Nature.com သို့ ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုသည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။ သင်အသုံးပြုနေသော browser ဗားရှင်းတွင် CSS ပံ့ပိုးမှု အကန့်အသတ်ရှိသည်။ အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသော browser ကို အသုံးပြုရန် (သို့မဟုတ် Internet Explorer ရှိ Compatibility Mode ကို ပိတ်ရန်) အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ထိုအတောအတွင်း၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုရရှိစေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆိုက်ကို styles နှင့် JavaScript မပါဘဲ render လုပ်ပါမည်။
AFEX ဖြင့် ကြိုတင်ကုသထားသော ပြောင်းဖူးပင်တွင် persistent oligosaccharides များကို ရှုပ်ထွေးစွာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် immunological နှင့် mass spectrometric နည်းလမ်းအသစ်များ။ Lignocellulosic biomass သည် ရုပ်ကြွင်းလောင်စာများအတွက် ရေရှည်တည်တံ့သော အစားထိုးနည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်ပြီး အစားအစာ၊ တိရစ္ဆာန်အစာ၊ လောင်စာနှင့် ဓာတုပစ္စည်းများကဲ့သို့သော ထုတ်ကုန်များ ထုတ်လုပ်ရန်အတွက် ဇီဝနည်းပညာများ တီထွင်ရာတွင် တွင်ကျယ်စွာ အသုံးပြုကြသည်။ ဤနည်းပညာများ၏ အဓိကသော့ချက်မှာ အပင်ဆဲလ်နံရံများတွင်ရှိသော ရှုပ်ထွေးသော ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်များကို glucose၊ xylose နှင့် arabinose ကဲ့သို့သော ရိုးရှင်းသော သကြားဓာတ်များအဖြစ် ပြောင်းလဲရန်အတွက် ကုန်ကျစရိတ်-ယှဉ်ပြိုင်နိုင်သော လုပ်ငန်းစဉ်များ တီထွင်ခြင်းဖြစ်သည်။ lignocellulosic biomass သည် အလွန်ခေါင်းမာသောကြောင့်၊ လိုချင်သော ထုတ်ကုန်ရရှိရန် အပူဓာတုကုသမှုများ (ဥပမာ၊ အမိုးနီးယားအမျှင် exfoliation (AFEX)၊ dilute acids (DA)၊ ionic liquids (IL)) နှင့် ဇီဝဗေဒကုသမှုများ (ဥပမာ၊ enzymatic hydrolysis နှင့် microbial fermentation) တို့ကို ပေါင်းစပ်ရမည်ဖြစ်သည်။ သို့သော်၊ hydrolysis လုပ်ငန်းစဉ်တွင် စီးပွားဖြစ် မှိုအင်ဇိုင်းများကို အသုံးပြုသောအခါ၊ ဖွဲ့စည်းထားသော ပျော်ဝင်နိုင်သော သကြားဓာတ်၏ 75-85% သာ monosaccharides များဖြစ်ပြီး ကျန် 15-25% မှာ microorganisms များအတွက် အမြဲတမ်းရရှိနိုင်ခြင်းမရှိသော ပျော်ဝင်နိုင်သော၊ မဖြေရှင်းနိုင်သော oligosaccharides များဖြစ်သည်။ ယခင်က ကျွန်ုပ်တို့သည် ကာဗွန်နှင့် diatomaceous earth ခွဲခြားခြင်းနှင့် size exclusion chromatography ပေါင်းစပ်မှုကို အသုံးပြု၍ ပျော်ဝင်နိုင်သော stubborn oligosaccharides များကို အောင်မြင်စွာ ခွဲထုတ်သန့်စင်ခဲ့ပြီး ၎င်းတို့၏ enzyme inhibitory properties များကိုလည်း စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ polymerization (DP) methylated uronic acid substitutions မြင့်မားသော oligosaccharides များသည် DP နိမ့်သောနှင့် neutral oligosaccharides များထက် စီးပွားဖြစ် enzyme blends များဖြင့် လုပ်ဆောင်ရန် ပိုမိုခက်ခဲကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပါသည်။ ဤနေရာတွင် အပင်ဆဲလ်နံရံများနှင့် enzymatic hydrolysates ရှိ glycan bonds များကို သွင်ပြင်လက္ခဏာဖော်ထုတ်ရန် အပင်ဇီဝဒြပ်ထု glycans အတွက် သီးသန့် monoclonal antibodies (mAbs) ကိုအသုံးပြု၍ glycan profiling၊ matrix-assisted laser desorption ionization၊ time-of-flight mass-spectrometry အပါအဝင် အပိုဆောင်းနည်းလမ်းများစွာကို အသုံးပြုမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ အစီရင်ခံပါသည်။ . MALDI-TOF-MS) သည် negative ions များ၏ secondary decay ပြီးနောက် spectroscopy မှရရှိသော structure-informative diagnostic peaks၊ gas chromatography နှင့် mass spectrometry (GC-MS) ကိုအသုံးပြု၍ derivatization နှင့်အတူနှင့်မပါဘဲ oligosaccharide bonds များကို သွင်ပြင်လက္ခဏာဖော်ထုတ်ရန် အသုံးပြုပါသည်။ oligosaccharides (DP 4–20) ၏ အရွယ်အစားသေးငယ်မှုကြောင့် ဤမော်လီကျူးများသည် mAb ချိတ်ဆက်မှုနှင့် လက္ခဏာရပ်ဖော်ထုတ်မှုအတွက် အသုံးပြုရန် ခက်ခဲပါသည်။ ဤပြဿနာကို ကျော်လွှားရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် microplate မျက်နှာပြင်ပေါ်တွင် DP နည်းသော ပျော်ဝင်နိုင်သော oligosaccharides အများစုကို အောင်မြင်စွာ အညွှန်းတပ်နိုင်သည့် biotin conjugation-based oligosaccharide immobilization နည်းလမ်းအသစ်ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး၊ ၎င်းကို သီးခြား ligation analysis အတွက် throughput မြင့်မားသော mAb စနစ်တွင် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဤနည်းလမ်းအသစ်သည် အနာဂတ်တွင် ရောဂါရှာဖွေရေး ရည်ရွယ်ချက်များအတွက် biomarkers များတွင်ရှိသော oligosaccharides များကို ခွဲထုတ်ပြီး လက္ခဏာရပ်ဖော်ထုတ်ရန် အသုံးပြုနိုင်သည့် ပိုမိုအဆင့်မြင့်သော throughput မြင့်မားသော glycome assays များ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကို အထောက်အကူပြုလိမ့်မည်။
စိုက်ပျိုးရေး၊ သစ်တော၊ မြက်ခင်းနှင့် သစ်သားပစ္စည်းများဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော Lignocellulosic ဇီဝလောင်စာသည် အစားအစာ၊ တိရစ္ဆာန်အစာ၊ လောင်စာနှင့် ဓာတုဗေဒ ရှေ့ပြေးပစ္စည်းများ အပါအဝင် ဇီဝအခြေခံ ထုတ်ကုန်များ ထုတ်လုပ်ရန်အတွက် အလားအလာရှိသော ကုန်ကြမ်းပစ္စည်းတစ်ခုဖြစ်ပြီး တန်ဖိုးမြင့် ထုတ်ကုန်များ ထုတ်လုပ်ရန်ဖြစ်သည်။၁။ အပင်ဆဲလ်နံရံများတွင် ရှိသော ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်များ (ဆဲလ်လူလို့စ်နှင့် ဟီမီဆယ်လူလို့စ် ကဲ့သို့သော) ကို ဓာတုဗေဒ လုပ်ငန်းစဉ်နှင့် ဇီဝပြောင်းလဲမှုများ (အင်ဇိုင်းဖြင့် ရေဓာတ်ပြိုကွဲခြင်းနှင့် အဏုဇီဝ အချဉ်ဖောက်ခြင်းကဲ့သို့) ဖြင့် monosaccharides အဖြစ်သို့ depolymerized လုပ်သည်။ အဖြစ်များသော ကြိုတင်ကုသမှုများတွင် အမိုးနီးယားအမျှင် ချဲ့ထွင်ခြင်း (AFEX)၊ ပျော့ပျောင်းသော အက်ဆစ် (DA)၊ အိုင်းယွန်းနစ် အရည် (IL) နှင့် ရေနွေးငွေ့ ပေါက်ကွဲမှု (SE) တို့ ပါဝင်ပြီး ၎င်းတို့သည် အပင်ဆဲလ်နံရံများကို ဖွင့်ခြင်းဖြင့် လစ်ဂနိုဆယ်လူလို့စ် ထုတ်လုပ်မှုကို လျှော့ချရန် ဓာတုပစ္စည်းများနှင့် အပူပေါင်းစပ်အသုံးပြုသည်။၃၊၄။ အရာဝတ္ထု၏ မာကျောမှု၊ ၅။ အင်ဇိုင်းဖြင့် ရေဓာတ်ပြိုကွဲခြင်းကို စီးပွားဖြစ် တက်ကြွသော ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်ပါဝင်သော အင်ဇိုင်းများ (CAZymes) ကို အသုံးပြု၍ မြင့်မားသော အစိုင်အခဲဝန်တွင် ပြုလုပ်ပြီး ဇီဝအခြေခံ လောင်စာများနှင့် ဓာတုပစ္စည်းများ ထုတ်လုပ်ရန် transgenic yeasts သို့မဟုတ် ဘက်တီးရီးယားများကို အသုံးပြု၍ အဏုဇီဝ အချဉ်ဖောက်ခြင်း ၆။
