Ẹ ṣeun fún ṣíbẹ̀wò sí Nature.com. Ẹ̀yà ẹ̀rọ ìṣàwárí tí ẹ ń lò ní àtìlẹ́yìn CSS díẹ̀. Fún ìrírí tí ó dára jùlọ, a gbà yín nímọ̀ràn pé kí ẹ lo ẹ̀rọ ìṣàwárí tí a ti mú gbóná (tàbí kí ẹ mú Ìbáramu Ipò nínú Internet Explorer kúrò). Ní ​​àkókò yìí, láti rí i dájú pé a ń tẹ̀síwájú láti ṣe àtìlẹ́yìn, a ó ṣe àtìlẹ́yìn sí ojú-òpó wẹ́ẹ̀bù náà láìsí àwọn àṣà àti JavaScript.
Àwọn ọ̀nà tuntun láti fi ìwádìí ìlera àti ìṣàfihàn ìwọ̀n ara hàn fún ìwádìí tó díjú ti àwọn oligosaccharides tó ń dúró nínú ẹ̀rọ ìgbóná ọkà tí a ti fi AFEX tọ́jú tẹ́lẹ̀. Lignocellulosic biomass jẹ́ ọ̀nà tó ṣeé gbéṣẹ́ láti fi epo fosil ṣe, a sì ń lò ó láti ṣe àgbékalẹ̀ ìmọ̀-ẹ̀rọ biotechnology fún ṣíṣe àwọn ọjà bíi oúnjẹ, oúnjẹ, epo àti kẹ́míkà. Kókó pàtàkì sí àwọn ìmọ̀-ẹ̀rọ wọ̀nyí ni ìdàgbàsókè àwọn ìlànà ìdíje-owó-orí fún yíyípadà àwọn carbohydrates díjú tó wà nínú àwọn ògiri sẹ́ẹ̀lì ewéko sí àwọn suga tó rọrùn bíi glucose, xylose àti arabinose. Nítorí pé biomass lignocellulosic le koko gan-an, ó gbọ́dọ̀ wà lábẹ́ ìtọ́jú thermochemical (fún àpẹẹrẹ, ammonia fiber exfoliation (AFEX), diluted acids (DA), ionic liquids (IL)) àti biological treatments (fún àpẹẹrẹ, enzymatic hydrolysis àti microbial fermentation) ní àpapọ̀ láti gba ọjà tí a fẹ́. . Síbẹ̀síbẹ̀, nígbà tí a bá lo àwọn enzymu fungal ti ìṣòwò nínú ilana hydrolysis, 75-85% àwọn suga tí ó lè yọ́ nìkan ni monosaccharides, àti 15-25% tó kù ni oligosaccharides tí ó lè yọ́, tí kò ṣeé yọ́, tí kò sí ní gbogbo ìgbà fún àwọn microorganisms. Tẹ́lẹ̀tẹ́lẹ̀, a ti ya àwọn oligosaccharides onígboyà tí wọ́n lè yọ́ sọ́tọ̀ tí wọ́n sì ti wẹ̀ mọ́ nípa lílo àpapọ̀ ìpínyà erogba àti diatomaceous earth àti ìyọkúrò ìwọ̀n chromatography, a sì tún ṣe ìwádìí lórí àwọn ohun ìní ìdínà enzyme wọn. A ti rí i pé àwọn oligosaccharides tí ó ní ìwọ̀n gíga ti polymerization (DP) methylated uronic acid substitutions jẹ́ ohun tí ó ṣòro láti ṣe pẹ̀lú àwọn àdàpọ̀ enzyme ti ìṣòwò ju àwọn oligosaccharides DP àti neutral DP lọ. Níbí, a ròyìn lílo ọ̀pọ̀lọpọ̀ ọ̀nà afikún, pẹ̀lú àwòrán glycan nípa lílo monoclonal antibodies (mAbs) pàtó fún plant biomass glycans láti ṣe àfihàn àwọn ìdè glycan nínú àwọn odi sẹ́ẹ̀lì igi àti enzymatic hydrolysates, matrix-assisted laser desorption ionization, time-of-flight mass- spectrometry. . MALDI-TOF-MS) ń lo àwọn ibi tí a ti ń rí ìṣètò-ìmọ̀ nípa ìṣètò tí a rí nípasẹ̀ spectroscopy lẹ́yìn ìbàjẹ́ kejì ti àwọn ions odi, gas chromatography àti mass spectrometry (GC-MS) láti ṣe àfihàn àwọn ìdè oligosaccharides pẹ̀lú àti láìsí ìyọrísí. Nítorí ìwọ̀n kékeré ti oligosaccharides (DP 4–20), àwọn molecule wọ̀nyí ṣòro láti lò fún ìsopọ̀ mAb àti ìṣàfihàn. Láti borí ìṣòro yìí, a lo ọ̀nà tuntun kan tí ó da lórí biotin conjugation tí ó fi àmì sí ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn oligosaccharides tí ó lè yọ́ DP tí ó kéré síi lórí ojú microplate, èyí tí a wá lò lẹ́yìn náà nínú ètò mAb tí ó ga fún ìṣàyẹ̀wò ligation pàtó kan. Ọ̀nà tuntun yìí yóò mú kí ìdàgbàsókè àwọn àyẹ̀wò glycome tí ó ga síi tí ó ga síi ní ọjọ́ iwájú tí a lè lò láti ya àwọn oligosaccharides tí ó wà nínú àwọn biomarkers sọ́tọ̀ àti láti ṣe àfihàn wọn fún àwọn ète ìwádìí.
Lignocellulosic biomass, tí a ṣe pẹ̀lú iṣẹ́ àgbẹ̀, igbó, koríko àti àwọn ohun èlò onígi, jẹ́ ohun èlò oúnjẹ tí ó ṣeé ṣe fún iṣẹ́ àgbékalẹ̀ àwọn ọjà tí ó dá lórí bio, títí bí oúnjẹ, oúnjẹ, epo àti àwọn ohun èlò ìṣáájú kẹ́míkà láti mú àwọn ọjà tí ó níye lórí ga jáde. Àwọn kábọ̀háídéréètì (bíi cellulose àti hemicellulose) tí ó wà nínú àwọn ògiri sẹ́ẹ̀lì ewéko ni a ti sọ di monosaccharides nípa ṣíṣe kẹ́míkà àti ìyípadà biotransformation (bíi enzymatic hydrolysis àti microbial fermentation). Àwọn ìtọ́jú ṣáájú àkókò náà ni ammonia fiber expansion (AFEX), dilute acid (DA), ionic liquid (IL), àti steam explosion (SE), èyí tí ó lo àpapọ̀ kẹ́míkà àti ooru láti dín iṣẹ́ àgbékalẹ̀ lignocellulose kù nípa ṣíṣí àwọn ògiri sẹ́ẹ̀lì ewéko3,4. àìgbọ́dọ̀máṣe ti ohun èlò, 5. A ń ṣe enzyme hydrolysis ní ẹrù líle gíga nípa lílo àwọn enzymes tí ó ní carbohydrate tí ó ń ṣiṣẹ́ lọ́wọ́ (CAZymes) àti microbial fermentation nípa lílo transgenic yeasts tàbí bacteria láti ṣe àwọn epo àti kẹ́míkà tí ó dá lórí bio-based 6.
