Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS. Para sa pinakamaayong kasinatian, among girekomendar nga mogamit ka og updated nga browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samtang, aron masiguro ang padayon nga suporta, among i-render ang site nga walay mga style ug JavaScript.
Bag-ong mga pamaagi sa immunological ug mass spectrometric para sa komplikado nga pag-analisa sa mga persistent oligosaccharides sa corn stover nga gi-pretreat gamit ang AFEX. Ang lignocellulosic biomass usa ka malungtarong alternatibo sa fossil fuels ug kaylap nga gigamit sa pagpalambo sa mga biotechnologies para sa produksyon sa mga produkto sama sa pagkaon, feed, fuels ug mga kemikal. Ang yawe niining mga teknolohiya mao ang pagpalambo sa mga proseso nga barato para sa pag-convert sa mga complex carbohydrates nga anaa sa mga plant cell walls ngadto sa mga simpleng asukar sama sa glucose, xylose ug arabinose. Tungod kay ang lignocellulosic biomass gahi kaayo og ulo, kinahanglan kini nga ipailalom sa mga thermochemical treatment (pananglitan, ammonia fiber exfoliation (AFEX), dilute acids (DA), ionic liquids (IL)) ug biological treatments (pananglitan, enzymatic hydrolysis ug microbial fermentation) nga gihiusa aron makuha ang gitinguha nga produkto. . Bisan pa, kung ang mga komersyal nga fungal enzymes gigamit sa proseso sa hydrolysis, 75-85% ra sa mga soluble sugars nga naporma ang monosaccharides, ug ang nahabilin nga 15-25% ang soluble, intractable oligosaccharides, nga dili kanunay magamit sa mga microorganism. Kaniadto, malampuson namong na-isolate ug na-purified ang mga soluble stubborn oligosaccharides gamit ang kombinasyon sa carbon ug diatomaceous earth separation ug size exclusion chromatography, ug gisusi usab ang ilang enzyme inhibitory properties. Among nakita nga ang mga oligosaccharides nga adunay mas taas nga degree sa polymerization (DP) methylated uronic acid substitutions mas lisod iproseso gamit ang commercial enzyme blends kaysa low DP ug neutral oligosaccharides. Dinhi among gitaho ang paggamit sa daghang dugang nga mga pamaagi, lakip ang glycan profiling gamit ang monoclonal antibodies (mAbs) nga espesipiko sa plant biomass glycans aron mailhan ang glycan bonds sa plant cell walls ug enzymatic hydrolysates, matrix-assisted laser desorption ionization, time-of-flight mass-spectrometry. . Ang MALDI-TOF-MS) naggamit ug structure-informative diagnostic peaks nga nakuha pinaagi sa spectroscopy human sa secondary decay sa negative ions, gas chromatography ug mass spectrometry (GC-MS) aron mailhan ang oligosaccharide bonds nga adunay ug walay derivatization. Tungod sa gamay nga gidak-on sa mga oligosaccharides (DP 4–20), kini nga mga molekula lisod gamiton para sa mAb binding ug characterization. Aron masulbad kini nga problema, among gigamit ang usa ka bag-ong biotin conjugation-based oligosaccharide immobilization method nga malampusong nag-label sa kadaghanan sa mga low DP soluble oligosaccharides sa microplate surface, nga gigamit dayon sa usa ka high throughput mAb system para sa espesipikong ligation analysis. Kini nga bag-ong pamaagi magpadali sa pag-uswag sa mas abante nga high throughput glycome assays sa umaabot nga magamit sa pag-isolate ug pag-characterize sa mga oligosaccharides nga anaa sa mga biomarker para sa mga katuyoan sa diagnostic.
Ang lignocellulosic biomass, nga gilangkoban sa mga materyales sa agrikultura, kalasangan, sagbot ug kahoy, usa ka potensyal nga feedstock alang sa produksiyon sa mga produktong bio-based, lakip ang pagkaon, feed, gasolina ug mga kemikal nga precursor aron makahimo og mas taas nga bili nga mga produkto1. Ang mga carbohydrates (sama sa cellulose ug hemicellulose) nga anaa sa mga bungbong sa selula sa tanom gi-depolymerize ngadto sa mga monosaccharides pinaagi sa kemikal nga pagproseso ug biotransformation (sama sa enzymatic hydrolysis ug microbial fermentation). Ang kasagarang mga pre-treatment naglakip sa ammonia fiber expansion (AFEX), dilute acid (DA), ionic liquid (IL), ug steam explosion (SE), nga naggamit og kombinasyon sa mga kemikal ug kainit aron makunhuran ang produksiyon sa lignocellulose pinaagi sa pag-abli sa mga bungbong sa selula sa tanom3,4. pagkagahi sa butang, 5. Ang enzymatic hydrolysis gihimo sa taas nga solids load gamit ang commercial active carbohydrate-containing enzymes (CAZymes) ug microbial fermentation gamit ang transgenic yeasts o bacteria aron makahimo og bio-based fuels ug kemikal6.