စီးပွားဖြစ်အင်ဇိုင်းများရှိ CAZymes များသည် ရှုပ်ထွေးသောကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်-သကြားချည်နှောင်မှုများကို monosaccharides2,7 ဖွဲ့စည်းရန် ပေါင်းစပ်ဖြတ်တောက်သည့် အင်ဇိုင်းများ၏ ရှုပ်ထွေးသောရောစပ်မှုဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသည်။ ကျွန်ုပ်တို့အစောပိုင်းက ဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း၊ လီနင်နှင့် ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်၏ အမွှေးနံ့သာပိုလီမာများ၏ ရှုပ်ထွေးသောကွန်ရက်သည် ၎င်းတို့ကို အလွန်ခက်ခဲစေပြီး၊ သကြားပြောင်းလဲမှုမပြီးပြတ်ဘဲ၊ ကြိုတင်ကုသထားသော ဇီဝဒြပ်ထု၏ အင်ဇိုင်းဖြင့် ရေဓာတ်ပြိုကွဲခြင်းအတွင်း မထုတ်လုပ်သော လိင်အိုလီဂိုဆာကရိုက် ၁၅-၂၅% စုဆောင်းမိစေသည်။ ၎င်းသည် ဇီဝဒြပ်ထုကြိုတင်ကုသနည်းအမျိုးမျိုးတွင် အဖြစ်များသောပြဿနာတစ်ခုဖြစ်သည်။ ဤပိတ်ဆို့မှုအတွက် အကြောင်းရင်းအချို့မှာ ရေဓာတ်ပြိုကွဲခြင်းအတွင်း အင်ဇိုင်းတားဆီးခြင်း သို့မဟုတ် အပင်ဇီဝဒြပ်ထုတွင် သကြားချည်နှောင်မှုများကို ချိုးဖျက်ရန် လိုအပ်သော မရှိမဖြစ်လိုအပ်သော အင်ဇိုင်းများ မရှိခြင်း သို့မဟုတ် နည်းပါးခြင်းတို့ ပါဝင်သည်။ အိုလီဂိုဆာကရိုက်များရှိ သကြားချည်နှောင်မှုများကဲ့သို့သော သကြားများ၏ ပါဝင်မှုနှင့် ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ဝိသေသလက္ခဏာများကို နားလည်ခြင်းသည် ရေဓာတ်ပြိုကွဲခြင်းအတွင်း သကြားပြောင်းလဲမှုကို တိုးတက်ကောင်းမွန်စေရန် ကျွန်ုပ်တို့အား ကူညီပေးမည်ဖြစ်ပြီး၊ ဇီဝနည်းပညာလုပ်ငန်းစဉ်များကို ရေနံမှရရှိသော ထုတ်ကုန်များနှင့် ကုန်ကျစရိတ်သက်သာစွာ ယှဉ်ပြိုင်နိုင်စေမည်ဖြစ်သည်။
ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်၏ဖွဲ့စည်းပုံကို ဆုံးဖြတ်ခြင်းသည် စိန်ခေါ်မှုတစ်ရပ်ဖြစ်ပြီး liquid chromatography (LC)11,12၊ nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)13၊ capillary electrophoresis (CE)14,15,16 နှင့် mass spectrometry (MS)17 ကဲ့သို့သော နည်းလမ်းများပေါင်းစပ်ရန် လိုအပ်ပါသည်။ ဆယ့်ရှစ်။ matrix (MALDI-TOF-MS) ကိုအသုံးပြု၍ laser desorption နှင့် ionization ပါဝင်သော time-of-flight mass spectrometry ကဲ့သို့သော MS နည်းလမ်းများသည် ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်ဖွဲ့စည်းပုံများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန်အတွက် စွယ်စုံသုံးနည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။ မကြာသေးမီက ဆိုဒီယမ်အိုင်းယွန်း adducts များ၏ Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS ကို oligosaccharide attachment positions၊ anomeric configuration များ၊ sequences များနှင့် branching positions များနှင့် ကိုက်ညီသော လက်ဗွေရာများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်အသုံးပြုခဲ့ကြသည်။
Glycan ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်နှောင်ကြိုးများကို နက်နက်ရှိုင်းရှိုင်း ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန်အတွက် အလွန်ကောင်းမွန်သောကိရိယာတစ်ခုဖြစ်သည်။ ဤနည်းလမ်းသည် ရှုပ်ထွေးသော ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်ဆက်စပ်မှုများကို နားလည်ရန် အပင်ဆဲလ်နံရံ glycan သို့ ဦးတည်သော monoclonal antibodies (mAbs) များကို စမ်းသပ်ကိရိယာများအဖြစ် အသုံးပြုသည်။ ကမ္ဘာတစ်ဝှမ်းတွင် mAbs ၂၅၀ ကျော် ရရှိနိုင်ပြီး saccharides အမျိုးမျိုးကို အသုံးပြု၍ linear နှင့် branched oligosaccharides အမျိုးမျိုးနှင့် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသည်24။ အပင်ဆဲလ်အမျိုးအစား၊ အင်္ဂါ၊ အသက်၊ ဖွံ့ဖြိုးမှုအဆင့်နှင့် ကြီးထွားမှုပတ်ဝန်းကျင်ပေါ် မူတည်၍ သိသာထင်ရှားသော ကွဲပြားမှုများရှိသောကြောင့် အပင်ဆဲလ်နံရံ၏ဖွဲ့စည်းပုံ၊ ပါဝင်မှုနှင့် ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများကို ဖော်ပြရန် mAbs အများအပြားကို ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် အသုံးပြုခဲ့ကြသည်။ မကြာသေးမီက ဤနည်းလမ်းကို အပင်နှင့် တိရစ္ဆာန်စနစ်များရှိ vesicle လူဦးရေနှင့် subcellular markers၊ ဖွံ့ဖြိုးမှုအဆင့်များ သို့မဟုတ် ပတ်ဝန်းကျင်လှုံ့ဆော်မှုများဖြင့် ဆုံးဖြတ်သည့်အတိုင်း glycan သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးတွင် ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာအခန်းကဏ္ဍများကို နားလည်ရန်နှင့် အင်ဇိုင်းလှုပ်ရှားမှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဖော်ထုတ်နိုင်ခဲ့ပြီးသော glycans နှင့် xylans ၏ ကွဲပြားသောဖွဲ့စည်းပုံအချို့တွင် pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), mixed bond glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) နှင့် arabino-galactan (ArbG)29 တို့ ပါဝင်သည်။
သို့သော်၊ ဤသုတေသနကြိုးပမ်းအားထုတ်မှုအားလုံးရှိနေသော်လည်း၊ oligosaccharide ထုတ်လွှတ်မှု၊ hydrolysis အတွင်း oligomeric chain length ပြောင်းလဲမှုများ၊ အမျိုးမျိုးသော low DP polymers များနှင့် ၎င်းတို့၏ curves များအပါအဝင် မြင့်မားသော solids load (HSL) hydrolysis အတွင်း oligosaccharide စုဆောင်းမှု၏ သဘောသဘာဝကို အာရုံစိုက်ထားသည့် လေ့လာမှုအနည်းငယ်သာရှိသည်။ ဖြန့်ဖြူးမှု ၃၀၊ ၃၁၊ ၃၂။ တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ glycan ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် glycan ဖွဲ့စည်းပုံ၏ ပြည့်စုံသော ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အသုံးဝင်သောကိရိယာတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း သက်သေပြခဲ့သော်လည်း၊ antibody နည်းလမ်းများကို အသုံးပြု၍ ရေတွင်ပျော်ဝင်နိုင်သော low DP oligosaccharides များကို အကဲဖြတ်ရန် ခက်ခဲပါသည်။ 5-10 kDa အောက် မော်လီကျူးအလေးချိန်ရှိသော သေးငယ်သော DP oligosaccharides များသည် ELISA ပြား ၃၃၊ ၃၄ နှင့် မချည်နှောင်ဘဲ antibody ထည့်သွင်းခြင်းမပြုမီ ဆေးကြောသွားပါသည်။
ဤတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် monoclonal antibodies များကို အသုံးပြု၍ avidin-coated plates များပေါ်တွင် ELISA assay ကို ပထမဆုံးအကြိမ်အဖြစ် သရုပ်ပြခဲ့ပြီး၊ ပျော်ဝင်နိုင်သော refractory oligosaccharides များအတွက် တစ်ဆင့် biotinylation လုပ်ထုံးလုပ်နည်းကို glycome analysis နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသည်။ glycome analysis အတွက် ကျွန်ုပ်တို့၏ချဉ်းကပ်မှုကို hydrolyzed sugar ပေါင်းစပ်မှုများ၏ trimethylsilyl (TMS) derivatization ကို အသုံးပြု၍ complementary oligosaccharide linkages များ၏ MALDI-TOF-MS နှင့် GC-MS ကိုအခြေခံသော analysis ဖြင့် အတည်ပြုခဲ့သည်။ ဤဆန်းသစ်သောချဉ်းကပ်မှုကို အနာဂတ်တွင် high-throughput နည်းလမ်းတစ်ခုအဖြစ် တီထွင်နိုင်ပြီး biomedical research35 တွင် ပိုမိုကျယ်ပြန့်သောအသုံးချမှုကို ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သည်။
