Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var. Ən yaxşı təcrübə üçün yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq Rejimini deaktiv etməyinizi) tövsiyə edirik. Bu vaxt ərzində davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stillər və JavaScript olmadan render edəcəyik.
AFEX ilə əvvəlcədən işlənmiş qarğıdalı sobasında davamlı oliqosaxaridlərin kompleks analizi üçün yeni immunoloji və kütlə spektrometrik metodlar. Liqnosellülozik biokütlə qazıntı yanacaqlarına davamlı alternativdir və qida, yem, yanacaq və kimyəvi maddələr kimi məhsulların istehsalı üçün biotexnologiyaların inkişafında geniş istifadə olunur. Bu texnologiyaların açarı bitki hüceyrə divarlarında mövcud olan mürəkkəb karbohidratları qlükoza, ksiloza və arabinoza kimi sadə şəkərlərə çevirmək üçün rəqabətədavamlı proseslərin inkişafıdır. Liqnosellülozik biokütlə çox inadkar olduğundan, istənilən məhsulu əldə etmək üçün termokimyəvi müalicələrə (məsələn, ammonyak lifinin aşındırılması (AFEX), seyreltilmiş turşular (DA), ion mayeləri (IL)) və bioloji müalicələrə (məsələn, fermentativ hidroliz və mikrob fermentasiyası) kombinasiya şəklində məruz qalmalıdır. Lakin, kommersiya məqsədli göbələk fermentləri hidroliz prosesində istifadə edildikdə, əmələ gələn həll olan şəkərlərin yalnız 75-85%-i monosaxaridlər, qalan 15-25%-i isə həmişə mikroorqanizmlər üçün əlçatan olmayan həll olan, həll olunmayan oliqosaxaridlərdir. Əvvəllər karbon və diatom torpaq ayrılması və ölçü istisna xromatoqrafiyasının kombinasiyasından istifadə edərək həll olan inadkar oliqosaxaridləri uğurla təcrid etmiş və təmizləmiş, həmçinin onların ferment inhibitor xüsusiyyətlərini araşdırmışıq. Daha yüksək dərəcədə polimerləşmə (DP) metilləşdirilmiş uron turşusu əvəzediciləri olan oliqosaxaridlərin aşağı DP və neytral oliqosaxaridlərə nisbətən kommersiya məqsədli ferment qarışıqları ilə emal edilməsinin daha çətin olduğunu müəyyən etmişik. Burada bitki hüceyrə divarlarında qlikan bağlarını və fermentativ hidrolizatları xarakterizə etmək üçün bitki biokütləsi qlikanlarına xas olan monoklonal antikorlardan (mAbs) istifadə edərək qlikan profilləmə, matris köməkli lazer desorbsiya ionlaşması, uçuş vaxtı kütlə spektrometriyası daxil olmaqla bir neçə əlavə metodun istifadəsini bildiririk. . MALDI-TOF-MS), mənfi ionların ikincili parçalanmasından sonra spektroskopiya, qaz xromatoqrafiyası və kütlə spektrometriyası (GC-MS) ilə əldə edilən struktur-informativ diaqnostik piklərdən istifadə edərək, törəmələşmə ilə və törəmələşmədən oliqosaxarid rabitələrini xarakterizə edir. Oliqosaxaridlərin kiçik ölçüsünə (DP 4–20) görə, bu molekulların mAb bağlanması və xarakteristikası üçün istifadəsi çətindir. Bu problemi aradan qaldırmaq üçün, mikroplitə səthində aşağı DP həll olan oliqosaxaridlərin əksəriyyətini uğurla etiketləyən yeni bir biotin konjugasiya əsaslı oliqosaxarid immobilizasiya metodu tətbiq etdik və daha sonra spesifik ligasiya təhlili üçün yüksək ötürücülü mAb sistemində istifadə edildi. Bu yeni metod gələcəkdə diaqnostik məqsədlər üçün biomarkerlərdə mövcud olan oliqosaxaridləri təcrid etmək və xarakterizə etmək üçün istifadə edilə bilən daha inkişaf etmiş yüksək ötürücülü qlikom analizlərinin hazırlanmasını asanlaşdıracaq.
Kənd təsərrüfatı, meşə təsərrüfatı, ot və oduncaq materiallarından ibarət olan liqnosellülozik biokütlə, daha yüksək dəyərli məhsullar istehsal etmək üçün qida, yem, yanacaq və kimyəvi prekursorlar da daxil olmaqla bioəsaslı məhsulların istehsalı üçün potensial xammaldır1. Bitki hüceyrə divarlarında mövcud olan karbohidratlar (məsələn, sellüloza və hemisellüloz) kimyəvi emal və biotransformasiya (məsələn, fermentativ hidroliz və mikrob fermentasiyası) yolu ilə monosaxaridlərə depolimerləşir. Ümumi ilkin emallara ammonyak lifinin genişlənməsi (AFEX), durulaşdırılmış turşu (DA), ion mayesi (IL) və buxar partlaması (SE) daxildir ki, bunlar bitki hüceyrə divarlarını açaraq liqnosellüloza istehsalını azaltmaq üçün kimyəvi maddələrin və istiliyin kombinasiyasından istifadə edir3,4. maddənin inadkarlığı, 5. Enzimatik hidroliz, kommersiya aktiv karbohidrat tərkibli fermentlər (CAZymes) və bioəsaslı yanacaq və kimyəvi maddələr istehsal etmək üçün transgen maya və ya bakteriyalardan istifadə edərək mikrob fermentasiyası istifadə edərək yüksək bərk maddələr yükündə həyata keçirilir6.
