Merci fir Äre Besuch op Nature.com. D'Browserversioun, déi Dir benotzt, huet limitéiert CSS-Ënnerstëtzung. Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech, en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). An der Zwëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir d'Websäit ouni Stiler a JavaScript duerstellen.
Nei immunologesch a massenspektrometresch Methoden fir d'komplex Analyse vu persistenten Oligosacchariden a Maisstöck, déi mat AFEX virbehandelt goufen. Lignocellulose Biomass ass eng nohalteg Alternativ zu fossile Brennstoffer a gëtt wäit verbreet benotzt fir Biotechnologien fir d'Produktioun vu Produkter wéi Liewensmëttel, Fudder, Brennstoffer a Chemikalien z'entwéckelen. De Schlëssel zu dësen Technologien ass d'Entwécklung vu käschtekompetitive Prozesser fir komplex Kuelenhydrater, déi a Planzenzellwänn präsent sinn, an einfach Zucker wéi Glukos, Xylose an Arabinose ëmzewandelen. Well Lignocellulose Biomass ganz haartnäckeg ass, muss se thermochemesche Behandlungen (z.B. Ammoniakfaser-Exfoliatioun (AFEX), verdënnte Säuren (DA), ionesch Flëssegkeeten (IL)) a biologesche Behandlungen (z.B. enzymatesch Hydrolyse a mikrobiell Fermentatioun) a Kombinatioun ënnerworf ginn, fir dat gewënschte Produkt ze kréien. Wann awer kommerziell Pilzenzyme am Hydrolyseprozess benotzt ginn, sinn nëmmen 75-85% vun den entstane lösleche Zucker Monosacchariden, an déi reschtlech 15-25% sinn löslech, onkontrolléierbar Oligosacchariden, déi net ëmmer fir Mikroorganismen verfügbar sinn. Virdrun hu mir erfollegräich löslech, haartnäckeg Oligosacchariden isoléiert a gereinegt mat Hëllef vun enger Kombinatioun vu Kuelestoff- an Diatoméenäerd-Trennung a Gréisstenausschlusschromatographie, an och hir Enzyminhibitoreigenschaften ënnersicht. Mir hunn festgestallt, datt Oligosacchariden, déi methyléiert Uronsäuresubstitutiounen mat engem méi héije Polymerisatiounsgrad (DP) enthalen, méi schwéier mat kommerziellen Enzymmëschunge veraarbecht ze ginn ewéi Oligosacchariden mat gerénger DP- an neutraler Quantitéit. Hei bericht mir iwwer d'Benotzung vu verschiddenen zousätzleche Methoden, dorënner Glykanprofiléierung mat Hëllef vu monoklonalen Antikörper (mAbs), déi spezifesch fir Glykane aus Planzebiomasse sinn, fir Glykanbindungen a Planzenzellwänn an enzymateschen Hydrolysaten ze charakteriséieren, Matrix-gestëtzte Laserdesorptiounsioniséierung, Time-of-Flight-Massenspektrometrie. MALDI-TOF-MS benotzt strukturinformativ diagnostesch Peaks, déi duerch Spektroskopie nom sekundären Zerfall vun negativen Ionen, Gaschromatographie a Massenspektrometrie (GC-MS) kritt ginn, fir Oligosaccharidbindungen mat an ouni Derivatiséierung ze charakteriséieren. Wéinst der klenger Gréisst vun den Oligosacchariden (DP 4–20) sinn dës Moleküle schwéier fir mAb-Bindung a Charakteriséierung ze benotzen. Fir dëst Problem ze léisen, hu mir eng nei Biotin-Konjugatiounsbaséiert Oligosaccharid-Immobilisatiounsmethod ugewannt, déi déi meescht vun den löslechen Oligosacchariden mat nidderegem DP erfollegräich op der Mikroplackenuewerfläch markéiert huet, déi dann an engem High-Throughput-mAb-System fir spezifesch Ligatiounsanalyse benotzt goufen. Dës nei Method wäert an Zukunft d'Entwécklung vu méi fortgeschrattene High-Throughput-Glykome-Tests erliichteren, déi kënne benotzt ginn, fir Oligosacchariden, déi a Biomarker fir diagnostesch Zwecker präsent sinn, ze isoléieren an ze charakteriséieren.
Lignocellulosesch Biomass, déi aus landwirtschaftlecher, forstwirtschaftlecher, Gras- a Holzmaterialien zesummegesat ass, ass e potenziellen Ausgangsmaterial fir d'Produktioun vu biobaséierte Produkter, dorënner Liewensmëttel, Fudder, Brennstoff a chemesch Virleefer, fir Produkter mat méi héijem Wäert ze produzéieren1. Kuelenhydrater (wéi Cellulose an Hemicellulose), déi a Planzenzellwänn präsent sinn, ginn duerch chemesch Veraarbechtung a Biotransformatioun (wéi enzymatesch Hydrolyse a mikrobiell Fermentatioun) zu Monosacchariden depolymeriséiert. Heefeg Virbehandlungen enthalen Ammoniakfaserexpansioun (AFEX), verdënnte Säure (DA), ionesch Flëssegkeet (IL) an Dampexplosioun (SE), déi eng Kombinatioun vu Chemikalien an Hëtzt benotzen, fir d'Lignocelluloseproduktioun ze reduzéieren, andeems d'Planzenzellwänn opgemaach ginn3,4. Sturheet vun der Matière, 5. Enzymatesch Hydrolyse gëtt bei enger héijer Feststoffbelaaschtung mat kommerziellen aktiven Kuelenhydrat-enthaltenden Enzymer (CAZymes) a mikrobiell Fermentatioun mat transgenen Hefen oder Bakterien duerchgefouert, fir biobaséiert Brennstoffer a Chemikalien ze produzéieren6.
