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Nuevos métodos inmunológicos y espectrométricos de masas para el análisis complejo de oligosacáridos persistentes en rastrojo de maíz pretratado con AFEX. La biomasa lignocelulósica es una alternativa sostenible a los combustibles fósiles y se utiliza ampliamente para desarrollar biotecnologías para la producción de productos como alimentos, piensos, combustibles y productos químicos. La clave de estas tecnologías es el desarrollo de procesos competitivos en costes para convertir los carbohidratos complejos presentes en las paredes celulares de las plantas en azúcares simples como glucosa, xilosa y arabinosa. Debido a que la biomasa lignocelulósica es muy resistente, debe someterse a tratamientos termoquímicos (por ejemplo, exfoliación de fibra con amoníaco (AFEX), ácidos diluidos (AD), líquidos iónicos (LI)) y tratamientos biológicos (por ejemplo, hidrólisis enzimática y fermentación microbiana) en combinación para obtener el producto deseado. Sin embargo, cuando se utilizan enzimas fúngicas comerciales en el proceso de hidrólisis, solo entre el 75 % y el 85 % de los azúcares solubles formados son monosacáridos, y el 15 % al 25 % restante son oligosacáridos solubles e insolubles, que no siempre están disponibles para los microorganismos. Anteriormente, hemos aislado y purificado con éxito oligosacáridos solubles resistentes mediante una combinación de separación con carbono y tierra de diatomeas y cromatografía de exclusión por tamaño, y también hemos investigado sus propiedades inhibidoras de enzimas. Hemos descubierto que los oligosacáridos que contienen sustituciones de ácido urónico metilado con un grado de polimerización (DP) más alto son más difíciles de procesar con mezclas de enzimas comerciales que los oligosacáridos neutros y de bajo DP. Aquí informamos el uso de varios métodos adicionales, incluyendo el perfilado de glicanos usando anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos para glicanos de biomasa vegetal para caracterizar enlaces de glicanos en paredes celulares vegetales e hidrolizados enzimáticos, ionización por desorción láser asistida por matriz, espectrometría de masas de tiempo de vuelo. MALDI-TOF-MS) utiliza picos de diagnóstico informativos de estructura obtenidos por espectroscopia después de la desintegración secundaria de iones negativos, cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS) para caracterizar enlaces de oligosacáridos con y sin derivatización. Debido al pequeño tamaño de los oligosacáridos (DP 4–20), estas moléculas son difíciles de usar para la unión y caracterización de mAb. Para superar este problema, aplicamos un nuevo método de inmovilización de oligosacáridos basado en la conjugación con biotina, que permitió marcar con éxito la mayoría de los oligosacáridos solubles de bajo grado de polimerización (DP) en la superficie de la microplaca. Este método se utilizó posteriormente en un sistema de anticuerpos monoclonales (mAb) de alto rendimiento para el análisis de ligación específica. Este nuevo método facilitará el desarrollo futuro de ensayos de glicoma de alto rendimiento más avanzados, que podrán utilizarse para aislar y caracterizar los oligosacáridos presentes en biomarcadores con fines diagnósticos.
La biomasa lignocelulósica, compuesta de materiales agrícolas, forestales, herbáceos y leñosos, es una materia prima potencial para la producción de productos de base biológica, incluidos alimentos, piensos, combustibles y precursores químicos para producir productos de mayor valor1. Los carbohidratos (como la celulosa y la hemicelulosa) presentes en las paredes celulares de las plantas se despolimerizan en monosacáridos mediante procesamiento químico y biotransformación (como hidrólisis enzimática y fermentación microbiana). Los pretratamientos comunes incluyen expansión de fibra con amoníaco (AFEX), ácido diluido (DA), líquido iónico (IL) y explosión de vapor (SE), que utilizan una combinación de productos químicos y calor para reducir la producción de lignocelulosa mediante la apertura de las paredes celulares de las plantas3,4. resistencia de la materia, 5. La hidrólisis enzimática se lleva a cabo con una alta carga de sólidos utilizando enzimas comerciales activas que contienen carbohidratos (CAZymes) y la fermentación microbiana utilizando levaduras o bacterias transgénicas para producir combustibles y productos químicos de base biológica 6.
Las CAZimas en las enzimas comerciales están compuestas por una mezcla compleja de enzimas que rompen sinérgicamente los enlaces complejos carbohidrato-azúcar para formar monosacáridos2,7. Como informamos anteriormente, la compleja red de polímeros aromáticos de lignina con carbohidratos los hace altamente difíciles de procesar, lo que lleva a una conversión incompleta de azúcares, acumulando entre un 15 y un 25 % de oligosacáridos sexuales que no se producen durante la hidrólisis enzimática de la biomasa pretratada. Este es un problema común en varios métodos de pretratamiento de biomasa. Algunas razones para este cuello de botella incluyen la inhibición enzimática durante la hidrólisis o la ausencia o bajos niveles de enzimas esenciales necesarias para romper los enlaces de azúcar en la biomasa vegetal. Comprender la composición y las características estructurales de los azúcares, como los enlaces de azúcar en los oligosacáridos, nos ayudará a mejorar la conversión de azúcares durante la hidrólisis, haciendo que los procesos biotecnológicos sean competitivos en costos con los productos derivados del petróleo.
