O ṣeun fun lilo si Nature.com.Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin CSS lopin.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Lakoko, lati rii daju pe atilẹyin tẹsiwaju, a yoo ṣe aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
Awọn ọna ajẹsara titun ati awọn ọna iwoye pupọ fun itupalẹ eka ti oligosaccharides itẹramọṣẹ ni adiro agbado ti a ti ṣaju pẹlu AFEX.Lignocellulosic baomass jẹ arosọ alagbero si awọn epo fosaili ati pe o jẹ lilo pupọ lati ṣe agbekalẹ awọn imọ-ẹrọ imọ-ẹrọ fun iṣelọpọ awọn ọja bii ounjẹ, ifunni, epo ati awọn kemikali.Bọtini si awọn imọ-ẹrọ wọnyi ni idagbasoke ti awọn ilana ifigagbaga-iye owo fun iyipada awọn carbohydrates eka ti o wa ninu awọn odi sẹẹli ọgbin sinu awọn suga ti o rọrun bii glucose, xylose ati arabinose.Nitori biomass lignocellulosic jẹ alagidi pupọ, o gbọdọ jẹ labẹ awọn itọju thermochemical (fun apẹẹrẹ, amonia fiber exfoliation (AFEX), dilute acids (DA), awọn olomi ionic (IL)) ati awọn itọju ti ibi (fun apẹẹrẹ, enzymatic hydrolysis ati bakteria microbial) ni apapo lati gba ọja ti o fẹ..Bibẹẹkọ, nigbati a ba lo awọn enzymu olu ti iṣowo ni ilana hydrolysis, nikan 75-85% ti awọn suga ti o yanju jẹ monosaccharides, ati pe 15-25% ti o ku jẹ tiotuka, oligosaccharides intractable, eyiti ko wa nigbagbogbo si awọn microorganisms.Ni iṣaaju, a ti ya sọtọ ni aṣeyọri ati sọ di mimọ oligosaccharides abori ti a ti sọ di mimọ nipa lilo apapo erogba ati iyapa ilẹ diatomaceous ati chromatography iyasoto iwọn, ati tun ṣe iwadii awọn ohun-ini inhibitory enzymu wọn.A ti rii pe awọn oligosaccharides ti o ni iwọn giga ti polymerization (DP) methylated uronic acid substitutions ni o nira sii lati ṣe ilana pẹlu awọn idapọmọra enzymu ti iṣowo ju DP kekere ati awọn oligosaccharides didoju.Nibi ti a jabo awọn lilo ti awọn orisirisi awọn ọna afikun, pẹlu glycan profaili lilo monoclonal egboogi (mAbs) pato lati gbin biomass glycans lati se apejuwe glycan bonds ni ọgbin cell Odi ati enzymatic hydrolysates, matrix-iranlọwọ lesa desorption ionization, akoko-ti-flight mass-spectrometry..MALDI-TOF-MS) nlo awọn oke-itumọ iwadii igbekalẹ ti o gba nipasẹ spectroscopy lẹhin ibajẹ keji ti awọn ions odi, chromatography gaasi ati spectrometry pupọ (GC-MS) lati ṣe apejuwe awọn ifunmọ oligosaccharide pẹlu ati laisi itọsẹ.Nitori iwọn kekere ti oligosaccharides (DP 4-20), awọn ohun elo wọnyi jẹra lati lo fun abuda mAb ati isọdi.Lati bori iṣoro yii, a lo ọna tuntun ti o da lori oligosaccharides immobilisation biotin ti o ṣaṣeyọri pupọ julọ ti oligosaccharides ti soluble DP kekere lori dada microplate, eyiti a lo lẹhinna ni eto mAb ti o ga julọ fun itupalẹ ligation pato.Ọna tuntun yii yoo dẹrọ idagbasoke awọn igbelewọn glycome giga ti o ga julọ ni ọjọ iwaju ti o le ṣee lo lati ya sọtọ ati ṣe afihan awọn oligosaccharides ti o wa ni awọn ami-ara biomarkers fun awọn idi iwadii.
Lignocellulosic baomass, ti o jẹ ti ogbin, igbo, koriko ati awọn ohun elo igi, jẹ ohun elo ifunni ti o pọju fun iṣelọpọ awọn ọja ti o da lori iti, pẹlu ounjẹ, ifunni, epo ati awọn iṣaju kemikali lati gbe awọn ọja ti o ga julọ jade.Carbohydrates (gẹgẹ bi awọn cellulose ati hemicellulose) ti o wa ninu awọn ogiri sẹẹli ọgbin ni a ti sọ dipolymerized sinu monosaccharides nipasẹ ṣiṣe kemikali ati biotransformation (gẹgẹbi enzymatic hydrolysis ati microbial bakteria).Awọn itọju iṣaaju ti o wọpọ pẹlu imugboroja okun amonia (AFEX), dilute acid (DA), omi ionic (IL), ati bugbamu steam (SE), eyiti o lo apapo awọn kemikali ati ooru lati dinku iṣelọpọ lignocellulose nipasẹ ṣiṣi awọn odi sẹẹli ọgbin3,4.agidi ti ọrọ, 5. Enzymatic hydrolysis ti wa ni ti gbe jade ni kan to ga okele fifuye lilo owo lọwọ carbohydrate-ti o ni awọn ensaemusi (CAZymes) ati makirobia bakteria lilo transgenic yeasts tabi kokoro arun lati gbe awọn iti-orisun epo ati kemikali 6.
