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AFEXで前処理したトウモロコシ茎葉中の難分解性オリゴ糖の複雑な分析のための新しい免疫学的および質量分析法。リグノセルロース系バイオマスは化石燃料に代わる持続可能な代替物であり、食品、飼料、燃料、化学品などの製品を生産するためのバイオテクノロジーの開発に広く利用されています。これらの技術の鍵は、植物細胞壁に存在する複雑な炭水化物をグルコース、キシロース、アラビノースなどの単純糖に変換するコスト競争力のあるプロセスの開発です。リグノセルロース系バイオマスは非常に頑固であるため、目的の製品を得るには、熱化学処理（例：アンモニア繊維剥離（AFEX）、希酸（DA）、イオン液体（IL））と生物学的処理（例：酵素加水分解および微生物発酵）を組み合わせて行う必要があります。しかし、加水分解プロセスで市販の真菌酵素を使用すると、生成される可溶性糖のうち単糖類は 75〜85% にすぎず、残りの 15〜25% は可溶性で難分解性のオリゴ糖であり、微生物が常に利用できるとは限りません。これまで、炭素と珪藻土の分離とサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを使用して、可溶性の難分解性オリゴ糖を分離および精製することに成功し、それらの酵素阻害特性も調査しました。重合度 (DP) が高いメチル化ウロン酸置換基を含むオリゴ糖は、DP が低い中性オリゴ糖よりも市販の酵素混合物で処理するのが難しいことがわかりました。ここでは、植物バイオマスグリカンに特異的なモノクローナル抗体 (mAb) を使用したグリカンプロファイリングによる植物細胞壁および酵素加水分解物のグリカン結合の特性評価、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法など、いくつかの追加方法の使用について報告します。 MALDI-TOF-MSは、負イオンの二次分解後の分光法、ガスクロマトグラフィー質量分析法（GC-MS）によって得られる構造情報診断ピークを利用して、誘導体化の有無にかかわらずオリゴ糖結合を特徴づけます。オリゴ糖はサイズが小さいため（DP 4～20）、これらの分子をmAb結合および特性評価に使用することは困難です。この問題を克服するために、ビオチン結合に基づく新しいオリゴ糖固定化法を適用し、マイクロプレート表面に低DP可溶性オリゴ糖の大部分を標識することに成功し、その後、特異的ライゲーション分析のためのハイスループットmAbシステムで使用しました。この新しい方法は、将来、診断目的でバイオマーカー中に存在するオリゴ糖を分離および特性評価するために使用できる、より高度なハイスループットグリコームアッセイの開発を促進します。
農業、林業、草、木質材料からなるリグノセルロース系バイオマスは、食品、飼料、燃料、高付加価値製品を製造する化学前駆体など、バイオベース製品の生産のための潜在的な原料です1。植物細胞壁に存在する炭水化物（セルロースやヘミセルロースなど）は、化学処理や生物変換（酵素加水分解や微生物発酵など）によって単糖類に解重合されます。一般的な前処理には、アンモニア繊維膨張（AFEX）、希酸（DA）、イオン液体（IL）、蒸気爆発（SE）などがあり、これらは化学物質と熱を組み合わせて植物細胞壁を開き、リグノセルロースの生成を減少させます3,4。物質の頑固さ、5。酵素加水分解は、市販の活性炭水化物含有酵素（CAZymes）を使用して高固形分負荷で行われ、微生物発酵は、バイオベース燃料や化学物質を生産するために遺伝子組み換え酵母や細菌を使用して行われます6。
市販の酵素に含まれるCAZymesは、複雑な炭水化物-糖結合を相乗的に切断して単糖を形成する酵素の複雑な混合物で構成されています2,7。以前に報告したように、リグニンと炭水化物の芳香族ポリマーの複雑なネットワークは、それらを非常に扱いにくくし、不完全な糖変換につながり、前処理されたバイオマスの酵素加水分解中に生成されない15～25%の6オリゴ糖が蓄積されます。これは、さまざまなバイオマス前処理方法に共通する問題です。このボトルネックの原因としては、加水分解中の酵素阻害、または植物バイオマス中の糖結合を切断するために必要な必須酵素の欠如または低レベルなどが挙げられます。オリゴ糖の糖結合などの糖の組成と構造特性を理解することは、加水分解中の糖変換を改善し、バイオテクノロジープロセスを石油由来製品とコスト競争力のあるものにするのに役立ちます。