Kommersiya fermentlərindəki CAZimlər, monosaxaridlər əmələ gətirmək üçün mürəkkəb karbohidrat-şəkər əlaqələrini sinergetik şəkildə parçalayan fermentlərin mürəkkəb qarışığından ibarətdir2,7. Daha əvvəl bildirdiyimiz kimi, ligninin karbohidratlarla aromatik polimerlərinin mürəkkəb şəbəkəsi onları olduqca çətinləşdirir ki, bu da şəkərin natamam çevrilməsinə səbəb olur və əvvəlcədən işlənmiş biokütlənin fermentativ hidrolizi zamanı istehsal olunmayan cinsi oliqosaxaridlərin 15-25%-ni toplayır. Bu, müxtəlif biokütlənin əvvəlcədən təmizlənməsi üsulları ilə bağlı ümumi bir problemdir. Bu darboğazın bəzi səbəblərinə hidroliz zamanı ferment inhibisiyası və ya bitki biokütləsində şəkər əlaqələrini qırmaq üçün tələb olunan vacib vacib fermentlərin olmaması və ya aşağı səviyyədə olması daxildir. Oliqosaxaridlərdəki şəkər əlaqələri kimi şəkərlərin tərkibini və struktur xüsusiyyətlərini anlamaq, hidroliz zamanı şəkər çevrilməsini yaxşılaşdırmağa kömək edəcək və biotexnoloji prosesləri neftdən əldə edilən məhsullarla rəqabətədavamlı edəcək.
Karbohidratların strukturunu təyin etmək çətindir və maye xromatoqrafiyası (LC)11,12, nüvə maqnit rezonans spektroskopiyası (NMR)13, kapilyar elektroforez (CE)14,15,16 və kütlə spektrometriyası (MS)17 kimi metodların kombinasiyasını tələb edir. ,18. Lazer desorbsiyası və matris (MALDI-TOF-MS) istifadə edərək ionlaşma ilə uçuş vaxtı kütlə spektrometriyası kimi MS metodları karbohidrat strukturlarını müəyyən etmək üçün çox yönlü bir metoddur. Son zamanlarda, natrium ion adduktlarının Toqquşma ilə İnduksiya Edilmiş Dissosiasiya (CID) tandem MS-i oliqosaxarid birləşmə mövqelərinə, anomer konfiqurasiyalara, ardıcıllıqlara və budaqlanma mövqelərinə uyğun barmaq izlərini müəyyən etmək üçün ən geniş istifadə olunur 20, 21.
Glikan analizi karbohidrat bağlarının dərindən müəyyən edilməsi üçün əla vasitədir22. Bu metod, mürəkkəb karbohidrat bağlarını anlamaq üçün bitki hüceyrə divarı qlikanına yönəldilmiş monoklonal antikorlardan (mAbs) zond kimi istifadə edir. Müxtəlif saxaridlərdən istifadə edərək müxtəlif xətti və şaxələnmiş oliqosaxaridlərə qarşı hazırlanmış 250-dən çox mAbs dünyada mövcuddur24. Bitki hüceyrəsinin növündən, orqanından, yaşından, inkişaf mərhələsindən və böyümə mühitindən asılı olaraq əhəmiyyətli fərqlər olduğundan, bitki hüceyrə divarının quruluşunu, tərkibini və modifikasiyalarını xarakterizə etmək üçün bir neçə mAbs geniş istifadə edilmişdir25,26. Daha yaxınlarda bu metod bitki və heyvan sistemlərindəki vezikül populyasiyalarını və onların subhüceyrə markerləri, inkişaf mərhələləri və ya ətraf mühit stimulları ilə müəyyən edilən qlikan daşınmasındakı müvafiq rollarını anlamaq və fermentativ aktivliyi müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir. Müəyyən edilmiş qlikan və ksilanların müxtəlif strukturlarından bəzilərinə pektin (P), ksilan (X), mannan (M), ksiloglukanlar (XylG), qarışıq rabitə qlükanları (MLG), arabinoksilan (ArbX), qalaktomannan (GalG), qlükuron turşusu-arabinoksilan (GArbX) və arabino-qalaktan (ArbG)29 daxildir.
Lakin, bütün bu tədqiqat səylərinə baxmayaraq, yalnız bir neçə tədqiqat yüksək bərk maddələr yükü (HSL) hidrolizi zamanı oliqosaxaridlərin yığılmasının təbiətinə, o cümlədən oliqosaxaridin sərbəst buraxılmasına, hidroliz zamanı oliqomer zəncir uzunluğu dəyişikliklərinə, müxtəlif aşağı DP polimerlərinə və onların əyrilərinə yönəlmişdir. paylanmalar 30,31,32. Bununla yanaşı, qlikan analizinin qlikan strukturunun hərtərəfli təhlili üçün faydalı bir vasitə olduğu sübut olunsa da, antikor metodlarından istifadə edərək suda həll olan aşağı DP oliqosaxaridlərini qiymətləndirmək çətindir. Molekulyar çəkisi 5-10 kDa-dan az olan daha kiçik DP oliqosaxaridləri ELISA lövhələrinə 33, 34 bağlanmır və antikor əlavə edilməzdən əvvəl yuyulur.
Burada ilk dəfə olaraq, həll olan odadavamlı oliqosaxaridlər üçün bir mərhələli biotinilləşmə prosedurunu qlikom analizi ilə birləşdirən monoklonal antikorlardan istifadə edərək avidinlə örtülmüş lövhələr üzərində ELISA analizini nümayiş etdiririk. Qlikom analizinə yanaşmamız hidroliz olunmuş şəkər tərkiblərinin trimetilsilil (TMS) törəməsindən istifadə edərək tamamlayıcı oliqosaxarid əlaqələrinin MALDI-TOF-MS və GC-MS əsaslı təhlili ilə təsdiqləndi. Bu innovativ yanaşma gələcəkdə yüksək məhsuldarlıqlı bir metod kimi inkişaf etdirilə və biotibbi tədqiqatlarda daha geniş tətbiq tapıla bilər35.
Fermentlərin və antikorların qlikozilləşmə kimi translyasiya sonrası modifikasiyaları36 onların bioloji aktivliyinə təsir göstərir. Məsələn, serum zülallarının qlikozilləşməsindəki dəyişikliklər iltihabi artritdə mühüm rol oynayır və qlikozilləşmədəki dəyişikliklər diaqnostik markerlər kimi istifadə olunur37. Ədəbiyyatda müxtəlif qlikanların mədə-bağırsaq traktının və qaraciyərin xroniki iltihabi xəstəlikləri, virus infeksiyaları, yumurtalıq, döş və prostat xərçəngi də daxil olmaqla müxtəlif xəstəliklərdə asanlıqla göründüyü bildirilir38,39,40. Antikor əsaslı qlikan ELISA metodlarından istifadə edərək qlikanların quruluşunu anlamaq mürəkkəb MS metodlarından istifadə etmədən xəstəliyin diaqnozunda əlavə inam yaradacaq.