CAZymes ninu awọn ensaemusi ti iṣowo jẹ akopọ ti idapọpọ eka ti awọn ensaemusi ti o papọ papọ awọn iwe ifowopamosi-suga idiju lati dagba monosaccharides2,7.Gẹgẹbi a ti royin tẹlẹ, nẹtiwọọki eka ti awọn polima aromatiki ti lignin pẹlu awọn carbohydrates jẹ ki wọn jẹ aibikita pupọ, eyiti o yori si iyipada suga ti ko pe, ikojọpọ 15-25% ti ibalopo oligosaccharides ti ko ṣe iṣelọpọ lakoko hydrolysis enzymatic ti biomass ti a ti ṣaju.Eleyi jẹ kan to wopo isoro pẹlu orisirisi baomasi pretreatment ọna.Diẹ ninu awọn idi fun igo igo yii pẹlu idinamọ enzymu lakoko hydrolysis, tabi isansa tabi awọn ipele kekere ti awọn enzymu pataki pataki ti o nilo lati fọ awọn ifunmọ suga ni baomasi ọgbin.Nimọye akopọ ati awọn abuda igbekale ti awọn suga, gẹgẹbi awọn ifunmọ suga ni oligosaccharides, yoo ṣe iranlọwọ fun wa ni ilọsiwaju iyipada suga lakoko hydrolysis, ṣiṣe awọn ilana imọ-ẹrọ imọ-ẹrọ ni idiyele-idije pẹlu awọn ọja ti o ni epo.
Ipinnu eto ti awọn carbohydrates jẹ nija ati pe o nilo apapọ awọn ọna bii kiromatogirafi omi (LC) 11,12, spectroscopy magnetic resonance spectroscopy (NMR) 13, electrophoresis capillary (CE) 14,15,16 ati mass spectrometry (MS)17.,mejidinlogun.Awọn ọna MS bi akoko-ti-flight mass spectrometry pẹlu lesa desorption ati ionization lilo matrix (MALDI-TOF-MS) jẹ ọna ti o wapọ fun idamo awọn ẹya carbohydrate.Laipe, Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS ti iṣuu soda ion adducts ti ni lilo pupọ julọ lati ṣe idanimọ awọn ika ọwọ ti o baamu awọn ipo asomọ oligosaccharide, awọn atunto anomeri, awọn ilana, ati awọn ipo ẹka 20, 21.
Itupalẹ Glycan jẹ ohun elo ti o tayọ fun idanimọ jinlẹ ti awọn iwe ifowopamọ carbohydrate22.Ọna yii nlo awọn ajẹsara monoclonal (mAbs) ti a ṣe itọsọna si glycan ogiri sẹẹli bi awọn iwadii lati loye awọn ọna asopọ carbohydrate eka.Diẹ sii ju 250 mAbs wa ni agbaye, ti a ṣe apẹrẹ lodi si ọpọlọpọ laini ati awọn oligosaccharides ti ẹka ni lilo awọn saccharide24 lọpọlọpọ.Ọpọlọpọ awọn mAbs ni a ti lo ni lilo pupọ lati ṣe apejuwe igbekalẹ, akopọ, ati awọn iyipada ti ogiri sẹẹli ọgbin, nitori awọn iyatọ nla wa ti o da lori iru sẹẹli ọgbin, eto ara, ọjọ-ori, ipele idagbasoke, ati agbegbe idagbasoke25,26.Laipẹ diẹ, ọna yii ni a ti lo lati loye awọn eniyan vesicle ni awọn eto ọgbin ati ẹranko ati awọn ipa wọn ni gbigbe glycan gẹgẹbi ipinnu nipasẹ awọn ami-ami subcellular, awọn ipele idagbasoke, tabi awọn iwuri ayika, ati lati pinnu iṣẹ ṣiṣe enzymatic.Diẹ ninu awọn oriṣiriṣi awọn ẹya ti glycans ati xylans ti a ti ṣe idanimọ pẹlu pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), glucans ti o dapọpọ (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG) , glucuronic acid-arabinoxylan (ArbX) ati arabino.
Bibẹẹkọ, laibikita gbogbo awọn igbiyanju iwadii wọnyi, awọn ijinlẹ diẹ nikan ti dojukọ iru ikojọpọ oligosaccharides lakoko fifuye okele giga (HSL) hydrolysis, pẹlu itusilẹ oligosaccharide, awọn iyipada pq oligomeric pq lakoko hydrolysis, awọn oriṣiriṣi awọn polima DP kekere, ati awọn iyipo wọn.awọn pinpin 30,31,32.Nibayi, botilẹjẹpe itupalẹ glycan ti fihan pe o jẹ ohun elo ti o wulo fun itupalẹ okeerẹ ti eto glycan, o nira lati ṣe iṣiro omi-tiotuka kekere DP oligosaccharides ni lilo awọn ọna antibody.Awọn oligosaccharides DP ti o kere pẹlu iwuwo molikula ti o kere ju 5-10 kDa ko sopọ mọ awọn awo ELISA 33, 34 ati pe a fo kuro ṣaaju afikun antibody.
Nibi, fun igba akọkọ, a ṣe afihan idanwo ELISA kan lori awọn awo ti a fi bo avidin nipa lilo awọn egboogi monoclonal, apapọ ilana ilana biotinylation kan-igbesẹ kan fun oligosaccharides refractory soluble pẹlu itupalẹ glycome.Ọna wa si itupalẹ glycome jẹ ifọwọsi nipasẹ MALDI-TOF-MS ati igbekale ipilẹ GC-MS ti awọn ọna asopọ oligosaccharides ibaramu ni lilo itọsẹ trimethylsilyl (TMS) ti awọn akojọpọ suga hydrolyzed.Ọna imotuntun yii le ṣe idagbasoke bi ọna ṣiṣe-giga ni ọjọ iwaju ati rii ohun elo gbooro ni iwadii biomedical35.
Awọn iyipada lẹhin-itumọ ti awọn enzymu ati awọn apo-ara, gẹgẹbi glycosylation, 36 ni ipa lori iṣẹ ṣiṣe ti ibi wọn.Fun apẹẹrẹ, awọn iyipada ninu glycosylation ti awọn ọlọjẹ omi ara ṣe ipa pataki ninu arthritis iredodo, ati awọn iyipada ninu glycosylation ni a lo bi awọn ami idanimọ37.Orisirisi awọn glycans ni a ti royin ninu awọn iwe-kikọ lati han ni imurasilẹ ni ọpọlọpọ awọn arun, pẹlu awọn arun iredodo onibaje ti apa ikun ati ẹdọ, awọn akoran ọlọjẹ, ovarian, igbaya, ati awọn aarun pirositeti38,39,40.Loye ilana ti glycans nipa lilo awọn ọna ELISA glycan ti o da lori antibody yoo pese igbẹkẹle afikun si iwadii aisan laisi lilo awọn ọna MS eka.