CAZyme a kommerziellen Enzyme bestinn aus enger komplexer Mëschung vun Enzymen, déi synergistesch komplex Kuelenhydrat-Zocker-Bindungen spalten, fir Monosacchariden ze bilden2,7. Wéi mir virdru bericht hunn, mécht dat komplex Netzwierk vun aromatesche Polymeren aus Lignin mat Kuelenhydrater se héich onkontrolléierbar, wat zu enger onvollstänneger Zockerkonversioun féiert, wouduerch 15-25% vun de Geschlechtsoligosacchariden accumuléiert ginn, déi net während der enzymatescher Hydrolyse vun der virbehandelter Biomasse produzéiert ginn. Dëst ass e gemeinsamt Problem mat verschiddene Biomasse-Virbehandlungsmethoden. E puer Grënn fir dësen Engpass sinn d'Enzyminhibitioun während der Hydrolyse oder d'Feele oder niddreg Niveauen vun essentiellen Enzymen, déi néideg sinn, fir Zockerbindungen an der Planzebiomasse ze briechen. D'Verständnis vun der Zesummesetzung an de strukturellen Charakteristike vun Zocker, wéi d'Zockerbindungen an Oligosacchariden, hëlleft eis, d'Zockerkonversioun während der Hydrolyse ze verbesseren, wouduerch biotechnologesch Prozesser käschtekompetitiv mat Pëtrolsprodukter ginn.
D'Struktur vu Kuelenhydrater ze bestëmmen ass eng Erausfuerderung a erfuerdert eng Kombinatioun vu Methoden wéi Flëssegkeetschromatographie (LC)11,12, Kärmagnetresonanzspektroskopie (NMR)13, Kapillarelektrophorese (CE)14,15,16 a Massenspektrometrie (MS)17. ,uechtzéng. MS-Methoden wéi Time-of-Flight-Massenspektrometrie mat Laserdesorption an Ioniséierung mat Hëllef vun enger Matrix (MALDI-TOF-MS) sinn eng villfälteg Method fir Kuelenhydratstrukturen z'identifizéieren. An der leschter Zäit gouf Kollisiounsinduzéiert Dissoziatioun (CID) Tandem MS vun Natriumionenaddukter am wäitste verbreet benotzt fir Fangerofdréck z'identifizéieren, déi Oligosaccharid-Uschlosspositiounen, anomer Konfiguratiounen, Sequenzen a Verzweigungspositiounen entspriechen 20, 21.
Glykananalyse ass en exzellent Instrument fir eng detailléiert Identifikatioun vu Kuelenhydratbindungen22. Dës Method benotzt monoklonal Antikörper (mAbs), déi op Glykan an der Planzenzellwand geriicht sinn, als Sonden, fir komplex Kuelenhydratbindungen ze verstoen. Méi wéi 250 mAbs sinn weltwäit verfügbar, déi géint verschidde linear an verzweigt Oligosacchariden mat verschiddene Sacchariden24 entwéckelt goufen. Verschidde mAbs goufen wäit verbreet benotzt, fir d'Struktur, d'Zesummesetzung an d'Modifikatioune vun der Planzenzellwand ze charakteriséieren, well et bedeitend Ënnerscheeder gëtt, ofhängeg vum Planzenzelltyp, Organ, Alter, Entwécklungsstadium a Wuestumsëmfeld25,26. Méi rezent gouf dës Method benotzt, fir Vesikelpopulatiounen a Planzen- an Déiersystemer an hir jeeweileg Rollen am Glykantransport ze verstoen, wéi se duerch subzellulär Markéierer, Entwécklungsstadien oder Ëmweltstimuli bestëmmt ginn, an fir d'enzymatesch Aktivitéit ze bestëmmen. E puer vun den ënnerschiddleche Strukturen vu Glykanen an Xylanen, déi identifizéiert goufen, enthalen Pektin (P), Xylan (X), Mannan (M), Xyloglucanen (XylG), gemëschte Bindungsglucanen (MLG), Arabinoxylan (ArbX), Galaktomannan (GalG), Glucuronsäure-Arabinoxylan (GArbX) an Arabino-Galaktan (ArbG)29.
Trotz all dësen Fuerschungsbemühungen hunn sech nëmmen e puer Studien op d'Natur vun der Oligosaccharid-Akkumulatioun während der Hydrolyse mat héijer Feststoffbelaaschtung (HSL) konzentréiert, dorënner d'Fräisetzung vun Oligosaccharid, Ännerungen vun der oligomerer Kettenlängt während der Hydrolyse, verschidde Polymere mat nidderegem DP-Gehalt an hir Verdeelungen 30,31,32. Mëttlerweil, obwuel d'Glykananalyse sech als nëtzlecht Instrument fir eng ëmfaassend Analyse vun der Glykanstruktur bewisen huet, ass et schwéier, waasserléislech Oligosaccharide mat nidderegem DP-Gehalt mat Antikörpermethoden ze evaluéieren. Méi kleng DP-Oligosaccharide mat engem Molekulargewiicht vu manner wéi 5-10 kDa bannen net un ELISA-Platten 33, 34 a ginn ewechgewäsch, ier d'Antikörper bäigefüügt ginn.
Hei demonstréiere mir fir d'éischt Kéier en ELISA-Assay op Avidin-beschichtete Placken mat monoklonalen Antikörper, andeems mir eng Een-Schrëtt-Biotinylierungsprozedur fir löslech refraktär Oligosacchariden mat Glycomanalyse kombinéiert. Eis Approche zur Glycomanalyse gouf duerch MALDI-TOF-MS an GC-MS baséiert Analyse vu komplementäre Oligosaccharid-Bindungen mat Hëllef vun der Trimethylsilyl (TMS)-Derivatiséierung vun hydrolyséierten Zockerkompositioune validéiert. Dësen innovativen Approche kann an Zukunft als High-Throughput-Method entwéckelt ginn a méi breet Uwendungen an der biomedizinescher Fuerschung fannen35.
Posttranslational Modifikatioune vun Enzymen an Antikörper, wéi Glykosylierung,36 beaflossen hir biologesch Aktivitéit. Zum Beispill spille Verännerungen an der Glykosylierung vu Serumproteinen eng wichteg Roll bei entzündlecher Arthritis, an Verännerungen an der Glykosylierung ginn als diagnostesch Markéierer37 benotzt. Verschidde Glykane goufen an der Literatur gemellt, déi direkt bei enger Villfalt vu Krankheeten optrieden, dorënner chronesch entzündlech Krankheeten vum Magen-Darm-Trakt a vun der Liewer, viral Infektiounen, Eierstock-, Broscht- a Prostatakriibs38,39,40. D'Verständnis vun der Struktur vu Glykane mat Hëllef vun Antikörper-baséierte Glykan-ELISA-Methoden gëtt zousätzlecht Vertrauen an der Krankheetsdiagnos ouni d'Benotzung vu komplexe MS-Methoden.