CAZymes nínú àwọn enzymes ìṣòwò jẹ́ àpapọ̀ àwọn enzymes tó díjú tí wọ́n ń pín àwọn ìdè carbohydrate-suga tó díjú pọ̀ láti ṣẹ̀dá monosaccharides2,7. Gẹ́gẹ́ bí a ṣe ròyìn tẹ́lẹ̀, nẹ́ẹ̀tìwọ́ọ̀kì díjú ti àwọn polima aromatic ti lignin pẹ̀lú àwọn carbohydrates mú kí wọ́n rọrùn láti yanjú, èyí tó ń yọrí sí ìyípadà suga tí kò pé, tó ń kó 15-25% àwọn oligosaccharides ìbálòpọ̀ jọ tí a kò ṣe nígbà ìdàpọ̀ enzymatic ti biomass tí a ti tọ́jú tẹ́lẹ̀. Èyí jẹ́ ìṣòro tó wọ́pọ̀ pẹ̀lú onírúurú ọ̀nà ìtọ́jú biomass. Àwọn ìdí kan fún ìdènà yìí ni ìdínà enzyme nígbà ìdàpọ̀, tàbí àìsí tàbí ìpele díẹ̀ ti àwọn enzymes pàtàkì tó ṣe pàtàkì tí a nílò láti fọ́ àwọn ìdè suga nínú biomass igi. Lílóye ìṣètò àti àwọn ànímọ́ ìṣètò ti àwọn suga, bíi àwọn ìdè suga nínú oligosaccharides, yóò ràn wá lọ́wọ́ láti mú ìyípadà suga sunwọ̀n síi nígbà ìdàpọ̀, èyí tó ń mú kí àwọn ilana biotechnological jẹ́ ìdíje pẹ̀lú àwọn ọjà tí a mú jáde láti epo rọ̀bì.
Ṣíṣe àgbékalẹ̀ àwọn kabọ̀háídéréètì jẹ́ ohun ìpèníjà, ó sì nílò àpapọ̀ àwọn ọ̀nà bíi liquid chromatography (LC)11,12, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)13, capillary electrophoresis (CE)14,15,16 àti mass spectrometry (MS)17. ,18. Àwọn ọ̀nà MS bíi time-of-flight mass spectrometry pẹ̀lú laser desorption àti ionization nípa lílo matrix (MALDI-TOF-MS) jẹ́ ọ̀nà tó wọ́pọ̀ fún dídá àwọn ètò carbohydrate mọ̀. Láìpẹ́ yìí, Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS ti sodium ion adducts ni a ti lò jùlọ láti dá àwọn ìka ọwọ́ mọ̀ tí ó bá àwọn ipò ìsopọ̀ oligosaccharide mu, àwọn ìṣètò anomeric, àwọn ìtẹ̀léra, àti àwọn ipò ẹ̀ka 20, 21.
Ìwádìí Glycan jẹ́ irinṣẹ́ tó dára jùlọ fún dídá àwọn ìdè carbohydrate mọ̀ dáadáa22. Ọ̀nà yìí ń lo àwọn èròjà ara monoclonal (mAbs) tí a tọ́ka sí láti gbin glycan ògiri sẹ́ẹ̀lì gẹ́gẹ́ bí ìwádìí láti lóye àwọn ìsopọ̀ carbohydrate tó díjú. Ó ju 250 mAbs lọ tí a ṣe ní gbogbo àgbáyé, tí a ṣe sí oríṣiríṣi oligosaccharides onílà àti ẹ̀ka nípa lílo onírúurú saccharides24. Ọ̀pọ̀ mAbs ni a ti lò ní gbogbogbòò láti ṣe àpèjúwe ìṣètò, ìṣètò, àti àwọn àtúnṣe ti ògiri sẹ́ẹ̀lì ewébẹ̀, nítorí pé àwọn ìyàtọ̀ pàtàkì wà tí ó sinmi lórí irú sẹ́ẹ̀lì ewébẹ̀, ẹ̀yà ara, ọjọ́ orí, ìpele ìdàgbàsókè, àti àyíká ìdàgbàsókè25,26. Láìpẹ́ yìí, a ti lo ọ̀nà yìí láti lóye àwọn ènìyàn vesicle nínú ètò ewébẹ̀ àti ẹranko àti ipa wọn nínú gbigbe glycan gẹ́gẹ́ bí a ṣe pinnu rẹ̀ nípasẹ̀ àwọn àmì subcellular, àwọn ìpele ìdàgbàsókè, tàbí àwọn ìsúnniṣe àyíká, àti láti pinnu ìṣiṣẹ́ enzymatic. Díẹ̀ lára ​​àwọn onírúurú ìṣètò glycans àti xylans tí a ti ṣàwárí ni pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), mixed bond glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) àti arabino-galactan (ArbG)29.
Sibẹsibẹ, pelu gbogbo awọn igbiyanju iwadii wọnyi, awọn iwadii diẹ nikan ni o ti dojukọ lori iru ikojọpọ oligosaccharide lakoko hydrolysis giga ti o lagbara (HSL), pẹlu idasilẹ oligosaccharide, awọn iyipada gigun chain oligomeric lakoko hydrolysis, awọn polima DP kekere, ati awọn iyipo wọn. pinpin 30,31,32. Nibayi, botilẹjẹpe itupalẹ glycan ti fihan pe o jẹ ohun elo ti o wulo fun itupalẹ pipe ti eto glycan, o nira lati ṣe ayẹwo awọn oligosaccharides DP kekere ti o le yọ ninu omi nipa lilo awọn ọna antibody. Awọn oligosaccharides DP kekere pẹlu iwuwo molikula ti ko to 5-10 kDa ko so mọ awọn awo ELISA 33, 34 ati pe a wẹ wọn kuro ṣaaju fifi antibody kun.
Níbí, fún ìgbà àkọ́kọ́, a ṣe àfihàn àyẹ̀wò ELISA lórí àwọn àwo tí a fi avidin bo nípa lílo àwọn èròjà ara monoclonal, tí a sì so ìlànà biotinylation ìgbésẹ̀ kan pọ̀ fún àwọn oligosaccharides tí ó lè yọ́ pẹ̀lú àyẹ̀wò glycome. Ọ̀nà tí a gbà ṣe àyẹ̀wò glycome ni a fi ìdí rẹ̀ múlẹ̀ nípasẹ̀ àyẹ̀wò MALDI-TOF-MS àti GC-MS ti àwọn ìsopọ̀ oligosaccharide àfikún nípa lílo trimethylsilyl (TMS) ti àwọn àkópọ̀ suga hydrolyzed. Ọ̀nà tuntun yìí ni a lè ṣe àgbékalẹ̀ gẹ́gẹ́ bí ọ̀nà ìgbékalẹ̀ gíga ní ọjọ́ iwájú kí a sì rí ìlò tí ó gbòòrò nínú ìwádìí biomedical35.