Iwadii iṣaaju wa fihan pe awọn oligosaccharides alagidi duro lainidi lẹhin iṣaju ati hydrolysis enzymatic (Nọmba 1).Ninu iṣẹ ti a tẹjade tẹlẹ, a ṣe agbekalẹ ọna isediwon eedu ti o lagbara-ipele lati ya sọtọ oligosaccharides lati AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) 8.Lẹhin isediwon akọkọ ati iyapa, awọn oligosaccharides ti wa ni ipin siwaju sii nipasẹ chromatography iyasoto iwọn (SEC) ati pe a gba ni aṣẹ iwuwo molikula.Awọn monomers suga ati awọn oligomers ti a tu silẹ lati ọpọlọpọ awọn itọju iṣaaju ni a ṣe atupale nipasẹ itupalẹ akojọpọ suga.Nigbati o ba ṣe afiwe akoonu ti oligomers suga ti o gba nipasẹ ọpọlọpọ awọn ọna iṣaaju, wiwa ti oligosaccharides alagidi jẹ iṣoro ti o wọpọ ni iyipada ti biomass si awọn monosaccharides ati pe o le ja si idinku ninu ikore suga ti o kere ju 10-15% ati paapaa to 18%.US.Ọna yii ni a lo fun iṣelọpọ titobi nla ti awọn ida oligosaccharides.Abajade ACH ati awọn ida ti o tẹle pẹlu oriṣiriṣi awọn iwuwo molikula ni a lo bi ohun elo idanwo fun ijuwe ti oligosaccharides ninu iṣẹ yii.
Lẹhin itọju iṣaaju ati hydrolysis enzymatic, awọn oligosaccharides ti o tẹramọ wa laisi omiipa.Nibi (A) jẹ ọna iyapa oligosaccharides ninu eyiti awọn oligosaccharides ti ya sọtọ lati AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) nipa lilo ibusun ti a kojọpọ ti erogba ti a mu ṣiṣẹ ati ilẹ diatomaceous;(B) Ọna fun Iyapa ti oligosaccharides.Awọn oligosaccharides ti wa ni iyatọ siwaju sii nipasẹ chromatography iyasoto (SEC);(C) Awọn monomers saccharide ati awọn oligomers ti a tu silẹ lati oriṣiriṣi awọn itọju (acid ti a fomi: DA, omi ionic: IL ati AFEX).Awọn ipo hydrolysis enzymatic: ikojọpọ awọn ipilẹ giga ti 25% (w / w) (iwọn 8% ikojọpọ glucan), awọn wakati 96 hydrolysis, 20 mg / g ti iṣelọpọ enzymu iṣowo (Ctec2: Htec2: MP-2: 1: ratio 1) ati (D) Awọn monomers suga ati awọn oligomers ti glucose, xylose-ti a tu silẹ lati inu adiro AF EXcorn.
Onínọmbà Glycan ti fihan pe o jẹ ohun elo ti o wulo fun itupalẹ igbekalẹ igbekalẹ ti glycans ni awọn iyọkuro ti o ya sọtọ lati awọn iyoku baomasi to lagbara.Bibẹẹkọ, awọn saccharides ti o yo omi jẹ aiṣedeede ni lilo ọna ibile yii41 nitori iwuwo molikula kekere oligosaccharides nira lati ṣe aibikita lori awọn awo ELISA ati pe a fo jade ṣaaju afikun antibody.Nitoribẹẹ, fun isọmọ antibody ati isọdi, ọna biotinylation kan-igbesẹ kan ni a lo lati wọ aṣọ tiotuka, oligosaccharides ti ko ni ibamu lori awọn awo ELISA ti a bo avidin.Ọna yii jẹ idanwo nipa lilo ACSH ti a ṣe tẹlẹ ati ida kan ti o da lori iwuwo molikula rẹ (tabi iwọn ti polymerization, DP).Biotinylation-igbesẹ kan ni a lo lati mu isunmọ oligosaccharides pọ si nipa fifi biotin-LC-hydrazide kun si idinku opin ti carbohydrate (Fig. 2).Ni ojutu, ẹgbẹ hemiacetal ni opin idinku awọn idahun pẹlu ẹgbẹ hydrazide ti biotin-LC-hydrazide lati ṣe asopọ hydrazone kan.Ni iwaju aṣoju idinku NaCNBH3, asopọ hydrazone ti dinku si ọja ipari biotinylated iduroṣinṣin.Pẹlu iyipada ti opin idinku suga, asopọ ti DP oligosaccharides kekere si awọn awo ELISA di ṣee ṣe, ati ninu iwadi wa eyi ni a ṣe lori awọn awo ti a bo avidin nipa lilo awọn mAbs ti a fojusi glycan.
Ṣiṣayẹwo awọn egboogi monoclonal ti o da lori ELISA fun oligosaccharides biotinylated.Nibi (A) ni idapo biotinylation ti oligosaccharides ati ibojuwo ELISA ti o tẹle pẹlu awọn mAbs ti a fojusi glycan lori awọn awo ti a bo NeutrAvidin ati (B) fihan ilana igbesẹ kan fun biotinylation ti awọn ọja ifaseyin.
Awọn awo ti a bo Avidin pẹlu oligosaccharides-conjugated antibodies lẹhinna fi kun si awọn ajẹsara akọkọ ati ile-ẹkọ keji ati ki o wẹ ni ina- ati alabọde ti o ni oye akoko.Lẹhin ti abuda antibody ti pari, ṣafikun sobusitireti TMB lati ṣafikun awo naa.Idahun naa ni ipari duro pẹlu sulfuric acid.A ṣe atupale awọn awopọ idawọle ni lilo oluka ELISA lati pinnu agbara abuda ti aporo ara kọọkan lati ṣe awari isopo-ara-ara-ara-ara-ara-ara.Fun awọn alaye ati awọn aye ti idanwo, wo apakan ti o baamu “Awọn ohun elo ati Awọn ọna”.