Eis fréier Studie huet gewisen, datt haartnäckeg Oligosacchariden no der Virbehandlung an der enzymatescher Hydrolyse net hydrolyséiert goufen (Figur 1). An eiser virdru publizéierter Aarbecht hu mir eng Festphas-Extraktiounsmethod mat Aktivkuel entwéckelt, fir Oligosacchariden aus AFEX-virbehandeltem Maisstoverhydrolysat (ACSH)8 ze isoléieren. No der initialer Extraktioun an Trennung goufen d'Oligosacchariden weider duerch Gréisstenausschlusschromatographie (SEC) fraktionéiert a no Molekulargewiicht gesammelt. Zockermonomeren an Oligomeren, déi aus verschiddene Virbehandlungen fräigesat goufen, goufen duerch Zockerzesummesetzungsanalyse analyséiert. Beim Verglach vum Inhalt vun Zockeroligomeren, déi duerch verschidde Virbehandlungsmethoden kritt goufen, ass d'Präsenz vun haartnäckegen Oligosacchariden e gemeinsamt Problem bei der Ëmwandlung vu Biomasse a Monosacchariden a kann zu enger Reduktioun vum Zockerausbezuch vun op d'mannst 10-15% a souguer bis zu 18% féieren. Dës Method gëtt fir weider grouss Produktioun vun Oligosaccharidfraktiounen benotzt. Den resultéierenden ACH a seng spéider Fraktiounen mat verschiddene Molekulargewiichter goufen als experimentellt Material fir d'Charakteriséierung vun Oligosacchariden an dëser Aarbecht benotzt.
No der Virbehandlung an enzymatescher Hydrolyse sinn persistent Oligosacchariden net hydrolyséiert bliwwen. Hei (A) ass eng Oligosaccharid-Trennungsmethod, bei där Oligosacchariden aus AFEX-virbehandeltem Maisstoverhydrolysat (ACSH) isoléiert ginn, andeems e gepackt Bett aus Aktivkuel an Diatoméenäerd benotzt gëtt; (B) Method fir d'Trennung vun Oligosacchariden. D'Oligosacchariden goufen weider duerch Gréisstenausschlusschromatographie (SEC) getrennt; (C) Saccharidmonomere an Oligomere, déi aus verschiddene Virbehandlungen fräigesat goufen (verdënnte Säure: DA, ionesch Flëssegkeet: IL an AFEX). Enzymatesch Hydrolysebedingungen: héich Feststoffbelaaschtung vun 25% (w/w) (ongeféier 8% Glucanbelaaschtung), 96 Stonnen Hydrolyse, 20 mg/g kommerziell Enzymbelaaschtung (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 Verhältnis) an (D) Zockermonomere an Oligomere vu Glukos, Xylose an Arabinose, déi aus AFEX-virbehandeltem Maisstover (ACS) fräigesat goufen.
D'Glykananalyse huet sech als nëtzlecht Instrument fir eng ëmfaassend Strukturanalyse vu Glykanen an Extrakter erwisen, déi aus feste Biomassereschter isoléiert goufen. Wéi och ëmmer, waasserléislech Sacchariden sinn ënnerrepresentéiert mat dëser traditioneller Method41, well Oligosacchariden mat nidderegem Molekulargewiicht schwéier op ELISA-Placken ze immobiliséieren sinn a virun der Zousaz vun Antikörper ausgewäsch ginn. Dofir gouf fir d'Antikörperbindung an d'Charakteriséierung eng Een-Schrëtt-Biotinyléierungsmethod benotzt fir léislech, net-konform Oligosacchariden op Avidin-beschichtete ELISA-Placken ze beschichten. Dës Method gouf mat eisem virdru produzéierten ACSH an enger Fraktioun baséiert op sengem Molekulargewiicht (oder Polymerisatiounsgrad, DP) getest. Eng Een-Schrëtt-Biotinyléierung gouf benotzt fir d'Bindungsaffinitéit vun den Oligosacchariden ze erhéijen andeems Biotin-LC-Hydrazid un den reduzéierenden Enn vum Kuelenhydrat bäigefüügt gouf (Fig. 2). An der Léisung reagéiert d'Hemiacetalgrupp um reduzéierenden Enn mat der Hydrazidgrupp vum Biotin-LC-Hydrazid fir eng Hydrazonbindung ze bilden. A Präsenz vum Reduktiounsmëttel NaCNBH3 gëtt d'Hydrazonbindung zu engem stabile biotinyléierten Endprodukt reduzéiert. Mat der Modifikatioun vum Zockerreduzéierenden Enn gouf d'Bindung vun Oligosacchariden mat nidderegem DP un ELISA-Platten méiglech, an an eiser Studie gouf dëst op Avidin-beschichtete Placken mat Glykan-gezielten mAbs gemaach.
Screening vu monoklonalen Antikörper baséiert op ELISA op biotinyléiert Oligosacchariden. Hei (A) kombinéiert d'Biotinyléierung vun Oligosacchariden an de spéideren ELISA-Screening mat Glykan-gezielten mAbs op NeutrAvidin-beschichtete Placken an (B) weist eng Een-Schrëtt-Prozedur fir d'Biotinyléierung vu Reaktiounsprodukter.
Avidin-beschichtete Placke mat Oligosaccharid-konjugéierten Antikörper goufen dann zu primären an sekundären Antikörper bäigefüügt a an engem liicht- an zäitsensitive Medium gewäsch. Nodeems d'Antikörperbindung ofgeschloss war, gëtt TMB-Substrat bäigefüügt fir d'Plack ze inkubéieren. D'Reaktioun gouf schliisslech mat Schwefelsäure gestoppt. Déi inkubéiert Placke goufen mat engem ELISA-Lieser analyséiert fir d'Bindungsstäerkt vun all Antikörper ze bestëmmen an antikörperspezifesch Vernetzung ze detektéieren. Fir Detailer a Parameter vum Experiment, kuckt déi entspriechend Sektioun "Materialien a Methoden".