Determinar la estructura de los carbohidratos es un desafío y requiere una combinación de métodos como la cromatografía líquida (LC)11,12, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)13, la electroforesis capilar (CE)14,15,16 y la espectrometría de masas (MS)17, ,dieciocho. Los métodos de MS, como la espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción láser e ionización utilizando una matriz (MALDI-TOF-MS), son un método versátil para identificar estructuras de carbohidratos. Recientemente, la espectrometría de masas en tándem con disociación inducida por colisión (CID) de aductos de iones de sodio ha sido la más utilizada para identificar huellas dactilares correspondientes a posiciones de unión de oligosacáridos, configuraciones anoméricas, secuencias y posiciones de ramificación 20, 21.
El análisis de glicanos es una excelente herramienta para la identificación exhaustiva de enlaces de carbohidratos22. Este método utiliza anticuerpos monoclonales (AcM) dirigidos a los glicanos de la pared celular vegetal como sondas para comprender los enlaces de carbohidratos complejos. Hay más de 250 AcM disponibles en todo el mundo, diseñados contra diversos oligosacáridos lineales y ramificados utilizando diversos sacáridos24. Varios AcM se han utilizado ampliamente para caracterizar la estructura, composición y modificaciones de la pared celular vegetal, ya que existen diferencias significativas dependiendo del tipo de célula vegetal, órgano, edad, etapa de desarrollo y entorno de crecimiento25,26. Más recientemente, este método se ha utilizado para comprender las poblaciones de vesículas en sistemas vegetales y animales y sus respectivos roles en el transporte de glicanos según lo determinado por marcadores subcelulares, etapas de desarrollo o estímulos ambientales, y para determinar la actividad enzimática. Algunas de las diferentes estructuras de glicanos y xilanos que se han identificado incluyen pectina (P), xilano (X), manano (M), xiloglucanos (XylG), glucanos de enlace mixto (MLG), arabinoxilano (ArbX), galactomanano (GalG), ácido glucurónico-arabinoxilano (GArbX) y arabino-galactano (ArbG)29.
Sin embargo, a pesar de todos estos esfuerzos de investigación, solo unos pocos estudios se han centrado en la naturaleza de la acumulación de oligosacáridos durante la hidrólisis de carga de sólidos alta (HSL), incluyendo la liberación de oligosacáridos, cambios en la longitud de la cadena oligomérica durante la hidrólisis, varios polímeros de bajo DP y sus curvas de distribución 30,31,32. Mientras tanto, aunque el análisis de glicanos ha demostrado ser una herramienta útil para un análisis integral de la estructura de los glicanos, es difícil evaluar los oligosacáridos de bajo DP solubles en agua utilizando métodos de anticuerpos. Los oligosacáridos de DP más pequeños con un peso molecular de menos de 5-10 kDa no se unen a las placas de ELISA 33, 34 y se lavan antes de la adición de anticuerpos.
Aquí, por primera vez, demostramos un ensayo ELISA en placas recubiertas con avidina utilizando anticuerpos monoclonales, combinando un procedimiento de biotinilación en un solo paso para oligosacáridos refractarios solubles con análisis del glicoma. Nuestro enfoque para el análisis del glicoma fue validado mediante análisis basados ​​en MALDI-TOF-MS y GC-MS de enlaces de oligosacáridos complementarios utilizando derivatización con trimetilsililo (TMS) de composiciones de azúcares hidrolizados. Este enfoque innovador puede desarrollarse como un método de alto rendimiento en el futuro y encontrar una aplicación más amplia en la investigación biomédica35.
Las modificaciones postraduccionales de enzimas y anticuerpos, como la glicosilación,36 afectan su actividad biológica. Por ejemplo, los cambios en la glicosilación de las proteínas séricas desempeñan un papel importante en la artritis inflamatoria, y se utilizan como marcadores diagnósticos37. Se ha informado en la literatura que diversos glicanos aparecen con frecuencia en una variedad de enfermedades, incluidas enfermedades inflamatorias crónicas del tracto gastrointestinal y el hígado, infecciones virales y cánceres de ovario, mama y próstata38,39,40. Comprender la estructura de los glicanos mediante métodos ELISA de glicanos basados ​​en anticuerpos proporcionará mayor confianza en el diagnóstico de enfermedades sin necesidad de utilizar métodos complejos de espectrometría de masas.