Əvvəlki tədqiqatımız göstərdi ki, inadkar oliqosaxaridlər əvvəlcədən emal və fermentativ hidrolizdən sonra hidrolizlənməmiş qalır (Şəkil 1). Əvvəllər dərc olunmuş işimizdə AFEX ilə əvvəlcədən emal olunmuş qarğıdalı soba hidrolizatından (ACSH)8 oliqosaxaridləri təcrid etmək üçün aktivləşdirilmiş kömür bərk fazalı ekstraksiya metodu hazırladıq. İlkin ekstraksiya və ayrılmadan sonra oliqosaxaridlər ölçü xaricetmə xromatoqrafiyası (SEC) ilə daha da fraksiyalaşdırıldı və molekulyar çəki sırası ilə toplandı. Müxtəlif əvvəlcədən emaldan ayrılan şəkər monomerləri və oliqomerler şəkər tərkibi təhlili ilə təhlil edildi. Müxtəlif əvvəlcədən emal üsulları ilə əldə edilən şəkər oliqomerlərinin tərkibini müqayisə edərkən, inadkar oliqosaxaridlərin olması biokütlənin monosaxaridlərə çevrilməsində ümumi bir problemdir və şəkər məhsuldarlığının ən azı 10-15% və hətta 18% -ə qədər azalmasına səbəb ola bilər. ABŞ. Bu metod oliqosaxarid fraksiyalarının daha geniş miqyaslı istehsalı üçün istifadə olunur. Bu işdə oliqosaxaridlərin xarakteristikası üçün eksperimental material kimi nəticədə yaranan ACH və onun sonrakı müxtəlif molekulyar çəkilərə malik fraksiyaları istifadə edilmişdir.
İlkin emal və fermentativ hidrolizdən sonra davamlı oliqosaxaridlər hidrolizlənməmiş qaldı. Burada (A) aktivləşdirilmiş karbon və diatomlu torpaqdan ibarət dolu bir təbəqə istifadə edərək AFEX ilə əvvəlcədən işlənmiş qarğıdalı sobası hidrolizatından (ACSH) oliqosaxaridlərin ayrıldığı oliqosaxarid ayırma üsuludur; (B) Oliqosaxaridlərin ayrılması üsulu. Oliqosaxaridlər ölçü istisna xromatoqrafiyası (SEC) ilə daha da ayrıldı; (C) Müxtəlif ilkin emallardan (seyreltilmiş turşu: DA, ion mayesi: IL və AFEX) ayrılan saxarid monomerləri və oliqomerləri. Enzimatik hidroliz şərtləri: 25% (ç/ç) yüksək bərk maddələrin yüklənməsi (təxminən 8% qlükan yüklənməsi), 96 saatlıq hidroliz, 20 mq/q kommersiya ferment yüklənməsi (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 nisbəti) və (D) AFEX əvvəlcədən işlənmiş qarğıdalı sobasından (ACS) ayrılan qlükoza, ksiloza və arabinozun şəkər monomerləri və oliqomerləri.
Qlikan analizi bərk biokütlə qalıqlarından təcrid olunmuş ekstraktlardakı qlikanların hərtərəfli struktur təhlili üçün faydalı bir vasitə olduğunu sübut etmişdir. Lakin, suda həll olan saxaridlər bu ənənəvi metoddan istifadə etməklə az təmsil olunur41, çünki aşağı molekulyar çəkili oliqosaxaridlərin ELISA lövhələrində immobilizasiyası çətindir və antikor əlavə edilməzdən əvvəl yuyulur. Buna görə də, antikor bağlanması və xarakteristikası üçün avidinlə örtülmüş ELISA lövhələrində həll olan, uyğun olmayan oliqosaxaridləri örtmək üçün bir mərhələli biotinilləşmə metodundan istifadə edilmişdir. Bu metod əvvəllər istehsal etdiyimiz ACSH və onun molekulyar çəkisinə (və ya polimerləşmə dərəcəsinə, DP) əsaslanan bir fraksiya istifadə edilərək sınaqdan keçirilmişdir. Karbohidratın reduksiyaedici ucuna biotin-LC-hidrazid əlavə etməklə oliqosaxarid bağlanma affinliyini artırmaq üçün bir mərhələli biotinilləşmə istifadə edilmişdir (Şəkil 2). Məhlulda reduksiyaedici ucundakı hemiasetal qrup biotin-LC-hidrazidin hidrazid qrupu ilə reaksiyaya girərək hidrazon rabitəsi əmələ gətirir. Reduksiyaedici NaCNBH3-ün iştirakı ilə hidrazon rabitəsi sabit biotinləşdirilmiş son məhsula qədər reduksiya olunur. Şəkər reduksiyaedici ucun modifikasiyası ilə aşağı DP oliqosaxaridlərinin ELISA lövhələrinə bağlanması mümkün oldu və bizim tədqiqatımızda bu, qlikan hədəflənmiş mAbs istifadə edərək avidinlə örtülmüş lövhələrdə aparıldı.
Biotinləşdirilmiş oliqosaxaridlər üçün ELISA əsasında monoklonal antikorların skrininqi. Burada (A) oliqosaxaridlərin birləşdirilmiş biotinilləşməsi və sonrakı NeutrAvidin örtüklü lövhələrdə qlikan hədəflənmiş mAbs ilə ELISA skrininqi və (B) reaksiya məhsullarının biotinilləşməsi üçün bir mərhələli prosedur göstərilir.
