გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის.ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს შეზღუდული CSS მხარდაჭერა.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).იმავდროულად, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ გამოვიყვანთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
ახალი იმუნოლოგიური და მასის სპექტრომეტრიული მეთოდები მდგრადი ოლიგოსაქარიდების კომპლექსური ანალიზისთვის AFEX-ით წინასწარ დამუშავებულ სიმინდის საცხობში.ლიგნოცელულოზური ბიომასა არის წიაღისეული საწვავის მდგრადი ალტერნატივა და ფართოდ გამოიყენება ბიოტექნოლოგიების შესამუშავებლად ისეთი პროდუქტების წარმოებისთვის, როგორიცაა საკვები, საკვები, საწვავი და ქიმიკატები.ამ ტექნოლოგიების გასაღები არის კონკურენტუნარიანი პროცესების შემუშავება მცენარეთა უჯრედის კედლებში არსებული რთული ნახშირწყლების გარდაქმნის მარტივ შაქარად, როგორიცაა გლუკოზა, ქსილოზა და არაბინოზა.იმის გამო, რომ ლიგნოცელულოზური ბიომასა ძალიან ჯიუტია, მას უნდა დაექვემდებაროს თერმოქიმიური დამუშავება (მაგ., ამიაკის ბოჭკოების აქერცვლა (AFEX), განზავებული მჟავები (DA), იონური სითხეები (IL)) და ბიოლოგიური მკურნალობა (მაგ. ფერმენტული ჰიდროლიზი და მიკრობული დუღილი) კომბინაციაში სასურველი პროდუქტის მისაღებად..თუმცა, როდესაც კომერციული სოკოვანი ფერმენტები გამოიყენება ჰიდროლიზის პროცესში, წარმოქმნილი ხსნადი შაქრების მხოლოდ 75-85% არის მონოსაქარიდები, ხოლო დანარჩენი 15-25% არის ხსნადი, შეუპოვარი ოლიგოსაქარიდები, რომლებიც ყოველთვის არ არის ხელმისაწვდომი მიკროორგანიზმებისთვის.ადრე, ჩვენ წარმატებით გამოვყავით და გავასუფთავეთ ხსნადი ჯიუტი ოლიგოსაქარიდები ნახშირბადის და დიატომაური დედამიწის გამოყოფისა და ზომის გამორიცხვის ქრომატოგრაფიის კომბინაციის გამოყენებით და ასევე გამოვიკვლიეთ მათი ფერმენტის ინჰიბიტორული თვისებები.ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ოლიგოსაქარიდები, რომლებიც შეიცავს უფრო მაღალი ხარისხის პოლიმერიზაციის (DP) მეთილირებული ურონის მჟავის შემცვლელებს, უფრო რთული დასამუშავებელია კომერციული ფერმენტების ნარევებით, ვიდრე დაბალი DP და ნეიტრალური ოლიგოსაქარიდები.აქ ჩვენ ვახსენებთ რამდენიმე დამატებითი მეთოდის გამოყენებას, მათ შორის გლიკანის პროფილირებას მცენარეთა ბიომასის გლიკანებისთვის სპეციფიკური მონოკლონური ანტისხეულების (mAbs) გამოყენებით მცენარეთა უჯრედის კედლებში გლიკანური ობლიგაციების დასახასიათებლად და ფერმენტული ჰიდროლიზატების, მატრიქსის დახმარებით ლაზერული დეზორბციის იონიზაცია, ფრენის დროის მასსპტრომეტრია..MALDI-TOF-MS) იყენებს სტრუქტურულ-ინფორმაციულ დიაგნოსტიკურ მწვერვალებს, რომლებიც მიიღება სპექტროსკოპიით უარყოფითი იონების მეორადი დაშლის შემდეგ, გაზის ქრომატოგრაფიით და მასის სპექტრომეტრიით (GC-MS) ოლიგოსაქარიდული ბმების დასახასიათებლად დერივაზაციით და მის გარეშე.ოლიგოსაქარიდების მცირე ზომის გამო (DP 4-20), ამ მოლეკულების გამოყენება რთულია mAb-ის შესაერთებლად და დასახასიათებლად.ამ პრობლემის დასაძლევად, ჩვენ გამოვიყენეთ ბიოტინის კონიუგაციაზე დაფუძნებული ოლიგოსაქარიდის იმობილიზაციის ახალი მეთოდი, რომელმაც წარმატებით დაასახელა დაბალი DP ხსნადი ოლიგოსაქარიდების უმეტესობა მიკროფირფიტის ზედაპირზე, რომელიც შემდეგ გამოიყენებოდა მაღალი გამტარუნარიანობის mAb სისტემაში სპეციფიური ლიგაციის ანალიზისთვის.ეს ახალი მეთოდი ხელს შეუწყობს მომავალში უფრო მოწინავე მაღალი გამტარუნარიანობის გლიკომის ანალიზების შემუშავებას, რომლებიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას ბიომარკერებში არსებული ოლიგოსაქარიდების იზოლირებისთვის და დასახასიათებლად დიაგნოსტიკური მიზნებისთვის.
ლიგნოცელულოზური ბიომასა, რომელიც შედგება სასოფლო-სამეურნეო, სატყეო მეურნეობის, ბალახისა და მერქნიანი მასალებისგან, წარმოადგენს პოტენციურ საკვებს ბიოლოგიურად დაფუძნებული პროდუქტების, მათ შორის საკვების, საკვების, საწვავის და ქიმიური წინამორბედების წარმოებისთვის უფრო მაღალი ღირებულების პროდუქტების წარმოებისთვის1.მცენარეთა უჯრედის კედლებში არსებული ნახშირწყლები (როგორიცაა ცელულოზა და ჰემიცელულოზა) დეპოლიმერიზდება მონოსაქარიდებად ქიმიური დამუშავებისა და ბიოტრანსფორმაციის გზით (როგორიცაა ფერმენტული ჰიდროლიზი და მიკრობული დუღილი).გავრცელებული წინასწარი მკურნალობა მოიცავს ამიაკის ბოჭკოს გაფართოებას (AFEX), განზავებულ მჟავას (DA), იონურ სითხეს (IL) და ორთქლის აფეთქებას (SE), რომლებიც იყენებენ ქიმიკატების და სითბოს კომბინაციას ლიგნოცელულოზის წარმოების შესამცირებლად მცენარის უჯრედის კედლების გახსნით3,4.მატერიის სიჯიუტე, 5. ფერმენტული ჰიდროლიზი ტარდება მყარი ნივთიერებების მაღალი დატვირთვით კომერციული აქტიური ნახშირწყლების შემცველი ფერმენტების (CAZymes) გამოყენებით და მიკრობული დუღილი ტრანსგენური საფუარების ან ბაქტერიების გამოყენებით ბიო-დაფუძნებული საწვავის და ქიმიკატების წარმოებისთვის 6 .