Nuestro estudio anterior mostró que los oligosacáridos persistentes permanecieron sin hidrolizar después del pretratamiento y la hidrólisis enzimática (Figura 1). En nuestro trabajo publicado anteriormente, desarrollamos un método de extracción en fase sólida con carbón activado para aislar oligosacáridos del hidrolizado de rastrojo de maíz pretratado con AFEX (ACSH)8. Después de la extracción y separación iniciales, los oligosacáridos se fraccionaron aún más mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y se recolectaron en orden de peso molecular. Los monómeros y oligómeros de azúcar liberados de varios pretratamientos se analizaron mediante análisis de composición de azúcares. Al comparar el contenido de oligómeros de azúcar obtenidos por varios métodos de pretratamiento, la presencia de oligosacáridos persistentes es un problema común en la conversión de biomasa a monosacáridos y puede conducir a una reducción en el rendimiento de azúcar de al menos 10-15% e incluso hasta 18%. Este método se utiliza para la producción a gran escala de fracciones de oligosacáridos. El ACH resultante y sus fracciones subsiguientes con diferentes pesos moleculares se utilizaron como material experimental para la caracterización de oligosacáridos en este trabajo.
Después del pretratamiento y la hidrólisis enzimática, los oligosacáridos persistentes permanecieron sin hidrolizar. Aquí (A) es un método de separación de oligosacáridos en el que los oligosacáridos se aíslan del hidrolizado de rastrojo de maíz pretratado con AFEX (ACSH) utilizando un lecho empaquetado de carbón activado y tierra de diatomeas; (B) Método para la separación de oligosacáridos. Los oligosacáridos se separaron posteriormente por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC); (C) Monómeros y oligómeros de sacáridos liberados de varios pretratamientos (ácido diluido: DA, líquido iónico: IL y AFEX). Condiciones de hidrólisis enzimática: alta carga de sólidos del 25% (p/p) (aproximadamente 8% de carga de glucano), 96 horas de hidrólisis, carga de enzima comercial de 20 mg/g (relación Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) y (D) Monómeros y oligómeros de azúcares de glucosa, xilosa y arabinosa liberados del rastrojo de maíz pretratado con AFEX (ACS).
El análisis de glicanos ha demostrado ser una herramienta útil para un análisis estructural integral de glicanos en extractos aislados de residuos de biomasa sólida. Sin embargo, los sacáridos solubles en agua están subrepresentados utilizando este método tradicional41 porque los oligosacáridos de bajo peso molecular son difíciles de inmovilizar en placas ELISA y se eliminan mediante lavado antes de la adición de anticuerpos. Por lo tanto, para la unión y caracterización de anticuerpos, se utilizó un método de biotinilación de un solo paso para recubrir oligosacáridos solubles y no conformes en placas ELISA recubiertas con avidina. Este método se probó utilizando nuestro ACSH producido previamente y una fracción basada en su peso molecular (o grado de polimerización, DP). La biotinilación de un solo paso se utilizó para aumentar la afinidad de unión de oligosacáridos mediante la adición de biotina-LC-hidrazida al extremo reductor del carbohidrato (Fig. 2). En solución, el grupo hemiacetal en el extremo reductor reacciona con el grupo hidrazida de la biotina-LC-hidrazida para formar un enlace hidrazona. En presencia del agente reductor NaCNBH3, el enlace hidrazona se reduce a un producto final biotinilado estable. Con la modificación del extremo reductor del azúcar, fue posible la unión de oligosacáridos de bajo grado de polimerización a placas ELISA, y en nuestro estudio esto se realizó en placas recubiertas de avidina utilizando anticuerpos monoclonales dirigidos a glicanos.
Detección de anticuerpos monoclonales mediante ELISA para oligosacáridos biotinilados. Aquí (A) se muestra la biotinilación combinada de oligosacáridos y la posterior detección mediante ELISA con anticuerpos monoclonales dirigidos a glicanos en placas recubiertas con NeutrAvidin, y (B) se muestra un procedimiento de un solo paso para la biotinilación de los productos de reacción.
Se añadieron anticuerpos primarios y secundarios a placas recubiertas con avidina y conjugadas con oligosacáridos, y se lavaron en un medio sensible a la luz y al tiempo. Una vez completada la unión de los anticuerpos, se añadió el sustrato TMB para incubar la placa. Finalmente, la reacción se detuvo con ácido sulfúrico. Las placas incubadas se analizaron mediante un lector ELISA para determinar la fuerza de unión de cada anticuerpo y detectar la reticulación específica de anticuerpos. Para obtener más detalles y conocer los parámetros del experimento, consulte la sección correspondiente «Materiales y métodos».
