Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Нове имунолошке и масене спектрометријске методе за комплексну анализу перзистентних олигосахарида у кукурузном зрну претходно третираном са AFEX. Лигноцелулозна биомаса је одржива алтернатива фосилним горивима и широко се користи за развој биотехнологија за производњу производа као што су храна, сточна храна, горива и хемикалије. Кључ ових технологија је развој исплативих процеса за претварање сложених угљених хидрата присутних у ћелијским зидовима биљака у једноставне шећере као што су глукоза, ксилоза и арабиноза. Пошто је лигноцелулозна биомаса веома тврдоглава, мора се подвргнути термохемијским третманима (нпр. ексфолијација амонијачних влакана (AFEX), разблажене киселине (DA), јонске течности (IL)) и биолошким третманима (нпр. ензимска хидролиза и микробна ферментација) у комбинацији да би се добио жељени производ. Међутим, када се комерцијални гљивични ензими користе у процесу хидролизе, само 75-85% формираних растворљивих шећера су моносахариди, а преосталих 15-25% су растворљиви, интрактабилни олигосахариди, који нису увек доступни микроорганизмима. Раније смо успешно изоловали и пречистили растворљиве тврдокорне олигосахариде користећи комбинацију сепарације угљеника и дијатомејске земље и хроматографије искључивања по величини, а такође смо истражили њихова инхибиторна својства према ензимима. Открили смо да су олигосахариди који садрже супституције метилисаних уронских киселина са вишим степеном полимеризације (ДП) тежи за обраду комерцијалним мешавинама ензима него олигосахариди са ниским ДП и неутрални олигосахариди. Овде извештавамо о употреби неколико додатних метода, укључујући профилисање гликана коришћењем моноклонских антитела (mAb) специфичних за гликане биљне биомасе за карактеризацију гликанских веза у ћелијским зидовима биљака и ензимским хидролизатима, јонизацију ласерском десорпцијом уз помоћ матрице, масен спектрометрију времена лета. MALDI-TOF-MS) користи структурно информативне дијагностичке пикове добијене спектроскопијом након секундарног распада негативних јона, гасну хроматографију и масену спектрометрију (GC-MS) за карактеризацију олигосахаридних веза са и без дериватизације. Због мале величине олигосахарида (ДП 4–20), ове молекуле је тешко користити за везивање и карактеризацију mAb. Да бисмо превазишли овај проблем, применили смо нову методу имобилизације олигосахарида засновану на конјугацији биотина која је успешно обележила већину олигосахарида растворљивих са ниским DP на површини микроплоче, што је затим коришћено у високопропусном mAb систему за специфичну анализу лигације. Ова нова метода ће олакшати развој напреднијих високопропусних гликомских тестова у будућности који се могу користити за изоловање и карактеризацију олигосахарида присутних у биомаркерима у дијагностичке сврхе.
Лигноцелулозна биомаса, састављена од пољопривредних, шумарских, травнатих и дрвенастих материјала, потенцијална је сировина за производњу био-базираних производа, укључујући храну, сточну храну, гориво и хемијске прекурсоре за производњу производа веће вредности1. Угљени хидрати (као што су целулоза и хемицелулоза) присутни у ћелијским зидовима биљака деполимеризују се у моносахариде хемијском обрадом и биотрансформацијом (као што су ензимска хидролиза и микробна ферментација). Уобичајени претходни третмани укључују експанзију амонијачних влакана (AFEX), разблажену киселину (DA), јонску течност (IL) и експлозију паре (SE), који користе комбинацију хемикалија и топлоте да би се смањила производња лигноцелулозе отварањем ћелијских зидова биљака3,4. тврдоглавост материје,5. Ензимска хидролиза се спроводи при високом оптерећењу чврстим материјама коришћењем комерцијалних ензима који садрже активне угљене хидрате (CAZymes) и микробне ферментације коришћењем трансгених квасаца или бактерија за производњу био-базираних горива и хемикалија6.
CAZyme-ови у комерцијалним ензимима састоје се од сложене мешавине ензима који синергистички цепају сложене везе угљених хидрата и шећера да би формирали моносахариде2,7. Као што смо раније известиле, сложена мрежа ароматичних полимера лигнина са угљеним хидратима чини их веома тешко обрадивим, што доводи до непотпуне конверзије шећера, акумулирајући 15-25% полних олигосахарида који се не производе током ензимске хидролизе претходно третиране биомасе. Ово је чест проблем код различитих метода претходне обраде биомасе. Неки од разлога за ово уско грло укључују инхибицију ензима током хидролизе или одсуство или ниске нивое есенцијалних есенцијалних ензима који су потребни за разбијање веза шећера у биљној биомаси. Разумевање састава и структурних карактеристика шећера, као што су везе шећера у олигосахаридима, помоћи ће нам да побољшамо конверзију шећера током хидролизе, чинећи биотехнолошке процесе исплативијим производима добијеним из нафте.
