Grazzi talli żort Nature.com. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibilità fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Metodi immunoloġiċi u spettrometriċi tal-massa ġodda għall-analiżi kumplessa ta' oligosakkaridi persistenti fi stover tal-qamħirrum ittrattat minn qabel b'AFEX. Il-bijomassa lignoċellulożika hija alternattiva sostenibbli għall-fjuwils fossili u tintuża ħafna biex tiżviluppa bijoteknoloġiji għall-produzzjoni ta' prodotti bħal ikel, għalf, fjuwils u kimiċi. Iċ-ċavetta għal dawn it-teknoloġiji hija l-iżvilupp ta' proċessi kompetittivi fl-ispejjeż għall-konverżjoni ta' karboidrati kumplessi preżenti fil-ħitan taċ-ċelloli tal-pjanti f'zokkor sempliċi bħal glukożju, ksilożju u arabinożju. Minħabba li l-bijomassa lignoċellulożika hija iebsa ħafna, trid tkun soġġetta għal trattamenti termokimiċi (eż., esfoljazzjoni tal-fibra tal-ammonja (AFEX), aċidi dilwiti (DA), likwidi joniċi (IL)) u trattamenti bijoloġiċi (eż., idroliżi enżimatika u fermentazzjoni mikrobjali) flimkien biex jinkiseb il-prodott mixtieq. Madankollu, meta enzimi fungali kummerċjali jintużaw fil-proċess ta' idroliżi, 75-85% biss taz-zokkor solubbli ffurmat huma monosakkaridi, u l-15-25% li jifdal huma oligosakkaridi solubbli u diffiċli biex jiġu ttrattati, li mhux dejjem huma disponibbli għall-mikroorganiżmi. Preċedentement, iżolajna u ppurifikajna b'suċċess oligosakkaridi stubborn solubbli billi użajna taħlita ta' separazzjoni tal-karbonju u tad-diatomew u kromatografija ta' esklużjoni tad-daqs, u investigajna wkoll il-proprjetajiet inibitorji tal-enzimi tagħhom. Sibna li l-oligosakkaridi li fihom sostituzzjonijiet tal-aċidu uroniku metilat b'grad ogħla ta' polimerizzazzjoni (DP) huma aktar diffiċli biex jiġu pproċessati b'taħlitiet ta' enzimi kummerċjali milli oligosakkaridi b'DP baxx u newtrali. Hawnhekk nirrappurtaw l-użu ta' diversi metodi addizzjonali, inkluż il-profiling tal-glikan bl-użu ta' antikorpi monoklonali (mAbs) speċifiċi għall-glikani tal-bijomassa tal-pjanti biex jikkaratterizzaw bonds tal-glikan fil-ħitan taċ-ċelloli tal-pjanti u idrolisati enżimatiċi, jonizzazzjoni tad-desorbiment bil-lejżer assistita mill-matriċi, spettrometrija tal-massa tal-ħin tat-titjira. . MALDI-TOF-MS) juża qċaċet dijanjostiċi informattivi dwar l-istruttura miksuba permezz ta' spettroskopija wara tħassir sekondarju ta' joni negattivi, kromatografija tal-gass u spettrometrija tal-massa (GC-MS) biex jikkaratterizza bonds tal-oligosakkaridi bid-derivatizzazzjoni u mingħajrha. Minħabba d-daqs żgħir tal-oligosakkaridi (DP 4–20), dawn il-molekuli huma diffiċli biex jintużaw għall-irbit u l-karatterizzazzjoni tal-mAb. Biex negħlbu din il-problema, applikajna metodu ġdid ta' immobilizzazzjoni tal-oligosakkaridi bbażat fuq il-konjugazzjoni tal-bijotina li ttikketta b'suċċess il-maġġoranza tal-oligosakkaridi solubbli b'DP baxx fuq il-wiċċ tal-mikropjastra, li mbagħad intuża f'sistema ta' mAb b'rendiment għoli għal analiżi speċifika ta' ligazzjoni. Dan il-metodu ġdid se jiffaċilita l-iżvilupp ta' assays tal-glikoma b'rendiment għoli aktar avvanzati fil-futur li jistgħu jintużaw biex jiżolaw u jikkaratterizzaw l-oligosakkaridi preżenti fil-bijomarkaturi għal skopijiet dijanjostiċi.
Il-bijomassa lignoċellulożika, magħmula minn materjali agrikoli, forestali, tal-ħaxix u tal-injam, hija materja prima potenzjali għall-produzzjoni ta' prodotti b'bażi ​​bijoloġika, inkluż ikel, għalf, fjuwil u prekursuri kimiċi biex jipproduċu prodotti ta' valur ogħla1. Il-karboidrati (bħal ċelluloża u emiċelluloża) preżenti fil-ħitan taċ-ċelloli tal-pjanti huma depolimerizzati f'monosakkaridi permezz ta' pproċessar kimiku u bijotrasformazzjoni (bħal idroliżi enżimatika u fermentazzjoni mikrobjali). It-trattamenti minn qabel komuni jinkludu l-espansjoni tal-fibra tal-ammonja (AFEX), l-aċidu dilwit (DA), il-likwidu joniku (IL), u l-isplużjoni tal-fwar (SE), li jużaw taħlita ta' kimiċi u sħana biex inaqqsu l-produzzjoni tal-lignoċelluloża billi jiftħu l-ħitan taċ-ċelloli tal-pjanti3,4. ir-reżistenza għall-materja, 5. L-idroliżi enżimatika titwettaq b'tagħbija għolja ta' solidi bl-użu ta' enzimi kummerċjali attivi li fihom karboidrati (CAZymes) u fermentazzjoni mikrobjali bl-użu ta' ħmira jew batterji transġeniċi biex jipproduċu fjuwils u kimiċi b'bażi ​​bijoloġika6.
