Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v aplikaci Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Mezitím budeme web vykreslovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Nové imunologické a hmotnostní spektrometrické metody pro komplexní analýzu perzistentních oligosacharidů v kukuřičných stéblech předem ošetřených AFEX. Lignocelulózová biomasa je udržitelnou alternativou k fosilním palivům a široce se používá k vývoji biotechnologií pro výrobu produktů, jako jsou potraviny, krmiva, paliva a chemikálie. Klíčem k těmto technologiím je vývoj cenově konkurenceschopných procesů pro přeměnu komplexních sacharidů přítomných v buněčných stěnách rostlin na jednoduché cukry, jako je glukóza, xylóza a arabinóza. Protože lignocelulózová biomasa je velmi houževnatá, musí být pro získání požadovaného produktu podrobena kombinaci termochemického ošetření (např. exfoliace amoniakových vláken (AFEX), zředěné kyseliny (DA), iontové kapaliny (IL)) a biologického ošetření (např. enzymatická hydrolýza a mikrobiální fermentace). Pokud se však v procesu hydrolýzy použijí komerční houbové enzymy, pouze 75–85 % vytvořených rozpustných cukrů tvoří monosacharidy a zbývajících 15–25 % tvoří rozpustné, neřešitelné oligosacharidy, které nejsou pro mikroorganismy vždy dostupné. Dříve jsme úspěšně izolovali a purifikovali rozpustné tvrdohlavé oligosacharidy pomocí kombinace separace uhlíku a křemeliny a vylučovací chromatografie a také jsme zkoumali jejich inhibiční vlastnosti vůči enzymům. Zjistili jsme, že oligosacharidy obsahující methylované uronové kyseliny s vyšším stupněm polymerace (DP) se obtížněji zpracovávají komerčními směsmi enzymů než oligosacharidy s nízkým DP a neutrální oligosacharidy. Zde uvádíme použití několika dalších metod, včetně profilování glykanů s použitím monoklonálních protilátek (mAb) specifických pro glykany rostlinné biomasy k charakterizaci glykanových vazeb v buněčných stěnách rostlin a enzymatických hydrolyzátech, matričně asistované laserové desorpční ionizace a hmotnostní spektrometrie s časem letu. MALDI-TOF-MS využívá strukturně informativní diagnostické píky získané spektroskopií po sekundárním rozpadu negativních iontů, plynovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií (GC-MS) k charakterizaci oligosacharidových vazeb s derivatizací a bez ní. Vzhledem k malé velikosti oligosacharidů (DP 4–20) je obtížné tyto molekuly použít pro vazbu a charakterizaci monoklonálních protilátek. Abychom tento problém překonali, aplikovali jsme novou metodu imobilizace oligosacharidů založenou na konjugaci s biotinem, která úspěšně označila většinu oligosacharidů rozpustných s nízkým DP na povrchu mikrotitrační destičky. Metoda byla následně použita ve vysokokapacitním systému monoklonálních protilátek pro specifickou ligační analýzu. Tato nová metoda v budoucnu usnadní vývoj pokročilejších vysokokapacitních glykomových testů, které lze použít k izolaci a charakterizaci oligosacharidů přítomných v biomarkerech pro diagnostické účely.
Lignocelulózová biomasa, složená ze zemědělských, lesnických, travních a dřevních materiálů, je potenciální surovinou pro výrobu bioproduktů, včetně potravin, krmiv, paliv a chemických prekurzorů, pro výrobu produktů s vyšší hodnotou1. Sacharidy (jako je celulóza a hemicelulóza) přítomné v buněčných stěnách rostlin se depolymerují na monosacharidy chemickým zpracováním a biotransformací (jako je enzymatická hydrolýza a mikrobiální fermentace). Mezi běžné předúpravy patří expanze amoniakových vláken (AFEX), zředěná kyselina (DA), iontová kapalina (IL) a parní exploze (SE), které využívají kombinaci chemikálií a tepla ke snížení produkce lignocelulózy otevřením buněčných stěn rostlin3,4. odolnost hmoty,5. Enzymatická hydrolýza se provádí při vysokém obsahu pevných látek za použití komerčních enzymů obsahujících aktivní sacharidy (CAZymes) a mikrobiální fermentace za použití transgenních kvasinek nebo bakterií za účelem výroby biopaliv a chemikálií6.
CAZymy v komerčních enzymech se skládají ze složité směsi enzymů, které synergicky štěpí komplexní vazby sacharid-cukr za vzniku monosacharidů2,7. Jak jsme již uvedli, složitá síť aromatických polymerů ligninu se sacharidy je činí vysoce neřešitelnými, což vede k neúplné přeměně cukrů, přičemž se akumuluje 15–25 % pohlavních oligosacharidů, které se neprodukují během enzymatické hydrolýzy předběžně upravené biomasy. To je běžný problém u různých metod předběžné úpravy biomasy. Mezi důvody tohoto úzkého místa patří inhibice enzymů během hydrolýzy nebo absence či nízké hladiny esenciálních enzymů, které jsou nezbytné k rozbití cukerných vazeb v rostlinné biomase. Pochopení složení a strukturních charakteristik cukrů, jako jsou cukerné vazby v oligosacharidech, nám pomůže zlepšit přeměnu cukrů během hydrolýzy, čímž se biotechnologické procesy stanou nákladově konkurenceschopnými s produkty odvozenými od ropy.
