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Nuevos métodos inmunológicos y espectrométricos de masas para el análisis complejo de oligosacáridos persistentes en rastrojo de maíz pretratado con AFEX. La biomasa lignocelulósica es una alternativa sostenible a los combustibles fósiles y se utiliza ampliamente para desarrollar biotecnologías destinadas a la producción de productos como alimentos, piensos, combustibles y productos químicos. La clave de estas tecnologías reside en el desarrollo de procesos rentables para convertir los carbohidratos complejos presentes en las paredes celulares de las plantas en azúcares simples como glucosa, xilosa y arabinosa. Debido a su alta resistencia, la biomasa lignocelulósica debe combinarse con tratamientos termoquímicos (p. ej., exfoliación de fibras con amoníaco [AFEX], ácidos diluidos [AD], líquidos iónicos [IL]) y biológicos (p. ej., hidrólisis enzimática y fermentación microbiana) para obtener el producto deseado. Sin embargo, cuando se utilizan enzimas fúngicas comerciales en el proceso de hidrólisis, solo entre el 75 % y el 85 % de los azúcares solubles formados son monosacáridos, y el 15 % restante son oligosacáridos solubles e intratables, que no siempre están disponibles para los microorganismos. Anteriormente, hemos aislado y purificado con éxito oligosacáridos solubles resistentes mediante una combinación de separación de carbono y tierra de diatomeas y cromatografía de exclusión por tamaño, y también hemos investigado sus propiedades inhibidoras de enzimas. Hemos descubierto que los oligosacáridos que contienen sustituciones de ácido urónico metilado con mayor grado de polimerización (GP) son más difíciles de procesar con mezclas de enzimas comerciales que los oligosacáridos con bajo GP y neutros. Aquí informamos del uso de varios métodos adicionales, incluyendo el perfil de glicanos usando anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos para glicanos de biomasa vegetal para caracterizar enlaces de glicanos en paredes celulares de plantas e hidrolizados enzimáticos, desorción-ionización láser asistida por matriz, espectrometría de masas de tiempo de vuelo. . MALDI-TOF-MS) utiliza picos de diagnóstico informativos de estructura obtenidos por espectroscopia después de la desintegración secundaria de iones negativos, cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS) para caracterizar enlaces de oligosacáridos con y sin derivatización. Debido al pequeño tamaño de los oligosacáridos (DP 4-20), estas moléculas son difíciles de usar para la unión y caracterización de mAb. Para superar este problema, aplicamos un nuevo método de inmovilización de oligosacáridos basado en la conjugación con biotina que marcó con éxito la mayoría de los oligosacáridos solubles de bajo DP en la superficie de la microplaca. Este método se utilizó posteriormente en un sistema de mAb de alto rendimiento para el análisis de ligación específica. Este nuevo método facilitará el desarrollo de ensayos de glicomas de alto rendimiento más avanzados en el futuro, que podrán utilizarse para aislar y caracterizar los oligosacáridos presentes en biomarcadores con fines diagnósticos.
La biomasa lignocelulósica, compuesta de materiales agrícolas, forestales, herbáceos y leñosos, es una materia prima potencial para la producción de productos de origen biológico, incluyendo alimentos, piensos, combustibles y precursores químicos para producir productos de mayor valor1. Los carbohidratos (como la celulosa y la hemicelulosa) presentes en las paredes celulares de las plantas se despolimerizan en monosacáridos mediante procesamiento químico y biotransformación (como la hidrólisis enzimática y la fermentación microbiana). Los pretratamientos comunes incluyen la expansión de fibra de amoníaco (AFEX), el ácido diluido (DA), el líquido iónico (IL) y la explosión de vapor (SE), que utilizan una combinación de productos químicos y calor para reducir la producción de lignocelulosa mediante la apertura de las paredes celulares de las plantas3,4. terquedad de la materia, 5. La hidrólisis enzimática se lleva a cabo con una alta carga de sólidos utilizando enzimas comerciales que contienen carbohidratos activos (CAZymes) y la fermentación microbiana utilizando levaduras o bacterias transgénicas para producir combustibles y productos químicos de origen biológico 6.
Las CAZimas en enzimas comerciales se componen de una mezcla compleja de enzimas que rompen sinérgicamente enlaces carbohidrato-azúcar complejos para formar monosacáridos2,7. Como se informó anteriormente, la compleja red de polímeros aromáticos de lignina con carbohidratos los hace altamente intratables, lo que conduce a una conversión incompleta de azúcares, acumulando entre un 15% y un 25% de oligosacáridos sexuales que no se producen durante la hidrólisis enzimática de la biomasa pretratada. Este es un problema común con varios métodos de pretratamiento de biomasa. Algunas razones para este cuello de botella incluyen la inhibición enzimática durante la hidrólisis, o la ausencia o bajos niveles de enzimas esenciales que se requieren para romper los enlaces de azúcar en la biomasa vegetal. Comprender la composición y las características estructurales de los azúcares, como los enlaces de azúcar en los oligosacáridos, nos ayudará a mejorar la conversión de azúcares durante la hidrólisis, haciendo que los procesos biotecnológicos sean competitivos en costos con los productos derivados del petróleo.