Is-CAZymes fl-enzimi kummerċjali huma magħmula minn taħlita kumplessa ta' enzimi li b'mod sinerġistiku jaqtgħu rabtiet kumplessi ta' karboidrati-zokkor biex jiffurmaw monosakkaridi2,7. Kif irrappurtajna qabel, in-netwerk kumpless ta' polimeri aromatiċi tal-lignin mal-karboidrati jagħmilhom diffiċli ħafna biex jiġu ttrattati, u dan iwassal għal konverżjoni mhux kompluta taz-zokkor, li takkumula 15-25% ta' oligosakkaridi sesswali li ma jiġux prodotti waqt l-idroliżi enżimatika tal-bijomassa ttrattata minn qabel. Din hija problema komuni b'diversi metodi ta' pretrattament tal-bijomassa. Xi raġunijiet għal dan l-ostaklu jinkludu l-inibizzjoni tal-enzimi waqt l-idroliżi, jew l-assenza jew livelli baxxi ta' enzimi essenzjali essenzjali li huma meħtieġa biex jinkisru r-rabtiet taz-zokkor fil-bijomassa tal-pjanti. Il-fehim tal-kompożizzjoni u l-karatteristiċi strutturali taz-zokkor, bħar-rabtiet taz-zokkor fl-oligosakkaridi, se jgħinna ntejbu l-konverżjoni taz-zokkor waqt l-idroliżi, u b'hekk il-proċessi bijoteknoloġiċi jkunu kompetittivi fl-ispejjeż mal-prodotti derivati ​​mill-pitrolju.
Id-determinazzjoni tal-istruttura tal-karboidrati hija ta’ sfida u teħtieġ taħlita ta’ metodi bħal kromatografija likwida (LC)11,12, spettroskopija tar-reżonanza manjetika nukleari (NMR)13, elettroforesi kapillari (CE)14,15,16 u spettrometrija tal-massa (MS)17. ,tmintax. Metodi MS bħall-ispettrometrija tal-massa time-of-flight b’desorbiment bil-lejżer u jonizzazzjoni bl-użu ta’ matriċi (MALDI-TOF-MS) huma metodu versatili għall-identifikazzjoni ta’ strutturi tal-karboidrati. Riċentement, l-MS tandem ta’ Dissoċjazzjoni Indotta minn Ħabta (CID) ta’ addotti tal-jone tas-sodju ntuża l-aktar biex jidentifika marki tas-swaba’ li jikkorrispondu għal pożizzjonijiet ta’ twaħħil ta’ oligosakkaridi, konfigurazzjonijiet anomeriċi, sekwenzi, u pożizzjonijiet ta’ fergħat 20, 21.
L-analiżi tal-glikan hija għodda eċċellenti għall-identifikazzjoni fil-fond tar-rabtiet tal-karboidrati22. Dan il-metodu juża antikorpi monoklonali (mAbs) diretti lejn il-glikan tal-ħajt taċ-ċellula tal-pjanti bħala sondi biex jifhem ir-rabtiet kumplessi tal-karboidrati. Aktar minn 250 mAbs huma disponibbli madwar id-dinja, iddisinjati kontra diversi oligosakkaridi lineari u ramifikati bl-użu ta' diversi sakkaridi24. Diversi mAbs intużaw ħafna biex jikkaratterizzaw l-istruttura, il-kompożizzjoni, u l-modifiki tal-ħajt taċ-ċellula tal-pjanti, peress li hemm differenzi sinifikanti skont it-tip ta' ċellula tal-pjanti, l-organu, l-età, l-istadju tal-iżvilupp, u l-ambjent tat-tkabbir25,26. Aktar reċentement, dan il-metodu ntuża biex jifhem il-popolazzjonijiet tal-vesikoli fis-sistemi tal-pjanti u tal-annimali u r-rwoli rispettivi tagħhom fit-trasport tal-glikan kif determinat minn markaturi subċellulari, stadji tal-iżvilupp, jew stimuli ambjentali, u biex jiddetermina l-attività enżimatika. Xi wħud mill-istrutturi differenti ta' glikani u ksilani li ġew identifikati jinkludu pektin (P), ksilan (X), mannan (M), ksiloglukani (XylG), glukani b'rabta mħallta (MLG), arabinoxylan (ArbX), galattomannan (GalG), aċidu glukuroniku-arabinoxylan (GArbX) u arabino-galattan (ArbG)29.
Madankollu, minkejja dawn l-isforzi kollha ta' riċerka, ftit studji biss iffokaw fuq in-natura tal-akkumulazzjoni tal-oligosakkaridi waqt l-idroliżi b'tagħbija għolja ta' solidi (HSL), inkluż ir-rilaxx tal-oligosakkaridi, bidliet fit-tul tal-katina oligomerika waqt l-idroliżi, diversi polimeri b'DP baxx, u l-kurvi tagħhom. distribuzzjonijiet 30,31,32. Sadanittant, għalkemm l-analiżi tal-glikan uriet li hija għodda utli għal analiżi komprensiva tal-istruttura tal-glikan, huwa diffiċli li jiġu evalwati l-oligosakkaridi b'DP baxx li jinħallu fl-ilma bl-użu ta' metodi ta' antikorpi. Oligosakkaridi DP iżgħar b'piż molekulari ta' inqas minn 5-10 kDa ma jorbtux mal-pjanċi ELISA 33, 34 u jinħaslu qabel iż-żieda tal-antikorpi.
Hawnhekk, għall-ewwel darba, qed nuru assay ELISA fuq pjanċi miksija bl-avidina bl-użu ta' antikorpi monoklonali, li jikkombinaw proċedura ta' bijotinilazzjoni f'pass wieħed għal oligosakkaridi refrattorji solubbli mal-analiżi tal-glikoma. L-approċċ tagħna għall-analiżi tal-glikoma ġie vvalidat permezz ta' analiżi bbażata fuq MALDI-TOF-MS u GC-MS ta' rabtiet ta' oligosakkaridi komplementari bl-użu tad-derivatizzazzjoni tat-trimethylsilyl (TMS) ta' kompożizzjonijiet ta' zokkor idrolizzat. Dan l-approċċ innovattiv jista' jiġi żviluppat bħala metodu ta' throughput għoli fil-futur u jsib applikazzjoni usa' fir-riċerka bijomedika35.
Modifiki post-traduzzjonali ta' enzimi u antikorpi, bħall-glikosilazzjoni,36 jaffettwaw l-attività bijoloġika tagħhom. Pereżempju, bidliet fil-glikosilazzjoni tal-proteini tas-serum għandhom rwol importanti fl-artrite infjammatorja, u bidliet fil-glikosilazzjoni jintużaw bħala markaturi dijanjostiċi37. Diversi glikani ġew irrappurtati fil-letteratura li jidhru faċilment f'varjetà ta' mard, inkluż mard infjammatorju kroniku tal-passaġġ gastrointestinali u l-fwied, infezzjonijiet virali, kanċer tal-ovarji, tas-sider u tal-prostata38,39,40. Il-fehim tal-istruttura tal-glikani bl-użu ta' metodi ELISA tal-glikan ibbażati fuq l-antikorpi se jipprovdi aktar kunfidenza fid-dijanjosi tal-mard mingħajr l-użu ta' metodi MS kumplessi.