კომერციულ ფერმენტებში CAZymes შედგება ფერმენტების რთული ნარევისგან, რომლებიც სინერგიულად წყვეტენ რთულ ნახშირწყალ-შაქრის ობლიგაციებს მონოსაქარიდების წარმოქმნით2,7.როგორც უკვე აღვნიშნეთ, ლიგნინის არომატული პოლიმერების რთული ქსელი ნახშირწყლებთან ერთად ხდის მათ უაღრესად გამძლეობას, რაც იწვევს შაქრის არასრულ გარდაქმნას, აგროვებს სქესობრივი ოლიგოსაქარიდების 15-25%-ს, რომლებიც არ წარმოიქმნება წინასწარ დამუშავებული ბიომასის ფერმენტული ჰიდროლიზის დროს.ეს არის საერთო პრობლემა ბიომასის წინასწარი დამუშავების სხვადასხვა მეთოდებთან დაკავშირებით.ამ შეფერხების ზოგიერთი მიზეზი მოიცავს ჰიდროლიზის დროს ფერმენტების ინჰიბირებას, ან არსებითი არსებითი ფერმენტების არარსებობას ან დაბალ დონეს, რომლებიც საჭიროა მცენარის ბიომასაში შაქრის ობლიგაციების დასაშლელად.შაქრის შემადგენლობისა და სტრუქტურული მახასიათებლების გაგება, როგორიცაა შაქრის ბმები ოლიგოსაქარიდებში, დაგვეხმარება გავაუმჯობესოთ შაქრის კონვერტაცია ჰიდროლიზის დროს, რაც ბიოტექნოლოგიურ პროცესებს კონკურენტუნარიანს გახდის ნავთობისგან წარმოებულ პროდუქტებთან შედარებით.
ნახშირწყლების სტრუქტურის დადგენა რთულია და მოითხოვს ისეთი მეთოდების კომბინაციას, როგორიცაა თხევადი ქრომატოგრაფია (LC)11,12, ბირთვული მაგნიტურ-რეზონანსული სპექტროსკოპია (NMR)13, კაპილარული ელექტროფორეზი (CE)14,15,16 და მასის სპექტრომეტრია (MS)17., თვრამეტი.MS მეთოდები, როგორიცაა ფრენის დროის მასის სპექტრომეტრია ლაზერული დეზორბციით და იონიზაციით მატრიცის გამოყენებით (MALDI-TOF-MS) ნახშირწყლების სტრუქტურების იდენტიფიცირების მრავალმხრივი მეთოდია.ბოლო დროს ნატრიუმის იონური დანამატების შეჯახებით გამოწვეული დისოციაციის (CID) ტანდემი MS ყველაზე ფართოდ იქნა გამოყენებული თითის ანაბეჭდების იდენტიფიცირებისთვის, რომლებიც შეესაბამება ოლიგოსაქარიდის მიმაგრების პოზიციებს, ანომერულ კონფიგურაციებს, თანმიმდევრობებს და განშტოების პოზიციებს 20, 21.
გლიკანის ანალიზი არის შესანიშნავი ინსტრუმენტი ნახშირწყლების ბმების სიღრმისეული იდენტიფიკაციისთვის22.ეს მეთოდი იყენებს მონოკლონურ ანტისხეულებს (mAbs), რომლებიც მიმართულია მცენარის უჯრედის კედლის გლიკანზე, როგორც ზონდებს რთული ნახშირწყლების კავშირების გასაგებად.250-ზე მეტი mAbs ხელმისაწვდომია მთელ მსოფლიოში, რომლებიც შექმნილია სხვადასხვა ხაზოვანი და განშტოებული ოლიგოსაქარიდების წინააღმდეგ, სხვადასხვა საქარიდების გამოყენებით24.რამდენიმე mAbs ფართოდ იქნა გამოყენებული მცენარის უჯრედის კედლის სტრუქტურის, შემადგენლობისა და მოდიფიკაციების დასახასიათებლად, რადგან არსებობს მნიშვნელოვანი განსხვავებები მცენარის უჯრედის ტიპის, ორგანოს, ასაკის, განვითარების სტადიისა და ზრდის გარემოს მიხედვით25,26.ახლახან, ეს მეთოდი გამოიყენებოდა მცენარეთა და ცხოველთა სისტემებში ვეზიკულების პოპულაციების გასაგებად და გლიკანის ტრანსპორტში მათი შესაბამისი როლის გასაგებად, როგორც ეს განისაზღვრება უჯრედული მარკერებით, განვითარების ეტაპებით ან გარემოს სტიმულებით, ასევე ფერმენტული აქტივობის დასადგენად.გლიკანებისა და ქსილანების ზოგიერთი სხვადასხვა სტრუქტურა, რომლებიც იდენტიფიცირებულია, მოიცავს პექტინს (P), ქსილანს (X), მანანს (M), ქსილოგლუკანებს (XylG), შერეული ბმა გლუკანებს (MLG), არაბინოქსილანს (ArbX), გალაქტომანანს (GalG), გლუკურონის მჟავა-არაბინოქსილანს (GA.rbA-GA) და 9.rbAnoxylan a.
თუმცა, მიუხედავად ყველა ამ კვლევის ძალისხმევისა, მხოლოდ რამდენიმე კვლევა იყო ფოკუსირებული ოლიგოსაქარიდების დაგროვების ბუნებაზე მაღალი მყარი დატვირთვის (HSL) ჰიდროლიზის დროს, მათ შორის ოლიგოსაქარიდის გამოყოფა, ოლიგომერული ჯაჭვის სიგრძის ცვლილებები ჰიდროლიზის დროს, სხვადასხვა დაბალი DP პოლიმერები და მათი მრუდები.განაწილებები 30,31,32.იმავდროულად, მიუხედავად იმისა, რომ გლიკანის ანალიზი აღმოჩნდა სასარგებლო ინსტრუმენტი გლიკანის სტრუქტურის ყოვლისმომცველი ანალიზისთვის, ძნელია წყალში ხსნადი დაბალი DP ოლიგოსაქარიდების შეფასება ანტისხეულების მეთოდების გამოყენებით.უფრო მცირე DP ოლიგოსაქარიდები, რომელთა მოლეკულური წონა 5-10 კდ-ზე ნაკლებია, არ უკავშირდება ELISA ფირფიტებს 33, 34 და გამოირეცხება ანტისხეულების დამატებამდე.
აქ, პირველად, ჩვენ ვაჩვენეთ ELISA ანალიზს ავიდინით დაფარულ ფირფიტებზე მონოკლონური ანტისხეულების გამოყენებით, რომელიც აერთიანებს ხსნადი ცეცხლგამძლე ოლიგოსაქარიდების ერთსაფეხურიანი ბიოტინილაციის პროცედურას გლიკომის ანალიზთან.ჩვენი მიდგომა გლიკომის ანალიზისადმი დადასტურებული იყო MALDI-TOF-MS და GC-MS დაფუძნებული ანალიზით დამატებითი ოლიგოსაქარიდული კავშირების გამოყენებით ჰიდროლიზებული შაქრის კომპოზიციების ტრიმეთილსილილის (TMS) დერივატიზაციის გამოყენებით.ეს ინოვაციური მიდგომა მომავალში შეიძლება განვითარდეს, როგორც მაღალი წარმადობის მეთოდი და უფრო ფართო გამოყენება ჰპოვოს ბიოსამედიცინო კვლევებში35.
ფერმენტების და ანტისხეულების შემდგომი ტრანსლაციური ცვლილებები, როგორიცაა გლიკოზილირება36, გავლენას ახდენს მათ ბიოლოგიურ აქტივობაზე.მაგალითად, შრატის ცილების გლიკოზილაციის ცვლილებები მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ანთებითი ართრიტის დროს, ხოლო გლიკოზილაციის ცვლილებები გამოიყენება დიაგნოსტიკური მარკერების სახით37.ლიტერატურაში მოხსენებულია, რომ სხვადასხვა გლიკანები ადვილად ვლინდება სხვადასხვა დაავადებებში, მათ შორის კუჭ-ნაწლავის ტრაქტისა და ღვიძლის ქრონიკული ანთებითი დაავადებები, ვირუსული ინფექციები, საკვერცხეების, სარძევე ჯირკვლის და პროსტატის კიბო38,39,40.გლიკანების სტრუქტურის გაგება ანტისხეულებზე დაფუძნებული გლიკანური ELISA მეთოდების გამოყენებით უზრუნველყოფს დაავადების დიაგნოსტიკის დამატებით ნდობას MS რთული მეთოდების გამოყენების გარეშე.