Determinar la estructura de los carbohidratos es un desafío y requiere una combinación de métodos como la cromatografía líquida (LC)11,12, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)13, la electroforesis capilar (CE)14,15,16 y la espectrometría de masas (MS)17. ,dieciocho. Los métodos de MS como la espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción láser e ionización utilizando una matriz (MALDI-TOF-MS) son un método versátil para identificar estructuras de carbohidratos. Recientemente, la MS en tándem de disociación inducida por colisión (CID) de aductos de iones sodio ha sido la más utilizada para identificar huellas dactilares correspondientes a posiciones de unión de oligosacáridos, configuraciones anoméricas, secuencias y posiciones de ramificación 20, 21 .
El análisis de glicanos es una herramienta excelente para la identificación exhaustiva de enlaces de carbohidratos22. Este método utiliza anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos al glicano de la pared celular vegetal como sondas para comprender los enlaces complejos de carbohidratos. Hay más de 250 mAb disponibles en todo el mundo, diseñados contra diversos oligosacáridos lineales y ramificados que utilizan diversos sacáridos24. Varios mAb se han utilizado ampliamente para caracterizar la estructura, la composición y las modificaciones de la pared celular vegetal, ya que existen diferencias significativas según el tipo de célula vegetal, el órgano, la edad, la etapa de desarrollo y el entorno de crecimiento25,26. Más recientemente, este método se ha utilizado para comprender las poblaciones de vesículas en sistemas vegetales y animales y sus respectivas funciones en el transporte de glicanos, determinadas por marcadores subcelulares, etapas de desarrollo o estímulos ambientales, y para determinar la actividad enzimática. Algunas de las diferentes estructuras de glicanos y xilanos que se han identificado incluyen pectina (P), xilano (X), manano (M), xiloglucanos (XylG), glucanos de enlace mixto (MLG), arabinoxilano (ArbX), galactomanano (GalG), ácido glucurónico-arabinoxilano (GArbX) y arabino-galactano (ArbG)29.
Sin embargo, a pesar de todos estos esfuerzos de investigación, solo unos pocos estudios se han centrado en la naturaleza de la acumulación de oligosacáridos durante la hidrólisis con alta carga de sólidos (HSL), incluyendo la liberación de oligosacáridos, los cambios en la longitud de la cadena oligomérica durante la hidrólisis, diversos polímeros de bajo DP y sus curvas de distribución 30,31,32. Mientras tanto, si bien el análisis de glicanos ha demostrado ser una herramienta útil para un análisis exhaustivo de la estructura de los glicanos, resulta difícil evaluar los oligosacáridos de bajo DP solubles en agua mediante métodos con anticuerpos. Los oligosacáridos de DP más pequeños, con un peso molecular inferior a 5-10 kDa, no se unen a las placas ELISA 33,34 y se eliminan por lavado antes de la adición de anticuerpos.
Aquí, por primera vez, demostramos un ensayo ELISA en placas recubiertas de avidina utilizando anticuerpos monoclonales, combinando un procedimiento de biotinilación de un solo paso para oligosacáridos refractarios solubles con el análisis de glicomas. Nuestro enfoque para el análisis de glicomas fue validado mediante análisis de enlaces complementarios de oligosacáridos basados ​​en MALDI-TOF-MS y GC-MS mediante derivatización con trimetilsililo (TMS) de composiciones de azúcares hidrolizados. Este innovador enfoque puede desarrollarse como un método de alto rendimiento en el futuro y encontrar una aplicación más amplia en la investigación biomédica35.
Las modificaciones postraduccionales de enzimas y anticuerpos, como la glicosilación,³⁶ afectan su actividad biológica. Por ejemplo, los cambios en la glicosilación de las proteínas séricas desempeñan un papel importante en la artritis inflamatoria, y estos cambios se utilizan como marcadores diagnósticos³⁷. Se ha descrito en la literatura la fácil aparición de diversos glicanos en diversas enfermedades, como enfermedades inflamatorias crónicas del tracto gastrointestinal y el hígado, infecciones virales y cánceres de ovario, mama y próstata^38,39,40. Comprender la estructura de los glicanos mediante métodos ELISA de glicanos basados ​​en anticuerpos proporcionará mayor seguridad en el diagnóstico de enfermedades sin necesidad de utilizar métodos complejos de EM.