Mir demonstréieren d'Nëtzlechkeet vun dëser nei entwéckelter Method fir spezifesch Uwendungen, andeems mir déi löslech Oligosacchariden, déi am ACSH präsent sinn, souwéi a rauen an gereinegten Oligosaccharidfraktiounen, déi aus Lignocellulosehydrolysaten isoléiert sinn, charakteriséieren. Wéi an der Figur 3 gewisen, sinn déi heefegst epitop-substituéiert Xylanen, déi am ACSH mat bioacyléierte Glykom-Assaymethoden identifizéiert ginn, normalerweis uronesch (U) oder methyluronesch (MeU) an pektesch Arabinogalaktanen. Déi meescht vun hinne goufen och an eiser viregter Studie iwwer d'Analyse vu Glykanen vun net-hydrolyséierte Feststoffer (UHS)43 fonnt.
Detektioun vu widderstännegen Oligosaccharid-Epitopen mat Hëllef vun engem monoklonalen Antikörper, deen op de Zellwandglykan geriicht ass. Déi "neutral" Fraktioun ass d'ACN-Fraktioun an déi "sauer" Fraktioun ass d'FA-Fraktioun. Méi hell Rout op der Hëtzekaart weisen en héijen Epitopgehalt un, a méi hell Blo weisen en eidelen Hannergrond un. D'Faarfwäerter op der Skala baséieren op réien OD-Wäerter fir d'Formuléierungen N=2. Déi Haaptepitopen, déi vun den Antikörper erkannt ginn, sinn op der rietser Säit gewisen.
Dës net-cellulose Strukturen konnten net vun den heefegsten Cellulasen an Hemicellulasen an der getester kommerzieller Enzymmëschung, déi déi am meeschte benotzt kommerziell Enzymer enthält, gespalt ginn. Dofir sinn nei Hëllefsenzymer fir hir Hydrolyse noutwendeg. Ouni déi néideg net-cellulose Hëllefsenzymer verhënneren dës net-cellulose Bindungen eng komplett Ëmwandlung a Monosacchariden, och wann hir Urzuckerpolymeren extensiv a méi kuerz Fragmenter hydrolyséiert a mat kommerziellen Enzymmëschunge geléist ginn.
Weider Studien iwwer d'Signalverdeelung a seng Bindungsstäerkt hunn gewisen, datt d'Bindungsepitope a Fraktiounen mat héijem DP (A, B, C, DP bis zu 20+) méi niddreg waren wéi a Fraktiounen mat nidderegem DP (D, E, F, DP) an Dimeren (Fig. 1). Säurefragmenter si méi heefeg an net-cellulose Epitope wéi an neutralen Fragmenter. Dës Phänomener entspriechen dem Muster, dat an eiser viregter Studie observéiert gouf, wou héich DP- a Säurebestanddeeler méi resistent géint enzymatesch Hydrolyse waren. Dofir kann d'Präsenz vun net-cellulose Glykan Epitope an U- a MeU-Substitutiounen staark zur Stabilitéit vun den Oligosacchariden bäidroen. Et sollt een drop hiweisen, datt d'Bindungs- an Detektiounseffizienz fir Oligosacchariden mat nidderegem DP problematesch ka sinn, besonnesch wann den Epitop en dimereschen oder trimereschen Oligosaccharid ass. Dëst kann mat kommerziellen Oligosacchariden vu verschiddene Längen getest ginn, déi all nëmmen een Epitop enthalen, deen un e spezifescht mAb bindt.
Sou huet d'Benotzung vu strukturspezifeschen Antikörper verschidden Aarte vu widderspréchleche Bindungen opgedeckt. Ofhängeg vun der Aart vum benotzten Antikörper, dem passenden Ligatiounsmuster an der Stäerkt vum Signal, dat e produzéiert (am meeschten an am mannsten heefeg), kënnen nei Enzymer identifizéiert a semi-quantitativ an d'Enzymmëschung bäigefüügt ginn, fir eng méi komplett Glykokonversioun. Wann een d'Analyse vun ACSH-Oligosacchariden als Beispill hëlt, kënne mir eng Datebank vu Glykanbindungen fir all Biomassematerial erstellen. Et sollt hei bemierkt ginn, datt déi ënnerschiddlech Affinitéit vun Antikörper berécksiichtegt soll ginn, a wann hir Affinitéit onbekannt ass, wäert dëst gewësse Schwieregkeeten beim Verglach vun de Signaler vu verschiddenen Antikörper schafen. Zousätzlech kann de Verglach vu Glykanbindungen am beschten tëscht Prouwe fir deeselwechten Antikörper funktionéieren. Dës haartnäckege Bindungen kënnen dann mat der CAZyme-Datebank verlinkt ginn, aus där mir Enzymer identifizéiere kënnen, Kandidatenzymer auswielen an op Bindungsbriechend Enzymer testen oder mikrobiell Systemer entwéckele kënnen, fir dës Enzymer fir d'Benotzung a Bioraffinerien auszedrécken.44
Fir ze evaluéieren, wéi immunologesch Methoden alternativ Methoden fir d'Charakteriséierung vun Oligosacchariden mat nidderegem Molekulargewiicht, déi a Lignocellulosehydrolysaten präsent sinn, ergänzen, hu mir MALDI (Fig. 4, S1-S8) an eng Analyse vun TMS-ofgeleeten Sacchariden baséiert op GC-MS um selwechte Panel (Fig. 5) Oligosacchariddeel duerchgefouert. MALDI gëtt benotzt fir ze vergläichen, ob d'Masseverdeelung vun den Oligosaccharidmoleküle mat der gewënschter Struktur iwwereneestëmmt. Op Fig. 4 gëtt d'MS vun den neutralen Komponenten ACN-A an ACN-B gewisen. D'ACN-A-Analyse huet eng Palette vu Pentosezucker vun DP 4–8 (Fig. 4) bis DP 22 (Fig. S1) bestätegt, deenen hir Gewiichter de MeU-Xylan-Oligosacchariden entspriechen. D'ACN-B-Analyse huet d'Pentose- a Glucoxylan-Serie mat DP 8-15 bestätegt. An zousätzlechem Material wéi der Figur S3 weisen d'FA-C-Säure-Eenheets-Masseverdeelungskaarte eng Palette vun (Me)U-substituéierten Pentosezucker mat engem DP vun 8-15, déi mat de substituéierten Xylanen iwwereneestëmmen, déi am ELISA-baséierten mAb-Screening fonnt goufen. D'Epitope si konsequent.