Ang mga CAZyme sa mga komersyal nga enzyme gilangkoban sa usa ka komplikado nga sagol sa mga enzyme nga synergistically nga nagbungkag sa mga complex carbohydrate-sugar bond aron maporma ang mga monosaccharide2,7. Sama sa among gitaho kaniadto, ang komplikado nga network sa mga aromatic polymer sa lignin nga adunay mga carbohydrate naghimo kanila nga dili masulbad, nga mosangpot sa dili kompleto nga pagkakabig sa asukal, nga nagtipon og 15-25% sa mga sex oligosaccharide nga wala gihimo sa panahon sa enzymatic hydrolysis sa pretreated biomass. Kini usa ka komon nga problema sa lainlaing mga pamaagi sa pretreatment sa biomass. Ang pipila ka mga hinungdan niini nga bottleneck naglakip sa pagpugong sa enzyme sa panahon sa hydrolysis, o ang pagkawala o ubos nga lebel sa hinungdanon nga mga enzyme nga gikinahanglan aron mabungkag ang mga bugkos sa asukal sa biomass sa tanum. Ang pagsabot sa komposisyon ug istruktura nga mga kinaiya sa mga asukal, sama sa mga bugkos sa asukal sa mga oligosaccharide, makatabang kanato nga mapaayo ang pagkakabig sa asukal sa panahon sa hydrolysis, nga maghimo sa mga proseso sa biotechnological nga kompetisyon sa gasto sa mga produkto nga gikan sa petrolyo.
Ang pagtino sa istruktura sa mga carbohydrates usa ka mahagiton ug nanginahanglan og kombinasyon sa mga pamaagi sama sa liquid chromatography (LC)11,12, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)13, capillary electrophoresis (CE)14,15,16 ug mass spectrometry (MS)17. ,diyes-otso. Ang mga pamaagi sa MS sama sa time-of-flight mass spectrometry nga adunay laser desorption ug ionization gamit ang matrix (MALDI-TOF-MS) usa ka magamit nga pamaagi alang sa pag-ila sa mga istruktura sa carbohydrate. Bag-ohay lang, ang Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS sa sodium ion adducts mao ang labing kaylap nga gigamit aron mailhan ang mga fingerprint nga katumbas sa mga posisyon sa pagkabit sa oligosaccharide, anomeric configurations, sequences, ug branching positions 20, 21.
Ang glycan analysis usa ka maayo kaayong himan alang sa lawom nga pag-ila sa mga carbohydrate bonds22. Kini nga pamaagi naggamit og monoclonal antibodies (mAbs) nga gitumong sa plant cell wall glycan isip mga probe aron masabtan ang complex carbohydrate linkages. Kapin sa 250 mAbs ang anaa sa tibuok kalibutan, nga gidisenyo batok sa lain-laing linear ug branched oligosaccharides gamit ang lain-laing saccharides24. Daghang mAbs ang kaylap nga gigamit aron mailhan ang istruktura, komposisyon, ug mga pagbag-o sa plant cell wall, tungod kay adunay mga mahinungdanong kalainan depende sa tipo sa plant cell, organ, edad, yugto sa paglambo, ug palibot sa pagtubo25,26. Bag-ohay lang, kini nga pamaagi gigamit aron masabtan ang mga populasyon sa vesicle sa mga sistema sa tanom ug hayop ug ang ilang tagsa-tagsa ka papel sa glycan transport nga gitino sa mga subcellular marker, mga yugto sa paglambo, o environmental stimuli, ug aron mahibal-an ang enzymatic activity. Ang pipila sa lain-laing istruktura sa glycans ug xylans nga nailhan naglakip sa pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), mixed bond glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) ug arabino-galactan (ArbG)29.
Apan, bisan pa niining tanan nga mga paningkamot sa panukiduki, pipila lang ka mga pagtuon ang naka-focus sa kinaiya sa akumulasyon sa oligosaccharide atol sa high solids load (HSL) hydrolysis, lakip ang pagpagawas sa oligosaccharide, mga pagbag-o sa gitas-on sa oligomeric chain atol sa hydrolysis, lain-laing mga low DP polymer, ug ang ilang mga kurba. distribusyon 30,31,32. Samtang, bisan tuod ang glycan analysis napamatud-an nga usa ka mapuslanon nga himan alang sa usa ka komprehensibo nga pag-analisar sa istruktura sa glycan, lisud ang pag-evaluate sa mga water-soluble low DP oligosaccharides gamit ang mga pamaagi sa antibody. Ang mas gagmay nga DP oligosaccharides nga adunay molekular nga gibug-aton nga ubos sa 5-10 kDa dili motapot sa mga plato sa ELISA 33, 34 ug mahugasan sa dili pa idugang ang antibody.
Dinhi, sa unang higayon, among gipakita ang usa ka ELISA assay sa mga avidin-coated plate gamit ang monoclonal antibodies, nga naghiusa sa usa ka one-step biotinylation procedure para sa soluble refractory oligosaccharides uban sa glycome analysis. Ang among pamaagi sa glycome analysis gi-validate pinaagi sa MALDI-TOF-MS ug GC-MS based analysis sa complementary oligosaccharide linkages gamit ang trimethylsilyl (TMS) derivatization sa hydrolyzed sugar compositions. Kini nga inobatibong pamaagi mahimong mapalambo isip usa ka high-throughput nga pamaagi sa umaabot ug makit-an ang mas lapad nga aplikasyon sa biomedical research35.
Ang mga post-translational nga pagbag-o sa mga enzyme ug antibodies, sama sa glycosylation,36 makaapekto sa ilang biological nga kalihokan. Pananglitan, ang mga pagbag-o sa glycosylation sa mga protina sa serum adunay hinungdanon nga papel sa inflammatory arthritis, ug ang mga pagbag-o sa glycosylation gigamit isip diagnostic markers37. Nagkalain-laing mga glycans ang gitaho sa literatura nga dali nga makita sa lainlaing mga sakit, lakip ang mga chronic inflammatory diseases sa gastrointestinal tract ug atay, mga impeksyon sa virus, kanser sa obaryo, suso, ug prostate38,39,40. Ang pagsabot sa istruktura sa mga glycans gamit ang mga pamaagi sa glycan ELISA nga nakabase sa antibody maghatag ug dugang nga pagsalig sa pagdayagnos sa sakit nga wala gigamit ang komplikado nga mga pamaagi sa MS.