Àwọn àtúnṣe lẹ́yìn ìtúmọ̀ àwọn enzymu àti àwọn èròjà ara, bíi glycosylation,36 ní ipa lórí ìṣiṣẹ́ wọn nínú ẹ̀dá alààyè. Fún àpẹẹrẹ, àwọn àyípadà nínú glycosylation ti àwọn èròjà ara ṣe ipa pàtàkì nínú àrùn oríkèé, àti àwọn àyípadà nínú glycosylation ni a lò gẹ́gẹ́ bí àmì àyẹ̀wò37. A ti ròyìn onírúurú glycans nínú ìwé láti fara hàn nínú onírúurú àrùn, títí bí àwọn àrùn onígbà díẹ̀ ti ìgbóná ara ti ọ̀nà inú àti ẹ̀dọ̀, àkóràn kòkòrò àrùn, àwọn àrùn jẹjẹrẹ ovarian, ọmú, àti prostate38,39,40. Lílóye ìṣètò àwọn glycans nípa lílo àwọn ọ̀nà ELISA tí ó da lórí antibody yóò fúnni ní ìgbẹ́kẹ̀lé síi nínú àyẹ̀wò àrùn láìlo àwọn ọ̀nà MS tí ó díjú.
Ìwádìí wa tẹ́lẹ̀ fihàn pé àwọn oligosaccharides aláìlágbára kò sí lábẹ́ omi lẹ́yìn ìtọ́jú ṣáájú àti ìfúnpọ̀ enzymatic (Àwòrán 1). Nínú iṣẹ́ wa tí a tẹ̀ jáde tẹ́lẹ̀, a ṣe àgbékalẹ̀ ọ̀nà ìyọkúrò èédú líle kan tí a mú ṣiṣẹ́ láti ya àwọn oligosaccharides kúrò nínú AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8. Lẹ́yìn ìyọkúrò àti ìyàsọ́tọ̀ àkọ́kọ́, a tún pín àwọn oligosaccharides sí i nípa chromatography exclusion size (SEC) a sì kó wọn jọ ní ìtòlẹ́sẹẹsẹ ìwọ̀n molikula. A ṣe àyẹ̀wò àwọn monomers suga àti oligomers tí a tú jáde láti inú onírúurú ìtọ́jú ṣáájú nípasẹ̀ ìṣàyẹ̀wò àkójọpọ̀ suga. Nígbà tí a bá ń fi àwọn oligosaccharides suga tí a rí nípasẹ̀ onírúurú ọ̀nà ìtọ́jú ṣáájú wéra, wíwà àwọn oligosaccharides aláìlágbára jẹ́ ìṣòro tí ó wọ́pọ̀ nínú ìyípadà biomass sí monosaccharides ó sì lè yọrí sí ìdínkù nínú ìyọkúrò suga ti o kere ju 10-15% àti àní títí dé 18%. US. Ọ̀nà yìí ni a lò fún ìṣẹ̀dá àwọn ìpín oligosaccharides ńlá síwájú sí i. ACH tí ó yọrí sí àti àwọn ìpín rẹ̀ pẹ̀lú àwọn ìwọ̀n molikula onírúurú ni a lò gẹ́gẹ́ bí ohun èlò ìwádìí fún ìṣàfihàn àwọn oligosaccharides nínú iṣẹ́ yìí.
Lẹ́yìn ìtọ́jú ṣáájú àti ìfúnpọ̀ enzyme, àwọn oligosaccharides tí ó dúró ṣinṣin kò sí nínú omi. Níbí (A) ni ọ̀nà ìyàsọ́tọ̀ oligosaccharides tí a fi ya àwọn oligosaccharides kúrò nínú AFEX-pretreated corn stover hydrolysate (ACSH) nípa lílo ibùsùn tí a ti fi carbon àti diatomaceous earth ṣe; (B) Ọ̀nà fún ìyàsọ́tọ̀ oligosaccharides. A tún ya àwọn oligosaccharides sọ́tọ̀ nípa chromatography ìyọkúrò ìwọ̀n (SEC); (C) Àwọn monomers Saccharide àti oligomers tí a tú jáde láti inú onírúurú ìtọ́jú ṣáájú (àsídì tí a ti diluted: DA, omi ionic: IL àti AFEX). Àwọn ipò hydrolysis enzymatic: ìfúnpọ̀ líle gíga ti 25% (w/w) (tó tó 8% glucan loading), hydrolysis wákàtí 96, ìfúnpọ̀ enzyme ti ìṣòwò 20 mg/g (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratio) àti (D) Àwọn monomers suga àti oligomers ti glucose, xylose àti arabinose tí a tú jáde láti inú AFEX corn stover tí a ti tọ́jú tẹ́lẹ̀ (ACS).
Ìwádìí Glycan ti fihàn pé ó jẹ́ ohun èlò tó wúlò fún ìwádìí ìṣètò gbogbogbòò ti àwọn glycans nínú àwọn èròjà tí a yà sọ́tọ̀ láti inú àwọn àpòkù biomass líle. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn saccharides tí ó lè yọ́ nínú omi kò fi bẹ́ẹ̀ hàn nípa lílo ọ̀nà ìbílẹ̀ yìí41 nítorí pé ó ṣòro láti mú àwọn oligosaccharides tí ó ní ìwọ̀n molikula kékeré dúró lórí àwọn àwo ELISA, a sì ti fọ̀ wọ́n kí a tó fi àwọn antibody kún un. Nítorí náà, fún ìdè antibody àti ìṣàfihàn, a lo ọ̀nà biotinylation ìgbésẹ̀ kan láti fi bo àwọn oligosaccharides tí ó lè yọ́, tí kò báramu lórí àwọn àwo ELISA tí a fi avidin bo. A dán ọ̀nà yìí wò nípa lílo ACSH wa tí a ti ṣe tẹ́lẹ̀ àti ìpín kan tí ó dá lórí ìwọ̀n molikula rẹ̀ (tàbí ìwọ̀n polymerization, DP). A lo biotinylation ìgbésẹ̀ kan láti mú kí ìdè oligosaccharide pọ̀ sí i nípa fífi biotin-LC-hydrazide kún òpin carbohydrate tí ó dínkù (Àwòrán 2). Nínú omi, ẹgbẹ́ hemiacetal ní òpin tí ó dínkù náà ń ṣe àgbékalẹ̀ pẹ̀lú ẹgbẹ́ hydrazide ti biotin-LC-hydrazide láti ṣẹ̀dá ìdè hydrazone. Níwájú ohun tí ó ń dínkù NaCNBH3, ìsopọ̀ hydrazone yóò dínkù sí ọjà ìparí biotinylated tí ó dúró ṣinṣin. Pẹ̀lú àtúnṣe ti ìparí ìdínkù suga, ìsopọ̀ àwọn oligosaccharides DP tí ó kéré sí àwọn àwo ELISA ṣeé ṣe, àti nínú ìwádìí wa, èyí ni a ṣe lórí àwọn àwo tí a fi avidin bo nípa lílo àwọn mAbs tí a fi glycan ṣe àfojúsùn.
Àyẹ̀wò àwọn èròjà ara tí a fi ELISA ṣe fún àwọn oligosaccharides tí a ti yọ kúrò nínú ara. Níbí (A) àpapọ̀ biotinylation ti oligosaccharides àti àyẹ̀wò ELISA lẹ́yìn náà pẹ̀lú àwọn mAbs tí a fi glycan ṣe lórí àwọn àwo tí a fi NeutrAvidin bo àti (B) fi ìlànà ìgbésẹ̀ kan hàn fún biotinylation ti àwọn ọjà ìṣesí.