Demostramos la utilidad de este método recientemente desarrollado para aplicaciones específicas mediante la caracterización de los oligosacáridos solubles presentes en ACSH, así como en fracciones de oligosacáridos crudos y purificados aislados de hidrolizados lignocelulósicos. Como se muestra en la Figura 3, los xilanos sustituidos con epítopos más comunes identificados en ACSH mediante métodos de ensayo de glicoma bioacilado suelen ser arabinogalactanos urónicos (U) o metilurónicos (MeU) y pécticos. La mayoría de ellos también se encontraron en nuestro estudio previo sobre el análisis de glicanos de sólidos no hidrolizados (UHS)43.
Detección de epítopos de oligosacáridos recalcitrantes mediante un anticuerpo monoclonal dirigido al glicano de la pared celular. La fracción “neutra” es la fracción ACN y la fracción “ácida” es la fracción FA. Los rojos más brillantes en el mapa de calor indican un mayor contenido de epítopos, y los azules más brillantes indican un fondo en blanco. Los valores de color en la escala se basan en los valores de DO brutos para formulaciones N=2. Los principales epítopos reconocidos por los anticuerpos se muestran a la derecha.
Estas estructuras no celulósicas no pudieron ser hidrolizadas por las celulasas y hemicelulasas más comunes presentes en la mezcla enzimática comercial analizada, que incluye las enzimas comerciales más utilizadas. Por lo tanto, se requieren nuevas enzimas auxiliares para su hidrólisis. Sin las enzimas accesorias no celulósicas necesarias, estos enlaces no celulósicos impiden la conversión completa a monosacáridos, incluso si sus polímeros de azúcar originales se hidrolizan extensamente en fragmentos más cortos y se disuelven utilizando mezclas enzimáticas comerciales.
Un estudio más detallado de la distribución de la señal y su fuerza de unión mostró que los epítopos de unión eran menores en las fracciones de azúcares de alto DP (A, B, C, DP hasta 20+) que en las fracciones de bajo DP (D, E, F, DP en dímeros) (Fig. 1). Los fragmentos ácidos son más comunes en los epítopos no celulósicos que los fragmentos neutros. Estos fenómenos son consistentes con el patrón observado en nuestro estudio anterior, donde los grupos ácidos y de alto DP fueron más resistentes a la hidrólisis enzimática. Por lo tanto, la presencia de epítopos de glicanos no celulósicos y sustituciones de U y MeU pueden contribuir en gran medida a la estabilidad de los oligosacáridos. Cabe señalar que la eficiencia de unión y detección puede ser problemática para los oligosacáridos de bajo DP, especialmente si el epítopo es un oligosacárido dimérico o trimérico. Esto se puede probar utilizando oligosacáridos comerciales de diferentes longitudes, cada uno conteniendo solo un epítopo que se une a un mAb específico.
Así, el uso de anticuerpos específicos para la estructura reveló ciertos tipos de enlaces recalcitrantes. Dependiendo del tipo de anticuerpo utilizado, el patrón de ligación apropiado y la intensidad de la señal que produce (más y menos abundante), se pueden identificar nuevas enzimas y agregarlas semicuantitativamente a la mezcla enzimática para una glicoconversión más completa. Tomando como ejemplo el análisis de oligosacáridos ACSH, podemos crear una base de datos de enlaces de glicanos para cada material de biomasa. Cabe señalar que se debe tener en cuenta la diferente afinidad de los anticuerpos, y si se desconoce su afinidad, esto generará ciertas dificultades al comparar las señales de diferentes anticuerpos. Además, la comparación de enlaces de glicanos puede funcionar mejor entre muestras para el mismo anticuerpo. Estos enlaces resistentes se pueden vincular a la base de datos CAZyme, a partir de la cual podemos identificar enzimas, seleccionar enzimas candidatas y probar enzimas que rompen enlaces, o desarrollar sistemas microbianos para expresar estas enzimas para su uso en biorrefinerías44.
Para evaluar cómo los métodos inmunológicos complementan los métodos alternativos para caracterizar los oligosacáridos de bajo peso molecular presentes en los hidrolizados lignocelulósicos, realizamos MALDI (Fig. 4, S1-S8) y análisis de sacáridos derivados de TMS basados ​​en GC-MS en el mismo panel (Fig. 5) parte de oligosacáridos. MALDI se utiliza para comparar si la distribución de masas de las moléculas de oligosacáridos coincide con la estructura prevista. En la figura 4 se muestra la MS de los componentes neutros ACN-A y ACN-B. El análisis de ACN-A confirmó un rango de azúcares pentosa que va desde DP 4–8 (Fig. 4) hasta DP 22 (Fig. S1), cuyos pesos corresponden a oligosacáridos de MeU-xilano. El análisis de ACN-B confirmó la serie de pentosa y glucoxilano con DP 8-15. En el material complementario, como la Figura S3, los mapas de distribución de masas de la fracción ácida FA-C muestran una gama de azúcares pentosa sustituidos con (Me)U con un DP de 8-15 que son consistentes con los xilanos sustituidos encontrados en el cribado de mAb basado en ELISA. Los epítopos son consistentes.