Ang among miaging pagtuon nagpakita nga ang mga gahig ulo nga oligosaccharides nagpabilin nga wala ma-hydrolyzed pagkahuman sa pretreatment ug enzymatic hydrolysis (Figure 1). Sa among gipatik nga trabaho kaniadto, naghimo kami usa ka pamaagi sa activated charcoal solid-phase extraction aron ibulag ang mga oligosaccharides gikan sa AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8. Pagkahuman sa inisyal nga pagkuha ug pagbulag, ang mga oligosaccharides dugang nga gi-fractionate pinaagi sa size exclusion chromatography (SEC) ug gikolekta base sa molecular weight. Ang mga sugar monomer ug oligomer nga gipagawas gikan sa lainlaing mga pretreatment gi-analisa pinaagi sa pag-analisa sa komposisyon sa asukal. Kung itandi ang sulud sa mga sugar oligomer nga nakuha pinaagi sa lainlaing mga pamaagi sa pretreatment, ang presensya sa mga gahig ulo nga oligosaccharides usa ka kasagarang problema sa pagkakabig sa biomass ngadto sa monosaccharides ug mahimong mosangpot sa pagkunhod sa ani sa asukal nga labing menos 10-15% ug bisan hangtod sa 18%. US. Kini nga pamaagi gigamit alang sa dugang nga dako nga produksiyon sa mga fraction sa oligosaccharide. Ang resulta nga ACH ug ang sunod nga mga fraction niini nga adunay lainlaing mga gibug-aton sa molekula gigamit ingon nga eksperimental nga materyal alang sa pag-ila sa mga oligosaccharides niini nga trabaho.
Human sa pretreatment ug enzymatic hydrolysis, ang mga persistent oligosaccharides nagpabilin nga wala ma-hydrolyze. Dinhi (A) ang usa ka pamaagi sa pagbulag sa oligosaccharide diin ang mga oligosaccharides gi-isolate gikan sa AFEX-pretreated corn stover hydrolysate (ACSH) gamit ang usa ka packed bed sa activated carbon ug diatomaceous earth; (B) Pamaagi sa pagbulag sa mga oligosaccharides. Ang mga oligosaccharides dugang nga gibulag pinaagi sa size exclusion chromatography (SEC); (C) Mga monomer ug oligomer sa Saccharide nga gipagawas gikan sa lainlaing mga pretreatment (diluted acid: DA, ionic liquid: IL ug AFEX). Mga kondisyon sa enzymatic hydrolysis: taas nga solids loading nga 25% (w/w) (gibana-bana nga 8% glucan loading), 96 ka oras nga hydrolysis, 20 mg/g commercial enzyme loading (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratio) ug (D) Mga monomer ug oligomer sa asukal sa glucose, xylose ug arabinose nga gipagawas gikan sa AFEX pre-treated corn stover (ACS).
Ang glycan analysis napamatud-an nga usa ka mapuslanon nga himan alang sa usa ka komprehensibo nga structural analysis sa mga glycan sa mga extract nga nahimulag gikan sa solid biomass residues. Bisan pa, ang mga water-soluble saccharides kulang sa representasyon gamit kini nga tradisyonal nga pamaagi41 tungod kay ang mga low molecular weight oligosaccharides lisud nga i-immobilize sa mga ELISA plate ug mahugasan sa dili pa idugang ang antibody. Busa, alang sa antibody binding ug characterization, usa ka one-step biotinylation method ang gigamit aron i-coat ang soluble, non-compliant oligosaccharides sa avidin-coated ELISA plates. Kini nga pamaagi gisulayan gamit ang among gihimo kaniadto nga ACSH ug usa ka fraction base sa molecular weight niini (o degree of polymerization, DP). Ang one-step biotinylation gigamit aron madugangan ang oligosaccharide binding affinity pinaagi sa pagdugang sa biotin-LC-hydrazide sa reducing end sa carbohydrate (Fig. 2). Sa solusyon, ang hemiacetal group sa reducing end mo-react sa hydrazide group sa biotin-LC-hydrazide aron maporma ang hydrazone bond. Sa presensya sa reducing agent nga NaCNBH3, ang hydrazone bond mokunhod ngadto sa usa ka lig-on nga biotinylated end product. Uban sa pag-usab sa sugar reducing end, ang pagbugkos sa low DP oligosaccharides ngadto sa ELISA plates nahimong posible, ug sa among pagtuon kini gihimo sa avidin-coated plates gamit ang glycan-targeted mAbs.
Pag-screen sa mga monoclonal antibodies base sa ELISA para sa mga biotinylated oligosaccharides. Dinhi (A) ang hiniusa nga biotinylation sa mga oligosaccharides ug ang sunod nga ELISA screening nga adunay glycan-targeted mAbs sa NeutrAvidin coated plates ug (B) nagpakita sa usa ka lakang nga pamaagi para sa biotinylation sa mga produkto sa reaksyon.
Ang mga plato nga giputos og avidin nga adunay oligosaccharide-conjugated antibodies gidugang dayon sa panguna ug sekondaryang mga antibodies ug gihugasan sa usa ka medium nga sensitibo sa kahayag ug oras. Human makompleto ang pagbugkos sa antibody, idugang ang TMB substrate aron ma-incubate ang plato. Ang reaksyon sa katapusan gipahunong gamit ang sulfuric acid. Ang mga gi-incubate nga plato gisusi gamit ang usa ka ELISA reader aron mahibal-an ang kusog sa pagbugkos sa matag antibody aron mahibal-an ang cross-linking nga espesipiko sa antibody. Alang sa mga detalye ug mga parameter sa eksperimento, tan-awa ang katugbang nga seksyon nga "Mga Materyales ug Pamaagi".