Lẹ́yìn náà, a fi àwọn àwo tí a fi Avidin bo pẹ̀lú àwọn èròjà tí a so pọ̀ mọ́ oligosaccharide kún àwọn èròjà àtọwọ́dá àkọ́kọ́ àti ìkejì, a sì fọ̀ wọ́n nínú ohun èlò tí ó ní ìmọ́lẹ̀ àti àkókò. Lẹ́yìn tí ìdè èròjà àtọwọ́dá bá ti parí, fi TMB substrate kún un láti fi àwo náà sínú. A dá ìhùwàpadà náà dúró pẹ̀lú sulfuric acid nígbẹ̀yìn gbẹ́yín. A ṣe àyẹ̀wò àwọn àwo tí a fi sínú àwo tí a fi sínú àwo tí a fi sínú àwo náà nípa lílo ohun èlò ELISA láti mọ agbára ìdè èròjà àtọwọ́dá kọ̀ọ̀kan láti ṣàwárí ìsopọ̀-ọ̀kan pàtó ti èròjà àtọwọ́dá. Fún àwọn ẹ̀kúnrẹ́rẹ́ àti àwọn pàrámítà ti ìdánwò náà, wo apá tí ó báramu “Àwọn Ohun Èlò àti Àwọn Ọ̀nà”.
A fi agbára ọ̀nà tuntun yìí hàn fún àwọn ohun èlò pàtó nípa ṣíṣe àfihàn àwọn oligosaccharides tí ó lè yọ́ nínú ACSH àti nínú àwọn ìpín oligosaccharide tí a ti sọ di mímọ́ tí a yà sọ́tọ̀ láti inú lignocellulosic hydrolysates. Gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn ní Àwòrán 3, àwọn xylan tí a fi epitope-substituted ṣe àfihàn jùlọ nínú ACSH nípa lílo àwọn ọ̀nà ìwádìí bioacylated glycome jẹ́ uronic (U) tàbí methyluronic (MeU) àti pectic arabinogalactans. Ọ̀pọ̀lọpọ̀ wọn ni a tún rí nínú ìwádìí wa tẹ́lẹ̀ lórí ìwádìí àwọn glycans ti àwọn solids tí kò ní hydrolyzed (UHS)43.
Ṣíṣàwárí àwọn epitopes oligosaccharide tí ó ń yípadà nípa lílo èròjà monoclonal tí a darí sí glycan ògiri sẹ́ẹ̀lì. Ìpín “aláìsí” ni ìpín ACN àti ìpín “àsídì” ni ìpín FA. Àwọn pupa tí ó mọ́lẹ̀ lórí àwòrán ooru fi àkóónú epitope tí ó ga jù hàn, àti àwọn àwọ̀ búlúù tí ó mọ́lẹ̀ fi àwọ̀ tí ó ṣófo hàn. Àwọn ìwọ̀n àwọ̀ lórí ìwọ̀n náà da lórí àwọn ìwọ̀n OD tí a kò rí fún àwọn àgbékalẹ̀ N=2. Àwọn epitopes pàtàkì tí àwọn èròjà ara-ẹni dá mọ̀ ni a fihàn ní apá ọ̀tún.
Àwọn ìṣètò tí kìí ṣe cellulose wọ̀nyí kò lè gé kúrò nípasẹ̀ àwọn cellulases àti hemicellulases tí ó wọ́pọ̀ jùlọ nínú àdàpọ̀ enzyme ti ìṣòwò tí a dán wò, èyí tí ó ní àwọn enzymes ti ìṣòwò tí a sábà máa ń lò jùlọ. Nítorí náà, a nílò àwọn enzymes ìrànlọ́wọ́ tuntun fún hydrolysis wọn. Láìsí àwọn enzymes tí kìí ṣe cellulose tí ó pọndandan, àwọn ìdè tí kìí ṣe cellulose wọ̀nyí ń dènà ìyípadà pípé sí àwọn monosaccharides, kódà bí àwọn polymer suga òbí wọn bá di hydrolyzed sí àwọn ègé kúkúrú tí a sì ń túká nípa lílo àwọn adalu enzyme ti ìṣòwò.
Ìwádìí síwájú síi nípa ìpínkiri àmì àti agbára ìsopọ̀ rẹ̀ fihàn pé àwọn epitopes ìsopọ̀ kéré síi nínú àwọn ìpín suga DP gíga (A, B, C, DP títí dé 20+) ju nínú àwọn ìpín DP kékeré (D, E, F, DP) nínú àwọn dimers) (Àwòrán 1). Àwọn ìpín acid wọ́pọ̀ jù nínú àwọn epitopes tí kìí ṣe cellulose ju àwọn ìpín diẹ́ẹ̀tì lọ. Àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ wọ̀nyí bá àpẹẹrẹ tí a rí nínú ìwádìí wa tẹ́lẹ̀ mu, níbi tí àwọn ìpín DP àti acid gíga ti dúró ṣinṣin sí hydrolysis enzymatic. Nítorí náà, wíwà àwọn epitopes tí kìí ṣe cellulose glycan àti àwọn ìyípadà U àti MeU lè ṣe àfikún gidigidi sí ìdúróṣinṣin àwọn oligosaccharides. Ó yẹ kí a kíyèsí pé ìsopọ̀ àti ìwádìí lè jẹ́ ìṣòro fún àwọn oligosaccharides DP kékeré, pàápàá jùlọ tí epitope náà bá jẹ́ dimeric tàbí trimeric oligosaccharides. A lè dán èyí wò nípa lílo àwọn oligosaccharides ti ìṣòwò tí ó ní àwọn gígùn ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, ọ̀kọ̀ọ̀kan wọn ní epitope kan ṣoṣo tí ó so mọ́ mAb kan pàtó.
Nítorí náà, lílo àwọn èròjà ara tí ó ní ìrísí pàtó fi àwọn irú ìdè tí ó ń yípadà hàn. Ní ìbámu pẹ̀lú irú èròjà ara tí a lò, ìlànà ìdè tí ó yẹ, àti agbára àmì tí ó ń mú jáde (tí ó pọ̀ jù àti èyí tí kò pọ̀ jù), a lè dá àwọn èròjà ara tuntun mọ̀ kí a sì fi kún adalu èròjà ara fún ìyípadà glycoconversion pípé. Ní gbígba ìwádìí ACSH oligosaccharides gẹ́gẹ́ bí àpẹẹrẹ, a lè ṣẹ̀dá ibi ìkópamọ́ glycan fún ohun èlò biomass kọ̀ọ̀kan. Ó yẹ kí a kíyèsí níbí pé ó yẹ kí a gbé ìfaramọ́ onírúurú èròjà ara kalẹ̀, tí a kò bá sì mọ ìfaramọ́ wọn, èyí yóò dá àwọn ìṣòro kan sílẹ̀ nígbà tí a bá ń fi àwọn àmì èròjà ara tí ó yàtọ̀ síra wéra. Ní àfikún, ìfiwéra àwọn èròjà ara glycan lè ṣiṣẹ́ dáradára láàrín àwọn àpẹẹrẹ fún èròjà ara kan náà. Lẹ́yìn náà, a lè so àwọn èròjà ara lílé yìí pọ̀ mọ́ ibi ìkópamọ́ CAZyme, láti inú èyí tí a lè dá àwọn èròjà ara mọ̀, yan àwọn èròjà ara lílé àti dánwò fún àwọn èròjà ara lílé, tàbí ṣe àgbékalẹ̀ àwọn ètò microbial láti fi àwọn èròjà ara lílé hàn fún lílò nínú biorefineries44.