Oliqosaxaridlə birləşmiş antikorları olan avidinlə örtülmüş lövhələr daha sonra birincili və ikincili antikorlara əlavə edildi və işığa və zamana həssas mühitdə yuyuldu. Antikor bağlanması tamamlandıqdan sonra lövhəni inkubasiya etmək üçün TMB substratı əlavə edin. Reaksiya nəhayət sulfat turşusu ilə dayandırıldı. İnkubasiya edilmiş lövhələr, antikorlara xas çarpaz əlaqəni aşkar etmək üçün hər bir antikorun bağlanma gücünü təyin etmək məqsədilə ELISA oxuyucusu istifadə edilərək təhlil edildi. Təcrübənin təfərrüatları və parametrləri üçün müvafiq "Materiallar və Metodlar" bölməsinə baxın.
Biz ACSH-də, eləcə də liqnosellülozik hidrolizatlardan təcrid olunmuş xam və təmizlənmiş oliqosaxarid fraksiyalarında mövcud olan həll olan oliqosaxaridləri xarakterizə etməklə bu yeni hazırlanmış metodun spesifik tətbiqlər üçün faydalılığını nümayiş etdiririk. Şəkil 3-də göstərildiyi kimi, bioasilləşdirilmiş qlikom analiz metodlarından istifadə edərək ACSH-də müəyyən edilən ən çox yayılmış epitop əvəzedici ksilanlar adətən uron (U) və ya metiluron (MeU) və pektik arabinoqalaktanlardır. Onların əksəriyyəti hidroliz olunmamış bərk maddələrin (UHS) qlikanlarının təhlili ilə bağlı əvvəlki tədqiqatımızda da aşkar edilmişdir43.
Hüceyrə divarı qlikanına yönəldilmiş monoklonal antikor istifadə edərək itaətsiz oliqosaxarid epitoplarının aşkarlanması. "Neytral" fraksiya ACN fraksiyası, "turşu" fraksiya isə FA fraksiyasıdır. İstilik xəritəsində daha parlaq qırmızılar daha yüksək epitop tərkibini, daha parlaq mavilər isə boş fonu göstərir. Şkaladakı rəng dəyərləri N=2 formulaları üçün xam OD dəyərlərinə əsaslanır. Antikorlar tərəfindən tanınan əsas epitoplar sağda göstərilib.
Bu qeyri-sellüloza strukturları, ən çox istifadə edilən kommersiya fermentlərini də əhatə edən sınaqdan keçirilmiş kommersiya ferment qarışığındakı ən çox yayılmış sellülazalar və hemisellülazalar tərəfindən parçalana bilmədi. Buna görə də, onların hidrolizi üçün yeni köməkçi fermentlər tələb olunur. Lazımi qeyri-sellüloza köməkçi fermentlər olmadan, bu qeyri-sellüloza bağları, ana şəkər polimerləri daha qısa fraqmentlərə geniş şəkildə hidroliz edilsə və kommersiya ferment qarışıqları istifadə edilərək həll edilsə belə, monosaxaridlərə tam çevrilmənin qarşısını alır.
Siqnal paylanmasının və onun bağlanma gücünün daha dərindən öyrənilməsi göstərdi ki, bağlanma epitopları yüksək DP şəkər fraksiyalarında (A, B, C, DP 20+-ə qədər) aşağı DP fraksiyalarına (D, E, F, DP) nisbətən dimerlərdə daha aşağı idi (Şəkil 1). Turşu fraqmentləri neytral fraqmentlərə nisbətən qeyri-sellüloza epitoplarında daha çox rast gəlinir. Bu hadisələr əvvəlki tədqiqatımızda müşahidə olunan modelə uyğundur, burada yüksək DP və turşu hissələri fermentativ hidrolizə daha davamlı idi. Buna görə də, qeyri-sellüloza qlikan epitoplarının və U və MeU əvəzetmələrinin olması oliqosaxaridlərin sabitliyinə böyük töhfə verə bilər. Qeyd etmək lazımdır ki, bağlanma və aşkarlama səmərəliliyi aşağı DP oliqosaxaridləri üçün problemli ola bilər, xüsusən də epitop dimer və ya trimer oliqosaxariddirsə. Bu, hər biri müəyyən bir mAb-a bağlanan yalnız bir epitop ehtiva edən müxtəlif uzunluqlu kommersiya oliqosaxaridləri istifadə edilərək sınaqdan keçirilə bilər.
Beləliklə, struktur-spesifik antikorların istifadəsi müəyyən növ itaətsiz əlaqələri aşkar etdi. İstifadə olunan antikor növündən, müvafiq ligasyon modelindən və yaratdığı siqnalın gücündən (ən çox və ən az bol) asılı olaraq, yeni fermentlər müəyyən edilə və daha tam qlikokonversiya üçün ferment qarışığına yarı-kəmiyyətli şəkildə əlavə edilə bilər. ACSH oliqosaxaridlərinin təhlilini nümunə olaraq götürərək, hər bir biokütlə materialı üçün qlikan əlaqələri verilənlər bazası yarada bilərik. Burada qeyd etmək lazımdır ki, antikorların fərqli yaxınlığı nəzərə alınmalıdır və onların yaxınlığı məlum deyilsə, bu, müxtəlif antikorların siqnallarını müqayisə edərkən müəyyən çətinliklər yaradacaq. Bundan əlavə, qlikan əlaqələrinin müqayisəsi eyni antikor üçün nümunələr arasında ən yaxşı şəkildə işləyə bilər. Daha sonra bu inadkar əlaqələr CAZyme verilənlər bazasına bağlana bilər ki, oradan fermentləri müəyyən edə, namizəd fermentləri seçə və əlaqəni pozan fermentləri sınaqdan keçirə və ya biorefinery zavodlarında istifadə üçün bu fermentləri ifadə etmək üçün mikrob sistemləri inkişaf etdirə bilərik44.