Určení struktury sacharidů je náročné a vyžaduje kombinaci metod, jako je kapalinová chromatografie (LC)11,12, nukleární magnetická rezonanční spektroskopie (NMR)13, kapilární elektroforéza (CE)14,15,16 a hmotnostní spektrometrie (MS)17. ,osmnáct. Metody MS, jako je hmotnostní spektrometrie s časem letu s laserovou desorpcí a ionizací za použití matrice (MALDI-TOF-MS), jsou všestrannou metodou pro identifikaci sacharidových struktur. V poslední době se k identifikaci otisků odpovídajících polohám připojení oligosacharidů, anomerním konfiguracím, sekvencím a polohám větvení nejčastěji používá tandemová MS s kolizně indukovanou disociací (CID) aduktů sodíkových iontů 20, 21.
Analýza glykanů je vynikajícím nástrojem pro hloubkovou identifikaci sacharidových vazeb22. Tato metoda využívá monoklonální protilátky (mAb) namířené proti glykanu v buněčné stěně rostlin jako sondy k pochopení komplexních sacharidových vazeb. Celosvětově je k dispozici více než 250 mAb, navržených proti různým lineárním a rozvětveným oligosacharidům s použitím různých sacharidů24. Několik mAb se široce používá k charakterizaci struktury, složení a modifikací buněčné stěny rostlin, protože existují významné rozdíly v závislosti na typu rostlinné buňky, orgánu, věku, vývojovém stádiu a růstovém prostředí25,26. V poslední době se tato metoda používá k pochopení populací vezikul v rostlinných a živočišných systémech a jejich příslušných rolí v transportu glykanů, jak je určeno subcelulárními markery, vývojovými stádii nebo environmentálními podněty, a k určení enzymatické aktivity. Mezi identifikované různé struktury glykanů a xylanů patří pektin (P), xylan (X), manan (M), xyloglukany (XylG), glukany se smíšenou vazbou (MLG), arabinoxylan (ArbX), galaktomannan (GalG), kyselina glukuronová-arabinoxylan (GArbX) a arabino-galaktan (ArbG)29.
Navzdory veškerému tomuto výzkumnému úsilí se však pouze několik studií zaměřilo na povahu akumulace oligosacharidů během hydrolýzy s vysokým obsahem pevných látek (HSL), včetně uvolňování oligosacharidů, změn délky oligomerního řetězce během hydrolýzy, různých polymerů s nízkým obsahem pevných látek a jejich křivek distribuce 30,31,32. Ačkoli se analýza glykanů ukázala jako užitečný nástroj pro komplexní analýzu struktury glykanů, je obtížné vyhodnotit ve vodě rozpustné oligosacharidy s nízkým obsahem pevných látek pomocí protilátkových metod. Menší DP oligosacharidy s molekulovou hmotností menší než 5-10 kDa se nevážou na ELISA destičky 33, 34 a před přidáním protilátek se vymyjí.
Zde poprvé demonstrujeme ELISA test na destičkách potažených avidinem s použitím monoklonálních protilátek, kombinující jednokrokový biotinylační postup pro rozpustné refrakterní oligosacharidy s analýzou glykomu. Náš přístup k analýze glykomu byl validován analýzou komplementárních oligosacharidových vazeb založenou na MALDI-TOF-MS a GC-MS s použitím trimethylsilylové (TMS) derivatizace hydrolyzovaných cukerných kompozic. Tento inovativní přístup může být v budoucnu vyvinut jako vysoce výkonná metoda a najít širší uplatnění v biomedicínském výzkumu35.
Posttranslační modifikace enzymů a protilátek, jako je glykosylace,36 ovlivňují jejich biologickou aktivitu. Například změny v glykosylaci sérových proteinů hrají důležitou roli u zánětlivé artritidy a změny v glykosylaci se používají jako diagnostické markery37. V literatuře bylo popsáno, že různé glykany se snadno objevují u řady onemocnění, včetně chronických zánětlivých onemocnění gastrointestinálního traktu a jater, virových infekcí, rakoviny vaječníků, prsu a prostaty38,39,40. Pochopení struktury glykanů pomocí metod ELISA pro stanovení glykanů na bázi protilátek poskytne větší jistotu v diagnostice onemocnění bez použití složitých MS metod.