ჩვენმა წინა კვლევამ აჩვენა, რომ ჯიუტი ოლიგოსაქარიდები რჩებოდა უჰიდროლიზებული წინასწარი დამუშავებისა და ფერმენტული ჰიდროლიზის შემდეგ (სურათი 1).ჩვენს ადრე გამოქვეყნებულ ნაშრომში, ჩვენ შევიმუშავეთ გააქტიურებული ნახშირის მყარი ფაზის ექსტრაქციის მეთოდი ოლიგოსაქარიდების იზოლირებისთვის AFEX-ს წინასწარ დამუშავებული სიმინდის ჰიდროლიზატიდან (ACSH)8.თავდაპირველი ექსტრაქციისა და გამოყოფის შემდეგ, ოლიგოსაქარიდები შემდგომ დანაწილდა ზომის გამორიცხვის ქრომატოგრაფიით (SEC) და შეგროვდა მოლეკულური წონის მიხედვით.შაქრის მონომერები და ოლიგომერები გამოთავისუფლებული სხვადასხვა წინასწარი დამუშავების შედეგად გაანალიზდა შაქრის შემადგენლობის ანალიზით.სხვადასხვა წინასწარი დამუშავების მეთოდებით მიღებული შაქრის ოლიგომერების შემცველობის შედარებისას, ჯიუტი ოლიგოსაქარიდების არსებობა საერთო პრობლემაა ბიომასის მონოსაქარიდებად გარდაქმნისას და შეიძლება გამოიწვიოს შაქრის მოსავლიანობის შემცირება მინიმუმ 10-15% და 18%-მდეც კი.ᲩᲕᲔᲜ.ეს მეთოდი გამოიყენება ოლიგოსაქარიდის ფრაქციების შემდგომი ფართომასშტაბიანი წარმოებისთვის.მიღებული ACH და მისი შემდგომი ფრაქციები სხვადასხვა მოლეკულური წონით გამოიყენებოდა ექსპერიმენტულ მასალად ოლიგოსაქარიდების დასახასიათებლად ამ ნაშრომში.
წინასწარი დამუშავებისა და ფერმენტული ჰიდროლიზის შემდეგ, მდგრადი ოლიგოსაქარიდები რჩებოდა უჰიდროლიზებული.აქ (A) არის ოლიგოსაქარიდების გამოყოფის მეთოდი, რომლის დროსაც ოლიგოსაქარიდები იზოლირებულია AFEX-ს წინასწარ დამუშავებული სიმინდის ჰიდროლიზატისგან (ACSH) გააქტიურებული ნახშირბადის და დიატომიური მიწის შეფუთული ფსკერის გამოყენებით;(B) ოლიგოსაქარიდების გამოყოფის მეთოდი.ოლიგოსაქარიდები შემდგომში გამოყოფილი იყო ზომის გამორიცხვის ქრომატოგრაფიით (SEC);(C) საქარიდული მონომერები და ოლიგომერები, რომლებიც გამოიყოფა სხვადასხვა წინასწარი დამუშავებისგან (განზავებული მჟავა: DA, იონური სითხე: IL და AFEX).ფერმენტული ჰიდროლიზის პირობები: მაღალი მყარი დატვირთვა 25% (w/w) (დაახლოებით 8% გლუკანის დატვირთვა), 96 საათის ჰიდროლიზი, 20 მგ/გ კომერციული ფერმენტის დატვირთვა (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 თანაფარდობა) და (D) შაქრის მონომერები და გლუკოზერენოზირებული ქორმოერები და გლუკოატრობინოზა-ექსჰომერები მეტი (ACS).
გლიკანის ანალიზი დადასტურდა, რომ არის სასარგებლო ინსტრუმენტი გლიკანების კომპლექსური სტრუქტურული ანალიზისთვის მყარი ბიომასის ნარჩენებისგან იზოლირებულ ექსტრაქტებში.თუმცა, წყალში ხსნადი საქარიდები ნაკლებად არის წარმოდგენილი ამ ტრადიციული მეთოდის გამოყენებით41, რადგან დაბალი მოლეკულური წონის ოლიგოსაქარიდები ძნელია იმობილიზაცია ELISA ფირფიტებზე და გამოირეცხება ანტისხეულების დამატებამდე.ამიტომ, ანტისხეულების შეკავშირებისა და დახასიათებისთვის, გამოყენებული იქნა ერთსაფეხურიანი ბიოტინილაციის მეთოდი ავიდინით დაფარულ ELISA ფირფიტებზე ხსნადი, შეუსაბამო ოლიგოსაქარიდების დასაფარად.ეს მეთოდი შემოწმდა ჩვენი ადრე წარმოებული ACSH და ფრაქციის გამოყენებით, რომელიც ეფუძნება მის მოლეკულურ წონას (ან პოლიმერიზაციის ხარისხს, DP).ერთსაფეხურიანი ბიოტინილაცია გამოყენებული იყო ოლიგოსაქარიდებთან შეკავშირების აფინურობის გასაზრდელად ბიოტინ-LC-ჰიდრაზიდის დამატებით ნახშირწყლების რედუქციულ ბოლოში (ნახ. 2).ხსნარში ჰემიაცეტალის ჯგუფი შემცირების ბოლოში რეაგირებს ბიოტინ-LC-ჰიდრაზიდის ჰიდრაზიდურ ჯგუფთან ჰიდრაზონის ბმის წარმოქმნით.შემცირების აგენტის NaCNBH3 თანდასწრებით, ჰიდრაზონის ბმა მცირდება სტაბილურად ბიოტინილირებულ საბოლოო პროდუქტად.შაქრის შემცირების დასასრულის მოდიფიკაციით შესაძლებელი გახდა დაბალი DP ოლიგოსაქარიდების შეერთება ELISA ფირფიტებთან და ჩვენს კვლევაში ეს გაკეთდა ავიდინით დაფარულ ფირფიტებზე გლიკანზე დამიზნებული mAbs-ების გამოყენებით.
მონოკლონური ანტისხეულების სკრინინგი ELISA-ზე დაფუძნებული ბიოტინილირებული ოლიგოსაქარიდებისთვის.აქ (A) ოლიგოსაქარიდების კომბინირებული ბიოტინილაცია და შემდგომი ELISA სკრინინგი გლიკანზე დამიზნებული mAbs-ებით ნეიტრავიდინით დაფარულ ფირფიტებზე და (B) აჩვენებს რეაქციის პროდუქტების ბიოტინილაციის ერთსაფეხურიან პროცედურას.
ავიდინით დაფარული ფირფიტები ოლიგოსაქარიდით კონიუგირებული ანტისხეულებით შემდეგ დაემატა პირველად და მეორად ანტისხეულებს და გარეცხეს სინათლისა და დროისადმი მგრძნობიარე გარემოში.ანტისხეულების დაკავშირების დასრულების შემდეგ, დაამატეთ TMB სუბსტრატი ფირფიტის ინკუბაციისთვის.რეაქცია საბოლოოდ შეწყდა გოგირდის მჟავით.ინკუბირებული ფირფიტები გაანალიზდა ELISA მკითხველის გამოყენებით, რათა განესაზღვრათ თითოეული ანტისხეულის შეკავშირების სიძლიერე ანტისხეულების სპეციფიკური ჯვარედინი კავშირის გამოსავლენად.ექსპერიმენტის დეტალებისა და პარამეტრებისთვის იხილეთ შესაბამისი სექცია „მასალები და მეთოდები“.