Espectro MALDI-MS de oligosacáridos solubles no conformes presentes en ACS. Aquí, (A) fracciones de bajo peso molecular de ACN-A que contienen oligosacáridos de glucuroxilano sustituidos con ácido urónico metilado (DP 4-8) y (B) oligosacáridos de xilano y ácido urónico metilado de ACN-B sustituidos con glucuroxilano (DP 8-15).
Análisis de la composición del residuo de glicano de oligosacáridos refractarios. Aquí (A) Composición de sacáridos TMS de diversas fracciones de oligosacáridos obtenidas mediante análisis GC-MS. (B) Estructuras de diversos azúcares derivados de TMS presentes en los oligosacáridos. ACN: fracción de acetonitrilo que contiene oligosacáridos neutros y FA: fracción de ácido ferúlico que contiene oligosacáridos ácidos.
Otra conclusión interesante se extrajo del análisis LC-MS de la fracción de oligosacáridos, como se muestra en la Figura S9 (los métodos se pueden consultar en el material complementario electrónico). Se observaron repetidamente fragmentos de hexosa y grupos -OAc durante la ligación de la fracción ACN-B. Este hallazgo no solo confirma la fragmentación observada en el análisis del glicoma y MALDI-TOF, sino que también proporciona nueva información sobre posibles derivados de carbohidratos en la biomasa lignocelulósica pretratada.
También realizamos un análisis de la composición de glicanos de las fracciones de oligosacáridos mediante derivatización de glicanos con TMS. Mediante GC-MS, determinamos la composición de azúcares neutros (no derivados) y ácidos (GluA y GalA) en la fracción de oligosacáridos (Fig. 5). El ácido glucurónico se encuentra en los componentes ácidos C y D, mientras que el ácido galacturónico se encuentra en los componentes ácidos A y B, ambos componentes de alto grado de polimerización (DP) de los azúcares ácidos. Estos resultados no solo confirman nuestros datos de ELISA y MALDI, sino que también son consistentes con nuestros estudios previos sobre la acumulación de oligosacáridos. Por lo tanto, creemos que los métodos inmunológicos modernos que utilizan la biotinilación de oligosacáridos y el posterior cribado mediante ELISA son suficientes para detectar oligosacáridos recalcitrantes solubles en diversas muestras biológicas.
Dado que los métodos de cribado de mAb basados ​​en ELISA han sido validados por varios métodos diferentes, quisimos explorar más a fondo el potencial de este nuevo método cuantitativo. Se adquirieron dos oligosacáridos comerciales, el oligosacárido de xilohexasacárido (XHE) y la 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriosa (A2XX), y se probaron utilizando un nuevo enfoque de mAb dirigido al glicano de la pared celular. La Figura 6 muestra una correlación lineal entre la señal de unión biotinilada y el logaritmo de la concentración de oligosacárido, lo que sugiere un posible modelo de adsorción de Langmuir. Entre los mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 y CCRC-M151 se correlacionaron con XHE, y CCRC-M108, CCRC-M109 y LM11 se correlacionaron con A2XX en un rango de 1 nm a 100 nano. Debido a la disponibilidad limitada de anticuerpos durante el experimento, se realizaron pocos experimentos con cada concentración de oligosacárido. Cabe destacar que algunos anticuerpos reaccionan de forma muy diferente al mismo oligosacárido como sustrato, presumiblemente porque se unen a epítopos ligeramente distintos y pueden tener afinidades de unión muy diferentes. Los mecanismos y las implicaciones de la identificación precisa de epítopos serán mucho más complejos cuando se aplique el nuevo método de anticuerpos monoclonales a muestras reales.
Se utilizaron dos oligosacáridos comerciales para determinar el rango de detección de diversos anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos a glicanos. En este caso, las correlaciones lineales con el logaritmo de la concentración de oligosacáridos indican patrones de adsorción de Langmuir para (A) XHE con mAb y (B) A2XX con mAb. Los epítopos correspondientes indican las estructuras de los oligosacáridos comerciales utilizados como sustratos en el ensayo.
El uso de anticuerpos monoclonales dirigidos a glicanos (análisis glicocómico o cribado de mAb basado en ELISA) es una herramienta poderosa para la caracterización exhaustiva de la mayoría de los principales glicanos de la pared celular que componen la biomasa vegetal. Sin embargo, el análisis clásico de glicanos solo caracteriza los glicanos de pared celular de mayor tamaño, ya que la mayoría de los oligosacáridos no se inmovilizan eficazmente en placas de ELISA. En este estudio, el rastrojo de maíz pretratado con AFEX se hidrolizó enzimáticamente con un alto contenido de sólidos. Se utilizó el análisis de azúcares para determinar la composición de los carbohidratos recalcitrantes de la pared celular en el hidrolizado. Sin embargo, el análisis de mAb de oligosacáridos más pequeños en hidrolizados está subestimado, y se necesitan herramientas adicionales para inmovilizar eficazmente los oligosacáridos en placas de ELISA.