glycosylation ကဲ့သို့သော အင်ဇိုင်းများနှင့် ပဋိပစ္စည်းများ၏ ဘာသာပြန်ပြီးနောက် ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများသည် ၎င်းတို့၏ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်ကို သက်ရောက်မှုရှိသည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ သွေးရည်ကြည်ပရိုတင်းများ၏ glycosylation ပြောင်းလဲမှုများသည် ရောင်ရမ်းမှုအဆစ်အမြစ်ရောင်ရမ်းခြင်းတွင် အရေးကြီးသော အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ပြီး၊ glycosylation ပြောင်းလဲမှုများကို ရောဂါရှာဖွေရေး အမှတ်အသားများအဖြစ် အသုံးပြုသည်၃၇။ glycan အမျိုးမျိုးသည် အစာအိမ်နှင့်အူလမ်းကြောင်းနှင့် အသည်း၏ နာတာရှည်ရောင်ရမ်းမှုရောဂါများ၊ ဗိုင်းရပ်စ်ကူးစက်မှုများ၊ သားဥအိမ်၊ ရင်သားနှင့် ဆီးကျိတ်ကင်ဆာများအပါအဝင် ရောဂါအမျိုးမျိုးတွင် အလွယ်တကူပေါ်လာကြောင်း စာပေများတွင် ဖော်ပြထားသည်၃၈၊၃၉၊၄၀။ antibody-based glycan ELISA နည်းလမ်းများကို အသုံးပြု၍ glycan များ၏ဖွဲ့စည်းပုံကို နားလည်ခြင်းသည် ရှုပ်ထွေးသော MS နည်းလမ်းများကို အသုံးမပြုဘဲ ရောဂါရှာဖွေရာတွင် ယုံကြည်မှုပိုမိုရရှိစေမည်ဖြစ်သည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လေ့လာမှုအရ ခေါင်းမာသော oligosaccharides များသည် ကြိုတင်ပြုပြင်ခြင်းနှင့် enzymatic hydrolysis (ပုံ ၁) ပြီးနောက် hydrolysis မဖြစ်ပေါ်ဘဲကျန်ရှိနေကြောင်းပြသခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်ထုတ်ဝေခဲ့သောလုပ်ငန်းတွင်၊ AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8 မှ oligosaccharides များကိုခွဲထုတ်ရန် activated charcoal solid-phase extraction နည်းလမ်းကိုကျွန်ုပ်တို့တီထွင်ခဲ့သည်။ ကနဦးထုတ်ယူခြင်းနှင့်ခွဲထုတ်ခြင်းပြီးနောက်၊ oligosaccharides များကို size exclusion chromatography (SEC) ဖြင့်ထပ်မံခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး molecular weight အလိုက်စုဆောင်းခဲ့သည်။ ကြိုတင်ပြုပြင်မှုအမျိုးမျိုးမှထုတ်လွှတ်သောသကြား monomers နှင့် oligomers များကိုသကြားဖွဲ့စည်းမှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုဖြင့်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ကြိုတင်ပြုပြင်မှုနည်းလမ်းများဖြင့်ရရှိသောသကြား oligomers များ၏ပါဝင်မှုကိုနှိုင်းယှဉ်သောအခါ၊ ခေါင်းမာသော oligosaccharides ရှိနေခြင်းသည် biomass ကို monosaccharides အဖြစ်ပြောင်းလဲခြင်းတွင်အဖြစ်များသောပြဿနာတစ်ခုဖြစ်ပြီးသကြားထွက်ရှိမှုကိုအနည်းဆုံး 10-15% မှ 18% အထိပင်လျော့ကျစေနိုင်သည်။ US။ ဤနည်းလမ်းကို oligosaccharide အပိုင်းအစများကိုနောက်ထပ်ကြီးမားသောထုတ်လုပ်မှုအတွက်အသုံးပြုသည်။ ရလဒ် ACH နှင့် မော်လီကျူးအလေးချိန်အမျိုးမျိုးရှိသော ၎င်း၏နောက်ဆက်တွဲအပိုင်းအစများကို ဤလုပ်ငန်းတွင် oligosaccharides ၏ လက္ခဏာရပ်ကို ဖော်ပြရန်အတွက် စမ်းသပ်ပစ္စည်းအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။
ကြိုတင်ပြုပြင်ခြင်းနှင့် အင်ဇိုင်းဖြင့် ရေဓာတ်ခွဲခြင်းပြီးနောက်၊ ကြာရှည်ခံ oligosaccharides များသည် ရေဓာတ်မရောနှောဘဲ ရှိနေပါသည်။ ဤနေရာတွင် (A) သည် activated carbon နှင့် diatomaceous earth ထုပ်ပိုးထားသော အခင်းကို အသုံးပြု၍ AFEX ကြိုတင်ပြုပြင်ထားသော ပြောင်းဖူး hydrolysate (ACSH) မှ oligosaccharides များကို ခွဲထုတ်သည့် oligosaccharide ခွဲထုတ်နည်းလမ်းဖြစ်သည်။ (B) oligosaccharides များ ခွဲထုတ်သည့် နည်းလမ်း။ oligosaccharides များကို size exclusion chromatography (SEC) ဖြင့် ထပ်မံခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ (C) ကြိုတင်ပြုပြင်မှုအမျိုးမျိုးမှ ထုတ်လွှတ်သော Saccharide monomers နှင့် oligomers များ (diluted acid: DA, ionic liquid: IL နှင့် AFEX)။ အင်ဇိုင်းဖြင့် ရေဓာတ်ပြိုကွဲခြင်း အခြေအနေများ- ၂၅% (w/w) မြင့်မားသော အစိုင်အခဲများ ထည့်သွင်းခြင်း (ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် ၈%)၊ ၉၆ နာရီ ရေဓာတ်ပြိုကွဲခြင်း၊ ၂၀ mg/g စီးပွားဖြစ် အင်ဇိုင်း ထည့်သွင်းခြင်း (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 အချိုး) နှင့် ( D) AFEX ကြိုတင်ပြုပြင်ထားသော ပြောင်းဖူးပင် (ACS) မှ ထုတ်လွှတ်သော ဂလူးကို့စ်၊ ဇိုင်လို့စ် နှင့် အာရာဘီနို့စ်တို့၏ သကြားမိုနိုမာများနှင့် အိုလီဂိုမာများ ဖြစ်သည်။
Glycan ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် အစိုင်အခဲဇီဝဒြပ်ထုအကြွင်းအကျန်များမှ ခွဲထုတ်ထားသော ထုတ်ယူမှုများတွင် glycans ၏ ပြည့်စုံသောဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အသုံးဝင်သောကိရိယာတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း သက်သေပြခဲ့သည်။ သို့သော်၊ ရေတွင်ပျော်ဝင်နိုင်သော saccharides များကို ဤရိုးရာနည်းလမ်း41 ကို အသုံးပြု၍ လုံလောက်စွာကိုယ်စားပြုခြင်းမရှိပါ၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် မော်လီကျူးအလေးချိန်နည်းသော oligosaccharides များသည် ELISA ပြားများပေါ်တွင် မလှုပ်ရှားနိုင်ဘဲ antibody ထည့်သွင်းခြင်းမပြုမီ ဆေးကြောသွားသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့် antibody ချိတ်ဆက်မှုနှင့် လက္ခဏာရပ်ဖော်ထုတ်မှုအတွက်၊ avidin ဖြင့်အုပ်ထားသော ELISA ပြားများပေါ်တွင် ပျော်ဝင်နိုင်သော၊ ကိုက်ညီမှုမရှိသော oligosaccharides များကို အုပ်ရန် တစ်ဆင့် biotinylation နည်းလမ်းကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဤနည်းလမ်းကို ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်ထုတ်လုပ်ခဲ့သော ACSH နှင့် ၎င်း၏မော်လီကျူးအလေးချိန် (သို့မဟုတ် polymerization ဒီဂရီ၊ DP) ကိုအခြေခံ၍ အပိုင်းအစတစ်ခုကို အသုံးပြု၍ စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်၏ လျှော့ချသည့်အဆုံးသို့ biotin-LC-hydrazide ကိုထည့်ခြင်းဖြင့် oligosaccharide ချိတ်ဆက်မှု affinity ကို မြှင့်တင်ရန် တစ်ဆင့် biotinylation ကို အသုံးပြုခဲ့သည် (ပုံ ၂)။ ပျော်ရည်တွင်၊ လျှော့ချသည့်အဆုံးရှိ hemiacetal အုပ်စုသည် biotin-LC-hydrazide ၏ hydrazide အုပ်စုနှင့် ဓာတ်ပြုပြီး hydrazone bond ဖွဲ့စည်းသည်။ လျှော့ချပေးသည့်ပစ္စည်း NaCNBH3 ရှိနေချိန်တွင် ဟိုက်ဒရာဇုန်းနှောင်ကြိုးသည် တည်ငြိမ်သော biotinylated end product အဖြစ်သို့ လျှော့ချခံရသည်။ သကြားလျှော့ချသည့်အဆုံးကို ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်းဖြင့် DP နိမ့်သော oligosaccharides များကို ELISA ပြားများနှင့် ချိတ်ဆက်နိုင်ခဲ့ပြီး ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုတွင် glycan-targeted mAbs များကို အသုံးပြု၍ avidin-coated ပြားများပေါ်တွင် ၎င်းကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