Одређивање структуре угљених хидрата је изазовно и захтева комбинацију метода као што су течна хроматографија (LC)11,12, нуклеарна магнетна резонантна спектроскопија (NMR)13, капиларна електрофореза (CE)14,15,16 и масена спектрометрија (MS)17. ,осамнаест. MS методе као што је масена спектрометрија времена лета са ласерском десорпцијом и јонизацијом коришћењем матрице (MALDI-TOF-MS) су свестрана метода за идентификацију структура угљених хидрата. Недавно се тандем MS адукта натријумових јона са дисоцијацијом индукованом колизијом (CID) најчешће користи за идентификацију отисака прстију који одговарају положајима везивања олигосахарида, аномерним конфигурацијама, секвенцама и положајима гранања 20, 21.
Анализа гликана је одличан алат за детаљну идентификацију угљених хидратних веза22. Ова метода користи моноклонска антитела (mAb) усмерена на гликан ћелијског зида биљака као сонде за разумевање сложених угљених хидратних веза. Више од 250 mAb је доступно широм света, дизајнираних против различитих линеарних и разгранатих олигосахарида коришћењем различитих сахарида24. Неколико mAb се широко користи за карактеризацију структуре, састава и модификација ћелијског зида биљака, јер постоје значајне разлике у зависности од типа биљне ћелије, органа, старости, фазе развоја и окружења раста25,26. У скорије време, ова метода се користи за разумевање популација везикула у биљним и животињским системима и њихових одговарајућих улога у транспорту гликана, одређеног субћелијским маркерима, фазама развоја или стимулусима из околине, и за одређивање ензимске активности. Неке од различитих структура гликана и ксилана које су идентификоване укључују пектин (P), ксилан (X), манан (M), ксилоглукане (XylG), глукане са мешовитим везама (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманан (GalG), глукуронску киселину-арабиноксилан (GArbX) и арабино-галактан (ArbG)29.
Међутим, упркос свим овим истраживачким напорима, само неколико студија се фокусирало на природу акумулације олигосахарида током хидролизе са високим оптерећењем чврстим материјама (HSL), укључујући ослобађање олигосахарида, промене дужине олигомерног ланца током хидролизе, различите полимере са ниским DP и њихове криве дистрибуције 30,31,32. У међувремену, иако се анализа гликана показала као користан алат за свеобухватну анализу структуре гликана, тешко је проценити олигосахариде са ниским DP растворљивим у води коришћењем метода антитела. Мањи DP олигосахариди са молекулском тежином мањом од 5-10 kDa се не везују за ELISA плоче 33, 34 и испирају се пре додавања антитела.
Овде, по први пут, демонстрирамо ELISA тест на плочама обложеним авидином користећи моноклонска антитела, комбинујући једностепени поступак биотинилације за растворљиве рефракторне олигосахариде са анализом гликома. Наш приступ анализи гликома је валидиран MALDI-TOF-MS и GC-MS анализом комплементарних олигосахаридних веза коришћењем триметилсилил (TMS) дериватизације хидролизованих шећерних композиција. Овај иновативни приступ може се развити као метода високог протока у будућности и пронаћи ширу примену у биомедицинским истраживањима35.
Посттранслационе модификације ензима и антитела, као што је гликозилација,36 утичу на њихову биолошку активност. На пример, промене у гликозилацији серумских протеина играју важну улогу у инфламаторном артритису, а промене у гликозилацији се користе као дијагностички маркери37. У литератури је објављено да се различити гликани лако појављују код разних болести, укључујући хроничне инфламаторне болести гастроинтестиналног тракта и јетре, вирусне инфекције, рак јајника, дојке и простате38,39,40. Разумевање структуре гликана коришћењем ELISA метода за гликане заснованих на антителима пружиће додатно поверење у дијагнози болести без употребе сложених MS метода.