炭水化物の構造を決定することは困難であり、液体クロマトグラフィー（LC）11,12、核磁気共鳴分光法（NMR）13、キャピラリー電気泳動（CE）14,15,16、質量分析法（MS）17、18などの方法の組み合わせが必要です。レーザー脱離イオン化マトリックスを用いた飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF-MS）などのMS法は、炭水化物の構造を同定するための汎用性の高い方法です。最近では、ナトリウムイオン付加物の衝突誘起解離（CID）タンデムMSが、オリゴ糖の結合位置、アノマー配置、配列、分岐位置に対応するフィンガープリントを同定するために最も広く使用されています20, 21。
グリカン分析は、糖鎖結合を詳細に同定するための優れたツールです22。この方法は、植物細胞壁グリカンを標的とするモノクローナル抗体（mAb）をプローブとして使用し、複雑な糖鎖結合を理解します。世界中で250種類以上のmAbが利用可能で、さまざまな糖類を使用してさまざまな直鎖状および分岐状オリゴ糖に対して設計されています24。いくつかのmAbは、植物細胞の種類、器官、年齢、発達段階、および生育環境によって大きな違いがあるため、植物細胞壁の構造、組成、および修飾を特徴付けるために広く使用されています25,26。最近では、この方法は、細胞内マーカー、発達段階、または環境刺激によって決定される、植物および動物システムにおける小胞集団とグリカン輸送におけるそれぞれの役割を理解し、酵素活性を決定するために使用されています。これまでに同定されたグリカンとキシランのさまざまな構造には、ペクチン（P）、キシラン（X）、マンナン（M）、キシログルカン（XylG）、混合結合グルカン（MLG）、アラビノキシラン（ArbX）、ガラクトマンナン（GalG）、グルクロン酸アラビノキシラン（GArbX）、アラビノガラクタン（ArbG）29などがあります。
しかし、これらの研究努力にもかかわらず、高固形分負荷（HSL）加水分解中のオリゴ糖蓄積の性質、オリゴ糖放出、加水分解中のオリゴマー鎖長の変化、さまざまな低DPポリマー、およびそれらの曲線分布に焦点を当てた研究はごくわずかです。30,31,32 一方、グリカン分析はグリカン構造の包括的な分析に有用なツールであることが証明されていますが、抗体法を使用して水溶性の低DPオリゴ糖を評価することは困難です。分子量が5～10 kDa未満の小さなDPオリゴ糖はELISAプレートに結合せず33,34、抗体添加前に洗い流されます。
本稿では、モノクローナル抗体を用いたアビジンコートプレート上でのELISAアッセイを初めて実証し、可溶性難分解性オリゴ糖に対するワンステップビオチン化手順とグリコーム解析を組み合わせた。グリコーム解析への我々のアプローチは、加水分解糖組成物のトリメチルシリル（TMS）誘導体化を用いた相補的オリゴ糖結合のMALDI-TOF-MSおよびGC-MSベースの解析によって検証された。この革新的なアプローチは、将来的にハイスループット法として開発され、生物医学研究においてより幅広い応用が見込まれる可能性がある35。
酵素や抗体の翻訳後修飾、例えばグリコシル化は、それらの生物学的活性に影響を与える。例えば、血清タンパク質のグリコシル化の変化は炎症性関節炎において重要な役割を果たし、グリコシル化の変化は診断マーカーとして用いられる。文献には、消化管や肝臓の慢性炎症性疾患、ウイルス感染症、卵巣がん、乳がん、前立腺がんなど、さまざまな疾患で容易に出現することが報告されている。抗体ベースのグリカンELISA法を用いてグリカンの構造を理解することで、複雑なMS法を用いずに疾患診断に対する信頼性を高めることができる。