Presentamos aquí un método novedoso y eficiente de inmovilización de oligosacáridos para la detección de anticuerpos monoclonales (mAb) mediante la combinación de biotinilación de oligosacáridos seguida de cribado ELISA en placas recubiertas con NeutrAvidin™. Los oligosacáridos biotinilados inmovilizados mostraron una afinidad suficiente por el anticuerpo, lo que permitió la detección rápida y eficiente de oligosacáridos recalcitrantes. El análisis de la composición de estos oligosacáridos resistentes mediante espectrometría de masas confirmó los resultados de este nuevo enfoque de inmunocribado. Por lo tanto, estos estudios demuestran que la combinación de biotinilación de oligosacáridos y cribado ELISA con anticuerpos monoclonales dirigidos a glicanos puede utilizarse para detectar enlaces cruzados en oligosacáridos y puede aplicarse ampliamente en otros estudios bioquímicos que caracterizan la estructura de los oligosacáridos.
Este método de perfilado de glicanos basado en biotina es el primer estudio capaz de investigar los enlaces de carbohidratos recalcitrantes de los oligosacáridos solubles en la biomasa vegetal. Esto ayuda a comprender por qué algunas partes de la biomasa son tan difíciles de procesar para la producción de biocombustibles. Este método cubre una importante laguna en los métodos de análisis del glicoma y amplía su aplicación a una gama más amplia de sustratos, más allá de los oligosacáridos vegetales. En el futuro, podríamos utilizar robótica para la biotinilación y emplear el método desarrollado para el análisis de alto rendimiento de muestras mediante ELISA.
La paja de maíz (CS), cultivada a partir de semillas híbridas Pioneer 33A14, se cosechó en 2010 en Kramer Farms, en Ray, Colorado. Con el permiso del propietario, esta biomasa puede utilizarse para investigación. Las muestras se almacenaron en seco, con un contenido de humedad inferior al 6%, en bolsas con cierre hermético a temperatura ambiente. Las muestras se almacenaron en seco, con un contenido de humedad inferior al 6%, en bolsas con cierre hermético a temperatura ambiente. Ajuste la cantidad de alimentos con una temperatura inferior al 6 % en paquetes con una temperatura constante. Las muestras se almacenaron en seco, con una humedad inferior al 6%, en bolsas con cierre hermético a temperatura ambiente.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6% La temperatura de los paquetes con una temperatura elevada es < 6%. Las muestras se almacenan en bolsas con cierre hermético a temperatura ambiente con una humedad inferior al 6 %.El estudio cumplió con las directrices locales y nacionales. El análisis composicional se realizó utilizando el protocolo NREL. Se determinó que la composición contenía 31,4 % de glucano, 18,7 % de xilano, 3,3 % de arabinano, 1,2 % de galactano, 2,2 % de acetilo, 14,3 % de lignina, 1,7 % de proteína y 13,4 % de ceniza.
Cellic® CTec2 (138 mg de proteína/ml, lote VCNI 0001) es una mezcla compleja de celulasa, β-glucosidasa y Cellic® HTec2 (157 mg de proteína/ml, lote VHN00001) de Novozymes (Franklinton, NC, EE. UU.)). Multifect Pectinase® (72 mg de proteína/ml), una mezcla compleja de enzimas degradadoras de pectina, fue donada por DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, EE. UU.). Las concentraciones de proteína enzimática se determinaron estimando el contenido de proteína (y restando la contribución del nitrógeno no proteico) utilizando el análisis de nitrógeno Kjeldahl (método AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, EE. UU.). La tierra de diatomeas 545 se compró a EMD Millipore (Billerica, MA). El carbón activado (DARCO, gránulos de malla 100), Avicel (PH-101), xilano de haya y todos los demás productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
El pretratamiento AFEX se realizó en GLBRC (Laboratorio de Investigación de Conversión de Biomasa, MSU, Lansing, MI, EE. UU.). El pretratamiento se llevó a cabo a 140 °C durante 15 minutos. 46 tiempo de residencia en una proporción 1:1 de amoníaco anhidro a biomasa con una carga del 60 % (p/p) en un reactor discontinuo de sobremesa de acero inoxidable (Parr Instruments Company). Tomó 30 minutos. El reactor se llevó a 140 °C y el amoníaco se liberó rápidamente, lo que permitió que la biomasa volviera rápidamente a la temperatura ambiente. La composición del rastrojo de maíz pretratado con AFEX (ACS) fue similar a la del rastrojo de maíz sin tratar (UT-CS).