Liqnosellülozik hidrolizatlarda mövcud olan aşağı molekulyar çəkili oliqosaxaridləri xarakterizə etmək üçün immunoloji metodların alternativ metodları necə tamamladığını qiymətləndirmək üçün eyni paneldə (Şəkil 5) GC-MS əsasında TMS-dən əldə edilən saxaridlərin MALDI (Şəkil 4, S1-S8) və analizini apardıq. MALDI, oliqosaxarid molekullarının kütlə paylanmasının nəzərdə tutulan quruluşa uyğun olub-olmadığını müqayisə etmək üçün istifadə olunur. Şəkil 4-də neytral komponentlər olan ACN-A və ACN-B-nin MS-i göstərilir. ACN-A analizi, çəkiləri MeU-ksilan oliqosaxaridlərinə uyğun gələn DP 4-8 (Şəkil 4) ilə DP 22 (Şəkil S1) arasında dəyişən pentoza şəkərlərinin diapazonunu təsdiqlədi. ACN-B analizi, DP 8-15 ilə pentoza və qlükoksilan seriyasını təsdiqlədi. Şəkil S3 kimi əlavə materiallarda, FA-C turşu hissəcik kütlə paylanma xəritələri, ELISA əsaslı mAb müayinəsində tapılan əvəzlənmiş ksilanlarla uyğun gələn DP 8-15 olan bir sıra (Me)U əvəzlənmiş pentoza şəkərlərini göstərir. Epitoplar uyğundur.
ACS-də mövcud olan həll olan uyğun olmayan oliqosaxaridlərin MALDI-MS spektri. Burada, (A) metilləşdirilmiş uron turşusu (DP 4-8) əvəzedici qlükuroksilan oliqosaxaridləri olan ACN-A aşağı çəki diapazonlu fraksiyaları və (B) qlükuroksilanla əvəzedici ACN-B ksilan və metilləşdirilmiş uron turşusu oliqosaxaridləri (DP 8-15).
Odadavamlı oliqosaxaridlərin qlikan qalığının tərkibinin təhlili. Burada (A) GC-MS analizi istifadə edilərək əldə edilən müxtəlif oliqosaxarid fraksiyalarının TMS saxarid tərkibi. (B) Oliqosaxaridlərdə mövcud olan müxtəlif TMS-dən əldə edilən şəkərlərin strukturları. ACN – neytral oliqosaxaridləri ehtiva edən asetonitril fraksiyası və FA – turşu oliqosaxaridləri ehtiva edən ferul turşusu fraksiyası.
Şəkil S9-da göstərildiyi kimi (metodlara elektron əlavə materialda baxmaq olar) oliqosaxarid fraksiyasının LC-MS analizindən başqa bir maraqlı nəticə çıxarıldı. ACN-B fraksiyasının bağlanması zamanı heksoza və -OAc qruplarının fraqmentləri dəfələrlə müşahidə edildi. Bu tapıntı yalnız qlikom və MALDI-TOF analizində müşahidə edilən fraqmentasiyanı təsdiqləmir, həm də əvvəlcədən işlənmiş liqnosellülozik biokütlədəki potensial karbohidrat törəmələri haqqında yeni məlumatlar verir.
Biz həmçinin TMS qlikan törəməsindən istifadə edərək oliqosaxarid fraksiyalarının qlikan tərkibinin təhlilini apardıq. GC-MS istifadə edərək, oliqosaxarid fraksiyasında sinir (qeyri-törəmə) və turşu şəkərlərinin (GluA və GalA) tərkibini təyin etdik (Şəkil 5). Qlükuron turşusu C və D turşu komponentlərində, qalakturon turşusu isə turşu şəkərlərinin yüksək DP komponentləri olan A və B turşu komponentlərində olur. Bu nəticələr yalnız ELISA və MALDI məlumatlarımızı təsdiqləmir, həm də oliqosaxaridlərin yığılması ilə bağlı əvvəlki tədqiqatlarımızla uyğun gəlir. Buna görə də, inanırıq ki, oliqosaxaridlərin biotinilləşdirilməsindən və sonrakı ELISA müayinəsindən istifadə edən müasir immunoloji metodlar müxtəlif bioloji nümunələrdə həll olan rezistent oliqosaxaridləri aşkar etmək üçün kifayətdir.
ELISA əsaslı mAb skrininq metodları bir neçə fərqli metodla təsdiqləndiyindən, bu yeni kəmiyyət metodunun potensialını daha da araşdırmaq istədik. İki kommersiya oliqosaxaridi, ksiloheksasaxarid oliqosaxaridi (XHE) və 23-α-L-arabinofuranosil-ksilotrioza (A2XX) alındı ​​və hüceyrə divarı qlikanını hədəf alan yeni mAb yanaşması istifadə edilərək sınaqdan keçirildi. Şəkil 6-da biotinləşdirilmiş bağlanma siqnalı ilə oliqosaxarid konsentrasiyası arasında xətti korrelyasiya göstərilir ki, bu da mümkün Langmuir adsorbsiya modelini göstərir. mAbs arasında CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 və CCRC-M151 XHE ilə, CCRC-M108, CCRC-M109 və LM11 isə 1 nm-dən 100 nano-ya qədər diapazonda A2XX ilə korrelyasiya etdi. Təcrübə zamanı antikorların məhdud mövcudluğu səbəbindən hər bir oliqosaxarid konsentrasiyası ilə məhdud təcrübələr aparılmışdır. Burada qeyd etmək lazımdır ki, bəzi antikorlar substrat kimi eyni oliqosaxaridə çox fərqli reaksiya verirlər, çünki ehtimal ki, onlar bir qədər fərqli epitoplara bağlanır və çox fərqli bağlanma yaxınlığına malik ola bilərlər. Yeni mAb yanaşması real nümunələrə tətbiq edildikdə epitopun dəqiq müəyyənləşdirilməsinin mexanizmləri və nəticələri daha mürəkkəb olacaq.
Müxtəlif qlikan hədəf alan mAbs-ların aşkarlama diapazonunu təyin etmək üçün iki kommersiya oliqosaxaridindən istifadə edilmişdir. Burada oliqosaxarid konsentrasiyasının loqarifmik konsentrasiyası ilə xətti korrelyasiyalar (A) mAb ilə XHE və (B) mAb ilə A2XX üçün Langmuir adsorbsiya nümunələrini göstərir. Müvafiq epitoplar analizdə substrat kimi istifadə edilən kommersiya oliqosaxaridlərinin strukturlarını göstərir.