L-istudju preċedenti tagħna wera li l-oligosakkaridi stubborn baqgħu mhux idrolizzati wara t-trattament minn qabel u l-idroliżi enżimatika (Figura 1). Fix-xogħol tagħna ppubblikat qabel, żviluppajna metodu ta' estrazzjoni f'fażi solida tal-faħam attivat biex niżolaw l-oligosakkaridi mill-idrolizzat tal-qamħirrum ittrattat minn qabel bl-AFEX (ACSH)8. Wara l-estrazzjoni u s-separazzjoni inizjali, l-oligosakkaridi ġew frazzjonati aktar permezz ta' kromatografija ta' esklużjoni tad-daqs (SEC) u miġbura skont il-piż molekulari. Il-monomeri u l-oligomeri taz-zokkor rilaxxati minn diversi trattamenti minn qabel ġew analizzati permezz ta' analiżi tal-kompożizzjoni taz-zokkor. Meta jitqabbel il-kontenut ta' oligomeri taz-zokkor miksuba b'diversi metodi ta' trattament minn qabel, il-preżenza ta' oligosakkaridi stubborn hija problema komuni fil-konverżjoni tal-bijomassa għal monosakkaridi u tista' twassal għal tnaqqis fir-rendiment taz-zokkor ta' mill-inqas 10-15% u anke sa 18%. Dan il-metodu jintuża għal aktar produzzjoni fuq skala kbira ta' frazzjonijiet ta' oligosakkaridi. L-ACH li jirriżulta u l-frazzjonijiet sussegwenti tiegħu b'piżijiet molekulari differenti ntużaw bħala materjal sperimentali għall-karatterizzazzjoni tal-oligosakkaridi f'dan ix-xogħol.
Wara t-trattament minn qabel u l-idroliżi enżimatika, l-oligosakkaridi persistenti baqgħu mhux idrolizzati. Hawnhekk (A) huwa metodu ta' separazzjoni tal-oligosakkaridi fejn l-oligosakkaridi huma iżolati minn idrolizzat tal-qamħirrum ittrattat minn qabel bl-AFEX (ACSH) bl-użu ta' sodda ppakkjata ta' karbonju attivat u trab diatomaċew; (B) Metodu għas-separazzjoni tal-oligosakkaridi. L-oligosakkaridi ġew separati aktar permezz ta' kromatografija ta' esklużjoni tad-daqs (SEC); (C) Monomeri u oligomeri tas-sakkaridi rilaxxati minn diversi trattamenti minn qabel (aċidu dilwit: DA, likwidu joniku: IL u AFEX). Kundizzjonijiet ta' idroliżi enżimatika: tagħbija għolja ta' solidi ta' 25% (w/w) (madwar 8% tagħbija ta' glukan), 96 siegħa ta' idroliżi, tagħbija ta' enzima kummerċjali ta' 20 mg/g (proporzjon Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) u (D) Monomeri taz-zokkor u oligomeri ta' glukożju, ksilożju u arabinożju rilaxxati minn qamħirrum ittrattat minn qabel bl-AFEX (ACS).
L-analiżi tal-glikani wriet li hija għodda utli għal analiżi strutturali komprensiva tal-glikani f'estratti iżolati minn residwi ta' bijomassa solida. Madankollu, is-sakkaridi li jinħallu fl-ilma huma sottorappreżentati bl-użu ta' dan il-metodu tradizzjonali41 għaliex l-oligosakkaridi ta' piż molekulari baxx huma diffiċli biex jiġu immobilizzati fuq pjanċi ELISA u jinħaslu qabel iż-żieda tal-antikorpi. Għalhekk, għall-irbit u l-karatterizzazzjoni tal-antikorpi, intuża metodu ta' bijotinilazzjoni f'pass wieħed biex jiksi oligosakkaridi solubbli u mhux konformi fuq pjanċi ELISA miksija bl-avidina. Dan il-metodu ġie ttestjat bl-użu tal-ACSH prodott qabel tagħna u frazzjoni bbażata fuq il-piż molekulari tiegħu (jew il-grad ta' polimerizzazzjoni, DP). Il-bijotinilazzjoni f'pass wieħed intużat biex tiżdied l-affinità tal-irbit tal-oligosakkaridi billi żdiedet bijotina-LC-idrazide mat-tarf li jnaqqas tal-karboidrat (Fig. 2). Fis-soluzzjoni, il-grupp hemiacetal fit-tarf li jnaqqas jirreaġixxi mal-grupp idrazide tal-bijotina-LC-idrazide biex jifforma rabta idrazona. Fil-preżenza tal-aġent li jnaqqas NaCNBH3, ir-rabta idrazona titnaqqas għal prodott finali bijotinilat stabbli. Bil-modifika tat-tarf li jnaqqas iz-zokkor, it-twaħħil ta' oligosakkaridi b'DP baxx ma' pjanċi ELISA sar possibbli, u fl-istudju tagħna dan sar fuq pjanċi miksija bl-avidina bl-użu ta' mAbs immirati lejn il-glikan.
Skrining ta' antikorpi monoklonali bbażati fuq ELISA għal oligosakkaridi bijotinilati. Hawnhekk (A) bijotinilazzjoni kkombinata ta' oligosakkaridi u skrining ELISA sussegwenti b'mAbs immirati lejn il-glikan fuq pjanċi miksija b'NeutrAvidin u (B) turi proċedura f'pass wieħed għall-bijotinilazzjoni ta' prodotti ta' reazzjoni.