A ṣe afihan iwulo ti ọna idagbasoke tuntun yii fun awọn ohun elo kan pato nipa sisọ awọn oligosaccharides tiotuka ti o wa ninu ACSH bakannaa ni robi ati awọn ida oligosaccharide ti a sọ di mimọ ti o ya sọtọ lati awọn hydrolysates lignocellulosic.Gẹgẹbi a ṣe han ni Nọmba 3, awọn xylans ti o wọpọ julọ ti o rọpo epitope ti a damọ ni ACSH nipa lilo awọn ọna assay bioacylated glycome assay jẹ igbagbogbo uronic (U) tabi methyluronic (MeU) ati pectic arabinogalactans.Pupọ ninu wọn ni a tun rii ninu iwadii iṣaaju wa lori itupalẹ awọn glycans ti awọn ipilẹ ti kii-hydrolyzed (UHS) 43.
Ṣiṣawari awọn epitopes oligosaccharides recalcitrant nipa lilo egboogi monoclonal kan ti a tọka si glycan ogiri sẹẹli.Ida “ipinnu” jẹ ida ACN ati ida “airotẹlẹ” jẹ ida FA.Awọn pupa didan lori maapu igbona tọkasi akoonu epitope ti o ga julọ, ati awọn buluu didan tọka si abẹlẹ òfo.Awọn iye awọ lori iwọn jẹ da lori awọn iye OD aise fun awọn agbekalẹ N = 2.Awọn epitopes akọkọ ti a mọ nipasẹ awọn apo-ara ni a fihan ni apa ọtun.
Awọn ẹya ti kii-cellulose wọnyi ko le ṣe pipin nipasẹ awọn sẹẹli ti o wọpọ julọ ati awọn hemicellulases ninu apopọ henensiamu ti iṣowo ti idanwo, eyiti o pẹlu awọn enzymu iṣowo ti o wọpọ julọ lo.Nitorinaa, awọn enzymu oluranlọwọ tuntun nilo fun hydrolysis wọn.Laisi awọn enzymu ẹya ẹrọ ti kii ṣe cellulose pataki, awọn iwe ifowopamosi ti kii-cellulose wọnyi ṣe idiwọ iyipada pipe si awọn monosaccharides, paapaa ti awọn polima ti suga obi wọn ba jẹ hydrolyzed lọpọlọpọ sinu awọn ajẹkù kukuru ati tituka nipa lilo awọn akojọpọ henensiamu ti iṣowo.
Iwadi siwaju sii ti pinpin ifihan agbara ati agbara abuda rẹ fihan pe awọn epitopes abuda wa ni isalẹ ni awọn ipele suga DP giga (A, B, C, DP titi di 20+) ju ni awọn ipin DP kekere (D, E, F, DP) ni awọn dimers) (Fig. 1).Awọn ajẹkù acid jẹ diẹ wọpọ ni awọn epitopes ti kii-cellulose ju awọn ajẹkù didoju.Awọn iṣẹlẹ wọnyi wa ni ibamu pẹlu apẹẹrẹ ti a ṣe akiyesi ninu iwadi wa ti tẹlẹ, nibiti DP giga ati awọn ẹya acid jẹ diẹ sii sooro si hydrolysis enzymatic.Nitorinaa, wiwa awọn epitopes glycan ti kii-cellulose ati awọn iyipada U ati MeU le ṣe alabapin pupọ si iduroṣinṣin ti awọn oligosaccharides.O yẹ ki o ṣe akiyesi pe abuda ati ṣiṣe wiwa le jẹ iṣoro fun awọn oligosaccharides DP kekere, paapaa ti epitope jẹ dimeric tabi trimeric oligosaccharides.Eyi le ṣe idanwo nipa lilo awọn oligosaccharides ti iṣowo ti awọn gigun oriṣiriṣi, ọkọọkan ti o ni epitope kan ṣoṣo ti o sopọ mọ mAb kan pato.
Nitorinaa, lilo awọn aporo-ara-itumọ ọna ṣe afihan awọn oriṣi awọn iwe ifowopamosi iṣipaya kan.Ti o da lori iru agboguntaisan ti a lo, ilana ligation ti o yẹ, ati agbara ifihan agbara ti o gbejade (julọ ati lọpọlọpọ), awọn enzymu tuntun le ṣe idanimọ ati ṣafikun ologbele-pupọ si adalu henensiamu fun iyipada glycoconversion pipe diẹ sii.Gbigba itupalẹ ti ACSH oligosaccharides gẹgẹbi apẹẹrẹ, a le ṣẹda data data ti awọn iwe adehun glycan fun ohun elo baomasi kọọkan.O yẹ ki o ṣe akiyesi nibi pe iyatọ oriṣiriṣi ti awọn aporo yẹ ki o ṣe akiyesi, ati pe ti ibatan wọn ko ba jẹ aimọ, eyi yoo ṣẹda awọn iṣoro kan nigbati o ba ṣe afiwe awọn ami ti awọn ọlọjẹ oriṣiriṣi.Ni afikun, lafiwe ti awọn iwe adehun glycan le ṣiṣẹ dara julọ laarin awọn ayẹwo fun egboogi kanna.Awọn ifunmọ agidi wọnyi le lẹhinna ni asopọ si data data CAZyme, lati inu eyiti a le ṣe idanimọ awọn enzymu, yan awọn enzymu oludije ati idanwo fun awọn ensaemusi ti n fọ adehun, tabi dagbasoke awọn eto microbial lati ṣafihan awọn enzymu wọnyi fun lilo ninu biorefineries44.