Among gipakita ang gamit niining bag-ong naugmad nga pamaagi alang sa piho nga mga aplikasyon pinaagi sa pag-ila sa mga soluble oligosaccharides nga anaa sa ACSH ingon man sa krudo ug purified oligosaccharide fractions nga nahimulag gikan sa lignocellulosic hydrolysates. Sama sa gipakita sa Figure 3, ang labing komon nga epitope-substituted xylans nga nailhan sa ACSH gamit ang bioacylated glycome assay methods kasagaran uronic (U) o methyluronic (MeU) ug pectic arabinogalactans. Kadaghanan niini nakit-an usab sa among miaging pagtuon sa pag-analisa sa mga glycans sa non-hydrolyzed solids (UHS)43.
Pag-ila sa mga recalcitrant oligosaccharide epitopes gamit ang monoclonal antibody nga gitumong sa cell wall glycan. Ang "neutral" nga fraction mao ang ACN fraction ug ang "acidic" nga fraction mao ang FA fraction. Ang mas hayag nga pula sa heatmap nagpakita sa mas taas nga epitope content, ug ang mas hayag nga asul nagpakita sa blangko nga background. Ang mga kantidad sa kolor sa sukdanan gibase sa hilaw nga mga kantidad sa OD para sa mga pormulasyon nga N=2. Ang mga pangunang epitopes nga nailhan sa mga antibody gipakita sa tuo.
Kining mga istruktura nga dili-cellulose dili mabuak sa labing komon nga mga cellulase ug hemicellulase sa gisulayan nga komersyal nga sagol nga enzyme, nga naglakip sa labing kasagarang gigamit nga komersyal nga mga enzyme. Busa, gikinahanglan ang bag-ong mga auxiliary enzyme alang sa ilang hydrolysis. Kung wala ang gikinahanglan nga mga non-cellulose accessory enzyme, kining mga non-cellulose bonds makapugong sa hingpit nga pagkakabig ngadto sa mga monosaccharide, bisan kung ang ilang ginikanan nga mga sugar polymer hingpit nga gi-hydrolyze ngadto sa mas mubo nga mga tipik ug gitunaw gamit ang mga komersyal nga sagol nga enzyme.
Ang dugang nga pagtuon sa pag-apod-apod sa signal ug ang kusog sa pagbugkos niini nagpakita nga ang mga epitope sa pagbugkos mas ubos sa mga fraction sa asukal nga taas og DP (A, B, C, DP hangtod sa 20+) kaysa sa mga fraction sa ubos og DP (D, E, F, DP) sa mga dimer) (Fig. 1). Ang mga tipik sa asido mas komon sa mga epitope nga dili cellulose kaysa mga tipik nga neutral. Kini nga mga panghitabo nahiuyon sa sumbanan nga naobserbahan sa among miaging pagtuon, diin ang mga tipik sa asido ug acid mas resistensyado sa enzymatic hydrolysis. Busa, ang presensya sa mga epitope nga dili cellulose glycan ug mga substitution sa U ug MeU mahimong dako og ikatabang sa kalig-on sa mga oligosaccharide. Kinahanglan nga matikdan nga ang kahusayan sa pagbugkos ug pag-ila mahimong problema alang sa mga oligosaccharide nga ubos og DP, labi na kung ang epitope usa ka dimeric o trimeric oligosaccharide. Mahimo kini nga masulayan gamit ang mga komersyal nga oligosaccharide nga lainlain ang gitas-on, nga ang matag usa adunay usa ra ka epitope nga mobugkos sa usa ka piho nga mAb.
Busa, ang paggamit sa mga antibody nga espesipiko sa istruktura nagpadayag sa pipila ka mga klase sa recalcitrant bonds. Depende sa klase sa antibody nga gigamit, ang angay nga ligation pattern, ug ang kusog sa signal nga gihimo niini (pinakadaghan ug labing gamay), ang mga bag-ong enzyme mahimong mailhan ug idugang nga semi-quantitatively sa sagol nga enzyme para sa mas kompleto nga glycoconversion. Gamit ang pag-analisar sa ACSH oligosaccharides isip pananglitan, makahimo kita og database sa glycan bonds para sa matag biomass material. Kinahanglan nga matikdan dinhi nga ang lainlaing affinity sa mga antibodies kinahanglan nga tagdon, ug kung ang ilang affinity wala mahibal-i, kini makamugna og pipila ka mga kalisud kung itandi ang mga signal sa lainlaing mga antibody. Dugang pa, ang pagtandi sa mga glycan bonds mahimong labing maayo nga molihok taliwala sa mga sample para sa parehas nga antibody. Kini nga mga gahi nga bond mahimo unya nga i-link sa CAZyme database, diin mahimo natong mailhan ang mga enzyme, mapili ang mga kandidato nga enzyme ug masulayan ang mga bond-breaking enzyme, o makahimo og mga microbial system aron ipahayag kini nga mga enzyme para magamit sa mga biorefineries44.