ჩვენ ვაჩვენებთ ამ ახლად შემუშავებული მეთოდის სარგებლობას სპეციფიკური აპლიკაციებისთვის ACSH-ში არსებული ხსნადი ოლიგოსაქარიდების დახასიათებით, ისევე როგორც ნედლი და გაწმენდილი ოლიგოსაქარიდების ფრაქციებში, რომლებიც იზოლირებულია ლიგნოცელულოზური ჰიდროლიზატებიდან.როგორც სურათი 3-ზეა ნაჩვენები, ყველაზე გავრცელებული ეპიტოპით შემცვლელი ქსილანები, რომლებიც იდენტიფიცირებულია ACSH-ში ბიოაცილირებული გლიკომის ანალიზის მეთოდების გამოყენებით, ჩვეულებრივ, არის ურონიული (U) ან მეთილურონი (MeU) და პექტიური არაბინოგალაქტანები.მათი უმეტესობა ასევე იქნა ნაპოვნი ჩვენს წინა კვლევაში არაჰიდროლიზებული მყარი ნივთიერებების გლიკანების ანალიზში (UHS)43.
მონოკლონური ანტისხეულის გამოყენებით, რომელიც მიმართულია უჯრედის კედლის გლიკანისკენ მიმართული ოლიგოსაქარიდული ეპიტოპების გამოვლენა."ნეიტრალური" ფრაქცია არის ACN ფრაქცია და "მჟავე" ფრაქცია არის FA ფრაქცია.სითბოს რუქაზე უფრო ნათელი წითელი მიუთითებს ეპიტოპის მაღალ შემცველობაზე, ხოლო ნათელი ლურჯი მიუთითებს ცარიელ ფონზე.ფერის მნიშვნელობები შკალაზე დაფუძნებულია ნედლი OD მნიშვნელობებზე N=2 ფორმულირებისთვის.ანტისხეულების მიერ აღიარებული ძირითადი ეპიტოპები ნაჩვენებია მარჯვნივ.
ამ არაცელულოზური სტრუქტურების დაშლა შეუძლებელია ყველაზე გავრცელებული ცელულაზებით და ჰემიცელულაზებით შემოწმებულ კომერციულ ფერმენტულ ნარევში, რომელიც მოიცავს ყველაზე ხშირად გამოყენებულ კომერციულ ფერმენტებს.ამიტომ, მათი ჰიდროლიზისთვის საჭიროა ახალი დამხმარე ფერმენტები.აუცილებელი არაცელულოზური დამხმარე ფერმენტების გარეშე, ეს არაცელულოზური ბმები ხელს უშლის სრულ გარდაქმნას მონოსაქარიდებად, მაშინაც კი, თუ მათი ძირითადი შაქრის პოლიმერები ინტენსიურად ჰიდროლიზდება უფრო მოკლე ფრაგმენტებად და იხსნება კომერციული ფერმენტული ნარევების გამოყენებით.
სიგნალის განაწილებისა და მისი შეკვრის სიძლიერის შემდგომმა კვლევამ აჩვენა, რომ შემაკავშირებელი ეპიტოპები უფრო დაბალია მაღალი DP შაქრის ფრაქციებში (A, B, C, DP 20+-მდე), ვიდრე დაბალი DP ფრაქციებში (D, E, F, DP) დიმერებში) (ნახ. 1).მჟავა ფრაგმენტები უფრო ხშირია არაცელულოზის ეპიტოპებში, ვიდრე ნეიტრალური ფრაგმენტები.ეს ფენომენი შეესაბამება ჩვენს წინა კვლევაში დაფიქსირებულ ნიმუშს, სადაც მაღალი DP და მჟავა ნაწილაკები უფრო მდგრადი იყო ფერმენტული ჰიდროლიზის მიმართ.აქედან გამომდინარე, არაცელულოზური გლიკანის ეპიტოპების და U და MeU ჩანაცვლების არსებობამ შეიძლება მნიშვნელოვნად შეუწყოს ხელი ოლიგოსაქარიდების სტაბილურობას.უნდა აღინიშნოს, რომ შებოჭვისა და გამოვლენის ეფექტურობა შეიძლება იყოს პრობლემური დაბალი DP ოლიგოსაქარიდებისთვის, განსაკუთრებით თუ ეპიტოპი არის დიმერული ან ტრიმერული ოლიგოსაქარიდი.ეს შეიძლება შემოწმდეს სხვადასხვა სიგრძის კომერციული ოლიგოსაქარიდების გამოყენებით, თითოეული შეიცავს მხოლოდ ერთ ეპიტოპს, რომელიც აკავშირებს კონკრეტულ mAb-ს.
ამრიგად, სტრუქტურისთვის სპეციფიკური ანტისხეულების გამოყენებამ გამოავლინა გარკვეული ტიპის რეკალციტრული ობლიგაციები.გამოყენებული ანტისხეულების ტიპზე, ლიგაციის შესაბამის შაბლონზე და მის მიერ წარმოქმნილ სიგნალის სიძლიერეზე (ყველაზე მეტად და ნაკლებად უხვი), შესაძლებელია ახალი ფერმენტების იდენტიფიცირება და ნახევრად რაოდენობრივად დამატება ფერმენტულ ნარევში უფრო სრული გლიკოკონვერტაციისთვის.მაგალითად, ACSH ოლიგოსაქარიდების ანალიზით, ჩვენ შეგვიძლია შევქმნათ გლიკანური ობლიგაციების მონაცემთა ბაზა თითოეული ბიომასის მასალისთვის.აქვე უნდა აღინიშნოს, რომ მხედველობაში უნდა იქნას მიღებული ანტისხეულების განსხვავებული აფინურობა და თუ მათი აფინურობა უცნობია, ეს გარკვეულ სირთულეებს შექმნის სხვადასხვა ანტისხეულების სიგნალების შედარებისას.გარდა ამისა, გლიკანური ბმების შედარება შეიძლება საუკეთესოდ მუშაობდეს იმავე ანტისხეულების ნიმუშებს შორის.ეს ჯიუტი ობლიგაციები შეიძლება შემდეგ დაუკავშირდეს CAZyme მონაცემთა ბაზას, საიდანაც შეგვიძლია გამოვავლინოთ ფერმენტები, შევარჩიოთ კანდიდატი ფერმენტები და შევამოწმოთ ბმის დამრღვევი ფერმენტები, ან განვავითაროთ მიკრობული სისტემები ამ ფერმენტების გამოსახატავად ბიოფინერიებში გამოსაყენებლად44.