MALDI-MS Spektrum vu lösleche net-konforme Oligosacchariden, déi an ACS präsent sinn. Hei (A) ACN-A Fraktiounen am niddrege Gewiichtsberäich, déi methyléiert Uronsäure (DP 4-8) enthalen, substituéiert mat Glucuroxylan-Oligosacchariden, an (B) ACN-B Xylan an methyléiert Uronsäure-Oligosacchariden, substituéiert mat Glucuroxylan (DP 8-15).
Analyse vun der Zesummesetzung vum Glykanreschter vu refraktäre Oligosacchariden. Hei (A) TMS-Saccharidzesummesetzung vu verschiddenen Oligosaccharidfraktiounen, déi mat GC-MS-Analyse kritt goufen. (B) Strukturen vu verschiddenen TMS-ofgeleeten Zucker, déi an Oligosacchariden präsent sinn. ACN – Acetonitrilfraktioun mat neutralen Oligosacchariden an FA – Ferulinsäurefraktioun mat Säure-Oligosacchariden.
Eng aner interessant Conclusioun gouf aus der LC-MS-Analyse vun der Oligosaccharidfraktioun gezunn, wéi an der Figur S9 gewisen (Methode kënnen am elektroneschen Ergänzungsmaterial gesi ginn). Fragmenter vun Hexose- an -OAc-Gruppen goufen ëmmer erëm während der Ligatioun vun der ACN-B-Fraktioun observéiert. Dës Erkenntnis bestätegt net nëmmen d'Fragmentéierung, déi an der Glycom- an der MALDI-TOF-Analyse observéiert gouf, mä liwwert och nei Informatiounen iwwer potenziell Kuelenhydratderivater an der virbehandelter Lignocellulosebiomass.
Mir hunn och eng Glykan-Zesummesetzungsanalyse vun Oligosaccharidfraktiounen mat Hëllef vun der TMS-Glykan-Derivatiséierung duerchgefouert. Mat GC-MS hu mir d'Zesummesetzung vun neurale (net-derivativen) an sauren Zucker (GluA a GalA) an der Oligosaccharidfraktioun bestëmmt (Fig. 5). Glucuronsäure gëtt an de sauren Komponenten C an D fonnt, während Galakturonsäure an de sauren Komponenten A a B fonnt gëtt, déi allebéid Komponenten mat héijem DP vu sauren Zucker sinn. Dës Resultater bestätegen net nëmmen eis ELISA- an MALDI-Donnéeën, mä si konsistent och mat eise fréiere Studien iwwer d'Akkumulatioun vun Oligosacchariden. Dofir gleewen mir, datt modern immunologesch Methoden, déi d'Biotinyléierung vun Oligosacchariden an den uschléissenden ELISA-Screening benotzen, ausreeche fir löslech widderspréchlech Oligosacchariden a verschiddene biologesche Proben z'entdecken.
Well ELISA-baséiert mAb-Screeningmethoden duerch verschidde Methode validéiert goufen, wollte mir de Potenzial vun dëser neier quantitativer Method weider exploréieren. Zwee kommerziell Oligosacchariden, Xylohexasaccharid-Oligosaccharid (XHE) an 23-α-L-Arabinofuranosyl-Xylotriose (A2XX), goufen kaaft an mat engem neien mAb-Usaz getest, deen op de Zellwandglykan abzielt. Figur 6 weist eng linear Korrelatioun tëscht dem biotinyléierte Bindungssignal an der logarithmescher Konzentratioun vun der Oligosaccharidkonzentratioun, wat op e méiglecht Langmuir-Adsorptiounsmodell hiweist. Ënnert den mAbs korreléierten CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 a CCRC-M151 mat XHE, an CCRC-M108, CCRC-M109 an LM11 mat A2XX iwwer e Beräich vun 1 nm bis 100 nano. Wéinst der limitéierter Disponibilitéit vun Antikörper während dem Experiment goufen nëmme limitéiert Experimenter mat all Oligosaccharidkonzentratioun duerchgefouert. Et sollt hei bemierkt ginn, datt verschidden Antikörper ganz anescht op datselwecht Oligosaccharid als Substrat reagéieren, wahrscheinlech well se un liicht ënnerschiddlech Epitope binden a ganz ënnerschiddlech Bindungsaffinitéite kënnen hunn. D'Mechanismen an d'Implikatioune vun enger korrekter Epitopidentifikatioun wäerte vill méi komplex sinn, wann den neien mAb-Usaz op richteg Proben ugewannt gëtt.
Zwee kommerziell Oligosacchariden goufen benotzt fir den Detektiounsberäich vu verschiddene Glykan-zielende mAbs ze bestëmmen. Hei weisen linear Korrelatiounen mat der Log-Konzentratioun vun der Oligosaccharidkonzentratioun Langmuir-Adsorptiounsmuster fir (A) XHE mat mAb an (B) A2XX mat mAb. Déi entspriechend Epitope weisen d'Strukturen vun de kommerziellen Oligosacchariden un, déi als Substrate am Assay benotzt ginn.