Naše předchozí studie ukázala, že tvrdohlavé oligosacharidy zůstaly po předúpravě a enzymatické hydrolýze nehydrolyzovány (obrázek 1). V naší dříve publikované práci jsme vyvinuli metodu extrakce na pevné fázi s aktivním uhlím pro izolaci oligosacharidů z hydrolyzátu kukuřičných stonků (ACSH)8 předúpravěného AFEX. Po počáteční extrakci a separaci byly oligosacharidy dále frakcionovány pomocí vylučovací chromatografie (SEC) a shromážděny podle molekulové hmotnosti. Cukerné monomery a oligomery uvolněné z různých předúprav byly analyzovány analýzou složení cukru. Při porovnávání obsahu cukerných oligomerů získaných různými metodami předúpravy je přítomnost tvrdohlavých oligosacharidů běžným problémem při přeměně biomasy na monosacharidy a může vést ke snížení výtěžku cukru o nejméně 10-15 % a dokonce až o 18 %. Tato metoda se používá pro další velkovýrobu oligosacharidových frakcí. Výsledný ACH a jeho následné frakce s různými molekulovými hmotnostmi byly v této práci použity jako experimentální materiál pro charakterizaci oligosacharidů.
Po předběžné úpravě a enzymatické hydrolýze zůstaly perzistentní oligosacharidy nehydrolyzované. Zde (A) je metoda separace oligosacharidů, při které jsou oligosacharidy izolovány z hydrolyzátu kukuřičných stonků (ACSH) předběžně ošetřeného AFEX za použití náplně z aktivního uhlí a křemeliny; (B) Metoda separace oligosacharidů. Oligosacharidy byly dále separovány pomocí vylučovací chromatografie (SEC); (C) Sacharidové monomery a oligomery uvolněné z různých předběžných úprav (zředěná kyselina: DA, iontová kapalina: IL a AFEX). Podmínky enzymatické hydrolýzy: vysoké množství pevných látek 25 % (hmotnostních) (přibližně 8 % glukanů), 96 hodin hydrolýzy, 20 mg/g komerčního enzymu (poměr Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) a (D) Cukerné monomery a oligomery glukózy, xylózy a arabinózy uvolněné z kukuřičných stonků předběžně ošetřených AFEX (ACS).
Analýza glykanů se ukázala jako užitečný nástroj pro komplexní strukturní analýzu glykanů v extraktech izolovaných ze zbytků pevné biomasy. Ve vodě rozpustné sacharidy jsou však při použití této tradiční metody nedostatečně zastoupeny41, protože oligosacharidy s nízkou molekulovou hmotností se obtížně imobilizují na ELISA destičkách a před přidáním protilátek se vymyjí. Proto byla pro vazbu a charakterizaci protilátek použita jednokroková biotinylační metoda k nanesení rozpustných, nekompatibilních oligosacharidů na ELISA destičky potažené avidinem. Tato metoda byla testována s použitím našeho dříve vyrobeného ACSH a frakce založené na jeho molekulové hmotnosti (nebo stupni polymerace, DP). Jednokroková biotinylace byla použita ke zvýšení vazebné afinity oligosacharidů přidáním biotin-LC-hydrazidu na redukující konec sacharidu (obr. 2). V roztoku reaguje hemiacetalová skupina na redukujícím konci s hydrazidovou skupinou biotin-LC-hydrazidu za vzniku hydrazonové vazby. V přítomnosti redukčního činidla NaCNBH3 se hydrazonová vazba redukuje na stabilní biotinylovaný konečný produkt. Modifikací konce redukujícího cukr se stala možná vazba oligosacharidů s nízkým DP na ELISA plotny a v naší studii to bylo provedeno na plotnách potažených avidinem za použití glykany cílených monoklonálních protilátek.
Screening monoklonálních protilátek na biotinylované oligosacharidy metodou ELISA. Zde (A) ukazuje kombinovanou biotinylaci oligosacharidů a následný ELISA screening s monoklonálními protilátkami zaměřenými na glykany na destičkách potažených NeutrAvidinem a (B) ukazuje jednostupňový postup biotinylace reakčních produktů.
Destičky potažené avidinem s protilátkami konjugovanými s oligosacharidem byly poté přidány k primárním a sekundárním protilátkám a promyty ve světelně a časově citlivém médiu. Po dokončení vazby protilátek byl přidán substrát TMB pro inkubaci destičky. Reakce byla nakonec zastavena kyselinou sírovou. Inkubované destičky byly analyzovány pomocí ELISA čtečky za účelem stanovení vazebné síly každé protilátky a detekce zesítění specifických protilátek. Podrobnosti a parametry experimentu viz odpovídající část „Materiály a metody“.