Imbagħad ġew miżjuda pjanċi miksija b'avidin b'antikorpi konjugati b'oligosakkaridi ma' antikorpi primarji u sekondarji u maħsula f'mezz sensittiv għad-dawl u l-ħin. Wara li t-twaħħil tal-antikorpi jkun komplut, żid is-sottostrat TMB biex tinkuba l-pjanċa. Ir-reazzjoni finalment twaqqfet bl-aċidu sulfuriku. Il-pjanċi inkubati ġew analizzati bl-użu ta' qarrej ELISA biex tiġi ddeterminata s-saħħa tat-twaħħil ta' kull antikorp biex jiġi skopert cross-linking speċifiku għall-antikorpi. Għal dettalji u parametri tal-esperiment, ara t-taqsima korrispondenti "Materjali u Metodi".
Aħna nuru l-utilità ta' dan il-metodu żviluppat ġdid għal applikazzjonijiet speċifiċi billi nikkaratterizzaw l-oligosakkaridi solubbli preżenti fl-ACSH kif ukoll fi frazzjonijiet ta' oligosakkaridi mhux raffinati u purifikati iżolati minn idrolisati lignoċellulożiċi. Kif muri fil-Figura 3, l-aktar xylans sostitwiti b'epitopi komuni identifikati fl-ACSH bl-użu ta' metodi ta' analiżi tal-glikoma bijoaċilata huma ġeneralment arabinogalattani uroniċi (U) jew metiluroniċi (MeU) u pektiċi. Ħafna minnhom instabu wkoll fl-istudju preċedenti tagħna dwar l-analiżi tal-glikani ta' solidi mhux idrolizzati (UHS)43.
Sejbien ta' epitopi oligosakkaridi rikalċitranti bl-użu ta' antikorp monoklonali dirett lejn il-glikan tal-ħajt taċ-ċellula. Il-frazzjoni "newtrali" hija l-frazzjoni ACN u l-frazzjoni "aċiduża" hija l-frazzjoni FA. Aħmar aktar qawwi fuq il-mappa tas-sħana jindika kontenut ogħla ta' epitopi, u blu aktar qawwi jindika sfond vojt. Il-valuri tal-kulur fuq l-iskala huma bbażati fuq valuri OD mhux ipproċessati għal formulazzjonijiet N=2. L-epitopi ewlenin rikonoxxuti mill-antikorpi huma murija fuq il-lemin.
Dawn l-istrutturi mhux taċ-ċelluloża ma setgħux jinqatgħu mill-aktar ċellulosi u emiċellulosi komuni fit-taħlita ta' enzimi kummerċjali ttestjata, li tinkludi l-aktar enzimi kummerċjali użati komunement. Għalhekk, huma meħtieġa enzimi awżiljarji ġodda għall-idroliżi tagħhom. Mingħajr l-enzimi aċċessorji mhux taċ-ċelluloża meħtieġa, dawn il-bonds mhux taċ-ċelluloża jipprevjenu l-konverżjoni sħiħa għal monosakkaridi, anke jekk il-polimeri taz-zokkor ġenituri tagħhom jiġu idrolizzati b'mod estensiv fi frammenti iqsar u maħlula bl-użu ta' taħlitiet ta' enzimi kummerċjali.
Studju ulterjuri tad-distribuzzjoni tas-sinjal u s-saħħa tal-irbit tiegħu wera li l-epitopi tal-irbit kienu aktar baxxi fi frazzjonijiet taz-zokkor b'DP għoli (A, B, C, DP sa 20+) milli fi frazzjonijiet b'DP baxx (D, E, F, DP) fid-dimeri) (Fig. 1). Il-frammenti tal-aċidu huma aktar komuni f'epitopi mhux taċ-ċelluloża milli fi frammenti newtrali. Dawn il-fenomeni huma konsistenti max-xejra osservata fl-istudju preċedenti tagħna, fejn DP għoli u gruppi tal-aċidu kienu aktar reżistenti għall-idroliżi enżimatika. Għalhekk, il-preżenza ta' epitopi tal-glikan mhux taċ-ċelluloża u s-sostituzzjonijiet ta' U u MeU jistgħu jikkontribwixxu ħafna għall-istabbiltà tal-oligosakkaridi. Ta' min jinnota li l-effiċjenza tal-irbit u tad-detezzjoni tista' tkun problematika għal oligosakkaridi b'DP baxx, speċjalment jekk l-epitopu huwa oligosakkaridu dimeriku jew trimeriku. Dan jista' jiġi ttestjat bl-użu ta' oligosakkaridi kummerċjali ta' tulijiet differenti, kull wieħed fih epitopu wieħed biss li jorbot ma' mAb speċifiku.
Għalhekk, l-użu ta' antikorpi speċifiċi għall-istruttura żvela ċerti tipi ta' bonds rikalċitranti. Skont it-tip ta' antikorp użat, il-mudell xieraq ta' ligazzjoni, u s-saħħa tas-sinjal li jipproduċi (l-aktar u l-inqas abbundanti), enzimi ġodda jistgħu jiġu identifikati u miżjuda semi-kwantitattivament mat-taħlita tal-enzimi għal glikokonverżjoni aktar kompluta. Jekk nieħdu l-analiżi tal-oligosakkaridi ACSH bħala eżempju, nistgħu noħolqu database ta' bonds tal-glikan għal kull materjal tal-bijomassa. Ta' min jinnota hawnhekk li l-affinità differenti tal-antikorpi għandha titqies, u jekk l-affinità tagħhom mhix magħrufa, dan joħloq ċerti diffikultajiet meta jitqabblu s-sinjali ta' antikorpi differenti. Barra minn hekk, it-tqabbil tal-bonds tal-glikan jista' jaħdem l-aħjar bejn kampjuni għall-istess antikorp. Dawn il-bonds stubborn jistgħu mbagħad jiġu marbuta mad-database CAZyme, li minnha nistgħu nidentifikaw l-enzimi, nagħżlu enzimi kandidati u nittestjaw għal enzimi li jkissru l-bonds, jew niżviluppaw sistemi mikrobjali biex nesprimu dawn l-enzimi għall-użu fil-bijoraffineriji44.