D'Benotzung vu Glykan-gezielte monoklonalen Antikörper (glykokomesch Analyse oder ELISA-baséiert mAb-Screening) ass e mächtegt Instrument fir eng detailléiert Charakteriséierung vun de meeschte vun den Haaptzellwandglykanen, déi d'Planzebiomass ausmaachen. Wéi och ëmmer, charakteriséiert déi klassesch Glykananalyse nëmme méi grouss Zellwandglykanen, well déi meescht Oligosacchariden net effizient op ELISA-Platten immobiliséiert sinn. An dëser Studie gouf AFEX-virbehandelt Maisstrëmp enzymatesch bei engem héije Feststoffgehalt hydrolyséiert. D'Zockeranalyse gouf benotzt fir d'Zesummesetzung vun widderstanen Zellwandkuelenhydrater am Hydrolysat ze bestëmmen. Wéi och ëmmer, d'mAb-Analyse vu méi klenge Oligosacchariden an Hydrolysaten gëtt ënnerschat, an zousätzlech Instrumenter sinn néideg fir Oligosacchariden effektiv op ELISA-Platten ze immobiliséieren.
Mir presentéieren hei eng nei an effizient Oligosaccharid-Immobilisatiounsmethod fir mAb-Screening andeems mir Oligosaccharid-Biotinyléierung gefollegt vun ELISA-Screening op NeutrAvidin™-beschichtete Placken kombinéiert. Déi immobiliséiert biotinyléiert Oligosacchariden hunn eng genuch Affinitéit fir den Antikörper gewisen, fir eng séier an effizient Detektioun vu widderstanen Oligosacchariden z'erméiglechen. D'Analyse vun der Zesummesetzung vun dësen haartnäckegen Oligosacchariden baséiert op Massenspektrometrie huet d'Resultater vun dësem neien Usaz zum Immunoscreening bestätegt. Dofir weisen dës Studien, datt d'Kombinatioun vun Oligosaccharid-Biotinyléierung an ELISA-Screening mat Glykan-gezielten monoklonalen Antikörper ka benotzt ginn, fir Vernetzungen an Oligosacchariden z'entdecken, a ka wäit an anere biochemesche Studien, déi d'Struktur vun Oligosacchariden charakteriséieren, ugewannt ginn.
Dës Biotin-baséiert Glykanprofiléierungsmethod ass den éischte Bericht, deen déi widderstandsfäeg Kuelenhydratbindunge vu léisleche Oligosacchariden an der Planzebiomass ënnersiche kann. Dëst hëlleft ze verstoen, firwat verschidden Deeler vun der Biomass sou haartnäckeg sinn, wann et ëm d'Produktioun vu Biokraftstoff geet. Dës Method fëllt eng wichteg Lück an de Glykomanalysemethoden an erweidert hir Uwendung op e méi breede Spektrum vu Substrater iwwer Planze-Oligosacchariden eraus. An Zukunft kënne mir Robotik fir d'Biotinyléierung benotzen an d'Method benotzen, déi mir fir d'High-Throughput-Analyse vu Proben mat Hëllef vun ELISA entwéckelt hunn.
Maisstréi (CS), deen aus Pioneer 33A14 Hybridsomen ugebaut gouf, gouf am Joer 2010 vun de Kramer Farms zu Ray, Colorado, geernt. Mat der Erlaabnes vum Grondbesëtzer kann dës Biomasse fir d'Fuerschung benotzt ginn. D'Prouwen goufen dréchen < 6% Fiichtegkeet a Zip-Lock-Tuten bei Raumtemperatur gelagert. D'Prouwen goufen dréchen < 6% Fiichtegkeet a Zip-Lock-Tuten bei Raumtemperatur gelagert. D'Veraarbechtung vun der Verëffentlechung fir d'Verwäertung < 6% op d'Pakete mat der Erhéijung vun der Kommissioun. D'Prouwen goufen dréchen bei enger Loftfiichtegkeet vu <6% a Säck mat Reißverschluss bei Raumtemperatur gelagert.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% D'Unzuel vun de Bedierfnesser mat der Verëffentlechung vun der Verëffentlechung ass < 6%. D'Prouwe ginn a Reißverschlussbeutel bei Raumtemperatur mat enger Fiichtegkeet vu < 6% gelagert.D'Studie huet mat lokalen a nationalen Richtlinne konform gehalen. D'Zesummesetzungsanalyse gouf mam NREL-Protokoll duerchgefouert. Et gouf festgestallt, datt d'Zesummesetzung 31,4% Glucan, 18,7% Xylan, 3,3% Arabinan, 1,2% Galaktan, 2,2% Acetyl, 14,3% Lignin, 1,7% Protein an 13,4% Äsch enthält.
Cellic® CTec2 (138 mg Protein/ml, Lot VCNI 0001) ass eng komplex Mëschung aus Cellulase, β-Glukosidase a Cellic® HTec2 (157 mg Protein/ml, Lot VHN00001) vun Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg Protein/ml), eng komplex Mëschung vu Pektin-ofbauenden Enzymen, gouf vun DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) gespent. D'Enzymproteinkonzentratioune goufen duerch d'Schätzung vum Proteingehalt (an d'Subtraktioun vum Bäitrag vum net-Protein-Stickstoff) mat Hëllef vun der Kjeldahl-Stickstoffanalyse (AOAC Method 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) bestëmmt. Diatoméenäerd 545 gouf vun EMD Millipore (Billerica, MA) kaaft. Aktivkuel (DARCO, 100 Mesh Granulat), Avicel (PH-101), Buchenxylan an all aner Chemikalien goufe vu Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) kaaft.
D'AFEX-Virbehandlung gouf am GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA) duerchgefouert. D'Virbehandlung gouf bei 140°C fir 15 Minutten duerchgefouert. D'Openthaltszäit war 46 Minutten bei engem Verhältnes vun 1:1 vun wasserfreiem Ammoniak zu Biomasse bei 60% (w/w) Belaaschtung an engem Edelstahl-Benchtop-Batchreaktor (Parr Instruments Company). Et huet 30 Minutten gedauert. De Reaktor gouf op 140°C bruecht an den Ammoniak gouf séier fräigesat, sou datt d'Biomass séier op Raumtemperatur zréckkoum. D'Zesummesetzung vum AFEX-virbehandelte Maisstrov (ACS) war ähnlech wéi déi vum onbehandelte Maisstrov (UT-CS).