biotinylated oligosaccharides အတွက် ELISA ကိုအခြေခံ၍ monoclonal antibodies များကို စစ်ဆေးခြင်း။ ဤတွင် (A) oligosaccharides များ၏ biotinylation နှင့် NeutrAvidin အုပ်ထားသောပြားများပေါ်တွင် glycan-targeted mAbs များဖြင့် နောက်ဆက်တွဲ ELISA စစ်ဆေးခြင်းကို ပေါင်းစပ်ထားပြီး (B) ဓာတ်ပြုထုတ်ကုန်များ၏ biotinylation အတွက် တစ်ဆင့်တည်းသော လုပ်ထုံးလုပ်နည်းကို ပြသထားသည်။
oligosaccharide-conjugated antibodies များပါသည့် Avidin အုပ်ထားသော ပြားများကို မူလနှင့် ဒုတိယ antibodies များထဲသို့ထည့်ပြီး အလင်းနှင့် အချိန်ကို အာရုံခံနိုင်သော ကြားခံတစ်ခုတွင် ဆေးကြောခဲ့သည်။ antibody ချည်နှောင်မှု ပြီးဆုံးသွားသောအခါ၊ ပြားကို incubate လုပ်ရန် TMB substrate ကို ထည့်ပါ။ နောက်ဆုံးတွင် sulfuric acid ဖြင့် ဓာတ်ပြုမှုကို ရပ်တန့်ခဲ့သည်။ antibody-specific cross-linking ကို ထောက်လှမ်းရန် antibody တစ်ခုစီ၏ ချည်နှောင်အားကို ဆုံးဖြတ်ရန် incubated ပြားများကို ELISA reader ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ စမ်းသပ်မှု၏ အသေးစိတ်အချက်အလက်များနှင့် parameters များအတွက် သက်ဆိုင်ရာ “ပစ္စည်းများနှင့် နည်းလမ်းများ” အပိုင်းကို ကြည့်ပါ။
ကျွန်ုပ်တို့သည် ACSH တွင်ရှိသော ပျော်ဝင်နိုင်သော oligosaccharides များအပြင် lignocellulosic hydrolysates မှခွဲထုတ်ထားသော ကုန်ကြမ်းနှင့် သန့်စင်ထားသော oligosaccharides အပိုင်းအစများတွင်ပါရှိသော အသွင်အပြင်ကို ဖော်ပြခြင်းဖြင့် သီးခြားအသုံးချမှုများအတွက် ဤအသစ်တီထွင်ထားသောနည်းလမ်း၏ အသုံးဝင်မှုကို သရုပ်ပြပါသည်။ ပုံ ၃ တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း bioacylated glycome assay နည်းလမ်းများကို အသုံးပြု၍ ACSH တွင် ဖော်ထုတ်တွေ့ရှိထားသော အသုံးအများဆုံး epitope-substituted xylans များမှာ uronic (U) သို့မဟုတ် methyluronic (MeU) နှင့် pectic arabinogalactans များဖြစ်သည်။ ၎င်းတို့အများစုကို hydrolyzed solids (UHS)43 ၏ glycans များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဆိုင်ရာ ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လေ့လာမှုတွင်လည်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။
ဆဲလ်နံရံ glycan သို့ ဦးတည်သော monoclonal antibody ကို အသုံးပြု၍ recalcitrant oligosaccharide epitopes များကို ထောက်လှမ်းခြင်း။ “ကြားနေ” အပိုင်းသည် ACN အပိုင်းဖြစ်ပြီး “အက်ဆစ်ဓာတ်” အပိုင်းသည် FA အပိုင်းဖြစ်သည်။ heatmap ရှိ ပိုမိုတောက်ပသော အနီရောင်များသည် epitope ပါဝင်မှု မြင့်မားကြောင်း ညွှန်ပြပြီး ပိုမိုတောက်ပသော အပြာရောင်များသည် ဗလာနောက်ခံကို ညွှန်ပြသည်။ စကေးပေါ်ရှိ အရောင်တန်ဖိုးများသည် ဖော်မြူလာ N=2 အတွက် ကုန်ကြမ်း OD တန်ဖိုးများအပေါ် အခြေခံသည်။ antibodies များမှ မှတ်မိသော အဓိက epitopes များကို ညာဘက်တွင် ပြသထားသည်။
ဤ non-cellulose ဖွဲ့စည်းပုံများကို အသုံးအများဆုံး စီးပွားဖြစ် အင်ဇိုင်းများပါဝင်သည့် စမ်းသပ်ထားသော စီးပွားဖြစ် အင်ဇိုင်းအရောအနှောတွင် အသုံးအများဆုံး cellulose နှင့် hemicellulose များက ဖြတ်တောက်၍မရပါ။ ထို့ကြောင့် ၎င်းတို့၏ hydrolysis အတွက် အရန်အင်ဇိုင်းအသစ်များ လိုအပ်ပါသည်။ လိုအပ်သော non-cellulose ဆက်စပ်အင်ဇိုင်းများမပါဘဲ၊ ဤ non-cellulose ချည်နှောင်မှုများသည် ၎င်းတို့၏ မိခင်သကြားပိုလီမာများကို အပိုင်းအစငယ်များအဖြစ် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် hydrolyzed လုပ်ကာ စီးပွားဖြစ် အင်ဇိုင်းအရောအနှောများကို အသုံးပြု၍ ပျော်ဝင်စေသော်လည်း monosaccharides အဖြစ် လုံးဝပြောင်းလဲခြင်းကို ကာကွယ်ပေးပါသည်။
အချက်ပြဖြန့်ဖြူးမှုနှင့် ၎င်း၏ ချည်နှောင်အားကို နောက်ထပ်လေ့လာမှုအရ မြင့်မားသော DP သကြားအပိုင်းအစများ (A၊ B၊ C၊ DP 20+ အထိ) တွင် ချည်နှောင်ထားသော epitopes များသည် dimers တွင်) နိမ့်သော DP အပိုင်းအစများ (D၊ E၊ F၊ DP) ထက် နည်းပါးကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ ၁)။ အက်ဆစ်အပိုင်းအစများသည် ကြားနေအပိုင်းအစများထက် non-cellulose epitopes များတွင် ပိုမိုအဖြစ်များသည်။ ဤဖြစ်စဉ်များသည် ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လေ့လာမှုတွင် တွေ့ရှိရသည့်ပုံစံနှင့် ကိုက်ညီပါသည်၊ ထိုတွင် DP မြင့်မားခြင်းနှင့် အက်ဆစ် moieties များသည် enzymatic hydrolysis ကို ပိုမိုခံနိုင်ရည်ရှိသည်။ ထို့ကြောင့် non-cellulose glycan epitopes နှင့် U နှင့် MeU အစားထိုးမှုများရှိနေခြင်းသည် oligosaccharides များ၏တည်ငြိမ်မှုကို များစွာအထောက်အကူပြုနိုင်သည်။ အထူးသဖြင့် epitope သည် dimeric သို့မဟုတ် trimeric oligosaccharide ဖြစ်ပါက ချည်နှောင်မှုနှင့် ထောက်လှမ်းမှုစွမ်းဆောင်ရည်သည် နိမ့်သော DP oligosaccharides များအတွက် ပြဿနာရှိနိုင်ကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။ ၎င်းကို သတ်မှတ်ထားသော mAb နှင့် ချိတ်ဆက်သော epitope တစ်ခုတည်းသာပါဝင်သော မတူညီသောအရှည်ရှိသော စီးပွားဖြစ် oligosaccharides များကို အသုံးပြု၍ စမ်းသပ်နိုင်သည်။
ထို့ကြောင့် ဖွဲ့စည်းပုံအလိုက် antibodies များကို အသုံးပြုခြင်းသည် recalcitrant bonds အမျိုးအစားအချို့ကို ဖော်ထုတ်ပေးပါသည်။ အသုံးပြုသော antibody အမျိုးအစား၊ သင့်လျော်သော ligation ပုံစံနှင့် ၎င်းထုတ်လုပ်သော signal ၏အစွမ်းသတ္တိ (အများဆုံးနှင့် အနည်းဆုံးပေါများမှု) ပေါ် မူတည်၍ အင်ဇိုင်းအသစ်များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်ပြီး ပိုမိုပြည့်စုံသော glycoconversion အတွက် အင်ဇိုင်းရောစပ်မှုထဲသို့ semi-quantitatively ထည့်သွင်းနိုင်သည်။ ACSH oligosaccharides များကို ဥပမာအဖြစ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းကို ယူ၍ biomass ပစ္စည်းတစ်ခုစီအတွက် glycan bonds များ၏ database တစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ ဖန်တီးနိုင်ပါသည်။ antibodies များ၏ ကွဲပြားခြားနားသော affinity ကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားသင့်ပြီး ၎င်းတို့၏ affinity ကို မသိရှိပါက မတူညီသော antibodies များ၏ signals များကို နှိုင်းယှဉ်ရာတွင် အခက်အခဲအချို့ ဖြစ်ပေါ်စေမည်ကို ဤနေရာတွင် သတိပြုသင့်သည်။ ထို့အပြင် glycan bonds များကို နှိုင်းယှဉ်ခြင်းသည် တူညီသော antibody အတွက် နမူနာများအကြား အကောင်းဆုံးအလုပ်လုပ်နိုင်ပါသည်။ ထို့နောက် ဤခေါင်းမာသော bonds များကို CAZyme database နှင့် ချိတ်ဆက်နိုင်ပြီး ၎င်းမှ အင်ဇိုင်းများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်ခြင်း၊ ကိုယ်စားလှယ်လောင်း အင်ဇိုင်းများကို ရွေးချယ်ခြင်းနှင့် bond-breaking enzymes များကို စမ်းသပ်ခြင်း သို့မဟုတ် biorefineries44 တွင် အသုံးပြုရန်အတွက် ဤအင်ဇိုင်းများကို ဖော်ပြရန် microbial systems များကို တီထွင်နိုင်ပါသည်။
