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Novi metudi immunologichi è spettrometrichi di massa per l'analisi cumplessa di oligosaccaridi persistenti in paglia di granu pretrattata cù AFEX. A biomassa lignocellulosica hè una alternativa sustenibile à i combustibili fossili è hè largamente aduprata per sviluppà biotecnologie per a produzzione di prudutti cum'è alimenti, mangimi, carburanti è chimichi. A chjave di queste tecnulugie hè u sviluppu di prucessi cumpetitivi in ​​termini di costi per cunvertisce i carboidrati cumplessi prisenti in e pareti cellulari di e piante in zuccheri simplici cum'è glucosiu, xilosiu è arabinosiu. Siccome a biomassa lignocellulosica hè assai testarda, deve esse sottumessa à trattamenti termochimichi (per esempiu, esfoliazione di fibre d'ammoniaca (AFEX), acidi diluiti (DA), liquidi ionichi (IL)) è trattamenti biologichi (per esempiu, idrolisi enzimatica è fermentazione microbica) in cumbinazione per ottene u pruduttu desideratu. Tuttavia, quandu l'enzimi fungini cummerciali sò aduprati in u prucessu d'idrolisi, solu u 75-85% di i zuccheri solubili furmati sò monosaccaridi, è u restante 15-25% sò oligosaccaridi solubili è intrattabili, chì ùn sò micca sempre dispunibili per i microrganismi. Prima di questu, avemu isolatu è purificatu cù successu oligosaccaridi stubborn solubili utilizendu una cumminazione di separazione di carbone è terra di diatomee è cromatografia di esclusione dimensionale, è avemu ancu investigatu e so proprietà inibitorie di l'enzimi. Avemu trovu chì l'oligosaccaridi chì cuntenenu sustituzioni di acidu uronicu metilatu à un gradu più altu di polimerizazione (DP) sò più difficiuli da processà cù miscele di enzimi cummerciali chè l'oligosaccaridi à bassu DP è neutri. Quì riportemu l'usu di parechji metudi supplementari, cumprese a prufilatura di i glicani utilizendu anticorpi monoclonali (mAbs) specifichi per i glicani di a biomassa vegetale per caratterizà i legami glicani in e pareti cellulari vegetali è idrolizzati enzimatici, ionizazione di desorbimentu laser assistita da matrice, spettrometria di massa à tempu di volu. . MALDI-TOF-MS) utilizza picchi diagnostichi informativi nantu à a struttura ottenuti per spettroscopia dopu u decadimentu secundariu di ioni negativi, gascromatografia è spettrometria di massa (GC-MS) per caratterizà i legami oligosaccaridi cù è senza derivatizazione. A causa di a piccula dimensione di l'oligosaccharidi (DP 4-20), ste molecule sò difficiuli d'utilizà per u ligame è a caratterizazione di l'anticorpi monoclonali (mAb). Per superà stu prublema, avemu applicatu un novu metudu d'immobilizazione di l'oligosaccharidi basatu annantu à a cunjugazione di biotina chì hà marcatu cù successu a maiò parte di l'oligosaccharidi solubili à bassu DP nantu à a superficia di a micropiastra, chì hè statu dopu utilizatu in un sistema di mAb à altu rendimentu per l'analisi di ligazione specifica. Stu novu metudu faciliterà u sviluppu di saggi di glicoma à altu rendimentu più avanzati in u futuru chì ponu esse aduprati per isolà è caratterizà l'oligosaccharidi presenti in i biomarcatori per scopi diagnostichi.
A biomassa lignocellulosica, cumposta da materiali agriculi, forestali, erbacei è legnosi, hè una materia prima putenziale per a pruduzzione di prudutti bio-basati, cumpresi alimenti, mangimi, carburanti è precursori chimichi per pruduce prudutti di valore più altu1. I carboidrati (cum'è a cellulosa è l'emicellulosa) presenti in i muri di e cellule vegetali sò depolimerizzati in monosaccaridi per via di trasfurmazioni chimiche è biotrasfurmazioni (cum'è l'idrolisi enzimatica è a fermentazione microbica). I pretrattamenti cumuni includenu l'espansione di fibre d'ammoniaca (AFEX), l'acidu diluitu (DA), u liquidu ionicu (IL) è l'esplosione di vapore (SE), chì utilizanu una cumminazione di chimichi è calore per riduce a pruduzzione di lignocellulosa aprendu i muri di e cellule vegetali3,4. ostinazione di a materia, 5. L'idrolisi enzimatica hè realizata à un altu caricu di solidi utilizendu enzimi cummerciali chì cuntenenu carboidrati attivi (CAZymes) è a fermentazione microbica utilizendu lieviti o batteri transgenici per pruduce carburanti è chimichi bio-basati 6.