Biex nevalwaw kif il-metodi immunoloġiċi jikkomplementaw metodi alternattivi għall-karatterizzazzjoni ta' oligosakkaridi ta' piż molekulari baxx preżenti f'idrolisati lignoċellulożiċi, wettaqna MALDI (Fig. 4, S1-S8) u analiżi ta' sakkaridi derivati ​​mit-TMS ibbażata fuq GC-MS fuq l-istess panel (Fig. 5) tal-parti tal-oligosakkaridi. MALDI jintuża biex jitqabbel jekk id-distribuzzjoni tal-massa tal-molekuli tal-oligosakkaridi taqbilx mal-istruttura maħsuba. Fil-fig. 4 turi MS tal-komponenti newtrali ACN-A u ACN-B. L-analiżi ACN-A kkonfermat firxa ta' zokkor pentożju li jvarjaw minn DP 4–8 (Fig. 4) sa DP 22 (Fig. S1), li l-piżijiet tagħhom jikkorrispondu għal oligosakkaridi MeU-xylan. L-analiżi ACN-B ikkonfermat is-serje pentożju u glukosakkaridi b'DP 8-15. F'materjal supplimentari bħall-Figura S3, il-mapep tad-distribuzzjoni tal-massa tal-partijiet aċidużi FA-C juru firxa ta' zokkor pentożju sostitwit b'(Me)U b'DP ta' 8-15 li huma konsistenti max-xylans sostitwiti misjuba fl-iskrinjar tal-mAb ibbażat fuq l-ELISA. L-epitopi huma konsistenti.
Spettru MALDI-MS ta' oligosakkaridi solubbli mhux konformi preżenti fl-ACS. Hawnhekk, (A) frazzjonijiet ta' firxa ta' piż baxx ta' ACN-A li fihom oligosakkaridi glucuroxylan sostitwiti b'aċidu uroniku metilat (DP 4-8) u (B) oligosakkaridi ACN-B xylan u aċidu uroniku metilat sostitwiti b'glucuroxylan (DP 8-15).
Analiżi tal-kompożizzjoni tar-residwu tal-glikan ta' oligosakkaridi refrattorji. Hawnhekk (A) Kompożizzjoni tas-sakkaridi tat-TMS ta' diversi frazzjonijiet ta' oligosakkaridi miksuba bl-użu tal-analiżi GC-MS. (B) Strutturi ta' diversi zokkor derivati ​​mit-TMS preżenti f'oligosakkaridi. ACN – frazzjoni tal-aċetonitrile li fiha oligosakkaridi newtrali u FA – frazzjoni tal-aċidu feruliku li fiha oligosakkaridi tal-aċidu.
Konklużjoni interessanti oħra ġiet meħuda mill-analiżi LC-MS tal-frazzjoni tal-oligosakkaridi, kif muri fil-Figura S9 (il-metodi jistgħu jidhru fil-materjal supplimentari elettroniku). Frammenti ta' gruppi hexose u -OAc ġew osservati ripetutament waqt il-ligazzjoni tal-frazzjoni ACN-B. Din is-sejba mhux biss tikkonferma l-frammentazzjoni osservata fl-analiżi tal-glikoma u MALDI-TOF, iżda tipprovdi wkoll informazzjoni ġdida dwar derivattivi potenzjali tal-karboidrati fil-bijomassa lignocellulosica ttrattata minn qabel.
Aħna wettaqna wkoll analiżi tal-kompożizzjoni tal-glikan tal-frazzjonijiet tal-oligosakkaridi bl-użu tad-derivatizzazzjoni tal-glikan TMS. Bl-użu tal-GC-MS, iddeterminajna l-kompożizzjoni taz-zokkor newrali (mhux derivattiv) u aċiduż (GluA u GalA) fil-frazzjoni tal-oligosakkaridi (Fig. 5). L-aċidu glukuroniku jinstab fil-komponenti aċidużi C u D, filwaqt li l-aċidu galatturoniku jinstab fil-komponenti aċidużi A u B, li t-tnejn huma komponenti DP għolja taz-zokkor aċiduż. Dawn ir-riżultati mhux biss jikkonfermaw id-dejta ELISA u MALDI tagħna, iżda huma wkoll konsistenti mal-istudji preċedenti tagħna dwar l-akkumulazzjoni tal-oligosakkaridi. Għalhekk, nemmnu li l-metodi immunoloġiċi moderni li jużaw il-bijotinilazzjoni tal-oligosakkaridi u l-iskrinjar ELISA sussegwenti huma biżżejjed biex jinstabu oligosakkaridi rikalċitranti solubbli f'diversi kampjuni bijoloġiċi.
Peress li l-metodi ta' skrinjar tal-mAb ibbażati fuq ELISA ġew ivvalidati b'diversi metodi differenti, ridna nesploraw aktar il-potenzjal ta' dan il-metodu kwantitattiv ġdid. Żewġ oligosakkaridi kummerċjali, xylexasaccharide oligosaccharide (XHE) u 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), inxtraw u ġew ittestjati bl-użu ta' approċċ ġdid ta' mAb li jimmira lejn il-glycan tal-ħajt taċ-ċellula. Il-Figura 6 turi korrelazzjoni lineari bejn is-sinjal ta' rbit bijotinilat u l-konċentrazzjoni logaritmika tal-konċentrazzjoni tal-oligosakkaridi, li tissuġġerixxi mudell possibbli ta' adsorbiment Langmuir. Fost l-mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, u CCRC-M151 kienu korrelati ma' XHE, u CCRC-M108, CCRC-M109, u LM11 kienu korrelati ma' A2XX fuq medda ta' 1 nm sa 100 nano. Minħabba d-disponibbiltà limitata ta' antikorpi matul l-esperiment, twettqu esperimenti limitati b'kull konċentrazzjoni ta' oligosakkaridi. Ta' min jinnota hawnhekk li xi antikorpi jirreaġixxu b'mod differenti ħafna għall-istess oligosakkaridu bħala sottostrat, preżumibbilment għax jorbtu ma' epitopi kemxejn differenti u jista' jkollhom affinitajiet ta' rbit differenti ħafna. Il-mekkaniżmi u l-implikazzjonijiet tal-identifikazzjoni preċiża tal-epitopi se jkunu ħafna aktar kumplessi meta l-approċċ il-ġdid tal-mAb jiġi applikat għal kampjuni reali.
Żewġ oligosakkaridi kummerċjali ntużaw biex jiġi ddeterminat il-medda ta' skoperta ta' diversi mAbs li jimmiraw il-glikan. Hawnhekk, korrelazzjonijiet lineari mal-konċentrazzjoni logaritmika tal-konċentrazzjoni tal-oligosakkaridi jindikaw mudelli ta' adsorbiment ta' Langmuir għal (A) XHE b'mAb u (B) A2XX b'mAb. L-epitopi korrispondenti jindikaw l-istrutturi tal-oligosakkaridi kummerċjali użati bħala sottostrati fl-assaġġ.