我々の以前の研究では、前処理と酵素加水分解後も難分解性オリゴ糖が未加水分解のまま残っていることが示された（図 1）。我々が以前に発表した研究では、AFEX前処理したトウモロコシ茎葉加水分解物（ACSH）8からオリゴ糖を分離するための活性炭固相抽出法を開発した。最初の抽出と分離の後、オリゴ糖はサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によってさらに分画され、分子量の順に収集された。さまざまな前処理から放出された糖モノマーとオリゴマーは、糖組成分析によって分析された。さまざまな前処理法によって得られた糖オリゴマーの含有量を比較すると、難分解性オリゴ糖の存在はバイオマスから単糖への変換における共通の問題であり、糖収率を少なくとも 10〜15%、場合によっては最大 18% 低下させる可能性がある。この方法は、オリゴ糖分画のさらなる大規模生産に使用される。得られたACHおよびその後の異なる分子量を持つ分画は、本研究におけるオリゴ糖の特性評価のための実験材料として使用された。
前処理と酵素加水分解の後、難分解性オリゴ糖が加水分解されずに残った。ここで、（A）活性炭と珪藻土の充填層を用いてAFEX前処理トウモロコシ茎葉加水分解物（ACSH）からオリゴ糖を分離するオリゴ糖分離法、（B）オリゴ糖の分離法。オリゴ糖はサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によってさらに分離された、（C）様々な前処理（希酸：DA、イオン液体：IL、AFEX）から放出された糖モノマーとオリゴマー。酵素加水分解条件：固形分濃度25％（w/w）（グルカン濃度約8％）、加水分解時間96時間、市販酵素添加量20mg/g（Ctec2：Htec2：MP-2：1：1の比率）、（D）AFEX前処理トウモロコシ茎葉（ACS）から放出されたグルコース、キシロース、アラビノースの糖モノマーおよびオリゴマー。
グリカン分析は、固体バイオマス残渣から分離された抽出物中のグリカンの包括的な構造分析に有用なツールであることが証明されています。しかし、この従来の方法では、低分子量オリゴ糖はELISAプレートに固定化するのが難しく、抗体添加前に洗い流されるため、水溶性糖類は十分に表現されていません。したがって、抗体結合および特性評価のために、可溶性で非適合性オリゴ糖をアビジンコートELISAプレートにコーティングするために、ワンステップビオチン化法が使用されました。この方法は、以前に作成したACSHと、その分子量（または重合度、DP）に基づく分画を使用してテストされました。ワンステップビオチン化は、炭水化物の還元末端にビオチン-LC-ヒドラジドを付加することにより、オリゴ糖の結合親和性を高めるために使用されました（図2）。溶液中では、還元末端のヘミアセタール基がビオチン-LC-ヒドラジドのヒドラジド基と反応してヒドラゾン結合を形成します。還元剤NaCNBH3の存在下では、ヒドラゾン結合は還元されて安定なビオチン化最終生成物となる。糖還元末端の修飾により、低DPオリゴ糖のELISAプレートへの結合が可能となり、本研究では、グリカンを標的とするモノクローナル抗体を用いてアビジンコートプレート上でこれを行った。
ビオチン化オリゴ糖に対するELISAに基づくモノクローナル抗体のスクリーニング。ここでは、（A）オリゴ糖のビオチン化とそれに続くニュートラアビジンコートプレート上でのグリカン標的mAbを用いたELISAスクリーニングの組み合わせ、および（B）反応生成物のビオチン化のためのワンステップ手順を示します。
オリゴ糖結合抗体を塗布したアビジンコートプレートに一次抗体と二次抗体を加え、光と時間に敏感な培地で洗浄した。抗体結合が完了したら、TMB基質を加えてプレートをインキュベートした。最後に硫酸で反応を停止させた。インキュベートしたプレートをELISAリーダーで分析し、各抗体の結合強度を測定して抗体特異的な架橋を検出した。実験の詳細とパラメータについては、「材料と方法」の該当セクションを参照のこと。
我々は、ACSH中に存在する可溶性オリゴ糖、およびリグノセルロース加水分解物から分離された粗オリゴ糖画分と精製オリゴ糖画分を特徴づけることによって、この新たに開発された方法の特定の用途における有用性を実証する。図3に示すように、バイオアシル化グリコームアッセイ法を用いてACSHで同定された最も一般的なエピトープ置換キシランは、通常、ウロン酸（U）またはメチルウロン酸（MeU）およびペクチンアラビノガラクタンである。これらのほとんどは、非加水分解固形物（UHS）のグリカン分析に関する我々の以前の研究43でも見つかっている。