lignocellulosic hydrolysates တွင်ရှိသော မော်လီကျူးအလေးချိန်နည်းသော oligosaccharides များကို လက္ခဏာရပ်ဖော်ပြရန် အခြားနည်းလမ်းများကို ကိုယ်ခံအားဆိုင်ရာနည်းလမ်းများက မည်သို့ဖြည့်စွက်ပေးသည်ကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် MALDI (ပုံ ၄၊ S1-S8) နှင့် GC-MS ကိုအခြေခံ၍ TMS မှဆင်းသက်လာသော saccharides များကို တူညီသော panel (ပုံ ၅) oligosaccharide အပိုင်းပေါ်တွင် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ MALDI ကို oligosaccharide မော်လီကျူးများ၏ mass distribution သည် ရည်ရွယ်ထားသောဖွဲ့စည်းပုံနှင့် ကိုက်ညီမှုရှိမရှိ နှိုင်းယှဉ်ရန် အသုံးပြုသည်။ ပုံ ၄ တွင် ကြားနေအစိတ်အပိုင်းများ ACN-A နှင့် ACN-B ၏ MS ကို ပြသထားသည်။ ACN-A ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် DP 4–8 (ပုံ ၄) မှ DP 22 (ပုံ S1) အထိရှိသော pentose သကြားအမျိုးအစားကို အတည်ပြုခဲ့ပြီး၊ ၎င်းတို့၏ အလေးချိန်များသည် MeU-xylan oligosaccharides နှင့် ကိုက်ညီသည်။ ACN-B ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် DP 8-15 ပါရှိသော pentose နှင့် glucoxylan စီးရီးကို အတည်ပြုခဲ့သည်။ ပုံ S3 ကဲ့သို့သော ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းတွင်၊ FA-C အက်ဆစ်ဓာတ်ပါဝင်သော အမှုန်အမွှားများ ဖြန့်ဖြူးမှုမြေပုံများသည် ELISA-အခြေပြု mAb စစ်ဆေးခြင်းတွင်တွေ့ရှိရသော အစားထိုး xylans နှင့်ကိုက်ညီသော DP 8-15 ရှိသော (Me)U အစားထိုး pentose သကြားဓာတ်အမျိုးမျိုးကို ပြသထားသည်။ epitopes များသည် တသမတ်တည်းရှိသည်။
ACS တွင်ရှိသော ပျော်ဝင်နိုင်သော non-compliant oligosaccharides များ၏ MALDI-MS spectrum။ ဤနေရာတွင်၊ (A) methylated uronic acid (DP 4-8) ပါဝင်သော ACN-A low weight range fractions များသည် glucuroxylan oligosaccharides များကို အစားထိုးထားပြီး (B) glucuroxylan (DP 8-15) ဖြင့် အစားထိုးထားသော ACN-B xylan နှင့် methylated uronic acid oligosaccharides များ။
ပြန်လည်ပြုပြင်မထားသော oligosaccharides များ၏ glycan residue ၏ ဖွဲ့စည်းမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။ ဤနေရာတွင် (A) GC-MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အသုံးပြု၍ ရရှိသော oligosaccharide အပိုင်းအစအမျိုးမျိုး၏ TMS saccharide ဖွဲ့စည်းမှု။ (B) oligosaccharides တွင်ရှိသော TMS မှဆင်းသက်လာသော သကြားအမျိုးမျိုး၏ ဖွဲ့စည်းပုံများ။ ACN – ကြားနေ oligosaccharides ပါဝင်သော acetonitrile အပိုင်းအစနှင့် အက်ဆစ် oligosaccharides ပါဝင်သော FA – ferulic acid အပိုင်းအစ။
ပုံ S9 တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း oligosaccharide အပိုင်းအစ၏ LC-MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမှ နောက်ထပ်စိတ်ဝင်စားဖွယ်ကောင်းသော နိဂုံးချုပ်ချက်ကို ရရှိခဲ့ပါသည် (နည်းလမ်းများကို အီလက်ထရွန်းနစ် ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းတွင် မြင်တွေ့နိုင်ပါသည်)။ ACN-B အပိုင်းအစကို ligation လုပ်စဉ်အတွင်း hexose နှင့် -OAc အုပ်စုများ၏ အပိုင်းအစများကို ထပ်ခါတလဲလဲ တွေ့ရှိခဲ့ရသည်။ ဤတွေ့ရှိချက်သည် glycome နှင့် MALDI-TOF ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် တွေ့ရှိရသည့် အပိုင်းအစများကို အတည်ပြုရုံသာမက ကြိုတင်ပြုပြင်ထားသော lignocellulosic biomass တွင် အလားအလာရှိသော carbohydrate derivatives အကြောင်း အချက်အလက်အသစ်များကိုလည်း ပေးပါသည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် TMS glycan derivatization ကို အသုံးပြု၍ oligosaccharide အပိုင်းအစများ၏ glycan ဖွဲ့စည်းမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကိုလည်း ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ GC-MS ကို အသုံးပြု၍ oligosaccharide အပိုင်းအစတွင် neural (non-derivative) နှင့် acidic sugars (GluA နှင့် GalA) တို့၏ ဖွဲ့စည်းမှုကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့ပါသည် (ပုံ ၅)။ Glucuronic acid ကို acidic components C နှင့် D တွင် တွေ့ရှိရပြီး galacturonic acid ကို acidic components A နှင့် B တွင် တွေ့ရှိရပြီး ၎င်းတို့နှစ်ခုစလုံးသည် acidic sugars များ၏ DP မြင့်မားသော components များဖြစ်သည်။ ဤရလဒ်များသည် ကျွန်ုပ်တို့၏ ELISA နှင့် MALDI data များကို အတည်ပြုရုံသာမက oligosaccharide စုဆောင်းမှုဆိုင်ရာ ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လေ့လာမှုများနှင့်လည်း ကိုက်ညီပါသည်။ ထို့ကြောင့် oligosaccharides ၏ biotinylation နှင့် နောက်ဆက်တွဲ ELISA screening ကိုအသုံးပြုသည့် ခေတ်မီ immunological နည်းလမ်းများသည် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာနမူနာအမျိုးမျိုးတွင် soluble recalcitrant oligosaccharides များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိရန် လုံလောက်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ယုံကြည်ပါသည်။
ELISA-အခြေခံ mAb စစ်ဆေးခြင်းနည်းလမ်းများကို နည်းလမ်းအမျိုးမျိုးဖြင့် အတည်ပြုပြီးဖြစ်သောကြောင့်၊ ဤအရေအတွက်ဆိုင်ရာနည်းလမ်းအသစ်၏ အလားအလာကို ကျွန်ုပ်တို့ ပိုမိုစူးစမ်းလေ့လာလိုပါသည်။ ဆဲလ်နံရံ glycan ကိုပစ်မှတ်ထားသော mAb ချဉ်းကပ်မှုအသစ်ကို အသုံးပြု၍ စီးပွားဖြစ် oligosaccharides နှစ်ခုဖြစ်သည့် xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) နှင့် 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX) ကို ဝယ်ယူပြီး စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ ပုံ ၆ တွင် biotinylated binding signal နှင့် oligosaccharide အာရုံစူးစိုက်မှု၏ log အာရုံစူးစိုက်မှုအကြား linear correlation ကိုပြသထားပြီး၊ ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော Langmuir adsorption model ကို အကြံပြုထားသည်။ mAbs များထဲတွင် CCRC-M137၊ CCRC-M138၊ CCRC-M147၊ CCRC-M148 နှင့် CCRC-M151 တို့သည် XHE နှင့် ဆက်စပ်နေပြီး CCRC-M108၊ CCRC-M109 နှင့် LM11 တို့သည် 1 nm မှ 100 nano အကွာအဝေးအတွင်း A2XX နှင့် ဆက်စပ်နေသည်။ စမ်းသပ်မှုအတွင်း ပဋိပစ္စည်းများ ရရှိနိုင်မှု အကန့်အသတ်ရှိသောကြောင့်၊ oligosaccharide ပါဝင်မှုတစ်ခုစီဖြင့် စမ်းသပ်မှုများကို အကန့်အသတ်ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အချို့သော ပဋိပစ္စည်းများသည် substrate ကဲ့သို့ oligosaccharide တစ်ခုတည်းကို အလွန်ကွဲပြားစွာ တုံ့ပြန်ကြောင်း ဤနေရာတွင် သတိပြုသင့်သည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် ၎င်းတို့သည် အနည်းငယ်ကွဲပြားသော epitopes များနှင့် ချိတ်ဆက်ပြီး အလွန်ကွဲပြားသော ချည်နှောင်မှု ချိတ်ဆက်မှုများ ရှိနိုင်သောကြောင့် ဖြစ်သည်။ mAb ချဉ်းကပ်မှုအသစ်ကို အစစ်အမှန်နမူနာများတွင် အသုံးချသောအခါ တိကျသော epitope ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်း၏ ယန္တရားများနှင့် သက်ရောက်မှုများသည် ပိုမိုရှုပ်ထွေးလာမည်ဖြစ်သည်။