Qlikan hədəflənmiş monoklonal antikorların istifadəsi (qlikokomik analiz və ya ELISA əsaslı mAb skrininqi) bitki biokütləsini təşkil edən əsas hüceyrə divarı qlikanlarının əksəriyyətinin dərin xarakteristikası üçün güclü bir vasitədir. Lakin, klassik qlikan analizi yalnız daha böyük hüceyrə divarı qlikanlarını xarakterizə edir, çünki əksər oliqosaxaridlər ELISA lövhələrində effektiv şəkildə immobilizasiya olunmur. Bu tədqiqatda AFEX ilə əvvəlcədən işlənmiş qarğıdalı sobası yüksək bərk maddələr tərkibində fermentativ şəkildə hidrolizə edilmişdir. Hidrolizatdakı itaətsiz hüceyrə divarı karbohidratlarının tərkibini təyin etmək üçün şəkər analizindən istifadə edilmişdir. Lakin, hidrolizatlardakı daha kiçik oliqosaxaridlərin mAb analizi az qiymətləndirilir və ELISA lövhələrində oliqosaxaridləri effektiv şəkildə immobilizasiya etmək üçün əlavə vasitələrə ehtiyac var.
Burada NeutrAvidin™ örtüklü lövhələrdə oliqosaxarid biotinilləşməsi və ardından ELISA müayinəsinin birləşdirilməsi ilə mAb müayinəsi üçün yeni və səmərəli oliqosaxarid immobilizasiya metodunu təqdim edirik. İmmobilizasiya olunmuş biotinilləşdirilmiş oliqosaxaridlər, antikor üçün kifayət qədər yaxınlıq göstərərək, itaətsiz oliqosaxaridlərin sürətli və səmərəli şəkildə aşkarlanmasına imkan yaratdı. Kütlə spektrometriyasına əsaslanan bu inadkar oliqosaxaridlərin tərkibinin təhlili immunskrinq üçün bu yeni yanaşmanın nəticələrini təsdiqlədi. Beləliklə, bu tədqiqatlar göstərir ki, oliqosaxarid biotinilləşməsi və ELISA müayinəsinin qlikan hədəflənmiş monoklonal antikorlarla kombinasiyası oliqosaxaridlərdə çarpaz əlaqələri aşkar etmək üçün istifadə edilə bilər və oliqosaxaridlərin quruluşunu xarakterizə edən digər biokimyəvi tədqiqatlarda geniş tətbiq oluna bilər.
Bu biotinə əsaslanan qlikan profilləmə metodu, bitki biokütləsində həll olan oliqosaxaridlərin itaətsiz karbohidrat bağlarını araşdıra bilən ilk hesabatdır. Bu, bioyanacaq istehsalına gəldikdə biokütlənin bəzi hissələrinin niyə bu qədər inadkar olduğunu anlamağa kömək edir. Bu metod qlikom analiz metodlarında mühüm bir boşluğu doldurur və tətbiqini bitki oliqosaxaridlərindən kənarda daha geniş substratlara genişləndirir. Gələcəkdə biotinilləşmə üçün robototexnikadan istifadə edə və ELISA istifadə edərək nümunələrin yüksək məhsuldarlıqlı təhlili üçün hazırladığımız metoddan istifadə edə bilərik.
Pioneer 33A14 hibrid toxumlarından yetişdirilən qarğıdalı samanı (KS) 2010-cu ildə Kolorado ştatının Rey şəhərindəki Kramer Farms-dan yığılmışdır. Torpaq sahibinin icazəsi ilə bu biokütlə tədqiqat üçün istifadə edilə bilər. Nümunələr otaq temperaturunda fermuarlı torbalarda quru və 6%-dən az nəmlik şəraitində saxlanılmışdır. Nümunələr otaq temperaturunda fermuarlı torbalarda quru və 6%-dən az nəmlik şəraitində saxlanılmışdır. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае. Nümunələr otaq temperaturunda fermuarlı torbalarda <6% rütubətdə quru saxlanılmışdır.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае с влажностью < 6%. Nümunələr fermuarlı torbalarda otaq temperaturunda və rütubət < 6% olan yerdə saxlanılır.Tədqiqat yerli və milli qaydalara uyğun idi. Tərkib təhlili NREL protokolundan istifadə etməklə aparılmışdır. Tərkibdə 31,4% qlükan, 18,7% ksilan, 3,3% arabinan, 1,2% qalaktan, 2,2% asetil, 14,3% liqnin, 1,7% protein və 13,4% kül olduğu aşkar edilmişdir.
Cellic® CTec2 (138 mq protein/ml, partiya VCNI 0001), Novozymes (Franklinton, NC, ABŞ) şirkətindən alınan sellülaza, β-qlükozidaza və Cellic® HTec2 (157 mq protein/ml, partiya VHN00001) kompleks qarışığıdır. Pektini parçalayan fermentlərin kompleks qarışığı olan Multifect Pectinase® (72 mq protein/ml), DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ABŞ) tərəfindən bağışlanmışdır. Ferment zülal konsentrasiyaları Kjeldahl azot analizindən (AOAC metodu 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ABŞ) istifadə edərək zülal tərkibini qiymətləndirməklə (və zülal olmayan azotun töhfəsini çıxmaqla) müəyyən edilmişdir. Diatomaceous earth 545 EMD Millipore (Billerica, MA) şirkətindən alınmışdır. Aktivləşdirilmiş karbon (DARCO, 100 mesh qranullar), Avicel (PH-101), fıstıq ksilanı və bütün digər kimyəvi maddələr Sigma-Aldrich-dən (Sent-Luis, MO) alınıb.
AFEX əvvəlcədən emal GLBRC-də (Biokütlə Çevrilmə Tədqiqat Laboratoriyası, MSU, Lansing, MI, ABŞ) aparılmışdır. Əvvəlcədən emal 140°C-də 15 dəqiqə ərzində aparılmışdır. 46 dəqiqə ərzində paslanmayan poladdan hazırlanmış tezgah reaktorunda (Parr Instruments Company) 60% (ç/ç) yüklənmə ilə susuz ammonyakın biokütləyə 1:1 nisbətində qalma müddəti. Bu, 30 dəqiqə çəkdi. Reaktor 140°C-yə gətirildi və ammonyak sürətlə buraxıldı və bu da biokütlənin tez bir zamanda otaq temperaturuna qayıtmasına imkan verdi. AFEX əvvəlcədən emal edilmiş qarğıdalı sobasının (ACS) tərkibi emal edilməmiş qarğıdalı sobasının (UT-CS) tərkibinə bənzəyirdi.