細胞壁グリカンを標的とするモノクローナル抗体を用いた難分解性オリゴ糖エピトープの検出。「中性」画分はACN画分、「酸性」画分はFA画分です。ヒートマップ上の明るい赤色はエピトープ含有量が高いことを示し、明るい青色は背景が空白であることを示します。スケール上の色の値は、N=2の製剤の生OD値に基づいています。抗体によって認識される主なエピトープは右側に示されています。
これらの非セルロース構造は、試験した市販酵素混合物（最も一般的に使用されている市販酵素を含む）に含まれる最も一般的なセルラーゼおよびヘミセルラーゼでは切断できませんでした。そのため、これらの非セルロース構造を加水分解するには、新たな補助酵素が必要となります。必要な非セルロース補助酵素がない場合、これらの非セルロース結合は、たとえ元の糖ポリマーがより短い断片に広範囲に加水分解され、市販酵素混合物を用いて溶解されたとしても、単糖への完全な変換を妨げます。
シグナル分布とその結合強度のさらなる研究により、結合エピトープは、高DP糖画分（A、B、C、DP 20以上）よりも低DP画分（D、E、F、DP 二量体）の方が低いことが示されました（図1）。酸性フラグメントは、中性フラグメントよりも非セルロースエピトープでより一般的です。これらの現象は、高DPおよび酸性部分が酵素加水分解に対してより耐性があるという、以前の研究で観察されたパターンと一致しています。したがって、非セルロースグリカンエピトープおよびUおよびMeU置換の存在は、オリゴ糖の安定性に大きく貢献する可能性があります。結合および検出効率は、特にエピトープが二量体または三量体のオリゴ糖の場合、低DPオリゴ糖では問題になる可能性があることに注意する必要があります。これは、それぞれ特定のmAbに結合するエピトープを1つだけ含む、長さの異なる市販のオリゴ糖を使用してテストできます。
このように、構造特異的抗体を用いることで、特定の種類の難分解性結合が明らかになった。使用する抗体の種類、適切なライゲーションパターン、および生成されるシグナルの強度（最も豊富で最も少ないもの）に応じて、新しい酵素を同定し、より完全な糖鎖変換のために酵素混合物に半定量的に添加することができる。ACSHオリゴ糖の分析を例にとると、各バイオマス材料のグリカン結合のデータベースを作成できる。ここで注意すべきは、抗体の親和性の違いを考慮する必要があることであり、親和性が不明な場合は、異なる抗体のシグナルを比較する際に困難が生じる。さらに、グリカン結合の比較は、同じ抗体の場合、サンプル間で最も効果的である可能性がある。これらの難分解性結合は、CAZymeデータベースにリンクすることができ、そこから酵素を同定したり、候補酵素を選択して結合切断酵素をテストしたり、バイオリファイナリーで使用するためにこれらの酵素を発現する微生物システムを開発したりすることができる44。
リグノセルロース加水分解物中に存在する低分子量オリゴ糖を特徴付けるための代替方法を免疫学的方法がどのように補完するかを評価するために、同じパネル (図 5) のオリゴ糖部分で MALDI (図 4、S1-S8) と GC-MS に基づく TMS 由来糖の分析を実施しました。MALDI は、オリゴ糖分子の質量分布が意図した構造と一致するかどうかを比較するために使用されます。図 4 には、中性成分 ACN-A と ACN-B の MS が示されています。ACN-A の分析により、DP 4-8 (図 4) から DP 22 (図 S1) の範囲のペントース糖が確認され、その重量は MeU-キシランオリゴ糖に相当します。ACN-B の分析により、DP 8-15 のペントースおよびグルコキシラン系列が確認されました。図S3などの補足資料では、FA-C酸性部分の質量分布マップに、DPが8～15の(Me)U置換ペントース糖の範囲が示されており、これはELISAベースのmAbスクリーニングで見つかった置換キシランと一致しています。エピトープも一致しています。
ACS中に存在する可溶性非適合オリゴ糖のMALDI-MSスペクトル。ここでは、（A）メチル化ウロン酸（DP 4-8）置換グルクロキシランオリゴ糖を含むACN-A低重量範囲画分と、（B）グルクロキシラン（DP 8-15）で置換されたキシランおよびメチル化ウロン酸オリゴ糖のACN-Bを示す。
難分解性オリゴ糖のグリカン残基の組成分析。ここでは、（A）GC-MS分析によって得られた様々なオリゴ糖画分のTMS糖組成。（B）オリゴ糖中に存在する様々なTMS由来糖の構造。ACNは中性オリゴ糖を含むアセトニトリル画分、FAは酸性オリゴ糖を含むフェルラ酸画分。