Наша претходна студија је показала да тврдокорни олигосахариди остају нехидролизовани након претходне обраде и ензимске хидролизе (Слика 1). У нашем претходно објављеном раду, развили смо метод екстракције активним угљем у чврстој фази како бисмо изоловали олигосахариде из хидролизата кукурузне сланине (ACSH)8 претходно третираног AFEX-ом. Након почетне екстракције и раздвајања, олигосахариди су даље фракционисани помоћу хроматографије искључивања по величини (SEC) и сакупљени по редоследу молекулске тежине. Мономери и олигомери шећера ослобођени из различитих претходних третмана анализирани су анализом састава шећера. Приликом упоређивања садржаја олигомера шећера добијених различитим методама претходне обраде, присуство тврдокорних олигосахарида је чест проблем у конверзији биомасе у моносахариде и може довести до смањења приноса шећера за најмање 10-15%, па чак и до 18%. САД. Ова метода се користи за даљу производњу олигосахаридних фракција великих размера. Добијени ACH и његове накнадне фракције са различитим молекулским тежинама коришћене су као експериментални материјал за карактеризацију олигосахарида у овом раду.
Након претходне обраде и ензимске хидролизе, перзистентни олигосахариди су остали нехидролизовани. Овде (А) је метода раздвајања олигосахарида у којој се олигосахариди изолују из хидролизата кукурузних сланина претходно третираних AFEX-ом (ACSH) коришћењем слоја од активног угља и дијатомејске земље; (Б) Метода за раздвајање олигосахарида. Олигосахариди су даље раздвојени хроматографијом искључивања по величини (SEC); (Ц) Мономери и олигомери сахарида ослобођени из различитих претходних третмана (разблажена киселина: DA, јонска течност: IL и AFEX). Услови ензимске хидролизе: високо оптерећење чврстим материјама од 25% (w/w) (приближно 8% оптерећења глуканом), хидролиза од 96 сати, оптерећење комерцијалним ензимом од 20 мг/г (однос Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) и (Д) Мономери и олигомери шећера ослобођени из кукурузних сланина претходно третираних AFEX-ом (ACS).
Анализа гликана се показала као користан алат за свеобухватну структурну анализу гликана у екстрактима изолованим из остатака чврсте биомасе. Међутим, сахариди растворљиви у води су недовољно заступљени коришћењем ове традиционалне методе41 јер је олигосахариде мале молекулске тежине тешко имобилизовати на ELISA плочама и испирају се пре додавања антитела. Стога је за везивање и карактеризацију антитела коришћена једностепена метода биотинилације за облагање растворљивих, некомпатибилних олигосахарида на ELISA плочама обложеним авидином. Ова метода је тестирана коришћењем нашег претходно произведеног ACSH и фракције на основу њене молекулске тежине (или степена полимеризације, DP). Једностепена биотинилација је коришћена за повећање афинитета везивања олигосахарида додавањем биотин-LC-хидразида на редукујући крај угљених хидрата (Сл. 2). У раствору, хемиацетална група на редукујућем крају реагује са хидразидном групом биотин-LC-хидразида да би формирала хидразонску везу. У присуству редукујућег средства NaCNBH3, хидразонска веза се редукује до стабилног биотинилисаног крајњег производа. Модификацијом краја који редукује шећер, постало је могуће везивање олигосахарида са ниским ДП за ELISA плоче, а у нашој студији то је урађено на плочама обложеним авидином коришћењем моноклоналних антитела усмерених на гликан.
Скрининг моноклонских антитела заснован на ELISA тесту за биотинилисане олигосахариде. Овде (А) комбинована биотинилација олигосахарида и накнадни ELISA скрининг са моноклоналним антителима усмереним на гликан на плочама обложеним NeutrAvidin-ом и (Б) приказује једностепени поступак за биотинилацију реакционих производа.
Плоче обложене авидином са антителима конјугованим са олигосахаридом су затим додате примарним и секундарним антителима и испране у медијуму осетљивом на светлост и време. Након што је везивање антитела завршено, додајте ТМБ супстрат да бисте инкубирали плочу. Реакција је коначно заустављена сумпорном киселином. Инкубиране плоче су анализиране помоћу ELISA читача да би се одредила јачина везивања сваког антитела ради детекције умрежавања специфичног за антитело. За детаље и параметре експеримента, погледајте одговарајући одељак „Материјали и методе“.