Se preparó ACSH de alto contenido de sólidos al 25% (p/p) (aproximadamente 8% de carga de dextrano) como material de partida para la producción a gran escala de oligosacáridos. La hidrólisis enzimática de ACS se realizó utilizando una mezcla de enzimas comerciales que incluía Cellic® Ctec2 10 mg de proteína/g de glucano (en biomasa pretratada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg de proteína/g de glucano y Multifect Pectinasa (Genencor Inc, EE. UU.). ), 5 mg de proteína/g de dextrano. La hidrólisis enzimática se llevó a cabo en un biorreactor de 5 litros con un volumen de trabajo de 3 litros, pH 4,8, 50 °C y 250 rpm. Después de la hidrólisis durante 96 horas, el hidrolizado se recogió por centrifugación a 6000 rpm durante 30 minutos y luego a 14000 rpm durante 30 minutos para eliminar los sólidos no hidrolizados. El hidrolizado se sometió a filtración estéril a través de un filtro de 0,22 mm. El hidrolizado filtrado se almacenó en frascos estériles a 4 °C y posteriormente se fraccionó en carbón activado.
Análisis de la composición de muestras de biomasa a base de extractos según los procedimientos de análisis de laboratorio del NREL: preparación de muestras para análisis de composición (NREL/TP-510-42620) y determinación de carbohidratos estructurales y lignina en biomasa (NREL/TP-510 – 42618)47.
El análisis de oligosacáridos del hidrolizado se realizó a escala de 2 ml mediante hidrólisis ácida en autoclave. Mezcle la muestra de hidrolizado con 69,7 µl de ácido sulfúrico al 72 % en un tubo de cultivo de 10 ml con tapón de rosca e incube durante 1 hora a 121 °C sobre una mesa de laboratorio. Enfríe en hielo y filtre en un vial para cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La concentración de oligosacáridos se determinó restando la concentración de monosacáridos de la muestra no hidrolizada a la concentración total de azúcares de la muestra hidrolizada con ácido.
Las concentraciones de glucosa, xilosa y arabinosa en la biomasa hidrolizada con ácido se analizaron utilizando un sistema HPLC Shimadzu equipado con un automuestreador, calentador de columna, bomba isocrática y detector de índice de refracción en una columna Bio-Rad Aminex HPX-87H. La columna se mantuvo a 50 °C y se eluyó con un flujo de 0,6 ml/min de H2SO4 5 mM en agua.
El sobrenadante del hidrolizado se diluyó y se analizó para determinar su contenido de monómeros y oligosacáridos. Los azúcares monoméricos obtenidos tras la hidrólisis enzimática se analizaron mediante HPLC equipada con una columna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P y una precolumna de cenizas. La temperatura de la columna se mantuvo a 80 °C y se utilizó agua como fase móvil con un flujo de 0,6 ml/min. Los oligosacáridos se determinaron mediante hidrólisis en ácido diluido a 121 °C según los métodos descritos en las referencias 41, 48 y 49.
Se realizó un análisis de sacáridos en residuos de biomasa cruda, pretratada con AFEX y no hidrolizada (incluida la producción de extractos de pared celular en serie y su cribado de mAb) utilizando procedimientos descritos previamente 27, 43, 50, 51. Para el análisis del glicoma, los residuos insolubles en alcohol del material de la pared celular vegetal se preparan a partir de residuos de biomasa y se someten a extracción en serie con reactivos cada vez más agresivos como oxalato de amonio (50 mM), carbonato de sodio (50 mM y 0,5 % p/v), CON. (1 M y 4 M, ambos con borohidruro de sodio al 1 % p/v) y clorito ácido como se describió previamente52,53. Los extractos se sometieron luego a ELISA contra un panel complejo de mAb50 dirigidos al glicano de la pared celular, y las reacciones de unión de mAb se presentaron como un mapa de calor. Los mAb dirigidos al glicano de la pared celular vegetal se compraron de existencias de laboratorio (series CCRC, JIM y MAC).
Biotinilación en un solo paso de oligosacáridos. La conjugación de carbohidratos con biotina-LC-hidrazida se realizó siguiendo el siguiente procedimiento. La biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO, 70 μl) mediante agitación vigorosa y calentamiento a 65 °C durante 1 min. Se añadieron 30 μl de ácido acético glacial y la mezcla se vertió sobre cianoborohidruro de sodio (6,4 mg/100 μmol), disolviéndolo completamente tras calentar a 65 °C durante aproximadamente 1 minuto. A continuación, se añadieron de 5 a 8 μl de la mezcla de reacción al oligosacárido seco (1-100 nmol) para obtener un exceso molar de 10 veces o más del marcador sobre el extremo reductor. La reacción se llevó a cabo a 65 °C durante 2 h, tras lo cual las muestras se purificaron inmediatamente. En los experimentos de marcaje sin reducción no se utilizó cianoborohidruro de sodio, y las muestras se hicieron reaccionar a 65 °C durante 2,5 horas.