glycan-targeting mAbs အမျိုးမျိုး၏ ထောက်လှမ်းမှုအကွာအဝေးကို ဆုံးဖြတ်ရန် စီးပွားဖြစ် oligosaccharides နှစ်ခုကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဤနေရာတွင်၊ oligosaccharide ပါဝင်မှု၏ log concentration နှင့် linear correlations များသည် (A) XHE ပါသော mAb နှင့် (B) A2XX mAb အတွက် Langmuir adsorption ပုံစံများကို ညွှန်ပြသည်။ သက်ဆိုင်ရာ epitopes များသည် assay တွင် substrates အဖြစ်အသုံးပြုသော စီးပွားဖြစ် oligosaccharides များ၏ဖွဲ့စည်းပုံကို ညွှန်ပြသည်။
glycan-targeted monoclonal antibodies များကို အသုံးပြုခြင်း (glycocomic analysis သို့မဟုတ် ELISA-based mAb screening) သည် အပင်ဇီဝဒြပ်ထုကို ဖွဲ့စည်းထားသော အဓိကဆဲလ်နံရံ glycans အများစုကို နက်နက်ရှိုင်းရှိုင်း လက္ခဏာရပ်ဖော်ထုတ်ရန်အတွက် အစွမ်းထက်သောကိရိယာတစ်ခုဖြစ်သည်။ သို့သော်၊ ရိုးရာ glycan ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် ဆဲလ်နံရံ glycans အများစုကိုသာ လက္ခဏာရပ်ပြသည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် oligosaccharides အများစုကို ELISA ပြားများတွင် ထိရောက်စွာ မလှုပ်ရှားနိုင်သောကြောင့်ဖြစ်သည်။ ဤလေ့လာမှုတွင်၊ AFEX-ကြိုတင်ကုသထားသော ပြောင်းဖူးပင်ကို အစိုင်အခဲပါဝင်မှုမြင့်မားသောနေရာတွင် အင်ဇိုင်းဖြင့် hydrolyzed လုပ်ခဲ့သည်။ hydrolyzate ရှိ recalcitrant ဆဲလ်နံရံကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်များ၏ ပါဝင်မှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် သကြားခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ သို့သော်၊ hydrolysates ရှိ သေးငယ်သော oligosaccharides များ၏ mAb ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လျှော့တွက်ထားပြီး၊ ELISA ပြားများပေါ်ရှိ oligosaccharides များကို ထိရောက်စွာ မလှုပ်ရှားနိုင်စေရန် အပိုဆောင်းကိရိယာများ လိုအပ်ပါသည်။
oligosaccharide biotinylation ကို ပေါင်းစပ်ပြီးနောက် NeutrAvidin™ အုပ်ထားသောပြားများပေါ်တွင် ELISA စစ်ဆေးခြင်းဖြင့် mAb စစ်ဆေးမှုအတွက် ထူးခြားပြီး ထိရောက်သော oligosaccharide immobilization နည်းလမ်းကို ဤနေရာတွင် ကျွန်ုပ်တို့ တင်ပြပါသည်။ immobilized biotinylated oligosaccharides များသည် recalcitrant oligosaccharides များကို မြန်ဆန်ထိရောက်စွာ ထောက်လှမ်းနိုင်စေရန် antibody အတွက် လုံလောက်သော affinity ကို ပြသခဲ့သည်။ mass spectrometry ကို အခြေခံ၍ ဤ stubborn oligosaccharides များ၏ ဖွဲ့စည်းမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် immunoscreening အတွက် ဤချဉ်းကပ်မှုအသစ်၏ ရလဒ်များကို အတည်ပြုခဲ့သည်။ ထို့ကြောင့်၊ ဤလေ့လာမှုများသည် oligosaccharide biotinylation နှင့် ELISA စစ်ဆေးမှုကို glycan-targeted monoclonal antibodies များနှင့် ပေါင်းစပ်ခြင်းကို oligosaccharides ရှိ crosslinks များကို ထောက်လှမ်းရန် အသုံးပြုနိုင်ပြီး oligosaccharides များ၏ ဖွဲ့စည်းပုံကို ဖော်ပြသည့် အခြားဇီဝဓာတုဗေဒဆိုင်ရာ လေ့လာမှုများတွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် အသုံးပြုနိုင်ကြောင်း ပြသထားသည်။
ဤ biotin-based glycan profiling နည်းလမ်းသည် အပင်ဇီဝလောင်စာတွင် ပျော်ဝင်နိုင်သော oligosaccharides များ၏ recalcitrant carbohydrate bonds များကို စုံစမ်းစစ်ဆေးနိုင်သည့် ပထမဆုံးအစီရင်ခံစာဖြစ်သည်။ ၎င်းသည် ဇီဝလောင်စာထုတ်လုပ်မှုနှင့်ပတ်သက်လာလျှင် ဇီဝလောင်စာ၏ အစိတ်အပိုင်းအချို့သည် အဘယ်ကြောင့် ဤမျှခေါင်းမာနေရသည်ကို နားလည်ရန် ကူညီပေးသည်။ ဤနည်းလမ်းသည် glycome ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနည်းလမ်းများတွင် အရေးကြီးသောကွာဟချက်ကို ဖြည့်ဆည်းပေးပြီး အပင် oligosaccharides များထက် ကျော်လွန်၍ ပိုမိုကျယ်ပြန့်သော substrates အမျိုးမျိုးသို့ ၎င်း၏အသုံးချမှုကို တိုးချဲ့သည်။ အနာဂတ်တွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် biotinylation အတွက် robotics ကို အသုံးပြုနိုင်ပြီး ELISA ကို အသုံးပြု၍ နမူနာများ၏ high-throughput ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် ကျွန်ုပ်တို့တီထွင်ထားသော နည်းလမ်းကို အသုံးပြုနိုင်သည်။
Pioneer 33A14 မျိုးစပ်မျိုးစေ့များမှ စိုက်ပျိုးထားသော ပြောင်းဖူးကောက်ရိုး (CS) ကို ၂၀၁၀ ခုနှစ်တွင် ကော်လိုရာဒိုပြည်နယ်၊ ရေးမြို့ရှိ Kramer Farms မှ ရိတ်သိမ်းခဲ့သည်။ မြေပိုင်ရှင်၏ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ဤဇီဝလောင်စာကို သုတေသနအတွက် အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။ နမူနာများကို အခန်းအပူချိန်တွင် ဇစ်ပိတ်အိတ်များထဲတွင် ခြောက်သွေ့သော အစိုဓာတ် ၆% အောက် သိမ်းဆည်းထားသည်။ နမူနာများကို အခန်းအပူချိန်တွင် ဇစ်ပိတ်အိတ်များထဲတွင် ခြောက်သွေ့သော အစိုဓာတ် ၆% အောက် သိမ်းဆည်းထားသည်။ Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. နမူနာများကို အခန်းအပူချိန်ရှိ ဇစ်ပါသောအိတ်များတွင် စိုထိုင်းဆ ၆% အောက် ခြောက်သွေ့စွာ သိမ်းဆည်းထားသည်။样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中။样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. နမူနာများကို ဇစ်အိတ်များထဲတွင် အခန်းအပူချိန်တွင် စိုထိုင်းဆ ၆% အောက် သိမ်းဆည်းထားသည်။လေ့လာမှုသည် ဒေသဆိုင်ရာနှင့် အမျိုးသားလမ်းညွှန်ချက်များနှင့်အညီ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ဖွဲ့စည်းမှုဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို NREL ပရိုတိုကောကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ဖွဲ့စည်းမှုတွင် ဂလူကန် ၃၁.၄%၊ ဇိုင်လန် ၁၈.၇%၊ အာရာဘီနန် ၃.၃%၊ ဂလက်တန် ၁.၂%၊ အက်စီတိုင်း ၂.၂%၊ လစ်နင် ၁၄.၃%၊ ပရိုတင်း ၁.၇% နှင့် ပြာ ၁၃.၄% ပါဝင်ကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။
Cellic® CTec2 (ပရိုတင်း ၁၃၈ မီလီဂရမ်/မီလီလီတာ၊ အသုတ် VCNI 0001) သည် Novozymes (Franklinton, NC, USA) မှ cellulase၊ β-glucosidase နှင့် Cellic® HTec2 (ပရိုတင်း ၁၅၇ မီလီဂရမ်/မီလီလီတာ၊ အသုတ် VHN00001) တို့၏ ရှုပ်ထွေးသော ရောစပ်မှုတစ်ခုဖြစ်သည်။ pectin ပြိုကွဲစေသော အင်ဇိုင်းများ၏ ရှုပ်ထွေးသော ရောစပ်မှုတစ်ခုဖြစ်သည့် Multifect Pectinase® (ပရိုတင်း ၇၂ မီလီဂရမ်/မီလီလီတာကို DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) မှ လှူဒါန်းခဲ့သည်။ အင်ဇိုင်းပရိုတင်းပါဝင်မှုများကို Kjeldahl နိုက်ထရိုဂျင် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (AOAC နည်းလမ်း ၂၀၀၁.၁၁၊ Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) ကို အသုံးပြု၍ ပရိုတင်းပါဝင်မှုကို ခန့်မှန်းခြင်း (နှင့် ပရိုတင်းမဟုတ်သော နိုက်ထရိုဂျင်၏ ပံ့ပိုးမှုကို နုတ်ခြင်းဖြင့်) ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ Diatomaceous earth 545 ကို EMD Millipore (Billerica, MA) မှ ဝယ်ယူခဲ့သည်။ activated carbon (DARCO, 100 mesh granules)၊ Avicel (PH-101)၊ beech xylan နှင့် အခြားဓာတုပစ္စည်းများအားလုံးကို Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) မှ ဝယ်ယူခဲ့သည်။