Užitečnost této nově vyvinuté metody pro specifické aplikace demonstrujeme charakterizací rozpustných oligosacharidů přítomných v ACSH, jakož i v surových a purifikovaných oligosacharidových frakcích izolovaných z lignocelulózových hydrolyzátů. Jak je znázorněno na obrázku 3, nejběžnější epitopem substituované xylany identifikované v ACSH pomocí metod stanovení bioacylovaného glykomu jsou obvykle uronové (U) nebo methyluronové (MeU) a pektinové arabinogalaktany. Většina z nich byla také nalezena v naší předchozí studii o analýze glykanů nehydrolyzovaných pevných látek (UHS)43.
Detekce rekalcitrantních oligosacharidových epitopů pomocí monoklonální protilátky namířené proti glykanu buněčné stěny. „Neutrální“ frakce je frakce ACN a „kyselá“ frakce je frakce FA. Jasnější červená na tepelné mapě označuje vyšší obsah epitopů a jasnější modrá označuje prázdné pozadí. Hodnoty barev na stupnici jsou založeny na nezpracovaných hodnotách optické hustoty (OD) pro formulace N=2. Hlavní epitopy rozpoznávané protilátkami jsou zobrazeny vpravo.
Tyto necelulózové struktury nemohly být štěpeny nejběžnějšími celulázami a hemicelulázami v testované komerční směsi enzymů, která obsahuje nejběžněji používané komerční enzymy. Proto jsou pro jejich hydrolýzu zapotřebí nové pomocné enzymy. Bez nezbytných necelulózových pomocných enzymů tyto necelulózové vazby brání úplné přeměně na monosacharidy, a to i v případě, že jejich mateřské cukerné polymery jsou extenzivně hydrolyzovány na kratší fragmenty a rozpuštěny za použití komerčních směsí enzymů.
Další studie distribuce signálu a jeho vazebné síly ukázala, že vazebné epitopy byly nižší ve frakcích cukrů s vysokým DP (A, B, C, DP až do 20+) než ve frakcích s nízkým DP (D, E, F, DP) v dimerech) (obr. 1). Kyselé fragmenty jsou častější u necelulózových epitopů než u neutrálních fragmentů. Tyto jevy jsou v souladu se vzorem pozorovaným v naší předchozí studii, kde vysoké DP a kyselé skupiny byly odolnější vůči enzymatické hydrolýze. Přítomnost necelulózových glykanových epitopů a substitucí U a MeU proto může významně přispět ke stabilitě oligosacharidů. Je třeba poznamenat, že účinnost vazby a detekce může být problematická u oligosacharidů s nízkým DP, zejména pokud je epitop dimerní nebo trimerní oligosacharid. To lze testovat pomocí komerčních oligosacharidů různých délek, z nichž každý obsahuje pouze jeden epitop, který se váže na specifickou monoklonální protilátku.
Použití strukturně specifických protilátek tak odhalilo určité typy rekalcitrantních vazeb. V závislosti na použitém typu protilátky, vhodném ligačním vzoru a síle signálu, který produkuje (nejvíce a nejméně hojný), lze identifikovat nové enzymy a semikvantitativně je přidat do směsi enzymů pro úplnější glykokonverzi. Na příkladu analýzy oligosacharidů ACSH můžeme vytvořit databázi glykanových vazeb pro každý biomasový materiál. Zde je třeba poznamenat, že je třeba vzít v úvahu různou afinitu protilátek, a pokud jejich afinita není známa, bude to při porovnávání signálů různých protilátek vytvářet určité obtíže. Kromě toho může porovnání glykanových vazeb fungovat nejlépe mezi vzorky pro stejnou protilátku. Tyto rekalcitní vazby pak lze propojit s databází CAZyme, ze které můžeme identifikovat enzymy, vybrat kandidátní enzymy a testovat enzymy rozbíjející vazby nebo vyvinout mikrobiální systémy pro expresi těchto enzymů pro použití v biorafineriích44.
Abychom vyhodnotili, jak imunologické metody doplňují alternativní metody pro charakterizaci nízkomolekulárních oligosacharidů přítomných v lignocelulózových hydrolyzátech, provedli jsme MALDI (obr. 4, S1-S8) a analýzu sacharidů odvozených z TMS na základě GC-MS na stejném panelu (obr. 5) oligosacharidové části. MALDI se používá k porovnání, zda hmotnostní distribuce molekul oligosacharidů odpovídá zamýšlené struktuře. Na obr. 4 je znázorněna MS neutrálních složek ACN-A a ACN-B. Analýza ACN-A potvrdila řadu pentózových cukrů v rozmezí od DP 4–8 (obr. 4) do DP 22 (obr. S1), jejichž hmotnosti odpovídají MeU-xylanovým oligosacharidům. Analýza ACN-B potvrdila řadu pentózových a glukoxylanových cukrů s DP 8-15. V doplňkových materiálech, jako je obrázek S3, mapy distribuce hmotnosti kyselých skupin FA-C ukazují řadu pentózových cukrů substituovaných (Me)U s DP 8-15, které jsou konzistentní se substituovanými xylany nalezenými při screeningu monoklonálních protilátek založeném na ELISA. Epitopy jsou konzistentní.