オリゴ糖画分のLC-MS分析から、もう一つ興味深い結論が得られました（図S9参照。分析方法は電子補足資料を参照）。ACN-B画分の連結中に、ヘキソースと-OAc基の断片が繰り返し観察されました。この結果は、グリコームおよびMALDI-TOF分析で観察された断片化を裏付けるだけでなく、前処理されたリグノセルロース系バイオマス中の潜在的な炭水化物誘導体に関する新たな情報も提供します。
また、TMSグリカン誘導体化を用いてオリゴ糖画分のグリカン組成分析も行いました。GC-MSを用いて、オリゴ糖画分中の中性糖（非誘導体化糖）と酸性糖（GluAおよびGalA）の組成を決定しました（図5）。酸性成分CおよびDにはグルクロン酸が、酸性成分AおよびBにはガラクツロン酸が含まれており、これらはいずれも高DPの酸性糖成分です。これらの結果は、ELISAおよびMALDIデータを裏付けるだけでなく、オリゴ糖蓄積に関するこれまでの研究とも一致しています。したがって、オリゴ糖のビオチン化とそれに続くELISAスクリーニングを用いた最新の免疫学的手法は、様々な生物学的サンプル中の可溶性難分解性オリゴ糖を検出するのに十分であると考えています。
ELISA ベースの mAb スクリーニング法はいくつかの異なる方法で検証されているため、この新しい定量法の可能性をさらに探りたいと考えました。2 つの市販オリゴ糖、キシロヘキササッカライドオリゴ糖 (XHE) と 23-α-L-アラビノフラノシルキシロトリオース (A2XX) を購入し、細胞壁グリカンを標的とする新しい mAb アプローチを使用してテストしました。図 6 は、ビオチン化結合シグナルとオリゴ糖濃度の log 濃度との間に線形相関があることを示しており、Langmuir 吸着モデルの可能性を示唆しています。mAb の中で、CCRC-M137、CCRC-M138、CCRC-M147、CCRC-M148、および CCRC-M151 は XHE と相関し、CCRC-M108、CCRC-M109、および LM11 は 1 nm から 100 ナノの範囲で A2XX と相関しました。実験期間中は抗体の入手量が限られていたため、各オリゴ糖濃度での実験回数は限られていた。ここで留意すべきは、一部の抗体は同じオリゴ糖を基質として用いても反応が大きく異なる場合があることである。これはおそらく、抗体がわずかに異なるエピトープに結合し、結合親和性が大きく異なるためと考えられる。新しいモノクローナル抗体（mAb）アプローチを実際のサンプルに適用する際には、正確なエピトープ同定のメカニズムと意義ははるかに複雑になるだろう。
2種類の市販オリゴ糖を用いて、様々な糖鎖標的型モノクローナル抗体の検出範囲を決定した。図中、オリゴ糖濃度の対数との線形相関は、（A）モノクローナル抗体を用いたXHEおよび（B）モノクローナル抗体を用いたA2XXのラングミュア吸着パターンを示している。対応するエピトープは、アッセイの基質として使用した市販オリゴ糖の構造を示している。
グリカンを標的としたモノクローナル抗体（グリココミクス分析またはELISAベースのmAbスクリーニング）の使用は、植物バイオマスを構成する主要な細胞壁グリカンのほとんどを詳細に特徴付けるための強力なツールです。しかし、従来のグリカン分析では、ほとんどのオリゴ糖がELISAプレートに効率的に固定されないため、より大きな細胞壁グリカンしか特徴付けられません。この研究では、AFEX前処理したトウモロコシ茎葉を高固形分濃度で酵素加水分解しました。糖分析を使用して、加水分解物中の難分解性細胞壁炭水化物の組成を決定しました。しかし、加水分解物中のより小さなオリゴ糖のmAb分析は過小評価されており、オリゴ糖をELISAプレートに効果的に固定するための追加のツールが必要です。
本稿では、オリゴ糖のビオチン化とそれに続くNeutrAvidin™コートプレート上でのELISAスクリーニングを組み合わせた、モノクローナル抗体スクリーニングのための新規かつ効率的なオリゴ糖固定化法を報告する。固定化されたビオチン化オリゴ糖は抗体に対して十分な親和性を示し、難分解性オリゴ糖の迅速かつ効率的な検出を可能にした。質量分析法に基づくこれらの難分解性オリゴ糖の組成分析により、この新しい免疫スクリーニング法の有効性が確認された。したがって、これらの研究は、オリゴ糖のビオチン化とグリカン標的モノクローナル抗体を用いたELISAスクリーニングの組み合わせが、オリゴ糖の架橋を検出するために使用でき、オリゴ糖の構造を特徴付ける他の生化学的研究にも広く応用できることを示している。