ACSH mat héijem Feststoffgehalt 25% (w/w) (ongeféier 8% Dextranbelaaschtung) gouf als Ausgangsmaterial fir d'Groussproduktioun vun Oligosacchariden preparéiert. Enzymatesch Hydrolyse vun ACS gouf mat enger kommerzieller Enzymmëschung duerchgefouert, déi Cellic® Ctec2 10 mg Protein/g Glucan (an virbehandelter Biomasse), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg Protein/g Glucan a Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) enthält. ), 5 mg Protein/g Dextran. Déi enzymatesch Hydrolyse gouf an engem 5-Liter Bioreaktor mat engem Aarbechtsvolumen vun 3 Liter, pH 4,8, 50°C an 250 rpm duerchgefouert. No der Hydrolyse fir 96 Stonnen gouf den Hydrolysat duerch Zentrifugatioun bei 6000 rpm fir 30 Minutten an duerno bei 14000 rpm fir 30 Minutten gesammelt, fir nethydrolyséiert Feststoffer ze entfernen. Den Hydrolysat gouf dann steril duerch e 0,22 mm Filterbecher gefiltert. Den gefilterten Hydrolysat gouf a sterile Fläsche bei 4°C gelagert an duerno op Kuelestoff fraktionéiert.
Analyse vun der Zesummesetzung vu Biomasseprouwen op Basis vun Extrakter no den NREL-Laboratoireanalyseprozeduren: Virbereedung vu Prouwen fir d'Zesummesetzungsanalyse (NREL/TP-510-42620) a Bestëmmung vu strukturelle Kuelenhydrater a Lignin an der Biomasse (NREL/TP-510 – 42618)47.
D'Oligosaccharidanalyse vum Hydrolysatstroum gouf op enger 2 ml Skala mat enger Autoklav-baséierter Säurehydrolysemethod duerchgefouert. Mëscht d'Hydrolysatprouf mat 69,7 µl 72% Schwefelsäure an engem 10 ml Kulturröhrchen mat Schraufverschluss a léisst 1 Stonn op enger Aarbechtsplaz bei 121 °C inkubéieren, killt op Äis of a filtert an e Fläschchen mat Héichleistungsflëssegkeetschromatographie (HPLC). D'Konzentratioun vun den Oligosacchariden gouf bestëmmt andeems d'Konzentratioun vu Monosacchariden an der net-hydrolyséierter Prouf vun der gesamter Zockerkonzentratioun an der sauerhydrolyséierter Prouf subtrahéiert gouf.
D'Glukos-, Xylose- an Arabinosekonzentratioune vun der sauer hydrolyséierter Biomasse goufen mat engem Shimadzu HPLC-System analyséiert, dat mat engem Autosampler, enger Kolonnenheizung, enger isokratischer Pompel an engem Breechungsindexdetektor op enger Bio-Rad Aminex HPX-87H Kolonn ausgestatt war. D'Kolonn gouf bei 50°C gehalen an mat 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 a Waasser eluéiert.
Den Hydrolysatsupernatant gouf verdënnt an op Monomer- an Oligosaccharidgehalt analyséiert. Monomer Zucker, déi no der enzymatescher Hydrolyse kritt goufen, goufen duerch HPLC analyséiert, déi mat enger Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P Kolonn an enger Ash Guard Kolonn ausgestatt war. D'Kolonntemperatur gouf op 80°C gehalen, Waasser gouf als mobil Phas mat enger Duerchflussrate vun 0,6 ml/min benotzt. D'Oligosaccharide goufen duerch Hydrolyse a verdënnter Säure bei 121°C no de Methoden bestëmmt, déi an de Referenzen 41, 48, 49 beschriwwe sinn.
D'Saccharidanalyse gouf op réien, AFEX-virbehandelten an all net-hydrolyséierte Biomassereschter (inklusiv der Produktioun vu seriellen Zellwandextrakten an hirem mAb-Screening) mat Hëllef vun de virdru beschriwwene Prozeduren 27, 43, 50, 51 duerchgefouert. Fir d'Glykomanalyse ginn alkoholonléislech Reschter vu Planzenzellwandmaterial aus Biomassereschter preparéiert an enger serieller Extraktioun mat ëmmer méi aggressiven Reagenzien wéi Ammoniumoxalat (50 mM), Natriumkarbonat (50 mM an 0,5% w/v), CON. (1M an 4M, béid mat 1% w/v Natriumborhydrid) a Säurechlorit ënnerworf, wéi virdru beschriwwen 52,53. D'Extrakter goufen dann engem ELISA-Test géint e komplexe Panel vun mAb50s ënnerworf, déi op de Zellwandglykan geriicht waren, an d'mAb-Bindungsreaktiounen goufen als Hëtzekaart presentéiert. mAbs, déi op Planzenzellwandglykan gezielt waren, goufen aus Laborbestänn (CCRC-, JIM- a MAC-Serie) kaaft.
Een-Schrëtt-Biotinyléierung vun Oligosacchariden. D'Konjugatioun vu Kuelenhydrater mat Biotin-LC-Hydrazid gouf mat der folgender Prozedur duerchgefouert. Biotin-LC-Hydrazid (4,6 mg/12 μmol) gouf an Dimethylsulfoxid (DMSO, 70 μl) duerch kräftegt Réieren an 1 Minutt bei 65°C erhëtzen geléist. Äiseddik (30 μl) gouf derbäigesat an d'Mëschung gouf op Natriumcyanoborhydrid (6,4 mg/100 µmol) gegoss an no ongeféier 1 Minutt bei 65°C erhëtzen komplett opgeléist. Duerno goufen 5 bis 8 μl vun der Reaktiounsmëschung dem gedréchenten Oligosaccharid (1-100 nmol) bäigefüügt, fir en 10-fache oder méi molare Iwwerschoss vum Label iwwer dem reduzéierenden Enn ze kréien. D'Reaktioun gouf 2 Stonnen bei 65°C duerchgefouert, duerno goufen d'Prouwe direkt gereinegt. Kee Natriumcyanoborhydrid gouf an den Etikettéierungsexperimenter ouni Reduktioun benotzt, an d'Prouwen goufen 2,5 Stonnen bei 65°C reagéiert.