I CAZimi in l'enzimi cummerciali sò cumposti da una mistura cumplessa d'enzimi chì scindenu sinergisticamente i ligami cumplessi carboidrati-zuccheru per furmà monosaccaridi2,7. Cum'è l'avemu digià signalatu, a reta cumplessa di polimeri aromatichi di lignina cù i carboidrati li rende assai intrattabili, ciò chì porta à una cunversione incompleta di u zuccheru, accumulendu u 15-25% di oligosaccaridi sessuali chì ùn sò micca prudutti durante l'idrolisi enzimatica di a biomassa pretrattata. Questu hè un prublema cumunu cù diversi metudi di pretrattamentu di a biomassa. Alcune ragioni per questu collu di buttiglia includenu l'inibizione enzimatica durante l'idrolisi, o l'assenza o bassi livelli di enzimi essenziali essenziali chì sò richiesti per rompe i ligami di u zuccheru in a biomassa vegetale. Capisce a cumpusizione è e caratteristiche strutturali di i zuccheri, cum'è i ligami di u zuccheru in l'oligosaccaridi, ci aiuterà à migliurà a cunversione di u zuccheru durante l'idrolisi, rendendu i prucessi biotecnologichi cumpetitivi in ​​termini di costi cù i prudutti derivati ​​da u petroliu.
Determinà a struttura di i carbuidrati hè difficiule è richiede una cumminazione di metudi cum'è a cromatografia liquida (LC)11,12, a spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)13, l'elettroforesi capillare (CE)14,15,16 è a spettrometria di massa (MS)17. ,diciottu. I metudi MS cum'è a spettrometria di massa à tempu di volu cù desorbimentu laser è ionizazione utilizendu una matrice (MALDI-TOF-MS) sò un metudu versatile per identificà e strutture di i carbuidrati. Recentemente, a MS in tandem di dissociazione indotta da collisione (CID) di addutti di ioni di sodiu hè stata più largamente aduprata per identificà l'impronte digitali currispondenti à e pusizioni di attaccamentu di l'oligosaccharidi, cunfigurazioni anomeriche, sequenze è pusizioni di ramificazione20, 21.
L'analisi di i glicani hè un strumentu eccellente per l'identificazione approfondita di i ligami di carboidrati22. Stu metudu usa anticorpi monoclonali (mAbs) diretti à u glicanu di a parete cellulare vegetale cum'è sonde per capisce i ligami di carboidrati cumplessi. Più di 250 mAbs sò dispunibili in u mondu sanu, cuncipiti contr'à diversi oligosaccaridi lineari è ramificati utilizendu diversi saccaridi24. Parechji mAbs sò stati largamente usati per caratterizà a struttura, a cumpusizione è e mudificazioni di a parete cellulare vegetale, postu chì ci sò differenze significative secondu u tipu di cellula vegetale, l'organu, l'età, u stadiu di sviluppu è l'ambiente di crescita25,26. Più recentemente, stu metudu hè statu adupratu per capisce e pupulazioni di vescicole in i sistemi vegetali è animali è i so rispettivi roli in u trasportu di glicani cum'è determinatu da marcatori subcellulari, stadii di sviluppu o stimuli ambientali, è per determinà l'attività enzimatica. Alcune di e diverse strutture di glicani è xilani chì sò state identificate includenu pectina (P), xilanu (X), mannanu (M), xiloglucani (XylG), glucani à legami misti (MLG), arabinossilanu (ArbX), galattomannanu (GalG), acidu glucuronicu-arabinossilanu (GArbX) è arabino-galattanu (ArbG)29.