MALDI-MS spektrum rozpustných nekompatibilních oligosacharidů přítomných v ACS. Zde (A) frakce ACN-A s nízkým hmotnostním rozsahem obsahující glukuroxylanové oligosacharidy substituované methylovanou uronovou kyselinou (DP 4-8) a (B) xylan ACN-B a methylované uronové oligosacharidy substituované glukuroxylanem (DP 8-15).
Analýza složení glykanového zbytku refrakterních oligosacharidů. Zde (A) Složení sacharidů TMS různých oligosacharidových frakcí získaných pomocí GC-MS analýzy. (B) Struktury různých cukrů odvozených z TMS přítomných v oligosacharidech. ACN – acetonitrilová frakce obsahující neutrální oligosacharidy a FA – frakce kyseliny ferulové obsahující kyselé oligosacharidy.
Další zajímavý závěr byl vyvozen z LC-MS analýzy oligosacharidové frakce, jak je znázorněno na obrázku S9 (metody lze nalézt v doplňkovém elektronickém materiálu). Fragmenty hexózy a -OAc skupin byly opakovaně pozorovány během ligace frakce ACN-B. Toto zjištění nejen potvrzuje fragmentaci pozorovanou v glykomové a MALDI-TOF analýze, ale také poskytuje nové informace o potenciálních derivátech sacharidů v předem upravené lignocelulózové biomase.
Také jsme provedli analýzu složení glykanů oligosacharidových frakcí pomocí TMS derivatizace glykanů. Pomocí GC-MS jsme stanovili složení nervových (nederivátových) a kyselých cukrů (GluA a GalA) v oligosacharidové frakci (obr. 5). Kyselina glukuronová se nachází v kyselých složkách C a D, zatímco kyselina galakturonová se nachází v kyselých složkách A a B, které jsou obě složkami kyselých cukrů s vysokým DP. Tyto výsledky nejen potvrzují naše data z ELISA a MALDI, ale jsou také v souladu s našimi předchozími studiemi akumulace oligosacharidů. Proto se domníváme, že moderní imunologické metody využívající biotinylaci oligosacharidů a následný ELISA screening jsou dostatečné k detekci rozpustných rekalcitrantních oligosacharidů v různých biologických vzorcích.
Vzhledem k tomu, že metody screeningu monoklonálních protilátek založené na ELISA byly validovány několika různými metodami, chtěli jsme dále prozkoumat potenciál této nové kvantitativní metody. Byly zakoupeny a testovány dva komerční oligosacharidy, xylohexasacharidový oligosacharid (XHE) a 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotrióza (A2XX) s použitím nového přístupu k monoklonálním protilátkám zaměřeného na glykan buněčné stěny. Obrázek 6 ukazuje lineární korelaci mezi signálem vazby biotinylatu a logaritmickou koncentrací oligosacharidu, což naznačuje možný model Langmuirovy adsorpce. Mezi monoklonálními protilátkami korelovaly CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 a CCRC-M151 s XHE a CCRC-M108, CCRC-M109 a LM11 s A2XX v rozsahu od 1 nm do 100 nano. Vzhledem k omezené dostupnosti protilátek během experimentu byly s každou koncentrací oligosacharidu provedeny omezené experimenty. Je třeba zde poznamenat, že některé protilátky reagují na stejný oligosacharid jako substrát velmi odlišně, pravděpodobně proto, že se vážou na mírně odlišné epitopy a mohou mít velmi odlišnou vazebnou afinitu. Mechanismy a důsledky přesné identifikace epitopů budou mnohem složitější, až bude nový přístup s monoklonálními protilátkami aplikován na reálné vzorky.
Pro stanovení detekčního rozsahu různých monoklonálních protilátek cílících na glykany byly použity dva komerční oligosacharidy. Lineární korelace s logaritmickou koncentrací oligosacharidů zde ukazují Langmuirovy adsorpční vzory pro (A) XHE s monoklonální protilátkou a (B) A2XX s monoklonální protilátkou. Odpovídající epitopy označují struktury komerčních oligosacharidů použitých jako substráty v testu.
Použití monoklonálních protilátek cílených na glykany (glykombinační analýza nebo screening monoklonálních protilátek založený na ELISA) je účinným nástrojem pro hloubkovou charakterizaci většiny hlavních glykanů buněčné stěny, které tvoří rostlinnou biomasu. Klasická analýza glykanů však charakterizuje pouze větší glykany buněčné stěny, protože většina oligosacharidů není na ELISA plotnách účinně imobilizována. V této studii byly kukuřičné stonky předem ošetřené AFEX enzymaticky hydrolyzovány s vysokým obsahem pevných látek. Analýza cukrů byla použita k určení složení odolných sacharidů buněčné stěny v hydrolyzátu. Analýza monoklonálních protilátek menších oligosacharidů v hydrolyzátech je však podceňována a pro efektivní imobilizaci oligosacharidů na ELISA plotnách jsou zapotřebí další nástroje.