Aron masusi kon giunsa sa mga pamaagi sa immunological pagkomplemento sa alternatibong mga pamaagi alang sa pag-ila sa mga low molecular weight oligosaccharides nga anaa sa lignocellulosic hydrolysates, among gihimo ang MALDI (Fig. 4, S1-S8) ug pag-analisa sa mga TMS-derived saccharides base sa GC-MS sa samang panel (Fig. 5) nga bahin sa oligosaccharide. Gigamit ang MALDI aron itandi kon ang mass distribution sa mga molekula sa oligosaccharide mohaom ba sa gituyo nga istruktura. Sa fig. 4 nagpakita sa MS sa neutral nga mga sangkap nga ACN-A ug ACN-B. Gikumpirma sa pag-analisa sa ACN-A ang usa ka han-ay sa mga asukal sa pentose gikan sa DP 4–8 (Fig. 4) hangtod sa DP 22 (Fig. S1), kansang mga gibug-aton katumbas sa MeU-xylan oligosaccharides. Gikumpirma sa pag-analisa sa ACN-B ang serye sa pentose ug glucoxylan nga adunay DP 8-15. Sa dugang nga materyal sama sa Figure S3, ang mga mapa sa distribusyon sa masa sa FA-C acidic moiety nagpakita sa usa ka han-ay sa (Me)U substituted pentose sugars nga adunay DP nga 8-15 nga nahiuyon sa substituted xylans nga nakit-an sa ELISA-based mAb screening. Ang mga epitope parehas.
MALDI-MS spectrum sa matunaw nga dili-compliant nga mga oligosaccharide nga anaa sa ACS. Dinhi, (A) ACN-A low weight range fractions nga adunay methylated uronic acid (DP 4-8) substituted glucuroxylan oligosaccharides ug (B) ACN-B xylan ug methylated uronic acid oligosaccharides nga gipulihan sa glucuroxylan (DP 8-15).
Pag-analisar sa komposisyon sa glycan residue sa refractory oligosaccharides. Dinhi (A) Komposisyon sa TMS saccharide sa lain-laing mga oligosaccharide fractions nga nakuha gamit ang GC-MS analysis. (B) Mga istruktura sa lain-laing mga asukal nga gikan sa TMS nga anaa sa mga oligosaccharides. ACN – acetonitrile fraction nga adunay neutral oligosaccharides ug FA – ferulic acid fraction nga adunay acid oligosaccharides.
Laing makapainteres nga konklusyon ang nakuha gikan sa LC-MS analysis sa oligosaccharide fraction, sama sa gipakita sa Figure S9 (ang mga pamaagi makita sa electronic supplementary material). Ang mga tipik sa hexose ug -OAc groups balik-balik nga naobserbahan atol sa ligation sa ACN-B fraction. Kini nga nakaplagan dili lamang nagpamatuod sa fragmentation nga naobserbahan sa glycome ug MALDI-TOF analysis, apan naghatag usab og bag-ong impormasyon bahin sa potensyal nga carbohydrate derivatives sa pretreated lignocellulosic biomass.
Naghimo usab kami og glycan composition analysis sa mga oligosaccharide fractions gamit ang TMS glycan derivatization. Gamit ang GC-MS, among gitino ang komposisyon sa neural (non-derivative) ug acidic sugars (GluA ug GalA) sa oligosaccharide fraction (Fig. 5). Ang glucuronic acid makita sa acidic components C ug D, samtang ang galacturonic acid makita sa acidic components A ug B, nga parehong high DP components sa acidic sugars. Kini nga mga resulta dili lamang nagpamatuod sa among ELISA ug MALDI data, apan nahiuyon usab sa among nangaging mga pagtuon sa oligosaccharide accumulation. Busa, nagtuo kami nga ang mga modernong immunological nga pamaagi gamit ang biotinylation sa oligosaccharides ug ang sunod nga ELISA screening igo na aron makit-an ang soluble recalcitrant oligosaccharides sa lainlaing mga biological sample.
Tungod kay ang mga pamaagi sa screening sa mAb nga nakabase sa ELISA napamatud-an na sa daghang lain-laing mga pamaagi, gusto namong mas tukion ang potensyal niining bag-ong quantitative nga pamaagi. Duha ka komersyal nga oligosaccharides, ang xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ug 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ang gipalit ug gisulayan gamit ang usa ka bag-ong pamaagi sa mAb nga nagtumong sa cell wall glycan. Ang Figure 6 nagpakita sa usa ka linear correlation tali sa biotinylated binding signal ug sa log concentration sa oligosaccharide concentration, nga nagsugyot sa usa ka posible nga Langmuir adsorption model. Taliwala sa mga mAbs, ang CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ug CCRC-M151 nakig-uban sa XHE, ug ang CCRC-M108, CCRC-M109, ug LM11 nakig-uban sa A2XX sa usa ka range nga 1 nm hangtod 100 nano. Tungod sa limitado nga availability sa mga antibodies atol sa eksperimento, limitado nga mga eksperimento ang gihimo sa matag konsentrasyon sa oligosaccharide. Kinahanglan nga matikdan dinhi nga ang ubang mga antibody lahi kaayo og reaksyon sa parehas nga oligosaccharide isip substrate, lagmit tungod kay kini motapot sa gamay nga lahi nga mga epitope ug mahimong adunay lahi kaayo nga mga affinity sa pagbugkos. Ang mga mekanismo ug implikasyon sa tukma nga pag-ila sa epitope mahimong mas komplikado kung ang bag-ong pamaagi sa mAb ipadapat sa tinuod nga mga sample.
Duha ka komersyal nga oligosaccharides ang gigamit aron mahibal-an ang detection range sa lain-laing glycan-targeting mAbs. Dinhi, ang linear correlations nga adunay log concentration sa oligosaccharide concentration nagpakita sa Langmuir adsorption patterns para sa (A) XHE nga adunay mAb ug (B) A2XX nga adunay mAb. Ang katugbang nga epitopes nagpakita sa mga istruktura sa komersyal nga oligosaccharides nga gigamit isip substrates sa assay.