このビオチンベースのグリカンプロファイリング法は、植物バイオマス中の可溶性オリゴ糖の難分解性糖鎖を解析できる初の報告です。これにより、バイオマスの一部がバイオ燃料生産においてなぜこれほど分解されにくいのかを理解する上で役立ちます。この方法は、グリコーム解析法の重要なギャップを埋め、植物オリゴ糖にとどまらず、より幅広い基質への応用を可能にします。将来的には、ビオチン化にロボット技術を用い、開発した方法をELISAを用いたサンプルのハイスループット解析に活用できる可能性があります。
パイオニア33A14ハイブリッド種子から栽培されたトウモロコシの茎（CS）は、2010年にコロラド州レイにあるクレイマー農場で収穫されました。地主の許可を得て、このバイオマスは研究目的で使用できます。 サンプルは、水分含有量6%未満の乾燥した状態で、ジップロック袋に入れて室温で保管した。 サンプルは、水分含有量6%未満の乾燥した状態で、ジップロック袋に入れて室温で保管した。 Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. サンプルは、室温で湿度6％未満の乾燥した状態で、ジッパー付き袋に入れて保管した。サンプルは、周囲温度で乾燥して＜６％の水分が密封袋内に存在した。サンプルを室温で乾燥 < 6% 6%未満です。 サンプルは、湿度6%未満の室温でジッパー付き袋に入れて保管する。本研究は、地域および国のガイドラインに準拠して実施されました。組成分析はNRELプロトコルを用いて行われました。その結果、グルカン31.4%、キシラン18.7%、アラビナン3.3%、ガラクトース1.2%、アセチル2.2%、リグニン14.3%、タンパク質1.7%、灰分13.4%が含まれていることが分かりました。
Cellic® CTec2（タンパク質138 mg/ml、ロットVCNI 0001）は、セルラーゼ、β-グルコシダーゼ、およびNovozymes（米国ノースカロライナ州フランクリン）製のCellic® HTec2（タンパク質157 mg/ml、ロットVHN00001）の複合混合物です。Multifect Pectinase®（タンパク質72 mg/mL）は、ペクチン分解酵素の複合ブレンドで、DuPont Industrial Biosciences（米国カリフォルニア州パロアルト）から提供されました。酵素タンパク質濃度は、ケルダール窒素分析（AOAC法2001.11、Dairy One Cooperative Inc.、米国ニューヨーク州イサカ）を使用してタンパク質含有量を推定し（非タンパク質窒素の寄与を差し引く）決定しました。珪藻土545はEMD Millipore（米国マサチューセッツ州ビレリカ）から購入しました。活性炭（DARCO社製、100メッシュ顆粒）、アビセル（PH-101）、ブナキシラン、およびその他のすべての化学物質は、Sigma-Aldrich社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
AFEX前処理はGLBRC（バイオマス変換研究室、ミシガン州立大学、ランシング、ミシガン州、米国）で行われた。前処理は140℃で15分間行われた。46滞留時間は、ステンレス鋼製卓上バッチリアクター（Parr Instruments Company）で、無水アンモニアとバイオマスの比率が1:1、負荷量が60%（w/w）の場合である。30分かかった。リアクターを140℃に上げると、アンモニアが急速に放出され、バイオマスがすぐに室温に戻ることができた。AFEX前処理したトウモロコシ茎葉（ACS）の組成は、未処理のトウモロコシ茎葉（UT-CS）の組成と類似していた。