Tuttavia, malgradu tutti questi sforzi di ricerca, solu pochi studii si sò cuncentrati nantu à a natura di l'accumulazione di oligosaccaridi durante l'idrolisi à alta carica di solidi (HSL), cumprese a liberazione di oligosaccaridi, i cambiamenti di lunghezza di a catena oligomerica durante l'idrolisi, diversi polimeri à bassu DP è e so curve. distribuzioni 30,31,32. Intantu, ancu s'è l'analisi di i glicani s'hè dimustrata un strumentu utile per un'analisi cumpleta di a struttura di i glicani, hè difficiule di valutà l'oligosaccaridi à bassu DP solubili in acqua utilizendu metudi anticorpali. L'oligosaccaridi DP più chjuchi cù un pesu moleculare inferiore à 5-10 kDa ùn si leganu micca à e piastre ELISA 33, 34 è sò lavati via prima di l'aggiunta di anticorpi.
Quì, per a prima volta, dimustremu un test ELISA nantu à piastre rivestite d'avidina utilizendu anticorpi monoclonali, cumbinendu una prucedura di biotinilazione in un passu per oligosaccaridi refrattari solubili cù l'analisi di u glicoma. U nostru approcciu à l'analisi di u glicoma hè statu validatu da l'analisi basata nantu à MALDI-TOF-MS è GC-MS di ligami oligosaccaridichi cumplementari utilizendu a derivatizazione di trimetilsilile (TMS) di cumpusizioni di zuccheru idrolizzate. Questu approcciu innovativu pò esse sviluppatu cum'è un metudu à altu rendimentu in u futuru è truvà una applicazione più larga in a ricerca biomedica35.
E mudificazioni post-traduzionali di l'enzimi è di l'anticorpi, cum'è a glicosilazione,36 affettanu a so attività biologica. Per esempiu, i cambiamenti in a glicosilazione di e proteine ​​sieriche ghjocanu un rolu impurtante in l'artrite infiammatoria, è i cambiamenti in a glicosilazione sò aduprati cum'è marcatori diagnostichi37. Diversi glicani sò stati signalati in a literatura per cumparisce facilmente in una varietà di malatie, cumprese e malatie infiammatorie croniche di u trattu gastrointestinale è di u fegatu, infezioni virali, cancri ovariani, di u senu è di a prostata38,39,40. Capisce a struttura di i glicani aduprendu metudi ELISA di glicani basati nantu à l'anticorpi furnisce una fiducia supplementare in a diagnosi di e malatie senza l'usu di metudi MS cumplessi.
U nostru studiu precedente hà dimustratu chì l'oligosaccaridi testardi sò rimasti senza idrolizazione dopu u pretrattamentu è l'idrolisi enzimatica (Figura 1). In u nostru travagliu publicatu prima, avemu sviluppatu un metudu di estrazione in fase solida cù carbone attivatu per isolà l'oligosaccaridi da l'idrolizatu di granu pretrattatu cù AFEX (ACSH)8. Dopu l'estrazione è a separazione iniziale, l'oligosaccaridi sò stati ulteriormente frazionati per cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) è raccolti in ordine di pesu moleculare. I monomeri è l'oligomeri di zuccheru liberati da vari pretrattamenti sò stati analizati per analisi di a cumpusizione di u zuccheru. Quandu si paraguna u cuntenutu di oligomeri di zuccheru ottenuti da vari metudi di pretrattamentu, a presenza di oligosaccaridi testardi hè un prublema cumunu in a cunversione di a biomassa in monosaccaridi è pò purtà à una riduzione di a resa di zuccheru di almenu 10-15% è ancu finu à u 18%. US. Stu metudu hè adupratu per una ulteriore pruduzzione à grande scala di frazioni di oligosaccaridi. L'ACH risultante è e so frazioni successive cù diversi pesi moleculari sò state aduprate cum'è materiale sperimentale per a caratterizazione di l'oligosaccaridi in questu travagliu.
Dopu à u pretrattamentu è l'idrolisi enzimatica, l'oligosaccaridi persistenti sò rimasti senza idrolizazione. Quì (A) hè un metudu di separazione di l'oligosaccaridi in u quale l'oligosaccaridi sò isolati da l'idrolizatu di paglia di mais pretrattata cù AFEX (ACSH) utilizendu un lettu imballatu di carbone attivatu è terra di diatomee; (B) Metudu per a separazione di l'oligosaccaridi. L'oligosaccaridi sò stati ulteriormente separati per cromatografia di esclusione dimensionale (SEC); (C) Monomeri è oligomeri saccaridichi liberati da vari pretrattamenti (acidu diluitu: DA, liquidu ionicu: IL è AFEX). Cundizioni di idrolisi enzimatica: carica elevata di solidi di 25% (p/p) (circa 8% di carica di glucanu), 96 ore di idrolisi, carica di enzimi cummerciale di 20 mg/g (rapportu Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) è (D) Monomeri è oligomeri di zuccheru di glucosiu, xilosiu è arabinosiu liberati da paglia di mais pretrattata cù AFEX (ACS).