Láti ṣe àyẹ̀wò bí àwọn ọ̀nà ìṣègùn ṣe ń ṣe àfikún àwọn ọ̀nà míràn fún ṣíṣe àfihàn àwọn oligosaccharides ìwọ̀n molecular kékeré tí ó wà nínú lignocellulosic hydrolysates, a ṣe MALDI (Àwòrán 4, S1-S8) àti ìṣàyẹ̀wò àwọn saccharides tí a mú láti inú TMS tí ó da lórí GC-MS lórí apá kan náà (Àwòrán 5) oligosaccharide. A lo MALDI láti fi wé bóyá ìpínkiri ibi-pupọ ti àwọn molikula oligosaccharide bá ìṣètò tí a fẹ́ mu. Ní àwòrán 4, a fi MS ti àwọn èròjà didoju hàn ACN-A àti ACN-B. Ìṣàyẹ̀wò ACN-A jẹ́rìí sí onírúurú àwọn suga pentose tí ó wà láti DP 4–8 (Àwòrán 4) sí DP 22 (Àwòrán S1), tí ìwọ̀n wọn bá MeU-xylan oligosaccharides mu. Ìṣàyẹ̀wò ACN-B jẹ́rìí sí àwọn pentose àti glucoxylán series pẹ̀lú DP 8-15. Nínú àwọn ohun èlò afikún bíi Àwòrán S3, àwọn àwòrán ìpínkiri ibi-ẹ̀rọ acidic ti FA-C fi àwọn DP ti 8-15 tí a fi rọ́pò (Me)U hàn, èyí tí ó bá àwọn xylan tí a fi rọ́pò mu, tí a rí nínú ìṣàyẹ̀wò mAb tí ó dá lórí ELISA mu. Àwọn epitopes náà dúró ṣinṣin.
Àwọn oligosaccharides tí kò ní ìtẹ̀léra tí MALDI-MS wà nínú ACS. Níbí, (A) Àwọn ìpín ìwọ̀n kékeré ACN-A tí ó ní methylated uronic acid (DP 4-8) tí a fi glucuroxylan oligosaccharides rọ́pò àti (B) ACN-B xylan àti methylated uronic acid oligosaccharides tí a fi glucuroxylan rọ́pò (DP 8-15).
Ìṣàyẹ̀wò ìṣètò àkójọpọ̀ glycan residue ti àwọn oligosaccharides tí kò ṣeé yípadà. Níbí (A) Ìṣètò TMS saccharide ti onírúurú ìpín oligosaccharide tí a rí nípa lílo ìṣàyẹ̀wò GC-MS. (B) Ìṣètò onírúurú suga tí TMS ti yọ jáde tí ó wà nínú oligosaccharides. ACN – ìpín acetonitrile tí ó ní oligosaccharides tí kò ṣeé yípadà àti ìpín FA – ìpín ferulic acid tí ó ní oligosaccharides acid.
Àpapọ̀ mìíràn tó dùn mọ́ni ni a mú láti inú ìṣàyẹ̀wò LC-MS ti ìpín oligosaccharide, gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn nínú Àwòrán S9 (a lè rí àwọn ọ̀nà nínú ohun èlò afikún ẹ̀rọ itanna). A ṣe àkíyèsí àwọn ìpín hexose àti -OAC leralera nígbà tí a bá ń so ìpín ACN-B pọ̀. Wíwá yìí kò wulẹ̀ jẹ́rìí sí ìpínyà tí a rí nínú ìṣàyẹ̀wò glycome àti MALDI-TOF nìkan, ṣùgbọ́n ó tún fúnni ní ìwífún tuntun nípa àwọn ohun tí ó lè fa carbohydrate nínú biomass lignocellulosic tí a ti tọ́jú tẹ́lẹ̀.
A tún ṣe àgbéyẹ̀wò àkójọpọ̀ glycan ti àwọn ìpín oligosaccharide nípa lílo ìyọrísí TMS glycan. Nípa lílo GC-MS, a pinnu àkójọpọ̀ àwọn suga neural (tí kìí ṣe ti ara) àti àwọn suga acidic (GluA àti GalA) nínú ìpín oligosaccharide (Àwòrán 5). A rí glucuronic acid nínú àwọn èròjà acidic C àti D, nígbàtí galacturonic acid wà nínú àwọn èròjà acidic A àti B, àwọn méjèèjì jẹ́ àwọn èròjà DP gíga ti àwọn suga acidic. Àwọn èsì wọ̀nyí kò wulẹ̀ jẹ́rìí sí ìwádìí ELISA àti MALDI wa nìkan, ṣùgbọ́n wọ́n tún bá àwọn ìwádìí wa tẹ́lẹ̀ mu nípa ìkójọpọ̀ oligosaccharide. Nítorí náà, a gbàgbọ́ pé àwọn ọ̀nà ìṣègùn òde òní tí ń lo biotinylation ti oligosaccharides àti ìṣàyẹ̀wò ELISA lẹ́yìn náà tó láti ṣàwárí àwọn oligosaccharides recalcitrant tí ó lè yọ́ nínú onírúurú àpẹẹrẹ ẹ̀dá alààyè.
Níwọ́n ìgbà tí a ti fi àwọn ọ̀nà ìṣàyẹ̀wò mAb tí ó dá lórí ELISA hàn nípasẹ̀ ọ̀pọ̀lọpọ̀ ọ̀nà, a fẹ́ láti túbọ̀ ṣe àwárí agbára ọ̀nà ìṣàyẹ̀wò tuntun yìí. A ra oligosaccharides oníṣòwò méjì, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) àti 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), a sì dán an wò nípa lílo ọ̀nà mAb tuntun kan tí ó dojúkọ glycan ògiri sẹ́ẹ̀lì. Àwòrán 6 fi ìbáṣepọ̀ onílànà hàn láàárín àmì ìsopọ̀ biotinylated àti ìṣọ̀kan log ti ìṣọ̀kan oligosaccharide, èyí tí ó ń fi hàn pé ó ṣeé ṣe kí Langmuir adsorption model ṣeé ṣe. Láàárín àwọn mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, àti CCRC-M151 ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú XHE, àti CCRC-M108, CCRC-M109, àti LM11 ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú A2XX lórí ìwọ̀n 1 nm sí 100 nano. Nítorí ìwọ̀n tí àwọn èròjà ara ń wà nígbà ìdánwò náà, a ṣe àwọn ìdánwò díẹ̀ pẹ̀lú ìṣọ̀kan oligosaccharide kọ̀ọ̀kan. Ó yẹ kí a kíyèsí níbí pé àwọn èròjà ara kan máa ń hùwà sí oligosaccharide kan náà gẹ́gẹ́ bí ohun èlò ìṣàpẹẹrẹ, ó ṣeé ṣe kí ó jẹ́ nítorí pé wọ́n máa ń so mọ́ àwọn epitopes tó yàtọ̀ díẹ̀, wọ́n sì lè ní àwọn ìbáṣepọ̀ ìsopọ̀ tó yàtọ̀ síra. Àwọn ìlànà àti àbájáde ìdámọ̀ epitope tó péye yóò túbọ̀ díjú sí i nígbà tí a bá lo ọ̀nà mAb tuntun sí àwọn àpẹẹrẹ gidi.