Демонстрирамо корисност ове новоразвијене методе за специфичне примене карактеризацијом растворљивих олигосахарида присутних у ACSH, као и у сировим и пречишћеним фракцијама олигосахарида изолованим из лигноцелулозних хидролизата. Као што је приказано на слици 3, најчешћи епитоп-супституисани ксилани идентификовани у ACSH коришћењем метода биоацилираног гликома су обично уронски (U) или метилуронски (MeU) и пектински арабиногалактани. Већина њих је такође пронађена у нашој претходној студији о анализи гликана нехидролизованих чврстих материја (UHS)43.
Детекција рекалцитрантних олигосахаридних епитопа коришћењем моноклонског антитела усмереног на гликан ћелијског зида. „Неутрална“ фракција је ACN фракција, а „кисела“ фракција је FA фракција. Светлије црвене боје на топлотној мапи указују на већи садржај епитопа, а светлије плаве боје указују на празну позадину. Вредности боја на скали су засноване на сировим OD вредностима за формулације N=2. Главни епитопи које препознају антитела приказани су са десне стране.
Ове нецелулозне структуре нису могле да се цепају најчешћим целулазама и хемицелулазама у тестираној комерцијалној ензимској смеши, која укључује најчешће коришћене комерцијалне ензиме. Стога су за њихову хидролизу потребни нови помоћни ензими. Без неопходних нецелулозних помоћних ензима, ове нецелулозне везе спречавају потпуну конверзију у моносахариде, чак и ако се њихови матични шећерни полимери екстензивно хидролизују у краће фрагменте и растворе коришћењем комерцијалних ензимских смеша.
Даља студија дистрибуције сигнала и његове јачине везивања показала је да су епитопи везивања били нижи у фракцијама шећера са високим ДП (А, Б, Ц, ДП до 20+) него у фракцијама са ниским ДП (Д, Е, Ф, ДП) (у димерима) (Сл. 1). Киселински фрагменти су чешћи у нецелулозним епитопима него у неутралним фрагментима. Ови феномени су у складу са обрасцем примећеним у нашој претходној студији, где су високи ДП и кисели делови били отпорнији на ензимску хидролизу. Стога, присуство нецелулозних гликанских епитопа и U и MeU супституција може значајно допринети стабилности олигосахарида. Треба напоменути да ефикасност везивања и детекције може бити проблематична за олигосахариде са ниским ДП, посебно ако је епитоп димерни или тримерни олигосахарид. Ово се може тестирати коришћењем комерцијалних олигосахарида различитих дужина, од којих сваки садржи само један епитоп који се везује за специфично mAb.
Дакле, употреба структурно специфичних антитела открила је одређене типове отпорних веза. У зависности од врсте коришћеног антитела, одговарајућег обрасца лигације и јачине сигнала који производи (најзаступљенији и најмање заступљени), нови ензими могу се идентификовати и полуквантитативно додати у смешу ензима ради потпуније гликоконверзије. Узимајући анализу ACSH олигосахарида као пример, можемо креирати базу података гликанских веза за сваки материјал биомасе. Овде треба напоменути да треба узети у обзир различит афинитет антитела, а ако је њихов афинитет непознат, то ће створити одређене потешкоће при поређењу сигнала различитих антитела. Поред тога, поређење гликанских веза може најбоље функционисати између узорака за исто антитело. Ове тврдокорне везе се затим могу повезати са CAZyme базом података, из које можемо идентификовати ензиме, одабрати кандидате за ензиме и тестирати ензиме који кидају везе или развити микробне системе за експресију ових ензима за употребу у биорафинеријама44.
Да бисмо проценили како имунолошке методе допуњују алтернативне методе за карактеризацију олигосахарида мале молекулске тежине присутних у лигноцелулозним хидролизатима, извршили смо MALDI (Сл. 4, S1-S8) и анализу сахарида изведених из TMS-а на основу GC-MS на истом панелу (Сл. 5) олигосахаридног дела. MALDI се користи за поређење да ли се масена расподела молекула олигосахарида подудара са жељеном структуром. На слици 4 је приказана MS неутралних компоненти ACN-A и ACN-B. ACN-A анализа је потврдила низ пентозних шећера у распону од DP 4–8 (Сл. 4) до DP 22 (Сл. S1), чије тежине одговарају MeU-ксилан олигосахаридима. ACN-B анализа је потврдила серију пентозе и глукоксилана са DP 8-15. У додатном материјалу као што је слика S3, мапе расподеле масе киселих остатака FA-C показују низ (Me)U супституисаних пентозних шећера са DP од 8-15 који су у складу са супституисаним ксилaнима пронађеним у ELISA-базираној mAb скринингу. Епитопи су конзистентни.