Ang paggamit sa glycan-targeted monoclonal antibodies (glycocomic analysis o ELISA-based mAb screening) usa ka gamhanang himan alang sa lawom nga pag-ila sa kadaghanan sa mga mayor nga cell wall glycans nga naglangkob sa biomass sa tanom. Bisan pa, ang classical glycan analysis nagpaila lamang sa mas dagkong cell wall glycans, tungod kay kadaghanan sa mga oligosaccharides dili episyente nga na-immobilize sa mga ELISA plate. Niini nga pagtuon, ang AFEX-pretreated corn stover gi-enzymatically hydrolyzed sa taas nga solids content. Gigamit ang sugar analysis aron mahibal-an ang komposisyon sa recalcitrant cell wall carbohydrates sa hydrolyzate. Bisan pa, ang mAb analysis sa mas gagmay nga oligosaccharides sa mga hydrolysate wala kaayo gihatagan og igong pagtagad, ug gikinahanglan ang dugang nga mga himan aron epektibong ma-immobilize ang mga oligosaccharides sa mga ELISA plate.
Among gitaho dinhi ang usa ka nobela ug episyente nga pamaagi sa oligosaccharide immobilization para sa mAb screening pinaagi sa paghiusa sa oligosaccharide biotinylation nga gisundan sa ELISA screening sa NeutrAvidin™ coated plates. Ang immobilized biotinylated oligosaccharides nagpakita og igong affinity para sa antibody aron makahimo og paspas ug episyente nga pag-detect sa recalcitrant oligosaccharides. Ang pag-analisar sa komposisyon niining mga gahig ulo nga oligosaccharides base sa mass spectrometry nagpamatuod sa mga resulta niining bag-ong pamaagi sa immunoscreening. Busa, kini nga mga pagtuon nagpakita nga ang kombinasyon sa oligosaccharide biotinylation ug ELISA screening uban sa glycan-targeted monoclonal antibodies magamit sa pag-detect sa crosslinks sa oligosaccharides ug mahimong kaylap nga magamit sa ubang biochemical studies nga nagpaila sa istruktura sa oligosaccharides.
Kining pamaagi sa pag-profile sa glycan nga nakabase sa biotin mao ang unang report nga makahimo sa pag-imbestiga sa mga recalcitrant carbohydrate bond sa mga soluble oligosaccharides sa biomass sa tanom. Makatabang kini sa pagsabot nganong ang ubang mga bahin sa biomass gahi kaayo kon bahin sa produksiyon sa biofuel. Kini nga pamaagi nagpuno sa usa ka importante nga kal-ang sa mga pamaagi sa pag-analisa sa glycome ug nagpalapad sa aplikasyon niini sa mas lapad nga mga substrate lapas sa mga oligosaccharides sa tanom. Sa umaabot, mahimo namong gamiton ang robotics para sa biotinylation ug gamiton ang pamaagi nga among naugmad para sa high-throughput analysis sa mga sample gamit ang ELISA.
Ang uhot sa mais (Corn straw o straw sa mais) nga gipatubo gikan sa Pioneer 33A14 hybrid seeds giani niadtong 2010 gikan sa Kramer Farms sa Ray, Colorado. Uban sa pagtugot sa tag-iya sa yuta, kini nga biomass magamit alang sa panukiduki. Ang mga sampol gitipigan nga uga nga < 6% nga kaumog sa mga zip-lock nga bag sa temperatura sa kwarto. Ang mga sampol gitipigan nga uga nga < 6% nga kaumog sa mga zip-lock nga bag sa temperatura sa kwarto. Образцы хранились сухими при влажности < 6% sa пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Ang mga sample gitipigan nga uga sa <6% nga humidity sa mga zippered bag sa temperatura sa kwarto.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Ang mga sample gitipigan sa mga zipper bag sa temperatura sa kwarto nga adunay humidity nga < 6%.Ang pagtuon misunod sa lokal ug nasyonal nga mga giya. Ang pag-analisar sa komposisyon gihimo gamit ang NREL protocol. Ang komposisyon nakit-an nga adunay sulod nga 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% protina ug 13.4% abo.
Ang Cellic® CTec2 (138 mg nga protina/ml, lot VCNI 0001) usa ka komplikado nga sagol sa cellulase, β-glucosidase ug Cellic® HTec2 (157 mg nga protina/ml, lot VHN00001) gikan sa Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Ang Multifect Pectinase® (72 mg nga protina/mL), usa ka komplikado nga sagol sa mga enzyme nga nagdaot sa pectin, gidonar sa DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Ang konsentrasyon sa protina sa enzyme gitino pinaagi sa pagbanabana sa sulud sa protina (ug pagkunhod sa kontribusyon sa non-protein nitrogen) gamit ang Kjeldahl nitrogen analysis (AOAC method 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Ang diatomaceous earth 545 gipalit gikan sa EMD Millipore (Billerica, MA). Ang activated carbon (DARCO, 100 mesh granules), Avicel (PH-101), beech xylan, ug tanang ubang kemikal gipalit gikan sa Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Ang AFEX pretreatment gihimo sa GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Ang pre-treatment gihimo sa 140° C sulod sa 15 minutos. 46 ka minuto nga residence time sa 1:1 ratio sa anhydrous ammonia ngadto sa biomass sa 60% (w/w) loading sa usa ka stainless steel benchtop batch reactor (Parr Instruments Company). Milungtad kini og 30 minutos. Ang reactor gipainit ngadto sa 140°C ug ang ammonia dali nga gipagawas, nga nagtugot sa biomass nga dali nga mobalik sa temperatura sa kwarto. Ang komposisyon sa AFEX pre-treated corn stover (ACS) susama sa untreated corn stover (UT-CS).