Lati ṣe iṣiro bi awọn ọna ajẹsara ṣe ṣe ibamu awọn ọna yiyan fun sisọ awọn oligosaccharides iwuwo molikula kekere ti o wa ninu awọn hydrolysates lignocellulosic, a ṣe MALDI (Fig. 4, S1-S8) ati itupalẹ awọn saccharides ti ari TMS ti o da lori GC-MS lori nronu kanna (Fig. 5) apakan oligosaccharide.MALDI ni a lo lati ṣe afiwe boya pinpin pupọ ti awọn ohun elo oligosaccharides baamu ilana ti a pinnu.Lori ọpọtọ.4 fihan MS ti awọn ẹya didoju ACN-A ati ACN-B.Ayẹwo ACN-A ṣe idaniloju ibiti awọn suga pentose ti o wa lati DP 4-8 (Fig. 4) si DP 22 (Fig. S1), ti awọn iwọn rẹ ṣe deede si MeU-xylan oligosaccharides.Ayẹwo ACN-B jẹrisi pentose ati jara glucoxylan pẹlu DP 8-15.Ninu awọn ohun elo afikun gẹgẹbi Nọmba S3, awọn maapu pinpin ibi-apo acidic FA-C ṣe afihan ọpọlọpọ (Me) U awọn suga pentose ti o rọpo pẹlu DP ti 8-15 ti o ni ibamu pẹlu awọn xylans ti o rọpo ti a rii ni iboju-orisun mAb ti ELISA.Awọn epitopes ni ibamu.
MALDI-MS julọ.Oniranran ti oligosaccharides ti o soluble ti ko ni ibamu ti o wa ninu ACS.Nibi, (A) ACN-A awọn ipin iwọn iwuwo kekere ti o ni methylated uronic acid (DP 4-8) rọpo glucuroxylan oligosaccharides ati (B) ACN-B xylan ati methylated uronic acid oligosaccharides rọpo pẹlu glucuroxylan (DP 8-15).
Onínọmbà ti akopọ ti iyokù glycan ti oligosaccharides refractory.Nibi (A) akopọ saccharide TMS ti ọpọlọpọ awọn ida oligosaccharides ti a gba ni lilo itupalẹ GC-MS.(B) Awọn ilana ti awọn oriṣiriṣi awọn suga ti o wa ni TMS ti o wa ninu oligosaccharides.ACN – ida acetonitrile ti o ni awọn oligosaccharides didoju ati FA – ida ferulic acid ti o ni awọn oligosaccharides acid ninu.
Ipari miiran ti o ni iyanilenu ni a fa lati inu itupalẹ LC-MS ti ida oligosaccharides, bi o ṣe han ni Nọmba S9 (awọn ọna ti a le rii ninu awọn ohun elo afikun itanna).Awọn ajẹkù ti awọn ẹgbẹ hexose ati -OAc ni a ṣe akiyesi leralera lakoko ligation ti ida ACN-B.Wiwa yii kii ṣe ijẹrisi pipin ti a ṣe akiyesi ni glycome ati itupalẹ MALDI-TOF nikan, ṣugbọn tun pese alaye tuntun nipa awọn itọsẹ carbohydrate ti o pọju ninu baomasi lignocellulosic ti a ti ṣaju.
A tun ṣe itupalẹ akojọpọ glycan ti awọn ida oligosaccharides nipa lilo itọsẹ TMS glycan.Lilo GC-MS, a pinnu akojọpọ ti nkankikan (ti kii ṣe itọsẹ) ati awọn suga acidic (GluA ati GalA) ni ida oligosaccharide (Fig. 5).Glucuronic acid wa ninu awọn paati ekikan C ati D, lakoko ti a rii galacturonic acid ni awọn paati ekikan A ati B, mejeeji ti awọn paati DP giga ti awọn suga ekikan.Awọn abajade wọnyi kii ṣe ijẹrisi data ELISA ati MALDI nikan, ṣugbọn tun wa ni ibamu pẹlu awọn iwadii iṣaaju wa ti ikojọpọ oligosaccharides.Nitorinaa, a gbagbọ pe awọn ọna ajẹsara ode oni nipa lilo biotinylation ti oligosaccharides ati ibojuwo ELISA ti o tẹle ni o to lati ṣawari awọn oligosaccharides recalcitrant tiotuka ni ọpọlọpọ awọn ayẹwo ti ibi.
Niwọn igba ti awọn ọna iboju mAb ti o da lori ELISA ti jẹ ifọwọsi nipasẹ ọpọlọpọ awọn ọna oriṣiriṣi, a fẹ lati ṣawari siwaju si agbara ti ọna titobi tuntun yii.Awọn oligosaccharides iṣowo meji, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ati 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ni a ra ati idanwo nipa lilo ọna mAb tuntun ti o fojusi glycan ogiri sẹẹli.Nọmba 6 ṣe afihan ibaramu laini laarin ifihan agbara abuda biotinylated ati ifọkansi log ti ifọkansi oligosaccharide, ni iyanju awoṣe adsorption Langmuir ti o ṣeeṣe.Lara awọn mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ati CCRC-M151 ti o ni ibamu pẹlu XHE, ati CCRC-M108, CCRC-M109, ati LM11 ni ibamu pẹlu A2XX lori ibiti o ti 10 namno.Nitori wiwa ti o lopin ti awọn apo-ara lakoko idanwo, awọn idanwo lopin ni a ṣe pẹlu ifọkansi oligosaccharide kọọkan.O yẹ ki o ṣe akiyesi nibi pe diẹ ninu awọn apo-ara fesi ni iyatọ pupọ si oligosaccharides kanna bi sobusitireti, aigbekele nitori wọn sopọ mọ awọn epitopes oriṣiriṣi oriṣiriṣi ati pe o le ni awọn ibatan abuda ti o yatọ pupọ.Awọn ilana ati awọn ifarabalẹ ti idanimọ epitope deede yoo jẹ idiju pupọ sii nigbati ọna mAb tuntun ba lo si awọn ayẹwo gidi.
Awọn oligosaccharides iṣowo meji ni a lo lati pinnu iwọn wiwa ti awọn mAbs ti o fojusi glycan.Nibi, awọn ibamu laini pẹlu ifọkansi log ti ifọkansi oligosaccharides tọkasi awọn ilana adsorption Langmuir fun (A) XHE pẹlu mAb ati (B) A2XX pẹlu mAb.Awọn epitopes ti o baamu tọkasi awọn ẹya ti awọn oligosaccharides ti iṣowo ti a lo bi awọn sobusitireti ninu idanwo naa.