MALDI-MS спектар растворљивих неусаглашених олигосахарида присутних у ACS. Овде су (A) ACN-A фракције ниског масеног опсега које садрже метиловану уронску киселину (DP 4-8) супституисане глукуроксилан олигосахариде и (B) ACN-B ксилан и метиловани уронски олигосахариди супституисани глукуроксиланом (DP 8-15).
Анализа састава гликанских остатака рефракторних олигосахарида. Овде (А) Састав ТМС сахарида различитих фракција олигосахарида добијених помоћу ГЦ-МС анализе. (Б) Структуре различитих шећера изведених из ТМС-а присутних у олигосахаридима. АЦН – фракција ацетонитрила која садржи неутралне олигосахариде и ФА – фракција ферулинске киселине која садржи киселе олигосахариде.
Још један занимљив закључак је извучен из LC-MS анализе олигосахаридне фракције, као што је приказано на слици S9 (методе се могу видети у електронском додатном материјалу). Фрагменти хексозних и -OAc група су више пута примећени током лигације ACN-B фракције. Ово откриће не само да потврђује фрагментацију примећену у гликому и MALDI-TOF анализи, већ пружа и нове информације о потенцијалним дериватима угљених хидрата у претходно третираној лигноцелулозној биомаси.
Такође смо извршили анализу састава гликана олигосахаридних фракција користећи ТМС дериватизацију гликана. Користећи ГЦ-МС, одредили смо састав неуралних (недериватних) и киселих шећера (ГлуА и ГалА) у олигосахаридној фракцији (Сл. 5). Глукуронска киселина се налази у киселим компонентама Ц и Д, док се галактуронска киселина налази у киселим компонентама А и Б, које су обе компоненте са високим ДП киселим шећерима. Ови резултати не само да потврђују наше ELISA и MALDI податке, већ су и у складу са нашим претходним студијама акумулације олигосахарида. Стога верујемо да су савремене имунолошке методе које користе биотинилацију олигосахарида и накнадни ELISA скрининг довољне за детекцију растворљивих рекалцитрантних олигосахарида у различитим биолошким узорцима.
Пошто су методе скрининга моноклонских антитела засноване на ELISA тесту валидиране помоћу неколико различитих метода, желели смо да даље истражимо потенцијал ове нове квантитативне методе. Два комерцијална олигосахарида, ксилохексасахарид олигосахарид (XHE) и 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX), купљена су и тестирана коришћењем новог приступа моноклонским антителима који циљају гликан ћелијског зида. Слика 6 приказује линеарну корелацију између сигнала биотинилисаног везивања и логаритамске концентрације олигосахарида, што сугерише могући модел Лангмуирове адсорпције. Међу моноклонским антителима, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 и CCRC-M151 су корелирали са XHE, а CCRC-M108, CCRC-M109 и LM11 су корелирали са A2XX у опсегу од 1 nm до 100 nano. Због ограничене доступности антитела током експеримента, ограничени експерименти су изведени са сваком концентрацијом олигосахарида. Овде треба напоменути да нека антитела реагују веома различито на исти олигосахарид као супстрат, вероватно зато што се везују за мало другачије епитопе и могу имати веома различите афинитете везивања. Механизми и импликације тачне идентификације епитопа биће много сложенији када се нови приступ моноклоналним антителима примени на стварне узорке.
Два комерцијална олигосахарида су коришћена за одређивање опсега детекције различитих моноклонских антитела (mAb) која циљају гликан. Овде, линеарне корелације са логаритамском концентрацијом олигосахарида указују на Лангмирове обрасце адсорпције за (A) XHE са mAb и (B) A2XX са mAb. Одговарајући епитопи указују на структуре комерцијалних олигосахарида који се користе као супстрати у тесту.
Употреба моноклонских антитела усмерених на гликан (гликокомска анализа или ELISA-базирани мАб скрининг) је моћан алат за детаљну карактеризацију већине главних гликана ћелијског зида који чине биљну биомасу. Међутим, класична анализа гликана карактерише само веће гликане ћелијског зида, јер већина олигосахарида није ефикасно имобилизована на ELISA плочама. У овој студији, кукурузни строб претходно третиран AFEX-ом је ензимски хидролизован при високом садржају чврстих материја. Анализа шећера је коришћена за одређивање састава отпорних угљених хидрата ћелијског зида у хидролизату. Међутим, мАб анализа мањих олигосахарида у хидролизатима је потцењена и потребни су додатни алати за ефикасну имобилизацију олигосахарида на ELISA плочама.