იმის შესაფასებლად, თუ როგორ ავსებს იმუნოლოგიური მეთოდები ლიგნოცელულოზულ ჰიდროლიზატებში არსებული დაბალი მოლეკულური წონის ოლიგოსაქარიდების დახასიათების ალტერნატიულ მეთოდებს, ჩვენ ჩავატარეთ MALDI (ნახ. 4, S1-S8) და TMS-გან მიღებული საქარიდების ანალიზი GC-MS-ზე დაფუძნებული იმავე პანელზე (ნახ. 5) ოლიგოსაქარიდის ნაწილზე.MALDI გამოიყენება შესადარებლად ემთხვევა თუ არა ოლიგოსაქარიდის მოლეკულების მასობრივი განაწილება დანიშნულ სტრუქტურას.ნახ.4 გვიჩვენებს ACN-A და ACN-B ნეიტრალური კომპონენტების MS.ACN-A ანალიზმა დაადასტურა პენტოზა შაქრების დიაპაზონი DP 4-8 (ნახ. 4) DP 22-მდე (ნახ. S1), რომლის წონა შეესაბამება MeU-ქსილან ოლიგოსაქარიდებს.ACN-B ანალიზმა დაადასტურა პენტოზისა და გლუკოქსილანის სერიები DP 8-15-ით.დამატებით მასალაში, როგორიცაა სურათი S3, FA-C მჟავე ნაწილის მასის განაწილების რუქებზე ნაჩვენებია (Me)U ჩანაცვლებული პენტოზა შაქრების დიაპაზონი DP 8-15-ით, რომლებიც შეესაბამება ELISA-ზე დაფუძნებული mAb სკრინინგში ნაპოვნი ჩანაცვლებულ ქსილანებს.ეპიტოპები თანმიმდევრულია.
ACS-ში არსებული ხსნადი არათანაბარი ოლიგოსაქარიდების MALDI-MS სპექტრი.აქ, (A) ACN-A დაბალი წონის დიაპაზონის ფრაქციები, რომლებიც შეიცავენ მეთილირებულ ურონის მჟავას (DP 4-8) ჩანაცვლებულ გლუკუროქსილანის ოლიგოსაქარიდებს და (B) ACN-B ქსილანს და მეთილირებული ურონის მჟავას ოლიგოსაქარიდებს, ჩანაცვლებული გლუკუროქსილანით (DP 8-15).
ცეცხლგამძლე ოლიგოსაქარიდების გლიკანური ნარჩენების შემადგენლობის ანალიზი.აქ (A) GC-MS ანალიზის გამოყენებით მიღებული სხვადასხვა ოლიგოსაქარიდული ფრაქციების TMS საქარიდული შემადგენლობა.(B) ოლიგოსაქარიდებში არსებული TMS-დან მიღებული სხვადასხვა შაქრის სტრუქტურები.ACN - აცეტონიტრილის ფრაქცია, რომელიც შეიცავს ნეიტრალურ ოლიგოსაქარიდებს და FA - ფერულის მჟავას ფრაქცია, რომელიც შეიცავს მჟავა ოლიგოსაქარიდებს.
კიდევ ერთი საინტერესო დასკვნა იქნა გამოტანილი ოლიგოსაქარიდის ფრაქციის LC-MS ანალიზიდან, როგორც ნაჩვენებია სურათზე S9 (მეთოდები ჩანს ელექტრონულ დამატებით მასალაში).ჰექსოზის და -OAc ჯგუფების ფრაგმენტები არაერთხელ დაფიქსირდა ACN-B ფრაქციის ლიგაციის დროს.ეს აღმოჩენა არა მხოლოდ ადასტურებს გლიკომისა და MALDI-TOF ანალიზში დაფიქსირებულ ფრაგმენტაციას, არამედ გვაწვდის ახალ ინფორმაციას ნახშირწყლების პოტენციური წარმოებულების შესახებ წინასწარ დამუშავებულ ლიგნოცელულოზურ ბიომასაში.
ჩვენ ასევე ჩავატარეთ ოლიგოსაქარიდული ფრაქციების გლიკანური შემადგენლობის ანალიზი TMS გლიკანის წარმოებულების გამოყენებით.GC-MS-ის გამოყენებით განვსაზღვრეთ ნერვული (არაწარმოებული) და მჟავე შაქრების (GluA და GalA) შემადგენლობა ოლიგოსაქარიდულ ფრაქციაში (ნახ. 5).გლუკურონის მჟავა გვხვდება მჟავე კომპონენტებში C და D, ხოლო გალაქტურონის მჟავა გვხვდება მჟავე კომპონენტებში A და B, რომლებიც მჟავე შაქრის მაღალი DP კომპონენტებია.ეს შედეგები არა მხოლოდ ადასტურებს ჩვენს ELISA და MALDI მონაცემებს, არამედ შეესაბამება ჩვენს წინა კვლევებს ოლიგოსაქარიდების დაგროვების შესახებ.აქედან გამომდინარე, მიგვაჩნია, რომ თანამედროვე იმუნოლოგიური მეთოდები ოლიგოსაქარიდების ბიოტინილაციისა და შემდგომი ELISA სკრინინგის გამოყენებით საკმარისია სხვადასხვა ბიოლოგიურ ნიმუშებში ხსნადი რეკალციტრატული ოლიგოსაქარიდების გამოსავლენად.
მას შემდეგ, რაც ELISA-ზე დაფუძნებული mAb სკრინინგის მეთოდები დადასტურებულია რამდენიმე განსხვავებული მეთოდით, ჩვენ გვინდოდა შემდგომ შეგვესწავლა ამ ახალი რაოდენობრივი მეთოდის პოტენციალი.ორი კომერციული ოლიგოსაქარიდი, ქსილოჰექსასაქარიდი ოლიგოსაქარიდი (XHE) და 23-α-L-არაბინოფურანოზილ-ქსილოტრიოზა (A2XX), შეძენილი იქნა და ტესტირება ახალი mAb მიდგომის გამოყენებით, რომელიც მიზნად ისახავს უჯრედის კედლის გლიკანს.სურათი 6 გვიჩვენებს წრფივ კორელაციას ბიოტინილირებულ შემაკავშირებელ სიგნალსა და ოლიგოსაქარიდის კონცენტრაციის ლოგის კონცენტრაციას შორის, რაც ვარაუდობს ლანგმუირის ადსორბციის შესაძლო მოდელს.mAbs-ებს შორის, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 და CCRC-M151 კორელირებულია XHE-სთან, და CCRC-M108, CCRC-M109 და LM11 კორელირებულია A2XXnm-თან na01-მდე დიაპაზონში.ექსპერიმენტის დროს ანტისხეულების შეზღუდული ხელმისაწვდომობის გამო, შეზღუდული ექსპერიმენტები ჩატარდა თითოეული ოლიგოსაქარიდის კონცენტრაციით.აქვე უნდა აღინიშნოს, რომ ზოგიერთი ანტისხეული ძალიან განსხვავებულად რეაგირებს ერთსა და იმავე ოლიგოსაქარიდზე, როგორც სუბსტრატს, სავარაუდოდ იმიტომ, რომ ისინი აკავშირებენ ოდნავ განსხვავებულ ეპიტოპებს და შეიძლება ჰქონდეთ ძალიან განსხვავებული დამაკავშირებელი კავშირები.ეპიტოპის ზუსტი იდენტიფიკაციის მექანიზმები და შედეგები ბევრად უფრო რთული იქნება, როდესაც ახალი mAb მიდგომა გამოყენებული იქნება რეალურ ნიმუშებზე.
ორი კომერციული ოლიგოსაქარიდი გამოიყენებოდა სხვადასხვა გლიკანის დამიზნების mAb-ების გამოვლენის დიაპაზონის დასადგენად.აქ, წრფივი კორელაციები ოლიგოსაქარიდის კონცენტრაციის ლოგის კონცენტრაციასთან მიუთითებს ლანგმუირის ადსორბციის შაბლონებზე (A) XHE-სთვის mAb-ით და (B) A2XX-ისთვის mAb-ით.შესაბამისი ეპიტოპები მიუთითებს კომერციული ოლიგოსაქარიდების სტრუქტურებზე, რომლებიც გამოიყენება ანალიზში სუბსტრატებად.