A lo awọn oligosaccharides ti iṣowo meji lati pinnu ibiti a ti n ṣawari awọn mAbs oriṣiriṣi ti a fojusi glycan. Nibi, awọn ibatan laini pẹlu ifọkansi log ti ifọkansi oligosaccharides fihan awọn ilana gbigba Langmuir fun (A) XHE pẹlu mAb ati (B) A2XX pẹlu mAb. Awọn epitopes ti o baamu tọka si awọn eto ti awọn oligosaccharides ti iṣowo ti a lo gẹgẹbi awọn ipilẹ ninu idanwo naa.
Lilo awọn egboogi monoclonal ti a fojusi glycan (itupalẹ glycocomic tabi ibojuwo mAb ti o da lori ELISA) jẹ ohun elo ti o lagbara fun idanimọ jinle ti ọpọlọpọ awọn glycans ogiri sẹẹli pataki ti o ṣe biomass ọgbin. Sibẹsibẹ, itupalẹ glycan kilasika ṣe afihan awọn glycans ogiri sẹẹli ti o tobi nikan, nitori ọpọlọpọ awọn oligosaccharides ko ni idaduro daradara lori awọn awo ELISA. Ninu iwadi yii, a fi hydrolyzed AFEX-pretreated corn stover ni akoonu ti o ga julọ. A lo itupalẹ suga lati pinnu akopọ ti awọn carbohydrates ogiri sẹẹli recalcitrant ninu hydrolyzate. Sibẹsibẹ, itupalẹ mAb ti awọn oligosaccharides kekere ninu awọn hydrolysates ni a ko ṣe akiyesi, ati pe awọn irinṣẹ afikun nilo lati ṣe idaduro awọn oligosaccharides lori awọn awo ELISA ni imunadoko.
A ṣe ìròyìn níbí ọ̀nà tuntun kan tí ó gbéṣẹ́ tí ó sì gbéṣẹ́ fún ìṣàyẹ̀wò mAb nípa sísopọ̀ biotinylation oligosaccharide àti ìṣàyẹ̀wò ELISA lórí àwọn àwo tí a fi NeutrAvidin™ bo. Àwọn oligosaccharides biotinylated tí a ti mú kí ó má ​​ṣiṣẹ́ fi hàn pé ó ní agbára tó láti jẹ́ kí àwọn oligosaccharides recalcitrant yára àti lọ́nà tó dára. Ìṣàyẹ̀wò àkópọ̀ àwọn oligosaccharides líle wọ̀nyí tí a gbé ka orí mass spectrometry jẹ́rìí sí àwọn àbájáde ọ̀nà tuntun yìí fún ìṣàyẹ̀wò ìṣègùn. Nítorí náà, àwọn ìwádìí wọ̀nyí fihàn pé àpapọ̀ biotinylation oligosaccharide àti ìṣàyẹ̀wò ELISA pẹ̀lú àwọn antibodies monoclonal tí a targeted glycan le ṣee lo láti ṣàwárí àwọn ìjápọ̀ nínú oligosaccharides àti pé a le lò ó ní gbogbogbòò nínú àwọn ìwádìí biochemical mìíràn tí ó ń ṣe àfihàn ìṣètò oligosaccharides.
Ọ̀nà ìṣàfihàn glycan tí a fi biotin ṣe yìí ni ìròyìn àkọ́kọ́ tí ó lè ṣe ìwádìí àwọn ìdè carbohydrate tí ó ní ìfàsẹ́yìn nínú oligosaccharides tí ó lè yọ́ nínú ewéko biomass. Èyí ń ran lọ́wọ́ láti lóye ìdí tí àwọn apá kan nínú biomass fi jẹ́ aláìlágbára tó bẹ́ẹ̀ nígbà tí ó bá kan ìṣelọ́pọ́ biofuel. Ọ̀nà yìí ń kún àlàfo pàtàkì kan nínú àwọn ọ̀nà ìṣàyẹ̀wò glycome, ó sì ń fa ìlò rẹ̀ sí oríṣiríṣi àwọn ohun èlò tí ó gbòòrò ju oligosaccharides ewéko lọ. Ní ọjọ́ iwájú, a lè lo robotik fún biotinylation kí a sì lo ọ̀nà tí a ti ṣe àgbékalẹ̀ fún ìṣàyẹ̀wò gíga ti àwọn àpẹẹrẹ nípa lílo ELISA.
Wọ́n kórè koríko àgbàdo (CS) tí wọ́n gbìn láti inú irúgbìn Pioneer 33A14 ní ọdún 2010 láti Kramer Farms ní Ray, Colorado. Pẹ̀lú àṣẹ ẹni tó ni ilẹ̀ náà, a lè lo koríko yìí fún ìwádìí. A kó àwọn àyẹ̀wò náà sí inú àwọn àpò tí a fi zip lock ṣe ní iwọ̀n otútù yàrá, tí kò fi bẹ́ẹ̀ ju 6% omi lọ. A kó àwọn àyẹ̀wò náà sí inú àwọn àpò tí a fi zip lock ṣe ní iwọ̀n otútù yàrá, tí kò fi bẹ́ẹ̀ ju 6% omi lọ. Образцы хранились сухими при влажности <6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. A fi àwọn àyẹ̀wò pamọ́ sínú àwọn àpò tí a fi síìpù sí ní iwọ̀n otútù yàrá ní ibi gbígbẹ ní ọrinrin tí ó kéré sí 6%.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью <6%. A fi awọn ayẹwo pamọ sinu awọn apo sipirẹ ni iwọn otutu yara pẹlu ọriniinitutu ti ko ju 6%.Ìwádìí náà bá ìlànà ìbílẹ̀ àti ti orílẹ̀-èdè mu. A ṣe àyẹ̀wò àkójọpọ̀ nǹkan nípa lílo ìlànà NREL. A rí i pé àkójọpọ̀ náà ní 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% protein àti 13.4% eeru.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) jẹ́ àdàpọ̀ tó ní ìṣọ̀kan ti cellulase, β-glucosidase àti Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) láti Novozymes (Franklinton, NC, USA)). DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) fi Pectinase® Multifect (72 mg protein/mL), àdàpọ̀ tó ní ìṣọ̀kan ti àwọn enzymes tó ń ba pectin jẹ́, ló fi ránṣẹ́. A pinnu ìwọ̀n amuaradagba enzyme nípa ṣíṣàyẹ̀wò iye amuaradagba (àti yíyọ àfikún nitrogen tí kì í ṣe amuaradagba kúrò) nípa lílo ìwádìí nitrogen Kjeldahl (ọ̀nà AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). A ra ilẹ̀ diatomaceous 545 láti ọ̀dọ̀ EMD Millipore (Billerica, MA). A ra erogba ti a mu ṣiṣẹ (DARCO, granules mesh 100), Avicel (PH-101), beech xylan, ati gbogbo awọn kemikali miiran lati ọdọ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
A ṣe ìtọ́jú AFEX ṣáájú ní GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). A ṣe ìtọ́jú ṣáájú ní 140° C. fún ìṣẹ́jú 15. Àkókò gbígbé 46 ní ìpíndọ́gba 1:1 ti ammonia anhydrous sí biomass ní 60% (w/w) tí a fi sínú àkójọpọ̀ irin alagbara (Parr Instruments Company). Ó gba ìṣẹ́jú 30. A mú àkójọpọ̀ náà dé 140°C a sì tú ammonia náà jáde kíákíá, èyí tí ó jẹ́ kí baomasi náà padà sí iwọ̀n otútù yàrá kíákíá. Ìṣètò AFEX corn stover tí a ti tọ́jú tẹ́lẹ̀ (ACS) jọ ti corn stover tí a kò tọ́jú (UT-CS).