高固形分ACSH 25% (w/w) (デキストラン含有量約8%) をオリゴ糖の大規模生産の出発原料として調製した。ACSの酵素加水分解は、Cellic® Ctec2 (前処理バイオマス中、タンパク質10 mg/gグルカン)、Htec2 (Novozymes、Franklinton、NC) (タンパク質5 mg/gグルカン)、およびMultifect Pectinase (Genencor Inc、USA) を含む市販の酵素混合物を使用して行った。酵素加水分解は、作業容量3リットル、pH 4.8、50℃、250 rpmの5リットルバイオリアクターで行った。 96時間加水分解した後、加水分解物を6000rpmで30分間、続いて14000rpmで30分間遠心分離して未加水分解固形物を除去し、加水分解物を回収した。その後、加水分解物を0.22mmフィルタービーカーで滅菌ろ過した。ろ過した加水分解物は滅菌ボトルに入れて4℃で保存し、その後炭素を用いて分画した。
NREL研究所の分析手順に従った抽出物ベースのバイオマスサンプルの組成分析：組成分析のためのサンプルの準備（NREL/TP-510-42620）およびバイオマス中の構造炭水化物とリグニンの決定（NREL/TP-510 – 42618）47。
加水分解物ストリームのオリゴ糖分析は、オートクレーブを用いた酸加水分解法を用いて2 mlスケールで実施した。加水分解物サンプルを10 mlスクリューキャップ付き培養チューブに入れ、72%硫酸69.7 µlと混合し、121℃のベンチトップで1時間インキュベートした後、氷上で冷却し、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）バイアルにろ過した。オリゴ糖の濃度は、酸加水分解サンプル中の総糖濃度から、加水分解前のサンプル中の単糖濃度を差し引くことで求めた。
酸加水分解したバイオマス中のグルコース、キシロース、アラビノースの濃度は、Bio-Rad Aminex HPX-87Hカラムにオートサンプラー、カラムヒーター、等速ポンプ、屈折率検出器を備えた島津HPLCシステムを使用して分析した。カラムは50℃に維持し、5 mM H2SO4水溶液を0.6 ml/minの流量で溶出した。
加水分解物の上清を希釈し、モノマーおよびオリゴ糖の含有量を分析した。酵素加水分解後に得られたモノマー糖は、Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P カラムおよび灰ガードカラムを備えた HPLC で分析した。カラム温度は 80 °C に維持し、移動相として水を使用し、流速は 0.6 ml/min とした。オリゴ糖は、文献 41、48、49 に記載されている方法に従って、121 °C の希酸中で加水分解することにより測定した。
糖分析は、生のバイオマス残渣、AFEX前処理したバイオマス残渣、および加水分解されていないすべてのバイオマス残渣（連続細胞壁抽出物の作製とそれらのmAbスクリーニングを含む）について、既述の手順27、43、50、51を使用して実施した。グリコーム分析では、バイオマス残渣から植物細胞壁物質のアルコール不溶性残渣を調製し、既述の手順52、53に従って、シュウ酸アンモニウム（50 mM）、炭酸ナトリウム（50 mMおよび0.5% w/v）、CON（1Mおよび4M、いずれも1% w/v水素化ホウ素ナトリウムを含む）、および亜塩素酸ナトリウムなどの、より攻撃的な試薬で連続抽出を行った。抽出物は、細胞壁グリカンを標的とする複合mAbパネル50に対してELISAにかけられ、mAb結合反応はヒートマップとして表示された。植物細胞壁グリカンを標的とするmAbは、研究室のストック（CCRC、JIMおよびMACシリーズ）から購入した。
オリゴ糖のワンステップビオチン化。炭水化物とビオチン-LC-ヒドラジドの結合は、以下の手順で行いました。ビオチン-LC-ヒドラジド（4.6 mg/12 μmol）をジメチルスルホキシド（DMSO、70 μl）に激しく撹拌しながら65℃で1分間加熱して溶解しました。氷酢酸（30 μl）を加え、混合物をシアノ水素化ホウ素ナトリウム（6.4 mg/100 μmol）に注ぎ、65℃で約1分間加熱して完全に溶解させました。次に、反応混合物5～8 μlを乾燥オリゴ糖（1～100 nmol）に加え、還元末端に対して10倍以上のモル過剰量の標識を得ました。反応は65℃で2時間行い、その後、サンプルを直ちに精製しました。還元を行わない標識実験ではシアノ水素化ホウ素ナトリウムは使用せず、試料は65℃で2.5時間反応させた。