გლიკანზე დამიზნებული მონოკლონური ანტისხეულების გამოყენება (გლიკოკომიკური ანალიზი ან ELISA-ზე დაფუძნებული mAb სკრინინგი) მძლავრი ინსტრუმენტია უჯრედის კედლის ძირითადი გლიკანების უმეტესობის სიღრმისეული დასახასიათებლად, რომლებიც ქმნიან მცენარეთა ბიომასას.თუმცა, კლასიკური გლიკანური ანალიზი ახასიათებს მხოლოდ უჯრედის კედლის უფრო დიდ გლიკანებს, რადგან ოლიგოსაქარიდების უმეტესობა არ არის ეფექტურად იმობილიზაცია ELISA ფირფიტებზე.ამ კვლევაში, AFEX-ით წინასწარ დამუშავებული სიმინდის ღუმელი ფერმენტულად ჰიდროლიზებული იყო მყარი ნივთიერებების მაღალი შემცველობით.შაქრის ანალიზი გამოიყენებოდა ჰიდროლიზატში უჯრედის კედლის გამძლე ნახშირწყლების შემადგენლობის დასადგენად.თუმცა, ჰიდროლიზატებში უფრო მცირე ოლიგოსაქარიდების mAb ანალიზი არ არის შეფასებული და საჭიროა დამატებითი ხელსაწყოები ELISA ფირფიტებზე ოლიგოსაქარიდების ეფექტური იმობილიზაციისთვის.
ჩვენ აქ ვახსენებთ ახალ და ეფექტურ ოლიგოსაქარიდის იმობილიზაციის მეთოდს mAb სკრინინგისთვის ოლიგოსაქარიდის ბიოტინილირების კომბინაციით, რასაც მოჰყვება ELISA სკრინინგი NeutrAvidin™ დაფარულ ფირფიტებზე.იმობილიზებულმა ბიოტინილირებულმა ოლიგოსაქარიდებმა აჩვენეს საკმარისი მიდრეკილება ანტისხეულების მიმართ, რათა უზრუნველყოფილიყო სწრაფი და ეფექტური გამოვლენა არასტაბილური ოლიგოსაქარიდები.ამ ჯიუტი ოლიგოსაქარიდების შემადგენლობის ანალიზმა მასსპექტრომეტრიაზე დაფუძნებული დაადასტურა იმუნოსკრინინგის ამ ახალი მიდგომის შედეგები.ამრიგად, ეს კვლევები აჩვენებს, რომ ოლიგოსაქარიდის ბიოტინილაციისა და ELISA სკრინინგის კომბინაცია გლიკანზე დამიზნებულ მონოკლონურ ანტისხეულებთან შეიძლება გამოყენებულ იქნას ოლიგოსაქარიდებში ჯვარედინი ბმულების გამოსავლენად და შეიძლება ფართოდ იქნას გამოყენებული სხვა ბიოქიმიურ კვლევებში, რომლებიც ახასიათებს ოლიგოსაქარიდების სტრუქტურას.
ეს ბიოტინზე დაფუძნებული გლიკანის პროფილირების მეთოდი არის პირველი ანგარიში, რომელსაც შეუძლია გამოიკვლიოს ხსნადი ოლიგოსაქარიდების უხეში ნახშირწყლების ბმები მცენარეთა ბიომასაში.ეს გვეხმარება იმის გაგებაში, თუ რატომ არის ბიომასის ზოგიერთი ნაწილი ასე ჯიუტი, როდესაც საქმე ეხება ბიოსაწვავის წარმოებას.ეს მეთოდი ავსებს მნიშვნელოვან ხარვეზს გლიკომის ანალიზის მეთოდებში და ავრცელებს მის გამოყენებას სუბსტრატების ფართო სპექტრზე, მცენარეული ოლიგოსაქარიდების მიღმა.მომავალში, ჩვენ შეიძლება გამოვიყენოთ რობოტიკა ბიოტინილირებისთვის და გამოვიყენოთ ჩვენ მიერ შემუშავებული მეთოდი ELISA-ს გამოყენებით ნიმუშების მაღალი გამტარუნარიანობის ანალიზისთვის.
Pioneer 33A14 ჰიბრიდული თესლიდან მოყვანილი სიმინდის ჩალა (CS) მოკრეფილი იქნა 2010 წელს კრამერის ფერმებიდან რეიში, კოლორადო.მიწის მესაკუთრის ნებართვით, ამ ბიომასის გამოყენება შესაძლებელია კვლევისთვის. ნიმუშები ინახებოდა მშრალ <6% ტენიანობის საცობებში, ოთახის ტემპერატურაზე. ნიმუშები ინახებოდა მშრალ <6% ტენიანობის საცობებში, ოთახის ტემპერატურაზე. Образцы храниль сухими при влажности < 6% პაკეტში სასტეჟკოй-молнией при комнатной ტემპერატურა. ნიმუშები ინახებოდა მშრალ <6% ტენიანობაზე ელვაშეკრულ ჩანთებში ოთახის ტემპერატურაზე.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температура со влажностью < 6%. ნიმუშები ინახება ელვა ჩანთებში ოთახის ტემპერატურაზე ტენიანობით <6%.კვლევა შეესაბამებოდა ადგილობრივ და ეროვნულ გაიდლაინებს.კომპოზიციური ანალიზი ჩატარდა NREL პროტოკოლის გამოყენებით.აღმოჩნდა, რომ შემადგენლობა შეიცავს 31,4% გლუკანს, 18,7% ქსილანს, 3,3% არაბინანს, 1,2% გალაქტანს, 2,2% აცეტილს, 14,3% ლიგნინს, 1,7% პროტეინს და 13,4% ნაცარს.
Cellic® CTec2 (138 მგ ცილა/მლ, ლოტი VCNI 0001) არის ცელულაზას, β-გლუკოზიდაზას და Cellic® HTec2 (157 მგ პროტეინი/მლ, ლოტი VHN00001) Novozymes-ის (Franklinton, NC, USA) კომპლექსური ნარევი.Multifect Pectinase® (72 მგ ცილა/მლ), პექტინის დამშლელი ფერმენტების კომპლექსური ნაზავი, შემოწირულია DuPont Industrial Biosciences-ის მიერ (Palo Alto, CA, USA).ფერმენტის ცილის კონცენტრაცია განისაზღვრა ცილის შემცველობის შეფასებით (და არაცილოვანი აზოტის წვლილის გამოკლებით) Kjeldahl-ის აზოტის ანალიზის გამოყენებით (AOAC მეთოდი 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Diatomaceous Earth 545 შეძენილი იქნა EMD Millipore-დან (Billerica, MA).გააქტიურებული ნახშირბადი (DARCO, 100 mesh გრანულები), Avicel (PH-101), წიფლის ქსილანი და ყველა სხვა ქიმიკატი შეძენილი იქნა Sigma-Aldrich-ისგან (St. Louis, MO).
AFEX წინასწარი მკურნალობა ჩატარდა GLBRC-ში (ბიომასის კონვერტაციის კვლევის ლაბორატორია, MSU, Lansing, MI, აშშ).წინასწარი დამუშავება ჩატარდა 140°C ტემპერატურაზე 15 წუთის განმავლობაში.46 ბინადრობის დრო უწყლო ამიაკისა და ბიომასის 1:1 თანაფარდობით 60% (w/w) დატვირთვით უჟანგავი ფოლადის სკამზე სერიულ რეაქტორში (Parr Instruments Company).30 წუთი დასჭირდა.რეაქტორი 140°C-მდე მიიყვანეს და ამიაკი სწრაფად გამოთავისუფლდა, რაც ბიომასას ოთახის ტემპერატურამდე სწრაფად დაბრუნების საშუალებას აძლევდა.AFEX წინასწარ დამუშავებული სიმინდის სტოვერის (ACS) შემადგენლობა მსგავსი იყო დაუმუშავებელი სიმინდის (UT-CS) შემადგენლობისა.