Овде извештавамо о новој и ефикасној методи имобилизације олигосахарида за скрининг моноклонских антитела комбиновањем биотинилације олигосахарида праћене ELISA скринингом на плочама обложеним NeutrAvidin™. Имобилизовани биотиниловани олигосахариди показали су довољан афинитет за антитело да би омогућили брзу и ефикасну детекцију отпорних олигосахарида. Анализа састава ових тврдокорних олигосахарида заснована на масеној спектрометрији потврдила је резултате овог новог приступа имуноскринингу. Стога, ове студије показују да се комбинација биотинилације олигосахарида и ELISA скрининга са моноклонским антителима усмереним на гликан може користити за детекцију унакрсних веза у олигосахаридима и може се широко примењивати у другим биохемијским студијама које карактеришу структуру олигосахарида.
Ова метода профилисања гликана заснована на биотину је први извештај који је способан да истражи отпорне везе угљених хидрата растворљивих олигосахарида у биљној биомаси. Ово помаже да се разуме зашто су неки делови биомасе толико тврдоглави када је у питању производња биогорива. Ова метода попуњава важну празнину у методама анализе гликома и проширује њену примену на шири спектар супстрата поред биљних олигосахарида. У будућности, можда ћемо користити роботику за биотинилацију и користити методу коју смо развили за високопропусну анализу узорака помоћу ELISA теста.
Кукурузна слама (CS) узгајана из хибридног семена Pioneer 33A14 убрана је 2010. године са фарме Kramer у Реју, Колорадо. Уз дозволу власника земљишта, ова биомаса се може користити за истраживање. Узорци су чувани суви < 6% влажности у кесама са затварачем на собној температури. Узорци су чувани суви < 6% влажности у кесама са затварачем на собној температури. Образци хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкој-молниеј при комнатној температури. Узорци су чувани суви на влажности <6% у кесама са затварачем на собној температури.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образци хранат в пакетах с застежкој-молниеј при комнатној температури с влажностьу < 6%. Узорци се чувају у кесама са затварачем на собној температури са влажношћу < 6%.Студија је била у складу са локалним и националним смерницама. Анализа састава је спроведена коришћењем NREL протокола. Утврђено је да састав садржи 31,4% глукана, 18,7% ксилана, 3,3% арабинана, 1,2% галактана, 2,2% ацетила, 14,3% лигнина, 1,7% протеина и 13,4% пепела.
Cellic® CTec2 (138 мг протеина/мл, серија VCNI 0001) је комплексна мешавина целулазе, β-глукозидазе и Cellic® HTec2 (157 мг протеина/мл, серија VHN00001) од Novozymes (Франклинтон, Северна Каролина, САД). Multifect Pectinase® (72 мг протеина/мл), комплексна мешавина ензима за разградњу пектина, донирала је компанија DuPont Industrial Biosciences (Пало Алто, Калифорнија, САД). Концентрације ензимских протеина одређене су проценом садржаја протеина (и одузимањем доприноса непротеинског азота) коришћењем Кјелдалове анализе азота (AOAC метода 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Итака, Њујорк, САД). Дијатомејска земља 545 је купљена од EMD Millipore (Билерика, Масачусетс). Активни угаљ (DARCO, грануле величине 100 mesh), Avicel (PH-101), буков ксилан и све остале хемикалије су купљене од Sigma-Aldrich (Сент Луис, Мисури).
Претходна обрада AFEX-ом је спроведена у GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, САД). Претходна обрада је спроведена на 140°C током 15 минута. Време задржавања је 46 минута при односу 1:1 безводног амонијака и биомасе при утовару од 60% (w/w) у столном реактору од нерђајућег челика (Parr Instruments Company). Трајало је 30 минута. Реактор је загрејан на 140°C и амонијак је брзо ослобођен, омогућавајући биомаси да се брзо врати на собну температуру. Састав претходно третиране AFEX кукурузне сланине (ACS) био је сличан саставу нетретиране кукурузне сланине (UT-CS).