L'analisi di i glicani s'hè dimustrata un strumentu utile per un'analisi strutturale cumpleta di i glicani in estratti isolati da residui di biomassa solida. Tuttavia, i saccaridi solubili in acqua sò sottorappresentati cù stu metudu tradiziunale41 perchè l'oligosaccharidi di bassu pesu moleculare sò difficiuli da immobilizà nantu à e piastre ELISA è sò lavati prima di l'aggiunta di l'anticorpi. Dunque, per u ligame è a caratterizazione di l'anticorpi, hè statu utilizatu un metudu di biotinilazione in un passu per rivestisce oligosaccaridi solubili è micca conformi nantu à e piastre ELISA rivestite di avidina. Stu metudu hè statu testatu utilizendu u nostru ACSH pruduttu prima è una frazione basata nantu à u so pesu moleculare (o gradu di polimerizazione, DP). A biotinilazione in un passu hè stata utilizata per aumentà l'affinità di ligame di l'oligosaccharidi aghjunghjendu biotina-LC-idrazide à l'estremità riducente di u carboidratu (Fig. 2). In soluzione, u gruppu emiacetale à l'estremità riducente reagisce cù u gruppu idrazide di biotina-LC-idrazide per furmà un ligame idrazonicu. In presenza di l'agente riducente NaCNBH3, u ligame idrazonicu hè riduttu à un pruduttu finale biotinilatu stabile. Cù a mudificazione di l'estremità riduttore di zuccheru, a ligatura di oligosaccaridi à bassu DP à e piastre ELISA hè diventata pussibule, è in u nostru studiu questu hè statu fattu nantu à piastre rivestite di avidina utilizendu mAb mirati à i glicani.
Screening di anticorpi monoclonali basatu annantu à ELISA per oligosaccaridi biotinilati. Quì (A) biotinilazione cumminata di oligosaccaridi è screening ELISA successivu cù mAb mirati à i glicani nantu à piastre rivestite di NeutrAvidina è (B) mostra una prucedura in un passu per a biotinilazione di i prudutti di reazione.
E piastre rivestite d'avidina cù anticorpi cuniugati à oligosaccaridi sò state poi aghjunte à l'anticorpi primari è secundarii è lavate in un mezu sensibile à a luce è à u tempu. Dopu chì u ligame di l'anticorpi hè cumpletu, aghjunghje u sustratu TMB per incubate a piastra. A reazione hè stata infine fermata cù l'acidu sulfuricu. E piastre incubate sò state analizate cù un lettore ELISA per determinà a forza di ligame di ogni anticorpu per rilevà u cross-linking specificu di l'anticorpu. Per i dettagli è i parametri di l'esperimentu, vede a sezione currispondente "Materiali è Metodi".
Dimostremu l'utilità di stu metudu sviluppatu di recente per applicazioni specifiche caratterizendu l'oligosaccharidi solubili prisenti in ACSH è ancu in frazioni di oligosaccaridi grezzi è purificati isolati da idrolizzati lignocellulosici. Cum'è mostratu in a Figura 3, i xilani sustituiti da epitopi più cumuni identificati in ACSH utilizendu metudi di analisi di glicomi bioacilati sò generalmente arabinogalattani uronic (U) o metiluronic (MeU) è pectic. A maiò parte di elli sò stati ancu truvati in u nostru studiu precedente nantu à l'analisi di glicani di solidi non idrolizzati (UHS)43.
Detezione di epitopi oligosaccaridichi recalcitranti cù un anticorpu monoclonale direttu à u glicanu di a parete cellulare. A frazione "neutra" hè a frazione ACN è a frazione "acida" hè a frazione FA. I rossi più brillanti nantu à a mappa di calore indicanu un cuntenutu di epitopi più altu, è i blu più brillanti indicanu un sfondate biancu. I valori di culore nantu à a scala sò basati nantu à i valori OD grezzi per e formulazioni N = 2. I principali epitopi ricunnisciuti da l'anticorpi sò mostrati à diritta.