Oliqosaxaridlərin genişmiqyaslı istehsalı üçün başlanğıc material kimi yüksək bərk maddələr olan ACSH 25% (ç/ç) (təxminən 8% dekstran yükü) hazırlanmışdır. ACS-in fermentativ hidrolizi Cellic® Ctec2 10 mq protein/q qlükan (əvvəlcədən işlənmiş biokütlədə), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mq protein/q qlükan və Multifect Pectinase (Genencor Inc, ABŞ) daxil olmaqla kommersiya ferment qarışığı istifadə edilərək həyata keçirilmişdir. Enzimatik hidroliz, iş həcmi 3 litr, pH 4.8, 50°C və 250 dövr/dəq olan 5 litrlik bioreaktorda aparılmışdır. 96 saat hidrolizdən sonra hidrolizat hidroliz olunmamış bərk maddələri çıxarmaq üçün 30 dəqiqə ərzində 6000 dövr/dəq-də, sonra isə 30 dəqiqə ərzində 14000 dövr/dəq-də santrifüqləmə yolu ilə toplanmışdır. Daha sonra hidrolizat 0,22 mm-lik filtr stəkanı vasitəsilə steril filtrasiyaya məruz qaldı. Süzülmüş hidrolizat steril şüşələrdə 4°C-də saxlanıldı və sonra karbon üzərində fraksiyalaşdırıldı.
NREL laboratoriya analiz prosedurlarına uyğun olaraq ekstrakt əsaslı biokütlə nümunələrinin tərkibinin təhlili: tərkib təhlili üçün nümunələrin hazırlanması (NREL/TP-510-42620) və biokütlədə struktur karbohidratların və liqninin təyini (NREL/TP-510 – 42618)47.
Hidrolizat axınının oliqosaxarid analizi avtoklav əsaslı turşu hidroliz metodundan istifadə edərək 2 ml miqyasda aparılmışdır. Hidrolizat nümunəsini 10 ml-lik vintli qapaqlı kulturasiya borusunda 69,7 µl 72% sulfat turşusu ilə qarışdırın və 121 °C-də masaüstündə 1 saat inkubasiya edin, buz üzərində soyudun və yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası (HPLC) flakonuna süzün. Oliqosaxaridlərin konsentrasiyası, hidroliz olunmamış nümunədəki monosaxaridlərin konsentrasiyasını turşu-hidroliz olunmuş nümunədəki ümumi şəkər konsentrasiyasından çıxmaqla müəyyən edilmişdir.
Turşu hidrolizə olunmuş biokütlədəki qlükoza, ksiloza və arabinoza konsentrasiyaları Bio-Rad Aminex HPX-87H sütununda avtonümunə götürən, sütun qızdırıcısı, izokratik nasos və refraktiv əmsal detektoru ilə təchiz olunmuş Shimadzu HPLC sistemi istifadə edilərək təhlil edilmişdir. Sütun 50°C-də saxlanılmış və 0,6 ml/dəq 5 mM H2SO4 su axını ilə elusiya edilmişdir.
Hidrolizat supernatantı durulaşdırılıb monomer və oliqosaxarid tərkibinə görə təhlil edilib. Fermentativ hidrolizdən sonra əldə edilən monomer şəkərlər Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P sütunu və kül qoruyucu sütunu ilə təchiz olunmuş HPLC vasitəsilə təhlil edilib. Sütunun temperaturu 80°C-də saxlanılıb, su 0,6 ml/dəq axın sürəti ilə mobil faza kimi istifadə edilib. Oliqosaxaridlər 41, 48, 49-cu istinadlarda təsvir edilən üsullara uyğun olaraq 121°C-də durulaşdırılmış turşuda hidroliz yolu ilə təyin edilib.
Saxarid analizi əvvəllər təsvir edilmiş prosedurlar 27, 43, 50, 51 istifadə edilərək xam, AFEX əvvəlcədən işlənmiş və bütün hidroliz olunmamış biokütlə qalıqları (seriyalı hüceyrə divarı ekstraktlarının istehsalı və onların mAb skrininqi daxil olmaqla) üzərində aparılmışdır. Qlikom analizi üçün bitki hüceyrə divarı materialının spirtdə həll olmayan qalıqları biokütlə qalıqlarından hazırlanır və əvvəllər təsvir edildiyi kimi ammonium oksalat (50 mM), natrium karbonat (50 mM və 0,5% w/v), CON (1M və 4M, hər ikisi 1% w/v natrium borohidrid ilə) və turşu xlorit kimi getdikcə aqressivləşən reagentlərlə seriyalı ekstraksiyaya məruz qalır52,53. Daha sonra ekstraktlar hüceyrə divarı qlikanına yönəldilmiş mAb50-lərin kompleks panelinə qarşı ELISA-ya məruz qaldı və mAb bağlanma reaksiyaları istilik xəritəsi kimi təqdim edildi. Bitki hüceyrə divarı qlikanını hədəf alan mAb-lar laboratoriya ehtiyatlarından (CCRC, JIM və MAC seriyaları) alındı.
Oliqosaxaridlərin bir mərhələli biotinilləşməsi. Karbohidratların biotin-LC-hidrazidlə konjugasiyası aşağıdakı prosedurdan istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. Biotin-LC-hidrazid (4,6 mq/12 μmol) dimetil sulfoksiddə (DMSO, 70 μl) güclü qarışdırma və 65°C-də 1 dəqiqə qızdırmaqla həll edilmişdir. Buzlaq sirkə turşusu (30 μl) əlavə edilmiş və qarışıq natrium siyanoborohidridin (6,4 mq/100 μmol) üzərinə tökülmüş və təxminən 65°C-də qızdırıldıqdan sonra tamamilə həll edilmişdir. Daha sonra, etiketin reduksiya ucu üzərində 10 qat və ya daha çox molar artıqlığı əldə etmək üçün qurudulmuş oliqosaxaridə (1-100 nmol) reaksiya qarışığının 5-dən 8 μl-ə qədəri əlavə edilmişdir. Reaksiya 65°C-də 2 saat ərzində aparılmış, bundan sonra nümunələr dərhal təmizlənmişdir. Etiketləmə təcrübələrində reduksiyasız natrium siyanoborohidrid istifadə edilmədi və nümunələr 65°C-də 2,5 saat ərzində reaksiyaya girdi.