Zde uvádíme novou a účinnou metodu imobilizace oligosacharidů pro screening monoklonálních protilátek kombinací biotinylace oligosacharidů a následného ELISA screeningu na destičkách potažených NeutrAvidin™. Imobilizované biotinylované oligosacharidy vykazovaly dostatečnou afinitu k protilátce, aby umožnily rychlou a účinnou detekci rezistentních oligosacharidů. Analýza složení těchto tvrdohlavých oligosacharidů založená na hmotnostní spektrometrii potvrdila výsledky tohoto nového přístupu k imunoscreeningu. Tyto studie tak ukazují, že kombinace biotinylace oligosacharidů a ELISA screeningu s monoklonálními protilátkami zaměřenými na glykany může být použita k detekci zesítění v oligosacharidech a může být široce aplikována v dalších biochemických studiích charakterizujících strukturu oligosacharidů.
Tato metoda profilování glykanů na bázi biotinu je první zprávou, která je schopna zkoumat rekalcitrantní sacharidové vazby rozpustných oligosacharidů v rostlinné biomase. To pomáhá pochopit, proč jsou některé části biomasy tak odolné, pokud jde o produkci biopaliv. Tato metoda zaplňuje důležitou mezeru v metodách analýzy glykomů a rozšiřuje její použití na širší škálu substrátů nad rámec rostlinných oligosacharidů. V budoucnu bychom mohli pro biotinylaci použít robotiku a metodu, kterou jsme vyvinuli, použít pro vysoce výkonnou analýzu vzorků pomocí ELISA.
Kukuřičná sláma (CS) vypěstovaná z hybridních semen Pioneer 33A14 byla sklizena v roce 2010 na farmě Kramer Farms v Ray v Coloradu. S povolením vlastníka pozemku lze tuto biomasu použít pro výzkum. Vzorky byly skladovány v suchu s vlhkostí < 6 % v uzavíratelných sáčcích při pokojové teplotě. Vzorky byly skladovány v suchu s vlhkostí < 6 % v uzavíratelných sáčcích při pokojové teplotě. Образцы хранились сухими при влажности < 6 % v пакетах с застежкой-молнией приности температуре. Vzorky byly skladovány v suchu při vlhkosti <6 % v sáčcích se zipem při pokojové teplotě.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре <6%. с влажно Vzorky se skladují v sáčcích na zip při pokojové teplotě s vlhkostí < 6 %.Studie byla v souladu s místními a národními směrnicemi. Analýza složení byla provedena pomocí protokolu NREL. Bylo zjištěno, že složení obsahuje 31,4 % glukanu, 18,7 % xylanu, 3,3 % arabinanu, 1,2 % galaktanu, 2,2 % acetylu, 14,3 % ligninu, 1,7 % bílkovin a 13,4 % popela.
Cellic® CTec2 (138 mg proteinu/ml, šarže VCNI 0001) je komplexní směs celulázy, β-glukosidázy a Cellic® HTec2 (157 mg proteinu/ml, šarže VHN00001) od společnosti Novozymes (Franklinton, NC, USA). Multifect Pectinase® (72 mg proteinu/ml), komplexní směs enzymů degradujících pektin, byla darována společností DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Koncentrace proteinů v enzymech byly stanoveny odhadem obsahu proteinů (a odečtením příspěvku neproteinového dusíku) pomocí Kjeldahlův test dusíku (metoda AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Křemelina 545 byla zakoupena od společnosti EMD Millipore (Billerica, MA). Aktivní uhlí (DARCO, granule 100 mesh), Avicel (PH-101), bukový xylan a všechny ostatní chemikálie byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Předúprava AFEX byla provedena v GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Předúprava probíhala při teplotě 140 °C po dobu 15 minut. Doba zdržení byla 46 minut při poměru 1:1 bezvodého amoniaku k biomase a 60% (hmotnostní) náplni v nerezovém stolním dávkovém reaktoru (Parr Instruments Company). Trvalo 30 minut. Reaktor byl zahřát na 140 °C a amoniak se rychle uvolnil, což umožnilo biomase rychlý návrat na pokojovou teplotu. Složení kukuřičných stonků předúpravěných AFEX (ACS) bylo podobné složení neošetřených kukuřičných stonků (UT-CS).