L-użu ta' antikorpi monoklonali mmirati lejn il-glikan (analiżi glikokomika jew skrinjar tal-mAb ibbażat fuq ELISA) huwa għodda qawwija għall-karatterizzazzjoni fil-fond tal-biċċa l-kbira tal-glikani ewlenin tal-ħajt taċ-ċelluli li jiffurmaw il-bijomassa tal-pjanti. Madankollu, l-analiżi klassika tal-glikan tikkaratterizza biss glikani akbar tal-ħajt taċ-ċelluli, peress li l-biċċa l-kbira tal-oligosakkaridi mhumiex immobilizzati b'mod effiċjenti fuq pjanċi ELISA. F'dan l-istudju, stover tal-qamħirrum ittrattat minn qabel bl-AFEX ġie idrolizzat enżimatikament b'kontenut għoli ta' solidi. L-analiżi taz-zokkor intużat biex tiddetermina l-kompożizzjoni tal-karboidrati rekalċitranti tal-ħajt taċ-ċelluli fl-idrolizzat. Madankollu, l-analiżi tal-mAb ta' oligosakkaridi iżgħar fl-idrolizzati hija sottovalutata, u huma meħtieġa għodod addizzjonali biex jiġu immobilizzati b'mod effettiv l-oligosakkaridi fuq pjanċi ELISA.
Hawnhekk qed nirrappurtaw metodu ġdid u effiċjenti ta' immobilizzazzjoni tal-oligosakkaridi għall-iskrinjar tal-mAb billi ngħaqqdu l-bijotinilazzjoni tal-oligosakkaridi segwita minn skrinjar ELISA fuq pjanċi miksija b'NeutrAvidin™. L-oligosakkaridi bijotinilati immobilizzati wrew affinità suffiċjenti għall-antikorp biex jippermettu skoperta rapida u effiċjenti ta' oligosakkaridi rekalċitranti. L-analiżi tal-kompożizzjoni ta' dawn l-oligosakkaridi stubborn ibbażata fuq l-ispettrometrija tal-massa kkonfermat ir-riżultati ta' dan l-approċċ ġdid għall-immunoskrinjar. Għalhekk, dawn l-istudji juru li l-kombinazzjoni tal-bijotinilazzjoni tal-oligosakkaridi u l-iskrinjar ELISA ma' antikorpi monoklonali mmirati lejn il-glikan tista' tintuża biex tiskopri crosslinks f'oligosakkaridi u tista' tiġi applikata b'mod wiesa' fi studji bijokimiċi oħra li jikkaratterizzaw l-istruttura tal-oligosakkaridi.
Dan il-metodu ta' profiling tal-glikan ibbażat fuq il-bijotina huwa l-ewwel rapport kapaċi jinvestiga r-rabtiet tal-karboidrati rekalċitranti ta' oligosakkaridi solubbli fil-bijomassa tal-pjanti. Dan jgħin biex wieħed jifhem għaliex xi partijiet tal-bijomassa huma daqshekk iebsa meta niġu għall-produzzjoni tal-bijofjuwil. Dan il-metodu jimla vojt importanti fil-metodi ta' analiżi tal-glikoma u jestendi l-applikazzjoni tiegħu għal firxa usa' ta' sottostrati lil hinn mill-oligosakkaridi tal-pjanti. Fil-futur, nistgħu nużaw ir-robotika għall-bijotinilazzjoni u nużaw il-metodu li żviluppajna għal analiżi b'rendiment għoli ta' kampjuni bl-użu tal-ELISA.
It-tiben tal-qamħirrum (CS) imkabbar miż-żerriegħa ibrida Pioneer 33A14 inħasad fl-2010 minn Kramer Farms f'Ray, Colorado. Bil-permess tas-sid tal-art, din il-bijomassa tista' tintuża għar-riċerka. Il-kampjuni nħażnu niexfa b'umdità ta' <6% f'boroż zip-lock f'temperatura tal-kamra. Il-kampjuni nħażnu niexfa b'umdità ta' <6% f'boroż zip-lock f'temperatura tal-kamra. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнат. Il-kampjuni nħażnu niexfa f'umdità ta' <6% f'boroż biż-żipp f'temperatura tal-kamra.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Il-kampjuni jinħażnu f'boroż biż-żipp f'temperatura tal-kamra b'umdità ta' < 6%.L-istudju kkonforma mal-linji gwida lokali u nazzjonali. L-analiżi kompożizzjonali twettqet bl-użu tal-protokoll NREL. Il-kompożizzjoni nstabet li fiha 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% proteina u 13.4% irmied.
Cellic® CTec2 (138 mg proteina/ml, lott VCNI 0001) huwa taħlita kumplessa ta' ċellulasi, β-glucosidasi u Cellic® HTec2 (157 mg proteina/ml, lott VHN00001) minn Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg proteina/mL), taħlita kumplessa ta' enzimi li jiddegradaw il-pektin, ingħatat minn DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Il-konċentrazzjonijiet tal-proteini tal-enzimi ġew determinati billi ġie stmat il-kontenut tal-proteini (u tnaqqas il-kontribuzzjoni tan-nitroġenu mhux tal-proteini) bl-użu tal-analiżi tan-nitroġenu Kjeldahl (metodu AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Id-dijatomeous earth 545 inxtara minn EMD Millipore (Billerica, MA). Il-karbonju attivat (DARCO, granuli ta' 100 malja), Avicel (PH-101), xylan tal-fagu, u l-kimiċi l-oħra kollha nxtraw minn Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
It-trattament minn qabel bl-AFEX twettaq fil-GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). It-trattament minn qabel twettaq f'temperatura ta' 140°C għal 15-il minuta. Ħin ta' residenza ta' 46 minuta b'proporzjon ta' 1:1 ta' ammonja anidra għall-bijomassa b'tagħbija ta' 60% (w/w) f'reattur tal-lott tal-istainless steel fuq il-bank (Parr Instruments Company). Dan ħa 30 minuta. Ir-reattur inġieb għal 140°C u l-ammonja ġiet rilaxxata malajr, u b'hekk il-bijomassa setgħet terġa' lura malajr għat-temperatura tal-kamra. Il-kompożizzjoni tal-qamħirrum ittrattat minn qabel bl-AFEX (ACS) kienet simili għal dik tal-qamħirrum mhux trattat (UT-CS).