Nuestro estudio previo mostró que los oligosacáridos persistentes permanecieron sin hidrolizar después del pretratamiento y la hidrólisis enzimática (Figura 1). En nuestro trabajo publicado previamente, desarrollamos un método de extracción en fase sólida con carbón activado para aislar oligosacáridos del hidrolizado de rastrojo de maíz pretratado con AFEX (ACSH)8. Después de la extracción y separación iniciales, los oligosacáridos se fraccionaron aún más mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y se recolectaron en orden de peso molecular. Los monómeros y oligómeros de azúcar liberados de varios pretratamientos se analizaron mediante análisis de composición de azúcar. Al comparar el contenido de oligómeros de azúcar obtenidos por varios métodos de pretratamiento, la presencia de oligosacáridos persistentes es un problema común en la conversión de biomasa a monosacáridos y puede conducir a una reducción en el rendimiento de azúcar de al menos 10-15% e incluso hasta 18%. EE. UU. Este método se utiliza para una mayor producción a gran escala de fracciones de oligosacáridos. El ACH resultante y sus fracciones posteriores con diferentes pesos moleculares se utilizaron como material experimental para la caracterización de oligosacáridos en este trabajo.
Tras el pretratamiento y la hidrólisis enzimática, los oligosacáridos persistentes permanecieron sin hidrolizar. En este trabajo (A) se presenta un método de separación de oligosacáridos en el que se aíslan del hidrolizado de rastrojo de maíz (ACSH) pretratado con AFEX mediante un lecho compacto de carbón activado y tierra de diatomeas; (B) Método de separación de oligosacáridos. Los oligosacáridos se separaron posteriormente mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC); (C) Monómeros y oligómeros de sacáridos liberados tras diversos pretratamientos (ácido diluido: DA, líquido iónico: IL y AFEX). Condiciones de hidrólisis enzimática: alta carga de sólidos de 25% (p/p) (aproximadamente 8% de carga de glucano), 96 horas de hidrólisis, 20 mg/g de carga de enzima comercial (relación Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) y (D) Monómeros de azúcar y oligómeros de glucosa, xilosa y arabinosa liberados del rastrojo de maíz pretratado con AFEX (ACS).
El análisis de glicanos ha demostrado ser una herramienta útil para un análisis estructural exhaustivo de glicanos en extractos aislados de residuos de biomasa sólida. Sin embargo, los sacáridos solubles en agua están subrepresentados con este método tradicional41 debido a que los oligosacáridos de bajo peso molecular son difíciles de inmovilizar en placas ELISA y se eliminan por lavado antes de la adición de anticuerpos. Por lo tanto, para la unión y caracterización de anticuerpos, se utilizó un método de biotinilación de un solo paso para recubrir oligosacáridos solubles no conformes en placas ELISA recubiertas con avidina. Este método se probó utilizando nuestro ACSH previamente producido y una fracción basada en su peso molecular (o grado de polimerización, DP). Se utilizó biotinilación de un solo paso para aumentar la afinidad de unión de los oligosacáridos mediante la adición de biotina-LC-hidrazida al extremo reductor del carbohidrato (Fig. 2). En solución, el grupo hemiacetal del extremo reductor reacciona con el grupo hidrazida de la biotina-LC-hidrazida para formar un enlace hidrazona. En presencia del agente reductor NaCNBH3, el enlace hidrazona se reduce a un producto final biotinilado estable. Con la modificación del extremo reductor de azúcar, se hizo posible la unión de oligosacáridos de bajo DP a placas ELISA. En nuestro estudio, esto se realizó en placas recubiertas con avidina utilizando mAb dirigidos a glicanos.
Cribado de anticuerpos monoclonales mediante ELISA para oligosacáridos biotinilados. En este estudio (A) se combina la biotinilación de oligosacáridos y el posterior cribado mediante ELISA con mAb dirigidos a glicanos en placas recubiertas con NeutrAvidin, y (B) se muestra un procedimiento de un solo paso para la biotinilación de productos de reacción.
Se añadieron placas recubiertas con avidina con anticuerpos conjugados con oligosacáridos a los anticuerpos primarios y secundarios, y se lavaron en un medio sensible a la luz y al tiempo. Tras completarse la unión de los anticuerpos, se añadió sustrato TMB para incubar la placa. La reacción se detuvo finalmente con ácido sulfúrico. Las placas incubadas se analizaron con un lector ELISA para determinar la fuerza de unión de cada anticuerpo y detectar la reticulación específica. Para más detalles y parámetros del experimento, véase la sección correspondiente «Materiales y métodos».