Recubrimiento ELISA y lavado de muestras de oligosacáridos biotinilados. Se añadieron 25 μl de muestras biotiniladas (100 μl de cada muestra concentrada diluida en 5 ml de solución tampón Tris 0,1 M (TBS)) a cada pocillo de la placa recubierta con avidina. Los pocillos de control se recubrieron con 50 μl de biotina a una concentración de 10 μg/ml en TBS 0,1 M. Se utilizó agua desionizada como recubrimiento para las mediciones en blanco. La tableta se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave la placa 3 veces con leche desnatada al 0,1% en TBS 0,1 M utilizando el programa n.º 11 para Grenier plano 3A.
Adición y lavado de anticuerpos primarios. Añada 40 µl de anticuerpo primario a cada pocillo. Incube la microplaca durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, lave las placas 3 veces con leche al 0,1 % en TBS 0,1 M utilizando el programa de lavado n.º 11 para Grenier Flat 3A.
Agregue el anticuerpo secundario y lave. Añada 50 µl de anticuerpo secundario de ratón/rata (diluido 1:5000 en leche al 0,1% en TBS 0,1 M) a cada pocillo. Incube la microplaca durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, lave las microplacas 5 veces con leche al 0,1% en TBS 0,1 M utilizando el programa de lavado de placas Grenier Flat 5A n.° 12.
Agregar un sustrato. Agregue 50 µl de 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) al sustrato base (añadiendo 2 gotas de tampón, 3 gotas de TMB, 2 gotas de peróxido de hidrógeno a 15 ml de agua desionizada). Prepare el sustrato de TMB. y agite en vórtex antes de usar). Incube la microplaca a temperatura ambiente durante 30 minutos. En la oscuridad.
Complete el paso y lea la tableta. Añada 50 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pocillo y registre la absorbancia de 450 a 655 nm utilizando un lector de ELISA.
Prepare soluciones de 1 mg/ml de estos analitos en agua desionizada: arabinosa, ramnosa, fucosa, xilosa, ácido galacturónico (GalA), ácido glucurónico (GlcA), manosa, glucosa, galactosa, lactosa, N-acetilmanosamina (manNAc), N-acetilglucosamina (glcNAc), N-acetilgalactosamina (galNAc), inositol (estándar interno). Se prepararon dos estándares añadiendo las soluciones de azúcar de 1 mg/ml que se muestran en la Tabla 1. Las muestras se congelan y liofilizan a -80 °C hasta eliminar toda el agua (generalmente entre 12 y 18 horas).
Añada de 100 a 500 µg de muestra a tubos con tapón de rosca en una balanza analítica. Registre la cantidad añadida. Lo ideal es disolver la muestra en una concentración específica de disolvente y añadirla al tubo como alícuota líquida. Utilice 20 µl de inositol a 1 mg/ml como estándar interno para cada tubo de muestra. La cantidad de estándar interno añadida a la muestra debe ser la misma que la añadida al tubo de referencia.
Agregue 8 ml de metanol anhidro a un vial con tapón de rosca. Luego, agregue 4 ml de solución de HCl metanólico 3 N, tape y agite. Este proceso no utiliza agua.
Agregue 500 µl de solución de HCl 1 M en metanol a las muestras de oligosacáridos y tubos TMS estándar. Las muestras se incubaron durante la noche (168 horas) a 80 °C en un bloque térmico. Seque el producto de metanólisis a temperatura ambiente usando un colector de secado. Agregue 200 µl de MeOH y seque de nuevo. Este proceso se repite dos veces. Agregue 200 µl de metanol, 100 µl de piridina y 100 µl de anhídrido acético a la muestra y mezcle bien. Incube las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos y seque. Agregue 200 µl de metanol y seque de nuevo.
Agregue 200 µl de Tri-Sil y caliente el tubo tapado durante 20 minutos a 80 °C. Luego, enfríe a temperatura ambiente. Utilice un secador para secar aún más la muestra hasta un volumen aproximado de 50 µl. Es importante tener en cuenta que no dejamos que las muestras se secaran por completo.
Agregue 2 ml de hexano y mezcle bien agitando en vórtex. Llene las puntas de las pipetas Pasteur (5-8 mm) con un trozo de lana de vidrio insertándolo sobre una pipeta de 5-3/4 pulgadas de diámetro. Las muestras se centrifugaron a 3000 g durante 2 minutos. Los residuos insolubles precipitaron. Seque la muestra hasta un volumen de 100-150 µl. Se inyectó un volumen aproximado de 1 µl en el GC-MS a una temperatura inicial de 80 °C y un tiempo inicial de 2,0 minutos (Tabla 2).