АЦСХ са високим садржајем чврстих материја 25% (w/w) (приближно 8% декстрана) је припремљен као почетни материјал за производњу олигосахарида у великим размерама. Ензимска хидролиза АЦС је извршена коришћењем комерцијалне мешавине ензима, укључујући Cellic® Ctec2 10 мг протеина/г глукана (у претходно третираној биомаси), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг протеина/г глукана и Multifect Pectinase (Genencor Inc, САД). ). ), 5 мг протеина/г декстрана. Ензимска хидролиза је спроведена у биореактору од 5 литара са радном запремином од 3 литра, pH 4,8, 50°C и 250 обртаја у минути. Након хидролизе током 96 сати, хидролизат је сакупљен центрифугирањем на 6000 обртаја у минути током 30 минута, а затим на 14000 обртаја у минути током 30 минута да би се уклониле нехидролизоване чврсте материје. Хидролизат је затим подвргнут стерилној филтрацији кроз филтерску чашу од 0,22 mm. Филтрирани хидролизат је чуван у стерилним боцама на 4°C, а затим фракционисан на активатору.
Анализа састава узорака биомасе на бази екстракта према лабораторијским процедурама анализе NREL-а: припрема узорака за анализу састава (NREL/TP-510-42620) и одређивање структурних угљених хидрата и лигнина у биомаси (NREL/TP-510 – 42618)47.
Анализа олигосахарида из хидролизатног тока је спроведена на скали од 2 мл коришћењем методе киселинске хидролизе засноване на аутоклаву. Узорак хидролизата помешати са 69,7 µl 72% сумпорне киселине у епрувети за култивацију од 10 мл са затварачем на завртање и инкубирати 1 сат на радном столу на 121 °C, охладити на леду и филтрирати у бочицу за високоефикасну течну хроматографију (HPLC). Концентрација олигосахарида је одређена одузимањем концентрације моносахарида у нехидролизованом узорку од укупне концентрације шећера у киселински хидролизованом узорку.
Концентрације глукозе, ксилозе и арабинозе у киселински хидролизованој биомаси анализиране су коришћењем Shimadzu HPLC система опремљеног аутоматским узорковачем, грејачем колоне, изократском пумпом и детектором индекса преламања на Bio-Rad Aminex HPX-87H колони. Колона је одржавана на 50°C и елуирана протоком 5 mM H2SO4 у води од 0,6 ml/min.
Супернатант хидролизата је разблажен и анализиран на садржај мономера и олигосахарида. Мономерни шећери добијени након ензимске хидролизе анализирани су HPLC-ом опремљеном Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P колоном и колоном за заштиту од пепела. Температура колоне је одржавана на 80°C, вода је коришћена као мобилна фаза са брзином протока од 0,6 ml/min. Олигосахариди су одређени хидролизом у разблаженој киселини на 121°C према методама описаним у реф. 41, 48, 49.
Анализа сахарида је спроведена на сировим, AFEX-ом претходно третираним и свим нехидролизованим остацима биомасе (укључујући производњу серијских екстраката ћелијског зида и њихов скрининг mAb) коришћењем претходно описаних поступака 27, 43, 50, 51. За анализу гликома, остаци материјала биљних ћелијских зидова нерастворљиви у алкохолу припремају се из остатака биомасе и подвргавају се серијској екстракцији са све агресивнијим реагенсима као што су амонијум оксалат (50 mM), натријум карбонат (50 mM и 0,5% w/v), CON. (1M и 4M, оба са 1% w/v натријум борохидрида) и кисели хлорит као што је претходно описано 52,53. Екстракти су затим подвргнути ELISA тесту против комплексног панела mAb50 усмерених на гликан ћелијског зида, а реакције везивања mAb су представљене као топлотна мапа. mAb који циљају гликан биљног ћелијског зида су купљени из лабораторијских залиха (CCRC, JIM и MAC серије).
Једностепена биотинилација олигосахарида. Коњугација угљених хидрата са биотин-ЛЦ-хидразидом извршена је коришћењем следећег поступка. Биотин-ЛЦ-хидразид (4,6 мг/12 μмол) је растворен у диметил сулфоксиду (ДМСО, 70 μмол) уз снажно мешање и загревање на 65°C током 1 минута. Додата је ледена сирћетна киселина (30 μмол) и смеша је сипана преко натријум цијаноборохидрида (6,4 мг/100 μмол) и потпуно растворена након загревања на 65°C током око 1 минута. Затим је од 5 до 8 μл реакционе смеше додато у осушени олигосахарид (1-100 нмол) да би се добио моларни вишак марке од 10 или више пута у односу на редукујући крај. Реакција је спроведена на 65°C током 2 сата, након чега су узорци одмах пречишћени. У експериментима обележавања без редукције није коришћен натријум цијаноборохидрид, а узорци су реаговали на 65°C током 2,5 сата.