Demostramos la utilidad de este nuevo método para aplicaciones específicas mediante la caracterización de los oligosacáridos solubles presentes en ACSH, así como en fracciones de oligosacáridos crudos y purificados aislados de hidrolizados lignocelulósicos. Como se muestra en la Figura 3, los xilanos con sustitución de epítopos más comunes identificados en ACSH mediante métodos de análisis de glicomas bioacilados suelen ser urónicos (U) o metilurónicos (MeU) y arabinogalactanos pécticos. La mayoría de ellos también se encontraron en nuestro estudio previo sobre el análisis de glicanos de sólidos no hidrolizados (UHS)43.
Detección de epítopos de oligosacáridos recalcitrantes mediante un anticuerpo monoclonal dirigido al glicano de la pared celular. La fracción "neutra" corresponde a la fracción ACN y la fracción "ácida" a la fracción FA. Los rojos más brillantes en el mapa de calor indican un mayor contenido de epítopos, y los azules más brillantes indican un fondo blanco. Los valores de color en la escala se basan en los valores de DO brutos para formulaciones N=2. Los principales epítopos reconocidos por los anticuerpos se muestran a la derecha.
Estas estructuras no celulósicas no pudieron ser escindidas por las celulasas y hemicelulasas más comunes en la mezcla de enzimas comerciales analizada, que incluye las enzimas comerciales más utilizadas. Por lo tanto, se requieren nuevas enzimas auxiliares para su hidrólisis. Sin las enzimas accesorias no celulósicas necesarias, estos enlaces no celulósicos impiden la conversión completa a monosacáridos, incluso si sus polímeros de azúcar originales se hidrolizan extensamente en fragmentos más cortos y se disuelven utilizando mezclas de enzimas comerciales.
Un estudio más a fondo de la distribución de la señal y su fuerza de unión mostró que los epítopos de unión fueron menores en las fracciones de azúcar de alto DP (A, B, C, DP hasta 20+) que en las fracciones de bajo DP (D, E, F, DP) en los dímeros) (Fig. 1). Los fragmentos ácidos son más comunes en los epítopos no celulósicos que los fragmentos neutros. Estos fenómenos son consistentes con el patrón observado en nuestro estudio anterior, donde los grupos altos de DP y ácidos fueron más resistentes a la hidrólisis enzimática. Por lo tanto, la presencia de epítopos de glicano no celulósicos y las sustituciones U y MeU pueden contribuir en gran medida a la estabilidad de los oligosacáridos. Se debe tener en cuenta que la unión y la eficiencia de detección pueden ser problemáticas para los oligosacáridos de bajo DP, especialmente si el epítopo es un oligosacárido dimérico o trimérico. Esto se puede probar utilizando oligosacáridos comerciales de diferentes longitudes, cada uno conteniendo solo un epítopo que se une a un mAb específico.
Por lo tanto, el uso de anticuerpos estructurales específicos reveló ciertos tipos de enlaces recalcitrantes. Dependiendo del tipo de anticuerpo utilizado, el patrón de ligadura apropiado y la intensidad de la señal que produce (más o menos abundante), se pueden identificar nuevas enzimas y añadirlas semicuantitativamente a la mezcla enzimática para una glicoconversión más completa. Tomando como ejemplo el análisis de oligosacáridos ACSH, podemos crear una base de datos de enlaces de glicano para cada material de biomasa. Cabe destacar que se debe tener en cuenta la diferente afinidad de los anticuerpos, y si se desconoce su afinidad, esto creará ciertas dificultades al comparar las señales de diferentes anticuerpos. Además, la comparación de enlaces de glicano puede funcionar mejor entre muestras del mismo anticuerpo. Estos enlaces resistentes se pueden vincular a la base de datos CAZyme, a partir de la cual podemos identificar enzimas, seleccionar enzimas candidatas y analizar enzimas que rompen enlaces, o desarrollar sistemas microbianos para expresar estas enzimas para su uso en biorrefinerías44.
Para evaluar cómo los métodos inmunológicos complementan los métodos alternativos para caracterizar oligosacáridos de bajo peso molecular presentes en hidrolizados lignocelulósicos, realizamos MALDI (Fig. 4, S1-S8) y análisis de sacáridos derivados de TMS basados ​​en GC-MS en el mismo panel (Fig. 5) parte de oligosacáridos. MALDI se utiliza para comparar si la distribución de masa de las moléculas de oligosacáridos coincide con la estructura deseada. En la fig. 4 se muestra MS de los componentes neutros ACN-A y ACN-B. El análisis de ACN-A confirmó un rango de azúcares pentosa que van desde DP 4-8 (Fig. 4) a DP 22 (Fig. S1), cuyos pesos corresponden a oligosacáridos MeU-xilano. El análisis de ACN-B confirmó la serie de pentosas y glucoxilanos con DP 8-15. En material suplementario como la Figura S3, los mapas de distribución de masas de la fracción ácida de FA-C muestran un rango de pentosas sustituidas con (Me)U con un DP de 8-15, que concuerdan con los xilanos sustituidos encontrados en el cribado de mAb basado en ELISA. Los epítopos son consistentes.