AFEX ကြိုတင်ပြုပြင်မှုကို GLBRC (ဇီဝဒြပ်ပေါင်းပြောင်းလဲခြင်းသုတေသနဓာတ်ခွဲခန်း၊ MSU၊ Lansing၊ MI၊ USA) တွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ကြိုတင်ပြုပြင်မှုကို ၁၄၀°C တွင် ၁၅ မိနစ်ကြာ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ သံမဏိစားပွဲခုံအသုတ်ဓာတ်ပေါင်းဖို (Parr Instruments Company) တွင် ရေဓာတ်မပါသော အမိုးနီးယားနှင့် ဇီဝဒြပ်ပေါင်း အချိုး ၁:၁ ဖြင့် ၆၀% (w/w) တင်ထားသည်။ မိနစ် ၃၀ ကြာခဲ့သည်။ ဓာတ်ပေါင်းဖိုကို ၁၄၀°C သို့ မြှင့်တင်ခဲ့ပြီး အမိုးနီးယားကို လျင်မြန်စွာ ထုတ်လွှတ်လိုက်သောကြောင့် ဇီဝဒြပ်ပေါင်းသည် အခန်းအပူချိန်သို့ လျင်မြန်စွာ ပြန်ရောက်နိုင်သည်။ AFEX ကြိုတင်ပြုပြင်ထားသော ပြောင်းဖူးအိုး (ACS) ၏ ပါဝင်မှုသည် ကုသမှုမခံယူရသေးသော ပြောင်းဖူးအိုး (UT-CS) နှင့် ဆင်တူသည်။
မြင့်မားသောအစိုင်အခဲ ACSH 25% (w/w) (ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 8% dextran loading) ကို oligosaccharides များ အများအပြားထုတ်လုပ်ရန်အတွက် အစပြုပစ္စည်းအဖြစ် ပြင်ဆင်ထားသည်။ ACS ၏ အင်ဇိုင်းဖြင့် hydrolysis ကို Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (ကြိုတင်ပြုပြင်ထားသော ဇီဝဒြပ်ထုတွင်)၊ Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC)၊ 5 mg protein/g glucan နှင့် Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) အပါအဝင် စီးပွားဖြစ် အင်ဇိုင်းအရောအနှောကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ အင်ဇိုင်းဖြင့် hydrolysis ကို 3 လီတာ၊ pH 4.8၊ 50°C နှင့် 250 rpm ရှိသော 5 လီတာ bioreactor တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ 96 နာရီကြာ hydrolysis ပြီးနောက်၊ hydrolyzate ကို 6000 rpm တွင် 30 မိနစ်ကြာ centrifugation ဖြင့် စုဆောင်းပြီးနောက် 14000 rpm တွင် 30 မိနစ်ကြာ hydrolysis မလုပ်ရသေးသော အစိုင်အခဲများကို ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ ထို့နောက် hydrolyzate ကို 0.22 မီလီမီတာ filter beaker မှတစ်ဆင့် ပိုးသတ်ထားသော filter ဖြင့် စစ်ထုတ်ခဲ့သည်။ စစ်ထုတ်ထားသော hydrolyzate ကို ပိုးသတ်ထားသော ပုလင်းများတွင် ၄°C တွင် သိမ်းဆည်းပြီးနောက် ကာဗွန်ဖြင့် အပိုင်းပိုင်းခွဲခဲ့သည်။
NREL ဓာတ်ခွဲခန်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများအရ ထုတ်ယူမှုအခြေခံ ဇီဝလောင်စာနမူနာများ၏ ပါဝင်မှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း- ပါဝင်မှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် နမူနာများ ပြင်ဆင်ခြင်း (NREL/TP-510-42620) နှင့် ဇီဝလောင်စာတွင် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်နှင့် လစ်နင်ကို ဆုံးဖြတ်ခြင်း (NREL/TP-510 – 42618)47။
ဟိုက်ဒရိုလိုက်ဇိတ်စီးကြောင်း၏ Oligosaccharide ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို autoclave-based acid hydrolysis နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ 2 ml စကေးဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ဟိုက်ဒရိုလိုက်ဇိတ်နမူနာကို 72% ဆာလဖျူရစ်အက်ဆစ် 69.7 µl နှင့် 10 ml screw cap culture tube ထဲတွင် ရောမွှေပြီး 121°C တွင် စားပွဲခုံပေါ်တွင် 1 နာရီကြာ incubation လုပ်ပါ၊ ရေခဲပေါ်တွင် အအေးခံပြီး high performance liquid chromatography (HPLC) vial ထဲသို့ filter လုပ်ပါ။ oligosaccharides ၏ ပါဝင်မှုကို အက်ဆစ် hydrolysis နမူနာရှိ စုစုပေါင်းသကြားပါဝင်မှုမှ hydrolysis မလုပ်ထားသော နမူနာရှိ monosaccharides ၏ ပါဝင်မှုကို နုတ်ခြင်းဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။
Bio-Rad Aminex HPX-87H ကော်လံပေါ်တွင် autosampler၊ column heater၊ isocratic pump နှင့် refractive index detector တပ်ဆင်ထားသော Shimadzu HPLC စနစ်ကို အသုံးပြု၍ အက်ဆစ်ဓာတ်ခွဲထားသော ဇီဝဒြပ်ထုတွင် ဂလူးကို့စ်၊ ဇိုင်လို့စ် နှင့် အာရာဘီနို့စ် ပါဝင်မှုများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ကော်လံကို 50°C တွင် ထိန်းသိမ်းထားပြီး ရေတွင် 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 ဖြင့် elevated လုပ်ခဲ့သည်။
hydrolyzate supernatant ကို ပျော့အောင်ပြုလုပ်ပြီး monomer နှင့် oligosaccharide ပါဝင်မှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ အင်ဇိုင်းဖြင့် hydrolysis ပြုလုပ်ပြီးနောက် ရရှိလာသော monomeric သကြားများကို Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ကော်လံနှင့် ပြာအကာကော်လံတပ်ဆင်ထားသော HPLC ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ကော်လံအပူချိန်ကို 80°C တွင် ထိန်းသိမ်းထားခဲ့ပြီး ရေကို 0.6 ml/min စီးဆင်းမှုနှုန်းဖြင့် မိုဘိုင်းအဆင့်အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ Oligosaccharides များကို refs. 41, 48, 49 တွင်ဖော်ပြထားသော နည်းလမ်းများအရ 121°C ရှိ dilute acid တွင် hydrolysis ဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။
Saccharide ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ကုန်ကြမ်း၊ AFEX ကြိုတင်ကုသထားသော နှင့် ရေဓာတ်ခွဲမထားသော ဇီဝဒြပ်ထု အကြွင်းအကျန်များအားလုံး (စီးရီးဆဲလ်နံရံ ထုတ်ယူမှုများ ထုတ်လုပ်ခြင်းနှင့် ၎င်းတို့၏ mAb စစ်ဆေးခြင်း အပါအဝင်) တွင် ယခင်ဖော်ပြခဲ့သည့် လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများ ၂၇၊ ၄၃၊ ၅၀၊ ၅၁ ကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ glycome ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ အပင်ဆဲလ်နံရံပစ္စည်းများ၏ အယ်လ်ကိုဟောတွင် မပျော်ဝင်နိုင်သော အကြွင်းအကျန်များကို ဇီဝဒြပ်ထု အကြွင်းအကျန်များမှ ပြင်ဆင်ပြီး ammonium oxalate (50 mM)၊ sodium carbonate (50 mM နှင့် 0.5% w/v)၊ CON. (1M နှင့် 4M၊ နှစ်ခုစလုံးတွင် 1% w/v sodium borohydride ပါရှိသည်) နှင့် acid chlorite ကဲ့သို့သော ပိုမိုပြင်းထန်သော reagents များဖြင့် စီးရီးထုတ်ယူမှု ပြုလုပ်ခဲ့သည်52,53။ ထို့နောက် ထုတ်ယူမှုများကို ဆဲလ်နံရံ glycan သို့ ဦးတည်သော mAb50s များ၏ ရှုပ်ထွေးသော panel နှင့် ELISA ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး mAb ချိတ်ဆက်မှုတုံ့ပြန်မှုများကို အပူမြေပုံအဖြစ် တင်ပြခဲ့သည်။ အပင်ဆဲလ်နံရံ glycan ကို ပစ်မှတ်ထားသော mAbs များကို ဓာတ်ခွဲခန်းစတော့ရှယ်ယာများ (CCRC၊ JIM နှင့် MAC စီးရီး) မှ ဝယ်ယူခဲ့သည်။