Ang taas nga solidong ACSH 25% (w/w) (gibana-bana nga 8% nga dextran loading) giandam isip sinugdanang materyal alang sa dakong produksiyon sa mga oligosaccharides. Ang enzymatic hydrolysis sa ACS gihimo gamit ang komersyal nga sagol nga enzyme nga naglakip sa Cellic® Ctec2 10 mg nga protina/g glucan (sa pretreated biomass), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg nga protina/g glucan, ug Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg nga protina/g dextran. Ang enzymatic hydrolysis gihimo sa usa ka 5-litro nga bioreactor nga adunay working volume nga 3 ka litro, pH 4.8, 50°C ug 250 rpm. Human sa hydrolysis sulod sa 96 ka oras, ang hydrolyzate gikolekta pinaagi sa centrifugation sa 6000 rpm sulod sa 30 minutos ug dayon sa 14000 rpm sulod sa 30 minutos aron makuha ang wala ma-hydrolyzed nga mga solido. Ang hydrolyzate gipailalom dayon sa sterile filtration pinaagi sa 0.22 mm filter beaker. Ang nasala nga hydrolyzate gitipigan sa sterile nga mga botelya sa 4° C ug dayon gi-fraksion sa carbon.
Pag-analisar sa komposisyon sa mga sample sa biomass nga gibase sa extract sumala sa mga pamaagi sa pag-analisar sa laboratoryo sa NREL: pag-andam sa mga sample alang sa pag-analisar sa komposisyon (NREL/TP-510-42620) ug pagtino sa mga structural carbohydrates ug lignin sa biomass (NREL/TP-510 – 42618)47.
Ang pag-analisa sa oligosaccharide sa hydrolyzate stream gihimo sa 2 ml nga sukdanan gamit ang autoclave-based acid hydrolysis method. Isagol ang hydrolyzate sample sa 69.7 µl nga 72% sulfuric acid sa usa ka 10 ml nga screw cap culture tube ug i-incubate sulod sa 1 ka oras sa benchtop sa 121 °C, pabugnawa sa yelo ug isala ngadto sa usa ka high performance liquid chromatography (HPLC) vial. Ang konsentrasyon sa oligosaccharides gitino pinaagi sa pag-iban sa konsentrasyon sa monosaccharides sa non-hydrolyzed sample gikan sa kinatibuk-ang konsentrasyon sa asukal sa acid-hydrolyzed sample.
Ang konsentrasyon sa glucose, xylose, ug arabinose sa acid hydrolysed biomass gisusi gamit ang Shimadzu HPLC system nga adunay autosampler, column heater, isocratic pump, ug refractive index detector sa Bio-Rad Aminex HPX-87H column. Ang column gimentinar sa 50°C ug gi-elute gamit ang 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 sa tubig.
Ang hydrolyzate supernatant gi-dilute ug gi-analisa para sa monomer ug oligosaccharide content. Ang mga monomeric sugars nga nakuha human sa enzymatic hydrolysis gi-analisa gamit ang HPLC nga adunay Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P column ug ash guard column. Ang temperatura sa column gimentinar sa 80°C, ang tubig gigamit isip mobile phase nga adunay flow rate nga 0.6 ml/min. Ang mga oligosaccharides gitino pinaagi sa hydrolysis sa dilute acid sa 121°C sumala sa mga pamaagi nga gihulagway sa refs. 41, 48, 49.
Ang pag-analisa sa Saccharide gihimo sa hilaw, AFEX pre-treated ug tanan nga wala-hydrolysed nga biomass residues (lakip ang produksiyon sa serial cell wall extracts ug ang ilang mAb screening) gamit ang mga pamaagi nga gihulagway kaniadto 27, 43, 50, 51. Alang sa pag-analisa sa glycome, ang mga alcohol-insoluble residues sa materyal sa plant cell wall giandam gikan sa mga biomass residues ug gipailalom sa serial extraction nga adunay nagkakusog nga mga reagents sama sa ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM ug 0.5% w/v), CON. (1M ug 4M, pareho nga adunay 1% w/v sodium borohydride) ug acid chlorite sama sa gihulagway kaniadto 52,53. Ang mga extract gipailalom dayon sa ELISA batok sa usa ka komplikado nga panel sa mAb50s nga gitumong sa cell wall glycan, ug ang mga reaksyon sa pagbugkos sa mAb gipresentar isip usa ka heat map. Ang mga mAbs nga nagtumong sa plant cell wall glycan gipalit gikan sa mga stock sa laboratoryo (CCRC, JIM ug MAC series).
Usa ka lakang nga biotinylation sa mga oligosaccharide. Ang conjugation sa carbohydrates uban sa biotin-LC-hydrazide gihimo gamit ang mosunod nga pamaagi. Ang Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) gitunaw sa dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) pinaagi sa kusog nga pagkutaw ug pagpainit sa 65° C sulod sa 1 ka minuto. Gidugang ang glacial acetic acid (30 µl) ug ang sagol gibubo sa sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) ug hingpit nga natunaw human sa pagpainit sa 65° C sulod sa mga 1 ka minuto. Dayon, gikan sa 5 ngadto sa 8 μl sa sagol nga reaksyon gidugang sa uga nga oligosaccharide (1-100 nmol) aron makakuha og 10 ka pilo o labaw pa nga molar excess sa label ibabaw sa reducing end. Ang reaksyon gihimo sa 65°C sulod sa 2 ka oras, pagkahuman niini ang mga sample giputli dayon. Walay sodium cyanoborohydride nga gigamit sa mga eksperimento sa pag-label nga walay reduction, ug ang mga sample gi-react sa 65° C. sulod sa 2.5 ka oras.