ACSH b'kontenut għoli ta' solidi 25% (w/w) (madwar 8% tagħbija ta' dextran) tħejja bħala materjal tal-bidu għall-produzzjoni fuq skala kbira ta' oligosakkaridi. L-idroliżi enżimatika tal-ACS twettqet bl-użu ta' taħlita kummerċjali ta' enzimi li tinkludi Cellic® Ctec2 10 mg proteina/g glucan (f'bijomassa ttrattata minn qabel), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteina/g glucan, u Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg proteina/g dextran. L-idroliżi enżimatika twettqet f'bijoreattur ta' 5 litri b'volum ta' ħidma ta' 3 litri, pH 4.8, 50°C u 250 rpm. Wara idroliżi għal 96 siegħa, l-idrolizzat inġabar permezz ta' ċentrifugazzjoni b'6000 rpm għal 30 minuta u mbagħad b'14000 rpm għal 30 minuta biex jitneħħew is-solidi mhux idrolizzati. L-idrolizzat imbagħad ġie soġġett għal filtrazzjoni sterili permezz ta' beaker tal-filtru ta' 0.22 mm. L-idrolizzat iffiltrat inħażen fi fliexken sterili f'4°C u mbagħad ġie frazzjonat fuq il-karbonju.
Analiżi tal-kompożizzjoni ta' kampjuni ta' bijomassa bbażati fuq estratt skont il-proċeduri tal-analiżi tal-laboratorju NREL: tħejjija ta' kampjuni għall-analiżi tal-kompożizzjoni (NREL/TP-510-42620) u determinazzjoni ta' karboidrati strutturali u lignin fil-bijomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
L-analiżi tal-oligosakkaridi tal-fluss tal-idrolizzat twettqet fuq skala ta' 2 ml bl-użu ta' metodu ta' idroliżi tal-aċidu bbażat fuq awtoklavi. Ħallat il-kampjun tal-idrolizzat ma' 69.7 µl ta' 72% aċidu sulfuriku f'tubu tal-kultura b'tapp bil-kamin ta' 10 ml u inkuba għal siegħa fuq bank f'121 °C, kessaħ fuq is-silġ u ffiltra ġo kunjett ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja (HPLC). Il-konċentrazzjoni tal-oligosakkaridi ġiet determinata billi tnaqqset il-konċentrazzjoni tal-monosakkaridi fil-kampjun mhux idrolizzat mill-konċentrazzjoni totali taz-zokkor fil-kampjun idrolizzat bl-aċidu.
Il-konċentrazzjonijiet tal-glukożju, ksilożju, u arabinożju fil-bijomassa idrolizzata bl-aċidu ġew analizzati bl-użu ta' sistema Shimadzu HPLC mgħammra b'awtokampjunatur, heater tal-kolonna, pompa iżokratika, u ditekter tal-indiċi refrattiv fuq kolonna Bio-Rad Aminex HPX-87H. Il-kolonna nżammet f'50°C u ġiet eluwita b'0.6 ml/min 5 mM H2SO4 fi fluss ta' ilma.
Is-supernatant tal-idrolizzat ġie dilwit u analizzat għall-kontenut ta' monomeru u oligosakkaridu. Iz-zokkor monomeriku miksub wara l-idroliżi enżimatika ġie analizzat permezz ta' HPLC mgħammar b'kolonna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P u kolonna ta' protezzjoni tal-irmied. It-temperatura tal-kolonna nżammet fi 80°C, l-ilma ntuża bħala l-fażi mobbli b'rata ta' fluss ta' 0.6 ml/min. L-oligosakkaridi ġew determinati permezz ta' idroliżi f'aċidu dilwit fi 121°C skont il-metodi deskritti fir-refs. 41, 48, 49.
L-analiżi tas-sakkaridi twettqet fuq residwi tal-bijomassa mhux ipproċessati, ittrattati minn qabel bl-AFEX u fuq residwi kollha mhux idrolizzati (inkluża l-produzzjoni ta' estratti tas-saff taċ-ċelluli serjali u l-iskrinjar tal-mAb tagħhom) bl-użu ta' proċeduri deskritti qabel 27, 43, 50, 51. Għall-analiżi tal-glikoma, residwi li ma jinħallux fl-alkoħol ta' materjal tas-saff taċ-ċelluli tal-pjanti huma ppreparati minn residwi tal-bijomassa u soġġetti għal estrazzjoni serjali b'reaġenti dejjem aktar aggressivi bħal ossalat tal-ammonju (50 mM), karbonat tas-sodju (50 mM u 0.5% w/v), CON. (1M u 4M, it-tnejn b'1% w/v boroidridu tas-sodju) u klorit tal-aċidu kif deskritt qabel52,53. L-estratti mbagħad ġew soġġetti għal ELISA kontra panel kumpless ta' mAb50s diretti lejn il-glikan tas-saff taċ-ċelluli, u r-reazzjonijiet ta' rbit tal-mAb ġew ippreżentati bħala mappa tas-sħana. L-mAbs li jimmiraw lejn il-glikan tas-saff taċ-ċelluli tal-pjanti nxtraw minn stokks tal-laboratorju (serje CCRC, JIM u MAC).
Bijotinilazzjoni f'pass wieħed ta' oligosakkaridi. Il-konjugazzjoni ta' karboidrati ma' biotin-LC-hydrazide twettqet bl-użu tal-proċedura li ġejja. Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) ġie maħlul f'dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) billi tħawwad bil-qawwa u ssaħħan f'65°C għal minuta. Ġie miżjud aċidu aċetiku glaċjali (30 µl) u t-taħlita tferra' fuq sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) u nħallet kompletament wara s-sħana f'65°C għal madwar minuta. Imbagħad, minn 5 sa 8 μl tat-taħlita ta' reazzjoni ġew miżjuda mal-oligosakkaridu mnixxef (1-100 nmol) biex jinkiseb eċċess molari ta' 10 darbiet jew aktar tat-tikketta fuq it-tarf li jnaqqas. Ir-reazzjoni twettqet f'65°C għal sagħtejn, wara li l-kampjuni ġew purifikati immedjatament. Ma ntuża l-ebda ċjanoboroidrid tas-sodju fl-esperimenti tat-tikkettar mingħajr tnaqqis, u l-kampjuni rreaġixxew f'65°C għal 2.5 sigħat.