მაღალი მყარი ACSH 25% (w/w) (დაახლოებით 8% დექსტრანის დატვირთვა) მომზადდა, როგორც საწყისი მასალა ოლიგოსაქარიდების ფართომასშტაბიანი წარმოებისთვის.ACS-ის ფერმენტული ჰიდროლიზი ჩატარდა კომერციული ფერმენტული ნარევის გამოყენებით, მათ შორის Cellic® Ctec2 10 მგ პროტეინი/გ გლუკანი (წინასწარ დამუშავებულ ბიომასაში), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 მგ ცილა/გ გლუკანი და Multifect Pectinase (Genencor Inc, აშშ).).), 5 მგ ცილა/გ დექსტრანი.ფერმენტული ჰიდროლიზი ჩატარდა 5 ლიტრიან ბიორეაქტორში სამუშაო მოცულობით 3 ლიტრი, pH 4,8, 50°C და 250 ბრ/წთ.ჰიდროლიზის შემდეგ 96 საათის განმავლობაში, ჰიდროლიზატი შეგროვდა ცენტრიფუგირებით 6000 rpm-ზე 30 წუთის განმავლობაში და შემდეგ 14000 rpm-ზე 30 წუთის განმავლობაში არაჰიდროლიზებული მყარი ნივთიერებების მოსაშორებლად.შემდეგ ჰიდროლიზატი დაექვემდებარა სტერილურ ფილტრაციას 0,22 მმ ფილტრის ჭიქის მეშვეობით.გაფილტრული ჰიდროლიზატი ინახებოდა სტერილურ ბოთლებში 4°C ტემპერატურაზე და შემდეგ დანაწილდა ნახშირბადზე.
ექსტრაქტზე დაფუძნებული ბიომასის ნიმუშების შემადგენლობის ანალიზი NREL ლაბორატორიული ანალიზის პროცედურების მიხედვით: ნიმუშების მომზადება შემადგენლობის ანალიზისთვის (NREL/TP-510-42620) და ბიომასაში სტრუქტურული ნახშირწყლებისა და ლიგნინის განსაზღვრა (NREL/TP-510 – 42618)47.
ჰიდროლიზატის ნაკადის ოლიგოსაქარიდის ანალიზი ჩატარდა 2 მლ შკალაზე ავტოკლავზე დაფუძნებული მჟავა ჰიდროლიზის მეთოდის გამოყენებით.შეურიეთ ჰიდროლიზატის ნიმუში 69,7 μl 72% გოგირდის მჟავას 10 მლ ხრახნიანი თავსახურის კულტურის მილში და ინკუბაცია 1 საათის განმავლობაში სკამზე 121 °C-ზე, გააცივეთ ყინულზე და გაფილტრეთ მაღალი ხარისხის თხევადი ქრომატოგრაფიის (HPLC) ფლაკონში.ოლიგოსაქარიდების კონცენტრაცია განისაზღვრა არაჰიდროლიზებულ ნიმუშში მონოსაქარიდების კონცენტრაციის გამოკლებით მჟავით ჰიდროლიზებულ ნიმუშში შაქრის მთლიანი კონცენტრაციისგან.
გლუკოზის, ქსილოზის და არაბინოზის კონცენტრაციები მჟავა ჰიდროლიზებულ ბიომასაში გაანალიზდა Shimadzu HPLC სისტემის გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილია ავტოსამპლერით, სვეტის გამათბობლით, იზოკრატული ტუმბოთ და რეფრაქციული ინდექსის დეტექტორით Bio-Rad Aminex HPX-87H სვეტზე.სვეტი შენარჩუნდა 50°C-ზე და გამოირეცხა 0.6 მლ/წთ 5 მმ H2SO4 წყალში.ნაკადი.
ჰიდროლიზატის ზენატანი განზავებულია და გაანალიზებულია მონომერისა და ოლიგოსაქარიდის შემცველობაზე.ფერმენტული ჰიდროლიზის შემდეგ მიღებული მონომერული შაქარი გაანალიზდა HPLC-ით, რომელიც აღჭურვილი იყო Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P სვეტით და ფერფლის დამცავი სვეტით.სვეტის ტემპერატურა შენარჩუნებული იყო 80°C-ზე, წყალი გამოიყენებოდა მოძრავ ფაზად 0,6 მლ/წთ.ოლიგოსაქარიდები განისაზღვრა განზავებულ მჟავაში ჰიდროლიზით 121°C ტემპერატურაზე აღწერილი მეთოდების მიხედვით.41, 48, 49.
საქარიდული ანალიზი ჩატარდა ნედლეულზე, AFEX წინასწარ დამუშავებულ და ყველა არაჰიდროლიზებულ ბიომასის ნარჩენებზე (უჯრედის კედლის სერიული ექსტრაქტების წარმოება და მათი mAb სკრინინგის ჩათვლით) ადრე აღწერილი პროცედურების 27, 43, 50, 51 გამოყენებით.გლიკომის ანალიზისთვის მცენარეული უჯრედის კედლის მასალის ალკოჰოლში უხსნადი ნარჩენები მზადდება ბიომასის ნარჩენებისგან და ექვემდებარება სერიულ ექსტრაქციას მზარდი აგრესიული რეაგენტებით, როგორიცაა ამონიუმის ოქსალატი (50 მმ), ნატრიუმის კარბონატი (50 მმ და 0.5% w/v), CON.(1M და 4M, ორივე 1% w/v ნატრიუმის ბოროჰიდრიდით) და მჟავა ქლორიტი, როგორც ადრე იყო აღწერილი52,53.შემდეგ ექსტრაქტები დაექვემდებარა ELISA-ს mAb50-ების კომპლექსურ პანელს, რომელიც მიმართულია უჯრედის კედლის გლიკანისკენ, და mAb შეკავშირების რეაქციები წარმოდგენილი იყო სითბოს რუკის სახით.მცენარის უჯრედის კედლის გლიკანზე გამიზნული mAbs შეძენილი იქნა ლაბორატორიული მარაგებიდან (CCRC, JIM და MAC სერიები).
ოლიგოსაქარიდების ერთსაფეხურიანი ბიოტინილაცია.ნახშირწყლების კონიუგაცია ბიოტინ-LC-ჰიდრაზიდთან ხდებოდა შემდეგი პროცედურის გამოყენებით.ბიოტინ-LC-ჰიდრაზიდი (4.6 მგ/12 მკმოლი) იხსნება დიმეთილ სულფოქსიდში (DMSO, 70 მკლ) ენერგიული მორევით და გაცხელებით 65°C-ზე 1 წუთის განმავლობაში.დაემატა გამყინვარების ძმარმჟავა (30 μl) და ნარევი დაასხით ნატრიუმის ციანობოროჰიდრიდზე (6.4 მგ/100 მკმოლი) და მთლიანად დაიშალა 65°C-ზე გაცხელების შემდეგ დაახლოებით 1 წუთის განმავლობაში.შემდეგ, 5-დან 8 მკლ-მდე რეაქციის ნარევი დაემატა გამხმარ ოლიგოსაქარიდს (1-100 ნმოლი), რათა მიღებულ იქნას ეტიკეტის 10-ჯერ ან მეტი მოლური ჭარბი შემცირების ბოლოზე.რეაქცია ჩატარდა 65°C ტემპერატურაზე 2 საათის განმავლობაში, რის შემდეგაც ნიმუშები დაუყოვნებლივ გაიწმინდა.ეტიკეტირების ექსპერიმენტებში არ იყო გამოყენებული ნატრიუმის ციანობოროჰიდრიდი შემცირების გარეშე და ნიმუშები რეაგირებდნენ 65°C-ზე 2.5 საათის განმავლობაში.