Lilo awọn egboogi monoclonal ti a fojusi glycan (itupalẹ glycocomic tabi iboju mAb ti o da lori ELISA) jẹ ohun elo ti o lagbara fun isọdi-jinlẹ ti pupọ julọ awọn glycans ogiri sẹẹli pataki ti o jẹ biomass ọgbin.Bibẹẹkọ, itupalẹ glycan kilasika nikan ṣe afihan awọn glycans ogiri sẹẹli ti o tobi, nitori ọpọlọpọ awọn oligosaccharides ko ni aibikita daradara lori awọn awo ELISA.Ninu iwadi yi, AFEX-pretreated agbado adiro ti a enzymatically hydrolyzed ni kan to ga okele akoonu.Ayẹwo suga ni a lo lati pinnu akopọ ti awọn carbohydrates ogiri sẹẹli recalcitrant ninu hydrolyzate.Bibẹẹkọ, itupalẹ mAb ti awọn oligosaccharides kekere ni awọn hydrolysates jẹ aibikita, ati pe awọn irinṣẹ afikun ni a nilo lati ṣe imunadoko oligosaccharides lori awọn awo ELISA.
A ṣe ijabọ iwe aramada kan ati ọna imudara oligosaccharides ti o munadoko fun ibojuwo mAb nipa apapọ oligosaccharide biotinylation atẹle nipasẹ ibojuwo ELISA lori awọn awo ti a bo NeutrAvidin ™.Awọn oligosaccharides biotinylated aibikita ṣe afihan isunmọ ti o to fun agboguntaidi lati jẹki wiwa iyara ati daradara ti oligosaccharides recalcitrant.Onínọmbà ti akopọ ti awọn oligosaccharides alagidi wọnyi ti o da lori iwoye pupọ ṣe idaniloju awọn abajade ti ọna tuntun yii si imunoscreening.Nitorinaa, awọn ijinlẹ wọnyi ṣe afihan pe apapọ ti oligosaccharide biotinylation ati ibojuwo ELISA pẹlu awọn ajẹsara monoclonal ti o ni idojukọ glycan le ṣee lo lati ṣe awari awọn ọna asopọ agbelebu ni oligosaccharides ati pe o le lo ni lilo pupọ ni awọn ijinlẹ biokemika miiran ti o n ṣe afihan ilana ti oligosaccharides.
Ọna profaili glycan ti o da lori biotin yii jẹ ijabọ akọkọ ti o lagbara lati ṣe iwadii awọn ifunmọ carbohydrate recalcitrant ti oligosaccharides tiotuka ninu baomasi ọgbin.Eyi ṣe iranlọwọ lati ni oye idi ti diẹ ninu awọn ẹya baomasi jẹ agidi nigbati o ba de si iṣelọpọ biofuel.Ọna yii kun aafo pataki ni awọn ọna itupalẹ glycome ati fa ohun elo rẹ si ọpọlọpọ awọn sobusitireti ti o kọja oligosaccharides ọgbin.Ni ojo iwaju, a le lo awọn ẹrọ-robotik fun biotinylation ati lo ọna ti a ti ni idagbasoke fun iṣiro-giga ti awọn ayẹwo nipa lilo ELISA.
Egbin agbado (CS) ti o dagba lati awọn irugbin arabara Pioneer 33A14 ti jẹ ikore ni ọdun 2010 lati Kramer Farms ni Ray, Colorado.Pẹlu igbanilaaye ti onile, baomasi yii le ṣee lo fun iwadii. Awọn apẹẹrẹ ti wa ni ipamọ gbẹ <6% ọrinrin ninu awọn apo titiipa zip ni iwọn otutu yara. Awọn apẹẹrẹ ti wa ni ipamọ gbẹ <6% ọrinrin ninu awọn apo titiipa zip ni iwọn otutu yara. Образцы хранились сухими при влажности <6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Awọn ayẹwo ti wa ni ipamọ gbẹ ni <6% ọriniinitutu ninu awọn apo idalẹnu ni iwọn otutu yara.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью <6%. Awọn ayẹwo ti wa ni ipamọ ni awọn apo idalẹnu ni iwọn otutu yara pẹlu ọriniinitutu <6%.Iwadi naa ni ibamu pẹlu awọn ilana agbegbe ati ti orilẹ-ede.Aṣeyẹwo akojọpọ ni a ṣe nipa lilo ilana NREL.A ri akopọ lati ni 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% amuaradagba ati 13. 4% eeru.
Cellic® CTec2 (138 mg amuaradagba / milimita, pupo VCNI 0001) jẹ adalu eka ti cellulase, β-glucosidase ati Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) lati Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 miligiramu amuaradagba/mL), idapọpọ eka ti awọn enzymu abuku pectin, jẹ itọrẹ nipasẹ DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Awọn ifọkansi amuaradagba Enzyme jẹ ipinnu nipasẹ iṣiro akoonu amuaradagba (ati iyokuro idasi ti nitrogen ti kii-amuaradagba) nipa lilo itupalẹ Kjeldahl nitrogen (ọna AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Diatomaceous earth 545 ti ra lati EMD Millipore (Billerica, MA).Erogba ti a mu ṣiṣẹ (DARCO, awọn granules mesh 100), Avicel (PH-101), beech xylan, ati gbogbo awọn kemikali miiran ni a ra lati Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX pretreatment ti a ṣe ni GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).A ṣe itọju iṣaaju ni 140 ° C. fun awọn iṣẹju 15.46 akoko ibugbe ni 1: 1 ipin ti anhydrous amonia si baomasi ni 60% (w / w) ikojọpọ ni a alagbara, irin benchtop riakito (Parr Instruments Company).O gba ọgbọn iṣẹju.A mu reactor lọ si 140°C ati pe amonia ti tu silẹ ni iyara, gbigba biomass lati yara pada si iwọn otutu yara.Ipilẹṣẹ ti AFEX agbado adiro ti a ti sọ tẹlẹ (ACS) jẹ iru si ti adiro agbado ti ko ni itọju (UT-CS).