ELISA-Beschichtung a Wäschung vu Prouwe vu biotinyléierten Oligosacchariden. 25 μl biotinyléierte Prouwe (100 μl vun all konzentréierter Prouf verdënnt an 5 ml vun 0,1 M Tris-Pufferléisung (TBS)) goufen an all Lach vun der Avidin-beschichteter Plack bäigefüügt. Kontrolllücke goufen mat 50 μl Biotin an enger Konzentratioun vun 10 μg/ml an 0,1 M TBS beschichtet. Deioniséiert Waasser gouf als Beschichtung fir d'Blindmiessunge benotzt. D'Tablett gouf 2 Stonnen bei Raumtemperatur am Däischteren inkubéiert. D'Plack 3-mol mat 0,1% Magermëllech an 0,1 M TBS mat dem Programm Nr. 11 fir Grenier-Flaach 3A wäschen.
Zousätz a Wäsche vun de primären Antikörper. Gitt 40 µl primären Antikörper an all Lach. Inkubéiert d'Mikroteller 1 Stonn bei Raumtemperatur am Däischteren. D'Teller goufen dann 3-mol mat 0,1% Mëllech an 0,1M TBS mat dem Wäschprogramm Nr. 11 fir Grenier Flat 3A gewäsch.
Sekundärantikörper derbäiginn a wäschen. An all Lach 50 µl sekundärantikörper vu Maus/Ratt (verdënnt 1:5000 an 0,1% Mëllech an 0,1 M TBS). D'Mikroteller 1 Stonn bei Raumtemperatur am Däischteren inkubéieren. D'Mikroteller goufen dann 5 Mol mat 0,1% Mëllech an 0,1 M TBS mam Grenier Flat 5A Plackewäschprogramm Nr. 12 gewäsch.
E Substrat derbäisetzen. Füügt 50 µl 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) zum Basissubstrat bäi (andeems 2 Drëpse Puffer, 3 Drëpse TMB, 2 Drëpse Waasserstoffperoxid an 15 ml deioniséiert Waasser bäigefüügt ginn). Preparéiert den TMB-Substrat a vortext virum Gebrauch). Inkubéiert d'Mikrotopp 30 Minutten bei Raumtemperatur. Am Däischteren.
Fëllt de Schrëtt aus a liest d'Tablett of. Füügt 50 µl 1 N Schwefelsäure an all Lach bäi a notéiert d'Absorptioun vu 450 bis 655 nm mat engem ELISA-Lieser.
Preparéiert 1 mg/ml Léisunge vun dësen Analyten an deioniséiertem Waasser: Arabinose, Rhamnose, Fukose, Xylos, Galakturonsäure (GalA), Glucuronsäure (GlcA), Mannose, Glukos, Galaktose, Laktose, N-Acetylmannosamin (manNAc), N-Acetylglukosamin (glcNAc), N-Acetylgalaktosamin (galNAc), Inositol (internen Standard). Zwee Standarde goufen preparéiert andeems d'1 mg/ml Zockerléisungen, déi an der Tabell 1 gewisen sinn, bäigefüügt goufen. D'Prouwen ginn agefruer a bei -80°C lyophiliséiert, bis all Waasser ewechgeholl ass (normalerweis ongeféier 12-18 Stonnen).
Gitt 100–500 µg Prouf an d'Réier mat Schraufverschluss op enger analytescher Wo. Schreift d'bäigesate Quantitéit op. Et ass am beschten, d'Prouf an enger spezifescher Konzentratioun vu Léisungsmëttel opzeléisen an als flëssegen Aliquot an d'Réier ze ginn. Benotzt 20 µl vun 1 mg/ml Inositol als internen Standard fir all Proufréier. D'Quantitéit vum internen Standard, déi an d'Prouf bäigefüügt gëtt, muss déiselwecht sinn wéi d'Quantitéit vum internen Standard, déi an d'Standardréier bäigefüügt gëtt.
Gidd 8 ml wasserfreiem Methanol an e Fläschchen mat Schraufverschluss. Dann 4 ml vun enger 3 N methanolescher HCl-Léisung, zougemaach a gerëselt. Dëse Prozess benotzt kee Waasser.
Füügt 500 µl vun enger 1 M HCl Methanolléisung zu den Oligosaccharid-Prouwen an de Standard-TMS-Réier bäi. D'Prouwen goufen iwwer Nuecht (168 Stonnen) bei 80°C an engem Thermoblock inkubéiert. D'Methanolyseprodukt bei Raumtemperatur mat engem Trocknungsmanifold dréchnen. Füügt 200 µl MeOH bäi a dréchent nach eng Kéier. Dëse Prozess gëtt zweemol widderholl. Füügt 200 µl Methanol, 100 µl Pyridin an 100 µl Essigsäureanhydrid zu der Prouf bäi a vermëscht gutt. Inkubéiert d'Prouwen 30 Minutten bei Raumtemperatur a dréchent se. Füügt 200 µl Methanol bäi a dréchent nach eng Kéier.
Füügt 200 µl Tri-Sil derbäi a maacht d'Röhre zou fir 20 Minutten. 80°C, da killt se op Raumtemperatur of. Benotzt en Trocknungsmanifold fir d'Prouf weider op e Volumen vun ongeféier 50 µl ze dréchnen. Et ass wichteg ze bemierken, datt mir d'Prouwe net komplett dréchne gelooss hunn.
Füügt 2 ml Hexan derbäi a vermëscht gutt duerch Vortexen. Fëllt d'Spëtze vu Pasteur-Pipetten (5-8 mm) mat engem Stéck Glaswoll andeems Dir d'Glaswoll op eng Pipett mat engem Duerchmiesser vu 5-3/4 Zoll setzt. D'Prouwen goufen 2 Minutten bei 3000 g zentrifugéiert. All onléislech Iwwerreschter gi gefall. D'Prouwen op 100-150 µl dréchnen. E Volumen vun ongeféier 1 μl gouf an de GC-MS bei enger Ufankstemperatur vun 80 °C an enger Ufankszäit vun 2,0 Minutten injizéiert (Tabell 2).