Espectro MALDI-MS de oligosacáridos solubles no conformables presentes en ACS. Aquí, (A) Fracciones de bajo peso molecular de ACN-A que contienen oligosacáridos de glucuroxilano sustituidos con ácido urónico metilado (DP 4-8) y (B) oligosacáridos de xilano y ácido urónico metilado sustituidos con glucuroxilano (DP 8-15) de ACN-B.
Análisis de la composición del residuo de glicano de oligosacáridos refractarios. Aquí (A) Composición de sacáridos TMS de diversas fracciones de oligosacáridos obtenida mediante análisis de GC-MS. (B) Estructuras de diversos azúcares derivados de TMS presentes en oligosacáridos. ACN: fracción de acetonitrilo que contiene oligosacáridos neutros y FA: fracción de ácido ferúlico que contiene oligosacáridos ácidos.
Otra conclusión interesante se extrajo del análisis LC-MS de la fracción de oligosacáridos, como se muestra en la Figura S9 (los métodos se pueden consultar en el material suplementario electrónico). Se observaron repetidamente fragmentos de hexosa y grupos -OAc durante la ligación de la fracción ACN-B. Este hallazgo no solo confirma la fragmentación observada en el análisis de glicoma y MALDI-TOF, sino que también aporta nueva información sobre los posibles derivados de carbohidratos en la biomasa lignocelulósica pretratada.
También realizamos un análisis de la composición de glicanos en fracciones de oligosacáridos mediante derivatización de glicanos con TMS. Mediante GC-MS, determinamos la composición de azúcares neuronales (no derivados) y ácidos (GluA y GalA) en la fracción de oligosacáridos (Fig. 5). El ácido glucurónico se encuentra en los componentes ácidos C y D, mientras que el ácido galacturónico se encuentra en los componentes ácidos A y B, ambos componentes de alto DP de los azúcares ácidos. Estos resultados no solo confirman nuestros datos de ELISA y MALDI, sino que también son consistentes con nuestros estudios previos sobre la acumulación de oligosacáridos. Por lo tanto, creemos que los métodos inmunológicos modernos que utilizan la biotinilación de oligosacáridos y el posterior cribado ELISA son suficientes para detectar oligosacáridos recalcitrantes solubles en diversas muestras biológicas.
Dado que los métodos de cribado con mAb basados ​​en ELISA se han validado mediante diversos métodos, quisimos explorar más a fondo el potencial de este nuevo método cuantitativo. Se adquirieron dos oligosacáridos comerciales, el oligosacárido xilohexasacárido (XHE) y la 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriosa (A2XX), y se analizaron utilizando un nuevo enfoque de mAb dirigido al glicano de la pared celular. La Figura 6 muestra una correlación lineal entre la señal de unión biotinilada y el logaritmo de la concentración de oligosacáridos, lo que sugiere un posible modelo de adsorción de Langmuir. Entre los mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 y CCRC-M151 se correlacionaron con XHE, y CCRC-M108, CCRC-M109 y LM11 se correlacionaron con A2XX en un rango de 1 nm a 100 nano. Debido a la disponibilidad limitada de anticuerpos durante el experimento, se realizaron experimentos limitados con cada concentración de oligosacárido. Cabe destacar que algunos anticuerpos reaccionan de forma muy distinta al mismo oligosacárido como sustrato, probablemente porque se unen a epítopos ligeramente distintos y pueden tener afinidades de unión muy distintas. Los mecanismos y las implicaciones de la identificación precisa de epítopos serán mucho más complejos cuando el nuevo enfoque de mAb se aplique a muestras reales.
Se utilizaron dos oligosacáridos comerciales para determinar el rango de detección de diversos mAb dirigidos a glicanos. En este estudio, las correlaciones lineales con el logaritmo de la concentración de oligosacáridos indican patrones de adsorción de Langmuir para (A) XHE con mAb y (B) A2XX con mAb. Los epítopos correspondientes indican las estructuras de los oligosacáridos comerciales utilizados como sustratos en el ensayo.
El uso de anticuerpos monoclonales dirigidos a glicanos (análisis glicocómico o cribado con mAb basado en ELISA) es una herramienta poderosa para la caracterización en profundidad de la mayoría de los principales glicanos de la pared celular que conforman la biomasa vegetal. Sin embargo, el análisis clásico de glicanos solo caracteriza glicanos de pared celular más grandes, ya que la mayoría de los oligosacáridos no se inmovilizan eficientemente en placas ELISA. En este estudio, el rastrojo de maíz pretratado con AFEX se hidrolizó enzimáticamente a un alto contenido de sólidos. El análisis de azúcares se utilizó para determinar la composición de carbohidratos recalcitrantes de la pared celular en el hidrolizado. Sin embargo, el análisis con mAb de oligosacáridos más pequeños en hidrolizados está subestimado, y se necesitan herramientas adicionales para inmovilizar eficazmente los oligosacáridos en placas ELISA.