Jako výchozí materiál pro velkovýrobu oligosacharidů byl připraven vysokopevnostní ACSH 25 % (hmotn./hmotn.) (s přibližně 8% dextranem). Enzymatická hydrolýza ACS byla provedena za použití komerční směsi enzymů obsahující Cellic® Ctec2 10 mg proteinu/g glukanu (v předem upravené biomase), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteinu/g glukanu a Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). 5 mg proteinu/g dextranu. Enzymatická hydrolýza byla provedena v 5litrovém bioreaktoru s pracovním objemem 3 litry, pH 4,8, teplotou 50 °C a 250 ot/min. Po 96 hodinách hydrolýzy byl hydrolyzát shromážděn centrifugací při 6000 ot/min po dobu 30 minut a poté při 14000 ot/min po dobu 30 minut za účelem odstranění nehydrolyzovaných pevných látek. Hydrolyzát byl poté podroben sterilní filtraci přes filtrační kádinku s průměrem pórů 0,22 mm. Přefiltrovaný hydrolyzát byl skladován ve sterilních lahvích při teplotě 4 °C a poté frakcionován na aktivním uhlí.
Analýza složení vzorků biomasy na bázi extraktů podle laboratorních analytických postupů NREL: příprava vzorků pro analýzu složení (NREL/TP-510-42620) a stanovení strukturních sacharidů a ligninu v biomase (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analýza oligosacharidů v proudu hydrolyzátu byla provedena v měřítku 2 ml za použití metody kyselé hydrolýzy v autoklávu. Vzorek hydrolyzátu byl smíchán s 69,7 µl 72% kyseliny sírové v 10ml kultivační zkumavce se šroubovacím uzávěrem a inkubován po dobu 1 hodiny na stole při 121 °C, ochlazen na ledu a přefiltrován do lahvičky pro vysoce účinnou kapalinovou chromatografii (HPLC). Koncentrace oligosacharidů byla stanovena odečtením koncentrace monosacharidů v nehydrolyzovaném vzorku od celkové koncentrace cukrů v kysele hydrolyzovaném vzorku.
Koncentrace glukózy, xylózy a arabinózy v kysele hydrolyzované biomase byly analyzovány pomocí HPLC systému Shimadzu vybaveného automatickým vzorkovačem, ohřívačem kolony, izokratickou pumpou a detektorem indexu lomu na koloně Bio-Rad Aminex HPX-87H. Kolona byla udržována na teplotě 50 °C a eluována průtokem 5 mM H2SO4 ve vodě o průtoku 0,6 ml/min.
Supernatant hydrolyzátu byl zředěn a analyzován na obsah monomerů a oligosacharidů. Monomerní cukry získané po enzymatické hydrolýze byly analyzovány pomocí HPLC vybavené kolonou Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P a kolonou s ochranou proti popelu. Teplota kolony byla udržována na 80 °C, jako mobilní fáze byla použita voda s průtokem 0,6 ml/min. Oligosacharidy byly stanoveny hydrolýzou ve zředěné kyselině při 121 °C podle metod popsaných v odkazech 41, 48, 49.
Analýza sacharidů byla provedena na surových, AFEX předem ošetřených a všech nehydrolyzovaných zbytcích biomasy (včetně produkce sériových extraktů buněčných stěn a jejich screeningu na monoklonální protilátky) za použití dříve popsaných postupů 27, 43, 50, 51. Pro analýzu glykomu se v alkoholu nerozpustné zbytky materiálu rostlinných buněčných stěn připraví ze zbytků biomasy a podrobí se sériové extrakci se stále agresivnějšími činidly, jako je oxalát amonný (50 mM), uhličitan sodný (50 mM a 0,5 % hm./obj.), CON. (1M a 4M, oba s 1 % hm./obj. borohydridem sodným) a kyselý chlornan, jak bylo popsáno dříve 52,53. Extrakty byly poté podrobeny ELISA testu proti komplexnímu panelu monoklonálních protilátek 50 namířených proti glykanu buněčné stěny a vazebné reakce monoklonálních protilátek byly prezentovány jako tepelná mapa. Monoklonální protilátky cílící na glykan buněčné stěny rostlin byly zakoupeny z laboratorních zásob (řady CCRC, JIM a MAC).
One-step biotinylation of oligosaccharides. The conjugation of carbohydrates with biotin-LC-hydrazide was performed using the following procedure. Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) by vigorous stirring and heating at 65° C. for 1 min. Glacial acetic acid (30 µl) was added and the mixture was poured onto sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) and completely dissolved after heating at 65° C. for about 1 minute. Then, from 5 to 8 μl of the reaction mixture was added to the dried oligosaccharide (1-100 nmol) to obtain a 10-fold or more molar excess of the label over the reducing end. The reaction was carried out at 65°C for 2 h, after which the samples were immediately purified. V experimentech se značením bez redukce nebyl použit kyanoborohydrid sodný a vzorky byly nechány reagovat při teplotě 65 °C po dobu 2,5 hodiny.