ELISA coating ug paghugas sa mga sample sa biotinylated oligosaccharides. 25 μl sa biotinylated samples (100 μl sa matag concentrated sample nga lasaw sa 5 ml sa 0.1 M Tris buffer solution (TBS)) ang gidugang sa matag well sa avidin-coated plate. Ang mga control wells gi-coat og 50 μl sa biotin sa konsentrasyon nga 10 μg/ml sa 0.1 M TBS. Ang deionized water gigamit isip coating para sa mga blank measurements. Ang tablet gi-incubate sulod sa 2 ka oras sa temperatura sa kwarto sa ngitngit nga lugar. Hugasi ang plato sa 3 ka beses gamit ang 0.1% skimmed milk sa 0.1 M TBS gamit ang program no. 11 para sa Grenier flat 3A.
Pagdugang ug paghugas sa mga primary antibody. Idugang ang 40 µl nga primary antibody sa matag atabay. I-incubate ang microplate sulod sa 1 ka oras sa temperatura sa kwarto sa ngitngit nga lugar. Ang mga plato gihugasan dayon sa 3 ka beses gamit ang 0.1% nga gatas sa 0.1M nga TBS gamit ang wash program #11 para sa Grenier Flat 3A.
Idugang ang ikaduhang antibody ug hugasi. Idugang ang 50 µl nga ikaduhang antibody sa ilaga/ilaga (gi-dilute 1:5000 sa 0.1% nga gatas sa 0.1 M TBS) sa matag atabay. I-incubate ang microplate sulod sa 1 ka oras sa temperatura sa kwarto sa ngitngit nga lugar. Ang mga microplate gihugasan dayon sa 5 ka beses gamit ang 0.1% nga gatas sa 0.1 M TBS gamit ang Grenier Flat 5A plate wash program #12.
Pagdugang og substrate. Idugang ang 50 µl nga 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) sa base substrate (pinaagi sa pagdugang og 2 ka tulo sa buffer, 3 ka tulo sa TMB, 2 ka tulo sa hydrogen peroxide sa 15 ml nga deionized nga tubig). Andama ang TMB substrate. ug i-vortex sa dili pa gamiton). I-incubate ang microplate sa temperatura sa kwarto sulod sa 30 minutos. Sa kangitngit.
Kompletoha ang lakang ug basaha ang tableta. Idugang ang 50 µl nga 1 N sulfuric acid sa matag atabay ug irekord ang absorbance gikan sa 450 ngadto sa 655 nm gamit ang ELISA reader.
Pag-andam og 1 mg/ml nga solusyon niining mga analyte sa deionized nga tubig: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (internal standard). Duha ka standard ang giandam pinaagi sa pagdugang sa 1 mg/mL nga mga solusyon sa asukal nga gipakita sa Table 1. Ang mga sample gi-freeze ug gi-lyophilize sa -80° C hangtod nga makuha ang tanang tubig (kasagaran mga 12-18 ka oras).
Idugang ang 100–500 µg nga sample sa mga screw cap tubes sa usa ka analytical balance. Irekord ang gidaghanon nga gidugang. Mas maayo nga tunawon ang sample sa usa ka piho nga konsentrasyon sa solvent ug idugang kini sa tubo isip liquid aliquot. Gamita ang 20 µl nga 1 mg/ml inositol isip internal standard para sa matag sample tube. Ang gidaghanon sa internal standard nga gidugang sa sample kinahanglan nga parehas sa gidaghanon sa internal standard nga gidugang sa standard tube.
Idugang ang 8 ml nga anhydrous methanol sa usa ka screw cap vial. Dayon idugang ang 4 ml nga 3 N. methanolic HCl solution, takpi ug uyoga. Kini nga proseso wala mogamit ug tubig.
Idugang ang 500 µl nga 1 M HCl methanol solution sa mga oligosaccharide sample ug standard TMS tubes. Ang mga sample gi-incubate sa tibuok gabii (168 ka oras) sa 80° C. sa usa ka thermal block. Pa-ugaa ang methanolysis product sa temperatura sa kwarto gamit ang drying manifold. Idugang ang 200 µl MeOH ug pa-ugaa pag-usab. Kini nga proseso gisubli kaduha. Idugang ang 200 µl nga methanol, 100 µl nga pyridine ug 100 µl nga acetic anhydride sa sample ug isagol og maayo. I-incubate ang mga sample sa temperatura sa kwarto sulod sa 30 minutos. ug pa-ugaa. Idugang ang 200 µl nga methanol ug pa-ugaa pag-usab.
Idugang ang 200 µl nga Tri-Sil ug ipainit ang tubo nga adunay taklob sulod sa 20 ka minuto. 80°C, dayon pabugnawa sa temperatura sa kwarto. Gamita ang drying manifold aron mamala pa ang sample hangtod moabot sa gibanabanang 50 µl nga gidaghanon. Importante nga matikdan nga wala nato tugoti nga hingpit nga mamala ang mga sample.
Idugang ang 2 ml nga hexane ug isagol og maayo pinaagi sa vortexing. Pun-a ang mga tumoy sa Pasteur pipettes (5-8 mm) og usa ka piraso sa glass wool pinaagi sa pagbutang sa glass wool sa ibabaw sa 5-3/4 pulgada nga diametro nga pipette. Ang mga sample gi-centrifuge sa 3000 g sulod sa 2 ka minuto. Ang bisan unsang dili matunaw nga mga residue gi-precipitate. Pa-ugaa ang sample ngadto sa 100-150 µl. Usa ka volume nga gibana-bana nga 1 μl ang gi-inject sa GC-MS sa inisyal nga temperatura nga 80 °C ug inisyal nga oras nga 2.0 ka minuto (Talaan 2).