Presentamos un método novedoso y eficiente de inmovilización de oligosacáridos para el cribado de mAb, combinando la biotinilación de oligosacáridos seguida de cribado ELISA en placas recubiertas con NeutrAvidin™. Los oligosacáridos biotinilados inmovilizados mostraron suficiente afinidad por el anticuerpo, lo que permitió la detección rápida y eficiente de oligosacáridos recalcitrantes. El análisis de la composición de estos oligosacáridos resistentes mediante espectrometría de masas confirmó los resultados de este nuevo enfoque de inmunocribado. Por lo tanto, estos estudios demuestran que la combinación de la biotinilación de oligosacáridos y el cribado ELISA con anticuerpos monoclonales dirigidos contra glicanos puede utilizarse para detectar entrecruzamientos en oligosacáridos y puede aplicarse ampliamente en otros estudios bioquímicos que caracterizan la estructura de oligosacáridos.
Este método de perfilado de glicanos basado en biotina es el primer informe capaz de investigar los enlaces de carbohidratos recalcitrantes de los oligosacáridos solubles en la biomasa vegetal. Esto ayuda a comprender por qué algunas partes de la biomasa son tan resistentes a la producción de biocombustibles. Este método llena un vacío importante en los métodos de análisis de glicanos y extiende su aplicación a una gama más amplia de sustratos más allá de los oligosacáridos vegetales. En el futuro, podríamos utilizar la robótica para la biotinilación y emplear el método que hemos desarrollado para el análisis de alto rendimiento de muestras mediante ELISA.
La paja de maíz (CS) obtenida a partir de semillas del híbrido Pioneer 33A14 se cosechó en 2010 en Kramer Farms en Ray, Colorado. Con la autorización del propietario, esta biomasa puede utilizarse para investigación. Las muestras se almacenaron secas a < 6 % de humedad en bolsas con cierre hermético a temperatura ambiente. Las muestras se almacenaron secas a < 6 % de humedad en bolsas con cierre hermético a temperatura ambiente. Ajuste la cantidad de alimentos con una temperatura inferior al 6 % en paquetes con una temperatura muy alta. Las muestras se almacenaron secas a <6% de humedad en bolsas con cierre a temperatura ambiente.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6% La temperatura de los paquetes con una temperatura elevada es < 6%. Las muestras se almacenan en bolsas con cierre a temperatura ambiente y con una humedad < 6%.El estudio cumplió con las directrices locales y nacionales. El análisis de composición se realizó según el protocolo NREL. Se encontró que la composición contenía 31,4 % de glucano, 18,7 % de xilano, 3,3 % de arabinano, 1,2 % de galactano, 2,2 % de acetilo, 14,3 % de lignina, 1,7 % de proteína y 13,4 % de cenizas.
Cellic® CTec2 (138 mg de proteína/ml, lote VCNI 0001) es una mezcla compleja de celulosa, β-glucosidasa y Cellic® HTec2 (157 mg de proteína/ml, lote VHN00001) de Novozymes (Franklinton, NC, EE. UU.). Multifect Pectinase® (72 mg de proteína/ml), una mezcla compleja de enzimas que degradan pectina, fue donada por DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, EE. UU.). Las concentraciones de proteína enzimática se determinaron estimando el contenido proteico (y restando la contribución del nitrógeno no proteico) mediante el análisis de nitrógeno Kjeldahl (método AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, EE. UU.). La tierra de diatomeas 545 se adquirió de EMD Millipore (Billerica, MA). El carbón activado (DARCO, gránulos de malla 100), Avicel (PH-101), xilano de haya y todos los demás productos químicos se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
El pretratamiento con AFEX se realizó en el GLBRC (Laboratorio de Investigación de Conversión de Biomasa, MSU, Lansing, MI, EE. UU.). El pretratamiento se realizó a 140 °C durante 15 minutos. El tiempo de residencia fue de 46 minutos con una proporción 1:1 de amoníaco anhidro a biomasa, con una carga del 60 % (p/p) en un reactor discontinuo de sobremesa de acero inoxidable (Parr Instruments Company). El tiempo de residencia fue de 30 minutos. El reactor se llevó a 140 °C y el amoníaco se liberó rápidamente, permitiendo que la biomasa retornara rápidamente a temperatura ambiente. La composición del rastrojo de maíz pretratado con AFEX (ACS) fue similar a la del rastrojo de maíz sin tratar (UT-CS).