ELISA премаз и испирање узорака биотинилисаних олигосахарида. 25 μl биотинилисаних узорака (100 μl сваког концентрованог узорка разблаженог у 5 ml 0,1 M Tris пуферског раствора (TBS)) додато је у сваки бунар плоче обложене авидином. Контролни бунарчићи су обложени са 50 μl биотина у концентрацији од 10 μg/ml у 0,1 M TBS. Дејонизована вода је коришћена као премаз за мерења у слепим пробама. Таблета је инкубирана 2 сата на собној температури у мраку. Плочу испрати 3 пута са 0,1% обраног млека у 0,1 M TBS користећи програм бр. 11 за Grenier flat 3A.
Додавање и испирање примарних антитела. Додати 40 µl примарног антитела у сваки бунар. Инкубирати микроплочу 1 сат на собној температури у мраку. Плоче су затим испране 3 пута са 0,1% млека у 0,1M TBS користећи програм прања #11 за Grenier Flat 3A.
Додати секундарно антитело и испрати. Додати 50 µl секундарног антитела миша/пацова (разблаженог 1:5000 у 0,1% млеку у 0,1 M TBS) у сваки бунар. Инкубирати микроплочу 1 сат на собној температури у мраку. Микроплоче су затим испране 5 пута са 0,1% млека у 0,1 M TBS користећи програм за прање плоча Grenier Flat 5A #12.
Додавање супстрата. Додати 50 µl 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина (TMB) основном супстрату (додавањем 2 капи пуфера, 3 капи TMB-а, 2 капи водоник-пероксида у 15 ml дејонизоване воде). Припремити TMB супстрат и промешати пре употребе. Инкубирати микроплочу на собној температури 30 минута. У мраку.
Завршите корак и очитајте таблету. Додајте 50 µl 1 N сумпорне киселине у сваку јажицу и забележите апсорбанцију од 450 до 655 nm користећи ELISA читач.
Припремити растворе од 1 мг/мл ових аналита у дејонизованој води: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактуронска киселина (GalA), глукуронска киселина (GlcA), маноза, глукоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманозамин (manNAc), N-ацетилглукозамин (glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (интерни стандард). Два стандарда су припремљена додавањем раствора шећера од 1 мг/мл приказаних у Табели 1. Узорци су замрзнути и лиофилизовани на -80°C док се не уклони сва вода (обично око 12-18 сати).
Додати 100–500 µг узорка у епрувете са затварачем на завртању на аналитичкој ваги. Забележити додату количину. Најбоље је растворити узорак у одређеној концентрацији растварача и додати га у епрувету као течни аликвот. Користите 20 µл инозитола концентрације 1 мг/мл као интерни стандард за сваку епрувету са узорком. Количина интерног стандарда додатог узорку мора бити иста као количина интерног стандарда додатог у стандардну епрувету.
Додати 8 мл безводног метанола у бочицу са затварачем на завртање. Затим додати 4 мл 3 N метанолног раствора HCl, затворити и промућкати. Овај поступак не користи воду.
Додати 500 µl 1 M раствора HCl метанола у узорке олигосахарида и стандардне TMS епрувете. Узорци су инкубирани преко ноћи (168 сати) на 80°C у термалном блоку. Осушити производ метанолизе на собној температури користећи разводник за сушење. Додати 200 µl MeOH и поново осушити. Овај поступак се понавља два пута. Додати 200 µl метанола, 100 µl пиридина и 100 µl анхидрида сирћетне киселине у узорак и добро промешати. Инкубирати узорке на собној температури 30 минута. Додати 200 µl метанола и поново осушити.
Додати 200 µl Tri-Sil-а и загревати затворену епрувету 20 минута. 80°C, затим охладити на собну температуру. Користите сушач за даље сушење узорка до запремине од приближно 50 µl. Важно је напоменути да нисмо дозволили да се узорци потпуно осуше.
Додати 2 мл хексана и добро промешати вортексом. Напунити врхове Пастерових пипета (5-8 мм) комадом стаклене вуне уметањем стаклене вуне на врх пипете пречника 5-3/4 инча. Узорци су центрифугирани на 3000 г током 2 минута. Сви нерастворљиви остаци су таложени. Осушити узорак на 100-150 µl. Запремина од приближно 1 μl је убризгана у GC-MS на почетној температури од 80 °C и почетном времену од 2,0 минута (Табела 2).