Awọn ipilẹ giga ACSH 25% (w / w) (isunmọ 8% ikojọpọ dextran) ti pese sile bi ohun elo ibẹrẹ fun iṣelọpọ iwọn nla ti oligosaccharides.Enzymatic hydrolysis ti ACS ni a ṣe pẹlu lilo idapọ enzymu ti iṣowo pẹlu Cellic® Ctec2 10 mg protein / g glucan (ninu biomass ti a ti ṣaju), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein / g glucan, ati Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 miligiramu amuaradagba/g dextran.Enzymatic hydrolysis ni a ṣe ni bioreactor 5-lita pẹlu iwọn iṣẹ ti 3 liters, pH 4.8, 50 ° C ati 250 rpm.Lẹhin hydrolysis fun awọn wakati 96, a gba hydrolyzate nipasẹ centrifugation ni 6000 rpm fun awọn iṣẹju 30 ati lẹhinna ni 14000 rpm fun awọn iṣẹju 30 lati yọ awọn ipilẹ ti ko ni omi kuro.Awọn hydrolyzate ti a ki o si tunmọ si ni ifo aseto nipasẹ kan 0.22 mm àlẹmọ beaker.Hydrolyzate filtered ti wa ni ipamọ ni awọn igo aibikita ni 4 ° C. ati lẹhinna jẹ ipin lori erogba.
Onínọmbà ti akopọ ti awọn ayẹwo biomass ti o da lori jade ni ibamu si awọn ilana itupalẹ yàrá NREL: igbaradi ti awọn ayẹwo fun itupalẹ akopọ (NREL/TP-510-42620) ati ipinnu ti awọn carbohydrates igbekale ati lignin ni baomasi (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosaccharides onínọmbà ti ṣiṣan hydrolyzate ni a ṣe lori iwọn 2 milimita kan nipa lilo ọna hydrolysis acid-orisun autoclave.Illa ayẹwo hydrolyzate pẹlu 69.7 µl ti 72% sulfuric acid ni 10 milimita skru fila asa tube ati incubate fun 1 h lori ibujoko ni 121 °C, dara lori yinyin ati àlẹmọ sinu iṣẹ ṣiṣe giga chromatography (HPLC).Ifojusi ti oligosaccharides ni a pinnu nipasẹ iyokuro ifọkansi ti awọn monosaccharides ninu apẹẹrẹ ti kii-hydrolyzed lati inu ifọkansi suga lapapọ ninu apẹẹrẹ acid-hydrolyzed.
Glukosi, xylose, ati awọn ifọkansi arabinose ninu acid hydrolysed biomass ni a ṣe atupale nipa lilo eto Shimadzu HPLC ti o ni ipese pẹlu autosampler, igbona ọwọn, fifa isocratic, ati aṣawari atọka itọka lori iwe Bio-Rad Aminex HPX-87H.A ṣe itọju ọwọn naa ni 50 ° C ati pe o gbe jade pẹlu 0.6 milimita / min 5 mM H2SO4 ninu omi.sisan.
Awọn supernatant hydrolyzate ti fomi ati atupale fun monomer ati akoonu oligosaccharides.Awọn sugars Monomeric ti a gba lẹhin enzymatic hydrolysis ni a ṣe atupale nipasẹ HPLC ti o ni ipese pẹlu Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P iwe ati ọwọn ẹṣọ eeru.Iwọn otutu ọwọn ti wa ni itọju ni 80 ° C, omi ti a lo bi alakoso alagbeka pẹlu iwọn sisan ti 0.6 milimita / min.Oligosaccharides jẹ ipinnu nipasẹ hydrolysis ni dilute acid ni 121 ° C ni ibamu si awọn ọna ti a ṣalaye ninu awọn atunwo.41, 48, 49.
Ayẹwo saccharide ni a ṣe lori aise, AFEX ti a ti ṣe itọju tẹlẹ ati gbogbo awọn iṣẹku biomass ti kii-hydrolysed (pẹlu iṣelọpọ ti awọn iyọkuro odi sẹẹli ni tẹlentẹle ati ibojuwo mAb wọn) nipa lilo awọn ilana ti a ṣalaye tẹlẹ 27, 43, 50, 51.Fun itupalẹ glycome, awọn iṣẹku ti oti-inoluble ti ohun elo ogiri sẹẹli ọgbin ni a pese sile lati awọn iṣẹku biomass ati ti a tẹriba si isediwon ni tẹlentẹle pẹlu awọn reagents ibinu ti o pọ si bii ammonium oxalate (50 mM), carbonate sodium (50 mM ati 0.5% w / v), CON.(1M ati 4M, mejeeji pẹlu 1% w/v sodium borohydride) ati acid chlorite gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ52,53.Awọn ayokuro naa lẹhinna tẹriba si ELISA lodi si panẹli eka kan ti mAb50s ti o tọka si glycan ogiri sẹẹli, ati awọn aati abuda mAb ni a gbekalẹ bi maapu ooru.mAbs ti o fojusi odi glycan sẹẹli ọgbin ni a ra lati awọn akojopo yàrá (CCRC, JIM ati jara MAC).
Biotinylation-igbesẹ kan ti oligosaccharides.Isopọpọ ti awọn carbohydrates pẹlu biotin-LC-hydrazide ni a ṣe ni lilo ilana atẹle.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) ni tituka ni dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) nipasẹ gbigbọn ti o lagbara ati alapapo ni 65 ° C. fun 1 min.Glacial acetic acid (30 µl) ni a fi kun ati pe a da adalu naa sori iṣuu soda cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) ati tituka patapata lẹhin alapapo ni 65° C. fun bii iṣẹju 1.Lẹhinna, lati 5 si 8 μl ti adalu ifaseyin ti a fi kun si oligosaccharides ti o gbẹ (1-100 nmol) lati gba 10-agbo tabi diẹ ẹ sii molar excess ti aami lori opin idinku.Ihuwasi naa ni a ṣe ni 65 ° C fun wakati 2, lẹhin eyi awọn apẹẹrẹ ti di mimọ lẹsẹkẹsẹ.Ko si iṣuu soda cyanoborohydride ti a lo ninu awọn adanwo isamisi laisi idinku, ati awọn ayẹwo ni a ṣe ni 65 ° C. fun awọn wakati 2.5.