ビオチン化オリゴ糖サンプルのELISAコーティングと洗浄。ビオチン化サンプル25 μl（各濃縮サンプル100 μlを0.1 Mトリス緩衝液（TBS）5 mlで希釈したもの）をアビジンコートプレートの各ウェルに加えた。コントロールウェルには、0.1 M TBS中の10 μg/ml濃度のビオチン50 μlをコーティングした。ブランク測定には脱イオン水をコーティングとして使用した。プレートを暗所で室温にて2時間インキュベートした。Grenier flat 3Aのプログラム番号11を使用して、0.1 M TBS中の0.1%脱脂粉乳でプレートを3回洗浄した。
一次抗体の添加と洗浄。各ウェルに40 µlの一次抗体を添加します。マイクロプレートを室温で暗所にて1時間インキュベートします。その後、Grenier Flat 3Aの洗浄プログラム#11を使用して、0.1M TBS中の0.1%ミルクでプレートを3回洗浄します。
二次抗体を加えて洗浄する。各ウェルにマウス/ラット二次抗体（0.1 M TBS中の0.1%ミルクで1:5000に希釈）を50 µl加える。マイクロプレートを暗所で室温にて1時間インキュベートする。その後、Grenier Flat 5Aプレート洗浄プログラム#12を用いて、0.1 M TBS中の0.1%ミルクでマイクロプレートを5回洗浄する。
基質の添加。 ベース基質（15 ml の脱イオン水に緩衝液 2 滴、TMB 3 滴、過酸化水素 2 滴を加える）に 3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン（TMB）50 µl を加える。 TMB 基質を準備する。 使用前にボルテックスする。 マイクロプレートを室温で 30 分間暗所でインキュベートする。
手順を完了し、タブレットを読み取ります。各ウェルに1N硫酸を50µl加え、ELISAリーダーを使用して450～655nmの吸光度を記録します。
アラビノース、ラムノース、フコース、キシロース、ガラクツロン酸（GalA）、グルクロン酸（GlcA）、マンノース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、N-アセチルマンノサミン（manNAc）、N-アセチルグルコサミン（glcNAc）、N-アセチルガラクトサミン（galNAc）、イノシトール（内部標準）の1 mg/ml溶液を脱イオン水で調製します。表1に示す1 mg/mLの糖溶液を加えて2つの標準溶液を調製しました。サンプルは凍結し、-80° Cで凍結乾燥して、すべての水分が除去されるまで（通常約12～18時間）乾燥させます。
分析天秤上で、スクリューキャップ付き試験管に100～500 µgの試料を加えます。添加量を記録してください。試料は特定の濃度の溶媒に溶解し、液体アリコートとして試験管に加えるのが最適です。各試料試験管には、内部標準として1 mg/mlのイノシトールを20 µl加えます。試料に加える内部標準の量は、標準試験管に加える内部標準の量と同じでなければなりません。
スクリューキャップ付きバイアルに無水メタノール8mlを加え、次に3Nメタノール性HCl溶液4mlを加え、蓋をして振とうする。この操作では水は使用しない。
オリゴ糖サンプルと標準TMSチューブに1 M HClメタノール溶液500 µlを加える。サンプルをサーマルブロックで80° Cで一晩（168時間）インキュベートする。乾燥マニホールドを使用して、室温でメタノリシス生成物を乾燥させる。200 µlのMeOHを加えて再び乾燥させる。このプロセスを2回繰り返す。サンプルに200 µlのメタノール、100 µlのピリジン、100 µlの無水酢酸を加えてよく混ぜる。サンプルを室温で30分間インキュベートし、乾燥させる。200 µlのメタノールを加えて再び乾燥させる。
200 µlのTri-Silを加え、蓋をしたチューブを80℃で20分間加熱した後、室温まで冷却します。乾燥マニホールドを使用して、サンプルを約50 µlの容量になるまでさらに乾燥させます。サンプルを完全に乾燥させなかったことに注意してください。
ヘキサン 2 ml を加え、ボルテックスでよく混ぜます。直径 5-3/4 インチのピペットの上にガラスウールを挿入して、パスツールピペット (5-8 mm) の先端にガラスウールを詰めます。サンプルを 3000 g で 2 分間遠心分離します。不溶性残渣は沈殿します。サンプルを 100-150 µl まで乾燥させます。約 1 μl の容量を、初期温度 80 °C、初期時間 2.0 分 (表 2) で GC-MS に注入します。