ELISA დაფარვა და ბიოტინილირებული ოლიგოსაქარიდების ნიმუშების რეცხვა.25 მკლ ბიოტინილირებული ნიმუშები (თითოეული კონცენტრირებული ნიმუშის 100 μl განზავებული 5 მლ 0,1 M Tris ბუფერულ ხსნარში (TBS)) დაემატა ავიდინით დაფარული ფირფიტის თითოეულ ჭას.საკონტროლო ჭები დაფარული იყო 50 μl ბიოტინით 10 μg/ml კონცენტრაციით 0.1 M TBS-ში.დეიონიზებული წყალი გამოიყენებოდა როგორც საფარი ცარიელი გაზომვებისთვის.ტაბლეტი ინკუბირებული იყო 2 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე სიბნელეში.გარეცხეთ ფირფიტა 3-ჯერ 0.1% უცხიმო რძით 0.1 M TBS-ში პროგრამის No.11 გრენიერის ბინა 3A.
პირველადი ანტისხეულების დამატება და რეცხვა.თითოეულ ჭაბურღილს დაამატეთ 40 μl პირველადი ანტისხეული.მიკროფირფიტა ინკუბაცია 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე სიბნელეში.შემდეგ ფირფიტები გარეცხილი იქნა 3-ჯერ 0.1% რძით 0.1M TBS-ში სარეცხი პროგრამის #11 გამოყენებით Grenier Flat 3A-სთვის.
დაამატეთ მეორადი ანტისხეულები და ჩამოიბანეთ.დაამატეთ 50 μl თაგვის/ვირთხის მეორადი ანტისხეული (განზავებული 1:5000 0.1% რძეში 0.1 M TBS-ში) თითოეულ ჭაბურღილში.მიკროფირფიტა ინკუბაცია 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე სიბნელეში.მიკროფირფიტები შემდეგ გარეცხეს 5-ჯერ 0.1% რძით 0.1 M TBS-ში Grenier Flat 5A ფირფიტის სარეცხი პროგრამის #12 გამოყენებით.
სუბსტრატის დამატება.დაამატეთ 50 μl 3,3',5,5'-ტეტრამეთილბენზიდინი (TMB) საბაზისო სუბსტრატს (2 წვეთი ბუფერის, 3 წვეთი TMB, 2 წვეთი წყალბადის ზეჟანგი 15 მლ დეიონიზებულ წყალს).მოამზადეთ TMB სუბსტრატი.და მორევი გამოყენებამდე).მიკროფირფიტა შედგით ოთახის ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში.სიბნელეში.
დაასრულეთ ნაბიჯი და წაიკითხეთ ტაბლეტი.თითოეულ ჭაბურღილს დაამატეთ 50 μl 1 N გოგირდმჟავა და ჩაწერეთ შთანთქმა 450-დან 655 ნმ-მდე ELISA მკითხველის გამოყენებით.
მოამზადეთ ამ ანალიზების 1 მგ/მლ ხსნარი დეიონიზებულ წყალში: არაბინოზა, რამნოზა, ფუკოზა, ქსილოზა, გალაქტურონის მჟავა (GalA), გლუკურონის მჟავა (GlcA), მანოზა, გლუკოზა, გალაქტოზა, ლაქტოზა, N-აცეტილმანოზამინი (manNAc.Glusam),(glcNAc), N-აცეტილგალაქტოზამინი (galNAc), ინოზიტოლი (შიდა სტანდარტი).მომზადდა ორი სტანდარტი 1 მგ/მლ შაქრის ხსნარის დამატებით, რომელიც ნაჩვენებია ცხრილში 1. ნიმუშები იყინება და ლიოფილიზებულია -80°C-ზე, სანამ წყალი არ მოიხსნება (ჩვეულებრივ, დაახლოებით 12-18 საათი).
დაამატეთ 100–500 მკგ ნიმუში ხრახნიანი თავსახურის მილებს ანალიტიკურ ბალანსზე.ჩაწერეთ დამატებული თანხა.უმჯობესია ნიმუში გავხსნათ გამხსნელის სპეციფიკურ კონცენტრაციაში და დავამატოთ იგი მილში თხევადი ალიქვოტის სახით.გამოიყენეთ 20 μl 1 მგ/მლ ინოზიტოლი, როგორც შიდა სტანდარტი თითოეული ნიმუშის მილისთვის.ნიმუშზე დამატებული შიდა სტანდარტის რაოდენობა უნდა იყოს იგივე, რაც შიდა სტანდარტის დამატებული სტანდარტული მილის რაოდენობა.
ხრახნიანი თავსახურის ფლაკონს დაამატეთ 8 მლ უწყლო მეთანოლი.შემდეგ 4 მლ 3 N. მეთანოლის HCl ხსნარი, თავსახური და შეანჯღრიეთ.ამ პროცესში წყალი არ გამოიყენება.
დაამატეთ 500 μl 1 M HCl მეთანოლის ხსნარი ოლიგოსაქარიდის ნიმუშებსა და სტანდარტულ TMS მილებს.ნიმუშები ინკუბირებული იყო ღამით (168 საათი) 80°C ტემპერატურაზე თერმულ ბლოკში.გააშრეთ მეთანოლიზის პროდუქტი ოთახის ტემპერატურაზე საშრობი კოლექტორის გამოყენებით.დაამატეთ 200 μl MeOH და კვლავ გააშრეთ.ეს პროცესი ორჯერ მეორდება.ნიმუშს დაამატეთ 200 μl მეთანოლი, 100 μl პირიდინი და 100 μl ძმარმჟავა ანჰიდრიდი და კარგად აურიეთ.ნიმუშების ინკუბირება ოთახის ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში.და გამხმარი.დაამატეთ 200 μl მეთანოლი და კვლავ გააშრეთ.
დაამატეთ 200 μl Tri-Sil და სითბოს თავდახურული მილაკი 20 წუთის განმავლობაში.80°C, შემდეგ გაცივდეს ოთახის ტემპერატურამდე.გამოიყენეთ საშრობი კოლექტორი ნიმუშის შემდგომი გასაშრობად დაახლოებით 50 μl მოცულობამდე.მნიშვნელოვანია აღინიშნოს, რომ ჩვენ არ დავუშვით ნიმუშები მთლიანად გაშრეს.
დაუმატეთ 2 მლ ჰექსანი და მორევით კარგად აურიეთ.შეავსეთ პასტერის პიპეტების წვერები (5-8 მმ) შუშის ბამბის ნაჭერით, 5-3/4 დიუმიანი დიამეტრის პიპეტის თავზე მინის ბამბის ჩასმით.ნიმუშები ცენტრიფუგირებული იყო 3000 გ-ზე 2 წუთის განმავლობაში.ნებისმიერი უხსნადი ნარჩენები გროვდება.ნიმუში გააშრეთ 100-150 მკლ-მდე.დაახლოებით 1 μl მოცულობა შეყვანილი იქნა GC-MS-ში საწყის ტემპერატურაზე 80 °C და საწყისი დრო 2.0 წუთის განმავლობაში (ცხრილი 2).