Potahování a promytí vzorků biotinylovaných oligosacharidů metodou ELISA. Do každé jamky destičky potažené avidinem bylo přidáno 25 μl biotinylovaných vzorků (100 μl každého koncentrovaného vzorku zředěného v 5 ml 0,1 M Tris pufrovacího roztoku (TBS)). Kontrolní jamky byly potaženy 50 μl biotinu o koncentraci 10 μg/ml v 0,1 M TBS. Pro slepá měření byla jako potah použita deionizovaná voda. Tableta byla inkubována 2 hodiny při pokojové teplotě ve tmě. Destička byla 3krát promyta 0,1% odstředěným mlékem v 0,1 M TBS za použití programu č. 11 pro Grenier flat 3A.
Přidání a promytí primárních protilátek. Do každé jamky přidejte 40 µl primární protilátky. Mikrotitrační destičku inkubujte 1 hodinu při pokojové teplotě ve tmě. Destičky byly poté 3krát promyty 0,1% mlékem v 0,1M TBS za použití promývacího programu č. 11 pro Grenier Flat 3A.
Přidejte sekundární protilátku a promyjte. Do každé jamky přidejte 50 µl sekundární protilátky myší/krysy (zředěné 1:5000 v 0,1% mléce v 0,1 M TBS). Inkubujte mikrotitrační destičku 1 hodinu při pokojové teplotě ve tmě. Mikrotitrační destičky byly poté 5krát promyty 0,1% mlékem v 0,1 M TBS za použití programu Grenier Flat 5A pro promývání destiček č. 12.
Přidání substrátu. Přidejte 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidinu (TMB) k základnímu substrátu (přidáním 2 kapek pufru, 3 kapek TMB, 2 kapek peroxidu vodíku do 15 ml deionizované vody). Připravte substrát TMB a před použitím promíchejte na vortexu. Inkubujte mikrotitrační destičku při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Ve tmě.
Dokončete krok a odečtěte tabletu. Do každé jamky přidejte 50 µl 1N kyseliny sírové a zaznamenejte absorbanci od 450 do 655 nm pomocí ELISA čtečky.
Připravte roztoky těchto analytů o koncentraci 1 mg/ml v deionizované vodě: arabinóza, rhamnóza, fukóza, xylóza, kyselina galakturonová (GalA), kyselina glukuronová (GlcA), manóza, glukóza, galaktóza, laktóza, N-acetylmannosamin (manNAc), N-acetylglukosamin (glcNAc), N-acetylgalaktosamin (galNAc), inositol (vnitřní standard). Dva standardy byly připraveny přidáním roztoků cukru o koncentraci 1 mg/ml uvedených v tabulce 1. Vzorky se zmrazí a lyofilizují při teplotě -80 °C, dokud se neodstraní veškerá voda (obvykle asi 12–18 hodin).
Do zkumavek se šroubovacím uzávěrem na analytických vahách přidejte 100–500 µg vzorku. Zaznamenejte přidané množství. Nejlepší je rozpustit vzorek ve specifické koncentraci rozpouštědla a přidat jej do zkumavky jako kapalný alikvot. Jako vnitřní standard pro každou zkumavku se vzorkem použijte 20 µl inositolu o koncentraci 1 mg/ml. Množství vnitřního standardu přidaného do vzorku musí být stejné jako množství vnitřního standardu přidaného do standardní zkumavky.
Do lahvičky se šroubovacím uzávěrem přidejte 8 ml bezvodého methanolu. Poté přidejte 4 ml 3N methanolického roztoku HCl, uzavřete a protřepejte. Tento postup nepoužívá vodu.
K vzorkům oligosacharidů a standardním zkumavkám TMS přidejte 500 µl 1 M roztoku HCl v methanolu. Vzorky byly inkubovány přes noc (168 hodin) při 80 °C v termobloku. Produkt methanolýzy vysušte při pokojové teplotě pomocí sušicího potrubí. Přidejte 200 µl MeOH a znovu vysušte. Tento postup se dvakrát opakuje. K vzorku přidejte 200 µl methanolu, 100 µl pyridinu a 100 µl acetanhydridu a dobře promíchejte. Vzorky inkubujte při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Vzorky se nechají inkubovat při pokojové teplotě po dobu 30 minut.
Přidejte 200 µl Tri-Sil a zahřívejte zkumavku s víčkem po dobu 20 minut. 80 °C, poté ochlaďte na pokojovou teplotu. Pomocí sušicího potrubí dále vysušte vzorek na objem přibližně 50 µl. Je důležité poznamenat, že jsme vzorky nenechali zcela vyschnout.
Přidejte 2 ml hexanu a dobře promíchejte vortexováním. Naplňte špičky Pasteurových pipet (5-8 mm) kouskem skleněné vlny tak, že skleněnou vatu vložíte na vrchol pipety o průměru 5-3/4 palce. Vzorky byly centrifugovány při 3000 g po dobu 2 minut. Veškeré nerozpustné zbytky se vysrážejí. Vzorek se vysuší na 100-150 µl. Objem přibližně 1 μl byl vstříknut do GC-MS při počáteční teplotě 80 °C a počáteční době 2,0 minuty (tabulka 2).