ELISA bo ati fifọ awọn ayẹwo ti oligosaccharides biotinylated.25 μl ti awọn ayẹwo biotinylated (100 μl ti ayẹwo ifọkansi kọọkan ti a fomi ni 5 milimita ti 0.1 M Tris buffer solution (TBS)) ni a fi kun si daradara kọọkan ti avidin-coated plate.Awọn kanga iṣakoso ni a bo pẹlu 50 μl ti biotin ni ifọkansi ti 10 μg / milimita ni 0.1 M TBS.Omi ti a fi omi ṣan silẹ ni a lo bi ibora fun awọn wiwọn òfo.Tabulẹti naa wa fun wakati 2 ni iwọn otutu yara ni dudu.Fọ awo naa ni igba mẹta pẹlu 0.1% wara ti a fi silẹ ni 0.1 M TBS nipa lilo eto No.11 fun Grenier alapin 3A.
Afikun ati fifọ awọn egboogi akọkọ.Fi 40 µl ti egboogi akọkọ si kanga kọọkan.Ṣe agbewọle microplate fun wakati 1 ni iwọn otutu yara ni dudu.Lẹhinna wẹ awọn awo naa ni igba mẹta pẹlu 0.1% wara ni 0.1M TBS ni lilo eto fifọ #11 fun Grenier Flat 3A.
Fi antibody elekeji si ki o wẹ.Fi 50 µl ti eku/eku egboogi elekeji (ti fomi 1:5000 ni 0.1% wara ni 0.1 M TBS) si kanga kọọkan.Ṣe agbewọle microplate fun wakati 1 ni iwọn otutu yara ni dudu.Lẹhinna wẹ awọn microplates naa ni igba 5 pẹlu 0.1% wara ni 0.1 M TBS ni lilo Grenier Flat 5A plate wash program #12.
Fifi kan sobusitireti.Fi 50 µl ti 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) si ipilẹ sobusitireti (nipa fifi 2 silė ti ifipamọ, 3 silė ti TMB, 2 silė ti hydrogen peroxide si 15 milimita ti omi deionized).Mura awọn TMB sobusitireti.ati vortex ṣaaju lilo).Ṣe agbewọle microplate ni iwọn otutu yara fun ọgbọn išẹju 30.Ninu okunkun.
Pari igbesẹ naa ki o ka tabulẹti naa.Ṣafikun 50 µl ti 1 N sulfuric acid si kanga kọọkan ki o ṣe igbasilẹ gbigba lati 450 si 655 nm ni lilo oluka ELISA kan.
Ṣetan awọn ojutu 1 mg / milimita ti awọn atupale wọnyi ni omi ti a ti sọ diionized: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (boṣewa ti inu).Awọn ipele meji ni a pese sile nipa fifi awọn ojutu suga 1 mg / mL ti o han ni Table 1. Awọn ayẹwo ti wa ni didi ati lyophilized ni -80 ° C. titi gbogbo omi yoo fi yọ kuro (nigbagbogbo nipa awọn wakati 12-18).
Ṣafikun 100-500 µg ti ayẹwo lati da awọn tubes fila lori iwọntunwọnsi itupalẹ.Ṣe igbasilẹ iye ti a ṣafikun.O dara julọ lati tu apẹẹrẹ ni ifọkansi kan pato ti epo ati fi kun si tube bi aliquot olomi.Lo 20 µl ti 1 mg/ml inositol gẹgẹbi idiwọn inu fun tube ayẹwo kọọkan.Awọn iye ti abẹnu bošewa fi kun si awọn ayẹwo gbọdọ jẹ kanna bi awọn iye ti abẹnu bošewa fi kun si awọn boṣewa tube.
Ṣafikun milimita 8 ti kẹmika anhydrous si vial fila dabaru kan.Lẹhinna 4 milimita ti 3 N. methanol HCl ojutu, capped ati gbigbọn.Ilana yii ko lo omi.
Ṣafikun 500 µl ti ojutu methanol 1 M HCl si awọn ayẹwo oligosaccharide ati awọn tubes TMS boṣewa.Awọn ayẹwo ti wa ni idabobo ni alẹ kan (wakati 168) ni 80 ° C. ni idina igbona.Gbẹ ọja methanolysis ni iwọn otutu yara nipa lilo ọpọlọpọ gbigbe.Fi 200 µl MeOH kun ati ki o gbẹ lẹẹkansi.Yi ilana ti wa ni tun lemeji.Fi 200 µl ti kẹmika, 100 µl ti pyridine ati 100 µl ti acetic anhydride sinu ayẹwo ati ki o dapọ daradara.Ṣe awọn ayẹwo ni iwọn otutu yara fun ọgbọn išẹju 30.ati ki o gbẹ.Fi 200 µl ti methanol kun ati ki o gbẹ lẹẹkansi.
Fi 200 µl ti Tri-Sil ati tube ti o ni ooru fun iṣẹju 20.80 ° C, lẹhinna tutu si iwọn otutu yara.Lo ọpọlọpọ gbigbe lati gbẹ ayẹwo siwaju si iwọn ti o to 50 µl.O ṣe pataki lati ṣe akiyesi pe a ko gba laaye awọn ayẹwo lati gbẹ patapata.
Fi 2 milimita ti hexane kun ati ki o dapọ daradara nipasẹ vortexing.Fọwọsi awọn imọran ti Pasteur pipettes (5-8 mm) pẹlu ẹyọ irun-agutan gilasi kan nipa fifi irun gilasi sii lori oke pipette 5-3 / 4 inch diamita.Awọn ayẹwo ni centrifuged ni 3000 g fun awọn iṣẹju 2.Eyikeyi insoluble iṣẹku ti wa ni precipitated.Gbẹ ayẹwo naa si 100-150 µl.Iwọn kan ti o to 1 μl ni a itasi sinu GC-MS ni iwọn otutu ibẹrẹ ti 80 °C ati akoko ibẹrẹ ti awọn iṣẹju 2.0 (Table 2).