Biotinləşdirilmiş oliqosaxarid nümunələrinin ELISA ilə örtülməsi və yuyulması. Avidinlə örtülmüş lövhənin hər quyusuna 25 μl biotinləşdirilmiş nümunələr (hər konsentrat nümunədən 100 μl 5 ml 0,1 M Tris bufer məhlulunda (TBS) durulaşdırılıb) əlavə edildi. Nəzarət quyuları 0,1 M TBS-də 10 μq/ml konsentrasiyasında 50 μl biotin ilə örtüldü. Boş ölçmələr üçün örtük kimi deionlaşdırılmış su istifadə edildi. Tablet otaq temperaturunda qaranlıqda 2 saat inkubasiya edildi. Grenier flat 3A üçün 11 nömrəli proqramdan istifadə edərək lövhəni 0,1 M TBS-də 0,1% yağsız südlə 3 dəfə yuyun.
İlkin antikorların əlavə edilməsi və yuyulması. Hər quyuya 40 µl ilkin antikor əlavə edin. Mikroplitəni otaq temperaturunda qaranlıqda 1 saat inkubasiya edin. Daha sonra plitələr Grenier Flat 3A üçün 11 nömrəli yuma proqramından istifadə edərək 0,1% süd ilə 0,1 M TBS-də 3 dəfə yuyuldu.
İkinci dərəcəli antikor əlavə edin və yuyun. Hər quyuya 50 µl siçan/siçovul ikinci dərəcəli antikoru (0,1 M TBS-də 0,1% süddə 1:5000 nisbətində durulaşdırılmış) əlavə edin. Mikroplitəni otaq temperaturunda qaranlıqda 1 saat inkubasiya edin. Daha sonra mikroplitələri 0,1% süddə 0,1 M TBS-də 5 dəfə yuyun.
Substrat əlavə olunur. Əsas substrata 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) əlavə edin (15 ml deionlaşdırılmış suya 2 damcı bufer, 3 damcı TMB, 2 damcı hidrogen peroksid əlavə etməklə). TMB substratını hazırlayın. İstifadədən əvvəl qarışdırın. Mikroplitəni otaq temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiya edin. Qaranlıqda.
Addımı tamamlayın və tableti oxuyun. Hər quyuya 50 µl 1 N sulfat turşusu əlavə edin və ELISA oxuyucusundan istifadə edərək 450-dən 655 nm-ə qədər absorbsiyanı qeyd edin.
Bu analitlərin deionlaşdırılmış suda 1 mq/ml məhlullarını hazırlayın: arabinoza, ramnoza, fukoza, ksiloza, qalakturon turşusu (GalA), qlükuron turşusu (GlcA), mannoza, qlükoza, qalaktoza, laktoza, N-asetilmannozamin (manNAc), N-asetilqlükozamin. (glcNAc), N-asetilqalaktozamin (galNAc), inozitol (daxili standart). Cədvəl 1-də göstərilən 1 mq/ml şəkər məhlulları əlavə edilməklə iki standart hazırlanmışdır. Nümunələr bütün su çıxarılana qədər (adətən təxminən 12-18 saat) -80°C-də dondurulur və liyofilizasiya edilir.
Analitik tərəzidə qapaqlı boruları vintləmək üçün 100–500 µq nümunə əlavə edin. Əlavə edilən miqdarı qeyd edin. Nümunəni müəyyən bir həlledici konsentrasiyasında həll edib maye alikvot kimi boruya əlavə etmək ən yaxşısıdır. Hər nümunə borusu üçün daxili standart kimi 20 µl 1 mq/ml inozitol istifadə edin. Nümunəyə əlavə edilən daxili standartın miqdarı standart boruya əlavə edilən daxili standartın miqdarı ilə eyni olmalıdır.
Vida qapağı olan flakona 8 ml susuz metanol əlavə edin. Sonra 4 ml 3 N metanollu HCl məhlulu əlavə edin, qapaqla bağlayın və çalxalayın. Bu proses su istifadə etmir.
Oliqosaxarid nümunələrinə və standart TMS borularına 500 µl 1 M HCl metanol məhlulu əlavə edin. Nümunələr bir gecədə (168 saat) 80°C-də termal blokda inkubasiya edildi. Metanoliz məhsulunu qurutma manifoldu istifadə edərək otaq temperaturunda qurudun. 200 µl MeOH əlavə edin və yenidən qurudun. Bu proses iki dəfə təkrarlanır. Nümunəyə 200 µl metanol, 100 µl piridin və 100 µl sirkə anhidridi əlavə edin və yaxşıca qarışdırın. Nümunələri otaq temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiya edin və qurudun. 200 µl metanol əlavə edin və yenidən qurudun.
200 µl Tri-Sil əlavə edin və qapaqlı boruda 20 dəqiqə 80°C-də qızdırın, sonra otaq temperaturuna qədər soyudun. Nümunəni təxminən 50 µl həcmə qədər qurutmaq üçün qurutma manifoldundan istifadə edin. Qeyd etmək vacibdir ki, nümunələrin tamamilə qurumasına icazə vermədik.
2 ml heksan əlavə edin və vorteks edərək yaxşıca qarışdırın. Pasteur pipetlərinin (5-8 mm) uclarını şüşə yun parçası ilə doldurun, şüşə yununu 5-3/4 düym diametrli pipetin üzərinə qoyun. Nümunələr 3000 q-da 2 dəqiqə ərzində santrifüj edildi. Həll olmayan qalıqlar çökdürülür. Nümunəni 100-150 µl-ə qədər qurudun. Təxminən 1 µl həcmdə maye GC-MS-ə 80 °C ilkin temperaturda və 2,0 dəqiqə ilkin vaxtda vuruldu (Cədvəl 2).