A pèsè ACSH 25% (w/w) (tó tó 8% dextran loading) gẹ́gẹ́ bí ohun èlò ìbẹ̀rẹ̀ fún ìṣẹ̀dá oligosaccharides tó pọ̀. A lo adalu enzyme ti ìṣòwò tí ó ní Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (nínú biomass tí a ti tọ́jú tẹ́lẹ̀), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan, àti Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg protein/g dextran. A ṣe enzyme hydrolysis nínú bioreactor 5-lita pẹ̀lú ìwọ̀n iṣẹ́ ti 3 liters, pH 4.8, 50°C àti 250 rpm. Lẹ́yìn hydrolysis fún wákàtí 96, a kó hydrolyzate jọ nípa centrifugation ní 6000 rpm fún ìṣẹ́jú 30 lẹ́yìn náà ní 14000 rpm fún ìṣẹ́jú 30 láti yọ àwọn solid tí kò ní hydrolyzed kúrò. Lẹ́yìn náà, wọ́n fi omi ìfọ́mọ́ tí ó ní ìfọ́mọ́ tí ó ní ìwọ̀n 0.22 mm ṣe àtúnṣe omi ìfọ́mọ́ tí ó ní ìfọ́mọ́ tí ó ní ìwọ̀n 0.22 mm. Wọ́n tọ́jú omi ìfọ́mọ́ tí ó ní ìfọ́mọ́ sínú àwọn ìgò tí ó ní ìfọ́mọ́ tí ó ní ìwọ̀n 4°C, lẹ́yìn náà wọ́n pín in sí orí erogba.
Ìṣàyẹ̀wò àkójọpọ̀ àwọn àpẹẹrẹ biomass tí a yọ jáde gẹ́gẹ́ bí ìlànà ìṣàyẹ̀wò yàrá NREL: ìpèsè àwọn àpẹẹrẹ fún ìṣàyẹ̀wò àkójọpọ̀ (NREL/TP-510-42620) àti ìpinnu àwọn kabọ̀háídéréètì ìṣètò àti lignin nínú biomass (NREL/TP-510 – 42618)47.
A ṣe àyẹ̀wò oligosaccharide ti ìṣàn hydrolyzate lórí ìwọ̀n 2 ml nípa lílo ọ̀nà hydrolysis acid ti o da lori autoclave. Da àyẹ̀wò hydrolyzate pọ̀ mọ́ 69.7 µl ti 72% sulfuric acid nínú páìpù ìṣàn skru 10 ml kí o sì fi sínú ààyè fún wákàtí kan lórí béńṣì ní 121 °C, tútù lórí yìnyín kí o sì sọ ọ́ di ìgò chromatography omi tí ó ní agbára gíga (HPLC). A pinnu ìṣọ̀kan oligosaccharides nípa yíyọ ìṣọ̀kan monosaccharides nínú àyẹ̀wò tí kò ní hydrolyzed kúrò nínú àpapọ̀ ìṣọ̀kan suga nínú àyẹ̀wò tí acid-hydrolyzed.
A ṣe àyẹ̀wò ìwọ̀n gúkúsì, xylose, àti arabinose nínú biomass acid hydrolysed tí a fi hydrolyzed acid ṣe nípa lílo ètò Shimadzu HPLC tí a fi autosampler, column heater, isocratic pump, àti refractive index detector lórí column Bio-Rad Aminex HPX-87H. A tọ́jú column náà ní 50°C a sì yọ 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 kúrò nínú omi.
A ti tú omi hydrolyzate supranatant náà jáde, a sì ṣe àyẹ̀wò rẹ̀ fún iye monomer àti oligosaccharide. A ṣe àyẹ̀wò àwọn suga monomeric tí a rí lẹ́yìn enzyme hydrolysis nípasẹ̀ HPLC tí a fi Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P column àti column protector eérú ṣe. A pa ìwọ̀n otútù column náà mọ́ ní 80°C, a lo omi gẹ́gẹ́ bí ìpele tí ń gbé kiri pẹ̀lú ìwọ̀n ìṣàn omi ti 0.6 ml/min. A pinnu àwọn oligosaccharides nípa lílo hydrolysis nínú acid diluted ní 121°C gẹ́gẹ́ bí àwọn ọ̀nà tí a ṣàlàyé nínú refs. 41, 48, 49.
A ṣe àyẹ̀wò Saccharide lórí àwọn àjẹkù biomass tí a kò fi omi bò, tí a ti tọ́jú tẹ́lẹ̀ àti gbogbo àwọn àjẹkù biomass tí a kò fi omi bò (pẹ̀lú ìṣẹ̀dá àwọn àyọkúrò odi sẹ́ẹ̀lì àti ìṣàyẹ̀wò mAb wọn) nípa lílo àwọn ìlànà tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ 27, 43, 50, 51. Fún àyẹ̀wò glycome, àwọn àjẹkù tí kò lè yọ́ nínú ohun èlò sẹ́ẹ̀lì ewéko ni a ń pèsè láti inú àwọn àjẹkù biomass a sì ń fi wọ́n sí ìyọkúrò ní ìtẹ̀léra pẹ̀lú àwọn ohun èlò oníjàgídíjàgan bíi ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM àti 0.5% w/v), CON. (1M àti 4M, méjèèjì pẹ̀lú 1% w/v sodium borohydride) àti acid chlorite gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀52,53. Lẹ́yìn náà, a fi ELISA ṣe àwọn àyọkúrò náà lòdì sí pánẹ́lì oníṣọ̀kan ti mAb50s tí a darí sí glycan odi sẹ́ẹ̀lì, a sì gbé àwọn ìṣe ìdè mAb kalẹ̀ gẹ́gẹ́ bí àwòrán ooru. A ra mAbs tí ó ń fojúsùn sí glycan odi sẹ́ẹ̀lì ewéko láti inú àwọn ọjà yàrá (CCRC, JIM àti MAC series).
Bíótínylation ìgbésẹ̀ kan ti àwọn oligosaccharides. A ṣe ìdàpọ̀ àwọn kabọ̀háídéréètì pẹ̀lú biotin-LC-hydrazide nípa lílo ìlànà wọ̀nyí. A yọ́ Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) nínú dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) nípa lílo agbára kíkankíkan àti gbígbóná ní 65° C. fún ìṣẹ́jú 1. A fi glacial acetic acid (30 µl) kún un, a sì da adalu náà sórí sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) a sì yọ́ pátápátá lẹ́yìn gbígbóná ní 65° C. fún ìṣẹ́jú 1. Lẹ́yìn náà, láti 5 sí 8 μl ti adalu ìṣesí náà ni a fi kún oligosaccharide gbígbẹ (1-100 nmol) láti gba ìlọ́po mẹ́wàá tàbí jù bẹ́ẹ̀ lọ ti àmì náà lórí òpin ìdínkù náà. A ṣe ìṣesí náà ní 65°C fún wákàtí 2, lẹ́yìn náà a wẹ àwọn àpẹẹrẹ náà mọ́ lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀. A kò lo sodium cyanoborohydride nínú àwọn àyẹ̀wò ìfàmìsí láìsí ìdínkù, a sì ṣe àyẹ̀wò àwọn àyẹ̀wò náà ní 65° C. fún wákàtí 2.5.