Queste strutture non cellulosiche ùn anu pussutu esse scisse da e cellulasi è emicellulasi più cumuni in a mistura enzimatica cummerciale testata, chì include l'enzimi cummerciali più cumunamente usati. Dunque, novi enzimi ausiliari sò necessarii per a so idrolisi. Senza l'enzimi accessori non cellulosici necessarii, questi ligami non cellulosici impediscenu a cunversione cumpleta in monosaccaridi, ancu s'è i so polimeri di zuccheru parenti sò ampiamente idrolizzati in frammenti più corti è dissolti aduprendu miscele enzimatiche cummerciali.
Un studiu più approfonditu di a distribuzione di u signale è di a so forza di ligame hà dimustratu chì l'epitopi di ligame eranu più bassi in e frazioni di zuccheru à DP altu (A, B, C, DP finu à 20+) chè in e frazioni à DP bassu (D, E, F, DP) in dimeri (Fig. 1). I frammenti acidi sò più cumuni in l'epitopi non cellulosici chè in i frammenti neutri. Quessi fenomeni sò coerenti cù u mudellu osservatu in u nostru studiu precedente, induve i gruppi DP è acidi alti eranu più resistenti à l'idrolisi enzimatica. Dunque, a presenza di epitopi di glicani non cellulosici è di sustituzioni U è MeU ponu cuntribuisce assai à a stabilità di l'oligosaccaridi. Ci vole à nutà chì l'efficienza di ligame è di rilevazione pò esse problematica per l'oligosaccaridi à DP bassu, soprattuttu s'è l'epitopu hè un oligosaccaride dimericu o trimericu. Questu pò esse testatu aduprendu oligosaccaridi cummerciali di diverse lunghezze, ognunu cuntenendu solu un epitopu chì si lega à un mAb specificu.
Cusì, l'usu d'anticorpi specifichi di struttura hà rivelatu certi tipi di ligami recalcitranti. Sicondu u tipu d'anticorpu utilizatu, u mudellu di ligatura apprupriatu è a forza di u signale ch'ellu produce (u più è u menu abbundante), novi enzimi ponu esse identificati è aghjunti semiquantitativamente à a mistura enzimatica per una glicoconversione più cumpleta. Pigliendu l'analisi di l'oligosaccaridi ACSH cum'è esempiu, pudemu creà una basa di dati di ligami glicani per ogni materiale di biomassa. Ci vole à nutà quì chì a diversa affinità di l'anticorpi deve esse presa in contu, è se a so affinità hè scunnisciuta, questu creerà certe difficultà quandu si paragunanu i signali di diversi anticorpi. Inoltre, u paragone di i ligami glicani pò funziunà megliu trà i campioni per u listessu anticorpu. Quessi ligami ostinati ponu esse ligati à a basa di dati CAZyme, da a quale pudemu identificà l'enzimi, selezziunà l'enzimi candidati è testà l'enzimi chì rompenu i ligami, o sviluppà sistemi microbici per sprime questi enzimi per l'usu in bioraffinerie44.
Per valutà cumu i metudi immunologichi cumplementanu i metudi alternativi per a caratterizazione di l'oligosaccharidi di bassu pesu moleculare prisenti in l'idrolizzati lignocellulosici, avemu realizatu MALDI (Fig. 4, S1-S8) è analisi di saccaridi derivati ​​da TMS basati annantu à GC-MS nantu à listessa parte di oligosaccaridi (Fig. 5). MALDI hè utilizatu per paragunà se a distribuzione di massa di e molecule di oligosaccaridi currisponde à a struttura prevista. In a fig. 4 si mostra MS di i cumpunenti neutri ACN-A è ACN-B. L'analisi ACN-A hà cunfirmatu una gamma di zuccheri pentosi chì varieghjanu da DP 4-8 (Fig. 4) à DP 22 (Fig. S1), chì i pesi currispondenu à l'oligosaccharidi MeU-xilanu. L'analisi ACN-B hà cunfirmatu a serie di pentosi è glucoxilani cù DP 8-15. In materiale supplementariu cum'è a Figura S3, e carte di distribuzione di massa di a parte acida FA-C mostranu una gamma di zuccheri pentosi sustituiti da (Me)U cù un DP di 8-15 chì sò coerenti cù i xilani sustituiti truvati in u screening di mAb basatu annantu à ELISA. L'epitopi sò coerenti.