အိုလီဂိုဆာကရိုက်များ၏ တစ်ဆင့်တည်းသော ဘိုင်အိုတင်နိုင်းလေးရှင်း။ ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်များကို ဘိုင်အိုတင်-LC-ဟိုက်ဒရာဇိုက်နှင့် ပေါင်းစပ်ခြင်းကို အောက်ပါလုပ်ထုံးလုပ်နည်းကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ဘိုင်အိုတင်-LC-ဟိုက်ဒရာဇိုက် (၄.၆ မီလီဂရမ်/၁၂ မိုက်ခရိုမို) ကို ဒိုင်မီသိုင်းဆာလဖောက်ဆိုဒ် (DMSO၊ ၇၀ မိုက်ခရိုလီတာ) တွင် ပြင်းထန်စွာမွှေပြီး ၆၅°C တွင် ၁ မိနစ်ခန့် အပူပေးခြင်းဖြင့် ပျော်ဝင်စေခဲ့သည်။ ရေခဲအက်စီတစ်အက်ဆစ် (၃၀ မိုက်ခရိုလီတာ) ကို ထည့်သွင်းပြီး အရောအနှောကို ဆိုဒီယမ်ဆိုင်ယာနိုဘိုရိုဟိုက်ဒရိုက် (၆.၄ မီလီဂရမ်/၁၀၀ မိုက်ခရိုမို) ပေါ်သို့ လောင်းထည့်ပြီး ၆၅°C တွင် ၁ မိနစ်ခန့် အပူပေးပြီးနောက် လုံးဝပျော်ဝင်စေခဲ့သည်။ ထို့နောက် ဓာတ်ပြုမှုအရောအနှော ၅ မှ ၈ မိုက်ခရိုလီတာအထိကို ခြောက်သွေ့သော အိုလီဂိုဆာကရိုက် (၁-၁၀၀ nmol) ထဲသို့ ထည့်ကာ လျှော့ချသည့်အဆုံးတွင် တံဆိပ်၏ ၁၀ ဆ သို့မဟုတ် ထို့ထက်ပိုသော မိုလာပိုလျှံမှုကို ရရှိရန် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ဓာတ်ပြုမှုကို ၆၅°C တွင် ၂ နာရီကြာ ပြုလုပ်ပြီးနောက် နမူနာများကို ချက်ချင်းသန့်စင်ခဲ့သည်။ လျော့ချခြင်းမရှိဘဲ အညွှန်းကပ်ခြင်းစမ်းသပ်မှုများတွင် ဆိုဒီယမ် ဆိုင်ယာနိုဘိုရိုဟိုက်ဒရိုက်ကို အသုံးမပြုခဲ့ဘဲ နမူနာများကို ၆၅°C တွင် ၂.၅ နာရီကြာ ဓာတ်ပြုခဲ့သည်။
biotinylated oligosaccharides နမူနာများကို ELISA အုပ်ခြင်းနှင့်ဆေးကြောခြင်း။ biotinylated နမူနာ ၂၅ μl (0.1 M Tris buffer solution (TBS) ၅ ml တွင်ရောစပ်ထားသော ပြင်းအားနမူနာတစ်ခုစီ၏ ၁၀၀ μl) ကို avidin အုပ်ထားသောပြား၏ well တစ်ခုစီထဲသို့ထည့်ခဲ့သည်။ Control well များကို 0.1 M TBS တွင် 10 μg/ml ပြင်းအားဖြင့် biotin ၅၀ μl ဖြင့်အုပ်ထားသည်။ အိုင်းယွန်းကင်းစင်သောရေကို blank measurements အတွက် coating အဖြစ်အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဆေးပြားကို အခန်းအပူချိန်တွင် မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် ၂ နာရီကြာ ထားခဲ့သည်။ Grenier flat 3A အတွက် program no. 11 ကို အသုံးပြု၍ 0.1% skimmed milk ဖြင့် 0.1 M TBS တွင် plate ကို ၃ ကြိမ်ဆေးကြောပါ။
မူလပဋိပစ္စည်းများထည့်သွင်းခြင်းနှင့်ဆေးကြောခြင်း။ မူလပဋိပစ္စည်း ၄၀ µl ကို ရေတွင်းတစ်ခုစီထဲသို့ထည့်ပါ။ မိုက်ခရိုပလိတ်ကို အခန်းအပူချိန်တွင် မှောင်နေသောနေရာ၌ ၁ နာရီကြာ ပြုစုပျိုးထောင်ပါ။ ထို့နောက် Grenier Flat 3A အတွက် ဆေးကြောခြင်းပရိုဂရမ် #၁၁ ကို အသုံးပြု၍ ပလိတ်များကို ၀.၁% နို့ဖြင့် ၀.၁M TBS တွင် ၃ ကြိမ်ဆေးကြောခဲ့သည်။
ဒုတိယပဋိပစ္စည်းထည့်ပြီး ဆေးကြောပါ။ ကြွက်/ကြွက် ဒုတိယပဋိပစ္စည်း ၅၀ µl (၀.၁% နို့တွင် ၀.၁ M TBS တွင် ၁:၅၀၀၀ ရောစပ်ထားသော) ကို ရေတွင်းတစ်ခုစီထဲသို့ ထည့်ပါ။ မိုက်ခရိုပလိတ်ကို အခန်းအပူချိန်တွင် မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် ၁ နာရီကြာ ပျိုးထောင်ပါ။ ထို့နောက် မိုက်ခရိုပလိတ်များကို Grenier Flat 5A ပြားဆေးကြောခြင်းအစီအစဉ် #၁၂ ကို အသုံးပြု၍ ၀.၁% နို့ဖြင့် ၀.၁ M TBS တွင် ၅ ကြိမ်ဆေးကြောခဲ့သည်။
အောက်ခံအလွှာထည့်ခြင်း။ 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) 50 µl ကို အောက်ခံအလွှာထဲသို့ ထည့်ပါ။ (buffer ၂ စက်၊ TMB ၃ စက်၊ hydrogen peroxide ၂ စက်တို့ကို deionized water ၁၅ ml ထဲသို့ထည့်ခြင်းဖြင့်)။ အသုံးမပြုမီ TMB အောက်ခံနှင့် vortex ကိုပြင်ဆင်ပါ။ မိုက်ခရိုပလိတ်ကို အခန်းအပူချိန်တွင် မိနစ် ၃၀ ကြာ incubate လုပ်ပါ။ မှောင်သောနေရာတွင်ထားပါ။
အဆင့်ကို ပြီးအောင်လုပ်ပြီး ဆေးပြားကို ဖတ်ပါ။ 1 N ဆာလဖျူရစ်အက်ဆစ် 50 µl ကို ရေတွင်းတစ်ခုစီထဲသို့ထည့်ပြီး ELISA စာဖတ်စက်ကို အသုံးပြု၍ 450 မှ 655 nm အထိ absorbance ကို မှတ်တမ်းတင်ပါ။
ဤခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပစ္စည်းများ၏ 1 mg/ml ပျော်ရည်များကို အိုင်းယွန်းကင်းစင်သောရေတွင် ပြင်ဆင်ပါ- arabinose၊ rhamnose၊ fucose၊ xylose၊ galacturonic acid (GalA)၊ glucuronic acid (GlcA)၊ mannose၊ glucose၊ galactose၊ lactose၊ N-acetylmannosamine (manNAc)၊ N-acetylglucosamine (glcNAc)၊ N-acetylgalactosamine (galNAc)၊ inositol (အတွင်းပိုင်းစံနှုန်း)။ ဇယား ၁ တွင်ပြထားသော 1 mg/mL သကြားပျော်ရည်များကိုထည့်သွင်းခြင်းဖြင့် စံနှုန်းနှစ်ခုကို ပြင်ဆင်ခဲ့သည်။ နမူနာများကို ရေအားလုံးဖယ်ရှားသည်အထိ (များသောအားဖြင့် ၁၂-၁၈ နာရီခန့်) အေးခဲစေပြီး -၈၀°C တွင် lyophilized လုပ်သည်။
နမူနာ 100–500 µg ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာချိန်ခွင်လျှာပေါ်ရှိ screw cap ပြွန်များထဲသို့ ထည့်ပါ။ ထည့်သောပမာဏကို မှတ်တမ်းတင်ပါ။ နမူနာကို သတ်မှတ်ထားသော ပျော်ရည်ပါဝင်မှုတွင် ပျော်ဝင်စေပြီး ပြွန်ထဲသို့ အရည် aliquot အဖြစ်ထည့်ခြင်းသည် အကောင်းဆုံးဖြစ်သည်။ နမူနာပြွန်တစ်ခုစီအတွက် အတွင်းပိုင်းစံနှုန်းအဖြစ် 1 mg/ml inositol 20 µl ကို အသုံးပြုပါ။ နမူနာထဲသို့ ထည့်ထားသော အတွင်းပိုင်းစံနှုန်းပမာဏသည် စံပြပြွန်ထဲသို့ ထည့်ထားသော အတွင်းပိုင်းစံနှုန်းပမာဏနှင့် တူညီရမည်။
ရေဓာတ်မပါသော မီသနော ၈ မီလီလီတာကို ቀስልባ့အဖုံးပါသော ဖန်ပုလင်းထဲသို့ ထည့်ပါ။ ထို့နောက် အဖုံးအုပ်ပြီး လှုပ်ခါပေးသော ၃ N မီသနော ဟိုက်ဒရိုစကာ ၄ မီလီလီတာ။ ဤလုပ်ငန်းစဉ်တွင် ရေကို အသုံးမပြုပါ။
oligosaccharide နမူနာများနှင့် စံ TMS ပြွန်များထဲသို့ 1 M HCl မီသနော ပျော်ရည် 500 µl ထည့်ပါ။ နမူနာများကို 80°C တွင် thermal block တစ်ခုတွင် တစ်ညလုံး (168 နာရီ) ထားခဲ့သည်။ ခြောက်သွေ့သော manifold ကို အသုံးပြု၍ အခန်းအပူချိန်တွင် မီသနော ပြိုကွဲမှု ထုတ်ကုန်ကို အခြောက်ခံပါ။ MeOH 200 µl ထည့်ပြီး ထပ်မံအခြောက်ခံပါ။ ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကို နှစ်ကြိမ်ထပ်လုပ်ပါ။ မီသနော 200 µl၊ pyridine 100 µl နှင့် acetic anhydride 100 µl တို့ကို နမူနာထဲသို့ထည့်ပြီး သမအောင် ရောမွှေပါ။ အခန်းအပူချိန်တွင် နမူနာများကို မိနစ် 30 ကြာ အခြောက်ခံပါ။ မီသနော 200 µl ထည့်ပြီး ထပ်မံအခြောက်ခံပါ။
Tri-Sil ၂၀၀ µl ထည့်ပြီး အပူပေးထားသောပြွန်ကို မိနစ် ၂၀ ကြာအောင် ၈၀°C တွင် အပူပေးပါ၊ ထို့နောက် အခန်းအပူချိန်အထိ အအေးခံပါ။ နမူနာကို ၅၀ µl ခန့်အထိ ထပ်မံအခြောက်ခံရန် အခြောက်ခံပိုက်ကို အသုံးပြုပါ။ နမူနာများကို လုံးဝခြောက်သွေ့အောင် ခွင့်မပြုခဲ့ကြောင်း သတိပြုရန် အရေးကြီးပါသည်။
ဟက်ဇန်း ၂ မီလီလီတာထည့်ပြီး vortexing ဖြင့် သမအောင် မွှေပါ။ Pasteur pipettes (၅-၈ မီလီမီတာ) ၏ အဖျားများကို ဖန်ဝါဖြင့် ဖြည့်ပါ။ နမူနာများကို ၃၀၀၀ ဂရမ်တွင် ၂ မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။ မပျော်ဝင်နိုင်သော အကြွင်းအကျန်များကို ခဲစေပါ။ နမူနာကို ၁၀၀-၁၅၀ µl အထိ အခြောက်ခံပါ။ ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် ၁ μl ပမာဏကို GC-MS ထဲသို့ ၈၀°C ၏ ကနဦးအပူချိန်တွင် ၂.၀ မိနစ်ကြာ ထိုးသွင်းခဲ့သည် (ဇယား ၂)။