Kisi ELISA u ħasil ta' kampjuni ta' oligosakkaridi bijotinilati. 25 μl ta' kampjuni bijotinilati (100 μl ta' kull kampjun ikkonċentrat dilwit f'5 ml ta' soluzzjoni buffer Tris 0.1 M (TBS)) ġew miżjuda ma' kull bir tal-pjanċa miksija bl-avidina. Il-bjar tal-kontroll ġew miksija b'50 μl ta' bijotina f'konċentrazzjoni ta' 10 μg/ml f'TBS 0.1 M. Ilma dejonizzat intuża bħala kisi għall-kejl vojt. Il-pillola ġiet inkubata għal sagħtejn f'temperatura tal-kamra fid-dlam. Aħsel il-pjanċa 3 darbiet b'ħalib xkumat 0.1% f'TBS 0.1 M bl-użu tal-programm nru 11 għal Grenier flat 3A.
Żieda u ħasil ta' antikorpi primarji. Żid 40 µl ta' antikorp primarju ma' kull bir. Inkuba l-mikropjastra għal siegħa f'temperatura tal-kamra fid-dlam. Il-pjastri mbagħad inħaslu 3 darbiet b'ħalib ta' 0.1% f'0.1M TBS bl-użu tal-programm ta' ħasil #11 għal Grenier Flat 3A.
Żid l-antikorp sekondarju u aħsel. Żid 50 µl ta' antikorp sekondarju tal-ġrieden/firien (dilwit 1:5000 f'ħalib ta' 0.1% f'0.1 M TBS) ma' kull bir. Inkuba l-mikropjastra għal siegħa f'temperatura tal-kamra fid-dlam. Il-mikropjastri mbagħad inħaslu 5 darbiet b'ħalib ta' 0.1% f'0.1 M TBS bl-użu tal-programm tal-ħasil tal-pjastri Grenier Flat 5A #12.
Żieda ta' sottostrat. Żid 50 µl ta' 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) mas-sottostrat bażi (billi żżid 2 qatriet ta' buffer, 3 qatriet ta' TMB, 2 qatriet ta' perossidu tal-idroġenu ma' 15 ml ta' ilma dejonizzat). Ipprepara s-sottostrat TMB. u ħawwad qabel l-użu). Inkuba l-mikropjastra f'temperatura tal-kamra għal 30 minuta. Fid-dlam.
Imla l-pass u aqra l-pillola. Żid 50 µl ta' aċidu sulfuriku 1 N ma' kull bir u rreġistra l-assorbenza minn 450 sa 655 nm billi tuża qarrej ELISA.
Ipprepara soluzzjonijiet ta' 1 mg/ml ta' dawn l-analiti f'ilma dejonizzat: arabinożju, ramnożju, fukożju, ksilożju, aċidu galatturoniku (GalA), aċidu glukuroniku (GlcA), mannożju, glukożju, galattożju, lattożju, N-aċetilmannosamina (manNAc), N-aċetilglukożamina (glcNAc), N-aċetilgalattożjamina (galNAc), inositol (standard intern). Żewġ standards ġew ippreparati billi żidna s-soluzzjonijiet taz-zokkor ta' 1 mg/mL murija fit-Tabella 1. Il-kampjuni huma ffriżati u lijofilizzati f'temperatura ta' -80°C sakemm jitneħħa l-ilma kollu (ġeneralment madwar 12-18-il siegħa).
Żid 100–500 µg ta' kampjun mat-tubi b'tapp bil-kamin fuq bilanċ analitiku. Irreġistra l-ammont miżjud. L-aħjar li tħoll il-kampjun f'konċentrazzjoni speċifika ta' solvent u żżidu mat-tubu bħala alikwott likwidu. Uża 20 µl ta' 1 mg/ml inositol bħala standard intern għal kull tubu tal-kampjun. L-ammont ta' standard intern miżjud mal-kampjun għandu jkun l-istess bħall-ammont ta' standard intern miżjud mat-tubu standard.
Żid 8 ml ta' metanol anidru ma' kunjett b'tapp bil-kamin. Imbagħad żid 4 ml ta' soluzzjoni ta' 3 N HCl metanoliku, għalaq l-għatu u mħawwad. Dan il-proċess ma jużax ilma.
Żid 500 µl ta' soluzzjoni ta' 1 M HCl metanol mal-kampjuni tal-oligosakkaridi u t-tubi standard tat-TMS. Il-kampjuni ġew inkubati matul il-lejl (168 siegħa) f'80°C f'blokk termali. Nixxef il-prodott tal-metanoliżi f'temperatura tal-kamra bl-użu ta' manifold tat-tnixxif. Żid 200 µl MeOH u nixxef mill-ġdid. Dan il-proċess jiġi ripetut darbtejn. Żid 200 µl ta' metanol, 100 µl ta' piridina u 100 µl ta' anidride aċetika mal-kampjun u ħawwad sew. Inkuba l-kampjuni f'temperatura tal-kamra għal 30 minuta. Żid 200 µl ta' metanol u nixxef mill-ġdid.
Żid 200 µl ta' Tri-Sil u saħħan it-tubu b'tapp għal 20 minuta. 80°C, imbagħad kessaħ għat-temperatura tal-kamra. Uża manifold tat-tnixxif biex tnixxef aktar il-kampjun għal volum ta' madwar 50 µl. Huwa importanti li wieħed jinnota li ma ħallejniex il-kampjuni jinxfu kompletament.
Żid 2 ml ta' eżan u ħawwad sew billi tħawwad bil-vortiċi. Imla l-ponot tal-pipetti Pasteur (5-8 mm) b'biċċa suf tal-ħġieġ billi ddaħħal is-suf tal-ħġieġ fuq pipetta b'dijametru ta' 5-3/4 pulzieri. Il-kampjuni ġew ċentrifugati fi 3000 g għal 2 minuti. Kwalunkwe residwu li ma jinħallx jiġi preċipitat. Nixxef il-kampjun għal 100-150 µl. Volum ta' madwar 1 μl ġie injettat fil-GC-MS f'temperatura inizjali ta' 80 °C u ħin inizjali ta' 2.0 minuti (Tabella 2).