A fi ELISA bo àwọn àpẹẹrẹ oligosaccharides biotinylated àti fífọ wọn. A fi 25 μl àwọn àpẹẹrẹ biotinylated (100 μl ti àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan tí a ti pò pọ̀ mọ́ 5 milimita ti omi Tris buffer 0.1 M (TBS)) kún gbogbo kànga tí a fi avidin bo. A fi 50 μl ti biotin bo àwọn kànga ìṣàkóso ní ìwọ̀n 10 μg/ml nínú 0.1 M TBS. A lo omi tí a ti yọ ion kúrò gẹ́gẹ́ bí ìbòrí fún àwọn ìwọ̀n òfo. A fi tábìlẹ́ẹ̀tì náà sínú ààbọ̀ fún wákàtí méjì ní ìwọ̀n otútù yàrá ní òkùnkùn. Fọ àwo náà ní ìgbà mẹ́ta pẹ̀lú wàrà tí a ti skimmed 0.1% nínú 0.1 M TBS nípa lílo ètò no. 11 fún Grenier flat 3A.
Fífi àwọn èròjà ara tí ó ní ìpìlẹ̀ kún àti fífọ. Fi 40 µl ti èròjà ara tí ó ní ìpìlẹ̀ kún inú kànga kọ̀ọ̀kan. Fi microplate náà sínú ihò fún wákàtí kan ní iwọ̀n otútù yàrá ní òkùnkùn. Lẹ́yìn náà, a fọ ​​àwọn àwo náà pẹ̀lú wàrà 0.1% nínú 0.1M TBS ní ìgbà mẹ́ta nípa lílo ètò ìfọṣọ #11 fún Grenier Flat 3A.
Fi antibody kejì kún un kí o sì fọ̀ ọ́. Fi 50 µl ti antibody asin/eku (tí a ti pò 1:5000 nínú wàrà 0.1% nínú 0.1 M TBS) kún kànga kọ̀ọ̀kan. Fi microplate náà sínú ihò fún wákàtí kan ní iwọ̀n otútù yàrá ní òkùnkùn. Lẹ́yìn náà, a fi wàrà 0.1% wẹ̀ àwọn microplate náà nígbà márùn-ún pẹ̀lú wàrà 0.1% nínú 0.1 M TBS nípa lílo ètò ìfọṣọ awo Grenier Flat 5A #12.
Fi ohun èlò ìpààrọ̀ kan kún un. Fi 50 µl ti 3,3′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) kún ohun èlò ìpààrọ̀ náà (nípa fífi 2 ìpààrọ̀ buffer, 3 ìpààrọ̀ TMB, 2 ìpààrọ̀ hydrogen peroxide sínú 15 milimita omi tí a ti yọ ion kúrò). Múra ohun èlò ìpààrọ̀ TMB sílẹ̀ kí o sì yípadà kí o tó lò ó). Fi ohun èlò ìpààrọ̀ náà sínú iwọ̀n otutu yàrá fún ìṣẹ́jú 30. Nínú òkùnkùn.
Pari igbesẹ naa ki o ka tabulẹti naa. Fi 50 µl ti 1 N sulfuric acid kun sinu kanga kọọkan ki o si ṣe igbasilẹ gbigba lati 450 si 655 nm nipa lilo oluka ELISA.
Ṣe àgbékalẹ̀ 1 mg/ml ti àwọn olùṣàyẹ̀wò wọ̀nyí nínú omi tí a ti yọ ion kúrò: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine. (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (ìwọ̀n inú). A ṣe àwọn ìlànà méjì nípa fífi àwọn omi sùgà 1 mg/mL tí a fihàn nínú Táblì 1 kún un. A fi àwọn àpẹẹrẹ dì í, a sì fi lyophili sí i ní -80° C. títí gbogbo omi yóò fi yọ́ kúrò (nígbà gbogbo, ó máa ń tó wákàtí 12-18).
Fi 100–500 µg ti ayẹwo kun lati fi awọn tube ideri bo pelu iwontunwonsi itupalẹ. Ṣe igbasilẹ iye ti a fi kun. O dara julọ lati tu ayẹwo naa sinu ifọkansi kan pato ti epo ki o si fi sii sinu tube naa gẹgẹbi ipin omi. Lo 20 µl ti 1 mg/ml inositol gẹgẹbi boṣewa inu fun tube ayẹwo kọọkan. Iye boṣewa inu ti a fi kun ayẹwo naa gbọdọ jẹ kanna bi iye boṣewa inu ti a fi kun si tube boṣewa.
Fi 8 milimita ti methanol ti ko ni omi sinu agolo ideri skru kan. Lẹhinna 4 milimita ti omi HCl 3 N. methanolic, ti a bo pelu ideri ati mimu. Ilana yii ko lo omi.
Fi omi methanol HCl 1 M 500 µl kún àwọn àpẹẹrẹ oligosaccharide àti àwọn páìpù TMS tí ó wọ́pọ̀. A fi àwọn àpẹẹrẹ náà sínú iná ní òru kan (wákàtí 168) ní 80° C. nínú ìgbóná ooru kan. Gbẹ ọjà methanolysis náà ní iwọ̀n otútù yàrá nípa lílo manifold gbígbẹ. Fi 200 µl MeOH kún un kí o sì tún gbẹ ẹ́. A tún ṣe ilana yìí lẹ́ẹ̀mejì. Fi 200 µl ti methanol, 100 µl ti pyridine àti 100 µl ti acetic anhydride kún àpẹẹrẹ náà kí o sì dàpọ̀ mọ́ ọn dáadáa. Fi àwọn àpẹẹrẹ náà sínú iwọ̀n otútù yàrá fún ìṣẹ́jú 30, kí o sì gbẹ ẹ́. Fi 200 µl ti methanol kún un kí o sì tún gbẹ ẹ́ lẹ́ẹ̀kan sí i.
Fi 200 µl ti Tri-Sil kun ki o si mu ọpọn ti a fi bo fun iṣẹju 20. 80°C, lẹhinna tutu si iwọn otutu yara. Lo ohun elo gbigbẹ lati tun gbẹ ayẹwo naa si iwọn ti o to 50 µl. O ṣe pataki lati ṣe akiyesi pe a ko gba awọn ayẹwo laaye lati gbẹ patapata.
Fi 2 milimita hexane kun ki o si dapọ daradara nipa didimu. Fi ege irun gilasi kun awọn opin awọn pipette Pasteur (5-8 mm) nipa fifi irun gilasi si ori pipette iwọn ila opin 5-3/4 inches. A fi centrifuge si awọn ayẹwo ni 3000 g fun iṣẹju meji. Eyikeyi awọn iyoku ti ko le yo ni a fi omi ṣan. Gbẹ ayẹwo naa si 100-150 µl. A fi iwọn didun to to 1 μl sinu GC-MS ni iwọn otutu akọkọ ti 80 °C ati akoko ibẹrẹ ti iṣẹju 2.0 (Tabili 2).