Se preparó ACSH con alto contenido de sólidos al 25 % (p/p) (aproximadamente un 8 % de carga de dextrano) como material de partida para la producción a gran escala de oligosacáridos. La hidrólisis enzimática de ACS se realizó utilizando una mezcla enzimática comercial que incluía Cellic® Ctec2 10 mg de proteína/g de glucano (en biomasa pretratada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg de proteína/g de glucano y Multifect Pectinasa (Genencor Inc, EE. UU.). ). ), 5 mg de proteína/g de dextrano. La hidrólisis enzimática se llevó a cabo en un biorreactor de 5 litros con un volumen de trabajo de 3 litros, pH 4,8, 50 °C y 250 rpm. Tras 96 horas de hidrólisis, el hidrolizado se recogió mediante centrifugación a 6000 rpm durante 30 minutos y, posteriormente, a 14000 rpm durante 30 minutos para eliminar los sólidos no hidrolizados. El hidrolizado se filtró estérilmente a través de un vaso de precipitados con filtro de 0,22 mm. Una vez filtrado, se almacenó en frascos estériles a 4 °C y se fraccionó en carbón.
Análisis de la composición de muestras de biomasa basadas en extracto según los procedimientos de análisis de laboratorio del NREL: preparación de muestras para análisis de composición (NREL/TP-510-42620) y determinación de carbohidratos estructurales y lignina en biomasa (NREL/TP-510 – 42618)47.
El análisis de oligosacáridos de la corriente de hidrolizado se realizó a una escala de 2 ml mediante un método de hidrólisis ácida en autoclave. La muestra de hidrolizado se mezcló con 69,7 µl de ácido sulfúrico al 72 % en un tubo de cultivo de 10 ml con tapón de rosca y se incubó durante 1 h en una mesa de trabajo a 121 °C. Se enfrió en hielo y se filtró a un vial para cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La concentración de oligosacáridos se determinó restando la concentración de monosacáridos en la muestra no hidrolizada de la concentración total de azúcares en la muestra hidrolizada con ácido.
Las concentraciones de glucosa, xilosa y arabinosa en la biomasa hidrolizada con ácido se analizaron mediante un sistema HPLC Shimadzu equipado con muestreador automático, calentador de columna, bomba isocrática y detector de índice de refracción en una columna Bio-Rad Aminex HPX-87H. La columna se mantuvo a 50 °C y se eluyó con 0,6 ml/min de H₂SO₄ 5 mM en agua.
El sobrenadante del hidrolizado se diluyó y se analizó el contenido de monómeros y oligosacáridos. Los azúcares monoméricos obtenidos tras la hidrólisis enzimática se analizaron mediante HPLC con una columna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P y una columna de protección de cenizas. La temperatura de la columna se mantuvo a 80 °C y se utilizó agua como fase móvil con un caudal de 0,6 ml/min. Los oligosacáridos se determinaron mediante hidrólisis en ácido diluido a 121 °C, según los métodos descritos en las referencias 41, 48 y 49.
El análisis de sacáridos se realizó en residuos de biomasa crudos, pretratados con AFEX y todos los no hidrolizados (incluyendo la producción de extractos seriados de la pared celular y su cribado de mAb) utilizando procedimientos descritos previamente 27, 43, 50, 51. Para el análisis de glicomas, los residuos insolubles en alcohol del material de la pared celular vegetal se preparan a partir de residuos de biomasa y se someten a extracción seriada con reactivos cada vez más agresivos como oxalato de amonio (50 mM), carbonato de sodio (50 mM y 0,5 % p/v), CON. (1 M y 4 M, ambos con borohidruro de sodio al 1 % p/v) y clorito ácido como se describió previamente52,53. Los extractos se sometieron entonces a ELISA contra un panel complejo de mAb50s dirigidos al glicano de la pared celular, y las reacciones de unión de mAb se presentaron como un mapa de calor. Los mAb dirigidos al glicano de la pared celular vegetal se adquirieron de existencias de laboratorio (series CCRC, JIM y MAC).
Biotinilación de oligosacáridos en un solo paso. La conjugación de carbohidratos con biotina-LC-hidrazida se realizó mediante el siguiente procedimiento. Se disolvió biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) en dimetilsulfóxido (DMSO, 70 μl) con agitación vigorosa y calentamiento a 65 °C durante 1 min. Se añadió ácido acético glacial (30 µl) y la mezcla se vertió sobre cianoborohidruro de sodio (6,4 mg/100 µmol), disolviéndose completamente tras calentar a 65 °C durante aproximadamente 1 minuto. A continuación, se añadieron de 5 a 8 μl de la mezcla de reacción al oligosacárido seco (1-100 nmol) para obtener un exceso molar de 10 veces o más del marcador sobre el extremo reductor. La reacción se llevó a cabo a 65 °C durante 2 h, tras lo cual las muestras se purificaron inmediatamente. No se utilizó cianoborohidruro de sodio en los experimentos de marcado sin reducción y las muestras se hicieron reaccionar a 65 °C durante 2,5 horas.
