötétben.
Végezd el a lépést, és olvasd le a tablettát. Adj 50 µl 1 N kénsavat minden egyes lyukhoz, és jegyezd fel az abszorbanciát 450 és 655 nm között ELISA leolvasóval.
Készítsen 1 mg/ml koncentrációjú oldatokat a következő analitokból ioncserélt vízben: arabinóz, ramnóz, fukóz, xilóz, galakturonsav (GalA), glükuronsav (GlcA), mannóz, glükóz, galaktóz, laktóz, N-acetilmannózamin (manNAc), N-acetilglükózamin (glcNAc), N-acetilgalaktózamin (galNAc), inozitol (belső standard). Két standardot készített az 1. táblázatban látható 1 mg/ml koncentrációjú cukoroldatok hozzáadásával. A mintákat -80°C-on fagyasztva tárolják, majd liofilizálják, amíg az összes víz el nem távolodik (általában körülbelül 12-18 óra).
Adjon 100–500 µg mintát analitikai mérlegen lévő csavaros tetejű kémcsövekbe. Jegyezze fel a hozzáadott mennyiséget. A legjobb, ha a mintát egy meghatározott koncentrációjú oldószerben oldja fel, és folyékony alikvotként adja a csőhöz. Minden mintacsőhöz 20 µl 1 mg/ml inozitolt használjon belső standardként. A mintához adott belső standard mennyiségének meg kell egyeznie a standard csőbe adott belső standard mennyiségével.
Adjon 8 ml vízmentes metanolt egy csavaros tetejű fiolába. Ezután adjon hozzá 4 ml 3 N metanolos HCl-oldatot, zárja le és rázza össze. Ez a folyamat nem használ vizet.
Adjunk 500 µl 1 M HCl-metanolos oldatot az oligoszacharid mintákhoz és a standard TMS csövekhez. A mintákat egy éjszakán át (168 órán át) 80°C-on inkubáltuk egy hőblokkban. A metanolízis termékét szobahőmérsékleten szárítóelosztó segítségével szárítsuk. Adjunk hozzá 200 µl MeOH-t, és szárítsuk újra. Ezt a folyamatot kétszer ismételjük meg. Adjunk 200 µl metanolt, 100 µl piridint és 100 µl ecetsavanhidridet a mintához, és jól keverjük össze. Inkubáljuk a mintákat szobahőmérsékleten 30 percig, majd szárítsuk. Adjunk hozzá 200 µl metanolt, és szárítsuk újra.
Adjunk hozzá 200 µl Tri-Sil reagenst, és melegítsük a kupakkal ellátott csövet 20 percig. Melegítsük 80°C-ra, majd hűtsük le szobahőmérsékletre. Szárítócsövet használjunk a minta további szárításához körülbelül 50 µl térfogatra. Fontos megjegyezni, hogy nem hagytuk a mintákat teljesen megszáradni.
Adjunk hozzá 2 ml hexánt, és vortexeléssel jól keverjük össze. Töltsük meg a Pasteur-pipetták (5-8 mm) hegyét egy üveggyapottal úgy, hogy az üveggyapotot egy 5-3/4 hüvelyk átmérőjű pipetta tetejére helyezzük. A mintákat 3000 g-vel 2 percig centrifugáltuk. Az oldhatatlan maradványok kicsapódtak. Szárítsuk a mintát 100-150 µl-re. Körülbelül 1 μl térfogatot injektáltunk a GC-MS készülékbe 80 °C kezdeti hőmérsékleten és 2,0 perces kezdeti idővel (2. táblázat).