Recubrimiento y lavado de muestras de oligosacáridos biotinilados mediante ELISA. Se añadieron 25 μl de muestras biotiniladas (100 μl de cada muestra concentrada diluida en 5 ml de solución tampón Tris (TBS) 0,1 M) a cada pocillo de la placa recubierta con avidina. Los pocillos control se recubrieron con 50 μl de biotina a una concentración de 10 μg/ml en TBS 0,1 M. Se utilizó agua desionizada como recubrimiento para las mediciones en blanco. La tableta se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en oscuridad. Lave la placa tres veces con leche desnatada al 0,1 % en TBS 0,1 M utilizando el programa n.º 11 para Grenier flat 3A.
Adición y lavado de anticuerpos primarios. Añadir 40 µl de anticuerpo primario a cada pocillo. Incubar la microplaca durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. A continuación, lavar las placas tres veces con leche al 0,1 % en TBS 0,1 M utilizando el programa de lavado n.º 11 para Grenier Flat 3A.
Añadir el anticuerpo secundario y lavar. Añadir 50 µl de anticuerpo secundario de ratón/rata (diluido 1:5000 en leche al 0,1 % en TBS 0,1 M) a cada pocillo. Incubar la microplaca durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. A continuación, lavar las microplacas 5 veces con leche al 0,1 % en TBS 0,1 M utilizando el programa de lavado de placas Grenier Flat 5A n.º 12.
Adición de un sustrato. Añada 50 µl de 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) al sustrato base (añadiendo 2 gotas de tampón, 3 gotas de TMB y 2 gotas de peróxido de hidrógeno a 15 ml de agua desionizada). Prepare el sustrato de TMB y agite en vórtex antes de usar. Incube la microplaca a temperatura ambiente durante 30 minutos en oscuridad.
Complete el paso y lea la tableta. Añada 50 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pocillo y registre la absorbancia de 450 a 655 nm con un lector de ELISA.
Prepare soluciones de 1 mg/ml de estos analitos en agua desionizada: arabinosa, ramnosa, fucosa, xilosa, ácido galacturónico (GalA), ácido glucurónico (GlcA), manosa, glucosa, galactosa, lactosa, N-acetilmanosamina (manNAc), N-acetilglucosamina (glcNAc), N-acetilgalactosamina (galNAc) e inositol (patrón interno). Se prepararon dos patrones añadiendo las soluciones de azúcar de 1 mg/ml que se muestran en la Tabla 1. Las muestras se congelan y liofilizan a -80 °C hasta que se elimina toda el agua (normalmente, entre 12 y 18 horas).
Añada de 100 a 500 µg de muestra a tubos con tapa de rosca en una balanza analítica. Registre la cantidad añadida. Es recomendable disolver la muestra en una concentración específica de disolvente y añadirla al tubo como una alícuota líquida. Utilice 20 µl de inositol de 1 mg/ml como estándar interno para cada tubo de muestra. La cantidad de estándar interno añadida a la muestra debe ser la misma que la añadida al tubo de referencia.
Añada 8 ml de metanol anhidro a un vial con tapa de rosca. A continuación, añada 4 ml de solución metanólica de HCl 3 N, tape y agite. Este proceso no utiliza agua.
Añadir 500 µl de solución de metanol HCl 1 M a las muestras de oligosacáridos y a los tubos TMS estándar. Las muestras se incubaron durante la noche (168 horas) a 80 °C en un bloque térmico. Secar el producto de metanólisis a temperatura ambiente utilizando un colector de secado. Añadir 200 µl de MeOH y secar de nuevo. Este proceso se repite dos veces. Añadir 200 µl de metanol, 100 µl de piridina y 100 µl de anhídrido acético a la muestra y mezclar bien. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos y secarlas. Añadir 200 µl de metanol y secar de nuevo.
Añada 200 µl de Tri-Sil y caliente el tubo tapado durante 20 minutos a 80 °C, luego enfríe a temperatura ambiente. Utilice un colector de secado para secar aún más la muestra hasta un volumen de aproximadamente 50 µl. Es importante tener en cuenta que no dejamos que las muestras se secaran completamente.
Añadir 2 ml de hexano y mezclar bien con vórtex. Llenar las puntas de las pipetas Pasteur (5-8 mm) con un trozo de lana de vidrio insertándola sobre una pipeta de 14,7 cm de diámetro. Las muestras se centrifugaron a 3000 g durante 2 minutos. Los residuos insolubles se precipitaron. Secar la muestra a 100-150 µl. Se inyectó un volumen de aproximadamente 1 µl en el sistema de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) a una temperatura inicial de 80 °C y un tiempo inicial de 2,0 minutos (Tabla 2).