Spettru MALDI-MS di oligosaccaridi solubili non conformi presenti in ACS. Quì, (A) frazioni di pesu bassu ACN-A chì cuntenenu oligosaccaridi glucuroxilanici sustituiti da l'acidu uronicu metilatu (DP 4-8) è (B) xilanu ACN-B è oligosaccaridi di l'acidu uronicu metilatu sustituiti cù glucuroxilanu (DP 8-15).
Analisi di a cumpusizione di u residuu glicanu di l'oligosaccharidi refrattarii. Quì (A) Cumpusizione di saccaridi TMS di varie frazioni di oligosaccaridi ottenute cù l'analisi GC-MS. (B) Strutture di vari zuccheri derivati ​​da TMS presenti in oligosaccaridi. ACN - frazione di acetonitrile chì cuntene oligosaccaridi neutri è FA - frazione di acidu ferulicu chì cuntene oligosaccaridi acidi.
Un'altra cunclusione interessante hè stata tratta da l'analisi LC-MS di a frazione di oligosaccaridi, cum'è mostratu in a Figura S9 (i metudi ponu esse visti in u materiale supplementariu elettronicu). Frammenti di gruppi esosi è -OAc sò stati osservati ripetutamente durante a ligazione di a frazione ACN-B. Questa scuperta ùn solu cunfirma a frammentazione osservata in l'analisi di glicoma è MALDI-TOF, ma furnisce ancu nuove informazioni nantu à i putenziali derivati ​​di carboidrati in a biomassa lignocellulosica pretrattata.
Avemu ancu realizatu un'analisi di a cumpusizione di i glicani di e frazioni di oligosaccaridi utilizendu a derivatizazione di i glicani TMS. Utilizendu GC-MS, avemu determinatu a cumpusizione di i zuccheri neurali (non derivati) è acidi (GluA è GalA) in a frazione di oligosaccaridi (Fig. 5). L'acidu glucuronicu si trova in i cumpunenti acidi C è D, mentre chì l'acidu galatturonicu si trova in i cumpunenti acidi A è B, tramindui cumpunenti à altu DP di i zuccheri acidi. Quessi risultati ùn solu cunfermanu i nostri dati ELISA è MALDI, ma sò ancu coerenti cù i nostri studii precedenti di accumulazione di oligosaccaridi. Dunque, credemu chì i metudi immunologichi muderni chì utilizanu a biotinilazione di oligosaccaridi è u susseguente screening ELISA sò sufficienti per rilevà oligosaccaridi recalcitranti solubili in vari campioni biologichi.
Siccomu i metudi di screening di mAb basati nantu à ELISA sò stati validati da parechji metudi diversi, vulemu esplorà più in prufundità u putenziale di stu novu metudu quantitativu. Dui oligosaccaridi cummerciali, l'oligosaccaride di xiloesasaccaride (XHE) è u 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriose (A2XX), sò stati acquistati è testati utilizendu un novu approcciu mAb chì mira u glicanu di a parete cellulare. A Figura 6 mostra una currelazione lineare trà u signale di ligame biotinilatu è a cuncentrazione logaritmica di a cuncentrazione di oligosaccaridi, chì suggerisce un pussibule mudellu di adsorbimentu di Langmuir. Frà i mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 è CCRC-M151 sò stati currelati cù XHE, è CCRC-M108, CCRC-M109 è LM11 sò stati currelati cù A2XX in un intervallu da 1 nm à 100 nano. A causa di a dispunibilità limitata di anticorpi durante l'esperimentu, sò stati realizati esperimenti limitati cù ogni cuncentrazione di oligosaccaridi. Ci vole à nutà quì chì certi anticorpi reagiscenu in modu assai diversu à u listessu oligosaccaride cum'è substratu, presumibilmente perchè si leganu à epitopi ligeramente diversi è ponu avè affinità di legame assai diverse. I meccanismi è l'implicazioni di l'identificazione precisa di l'epitopi saranu assai più cumplessi quandu u novu approcciu mAb serà applicatu à campioni reali.
Dui oligosaccaridi cummerciali sò stati aduprati per determinà a gamma di rilevazione di diversi mAb chì miranu i glicani. Quì, e correlazioni lineari cù a cuncentrazione logaritmica di a cuncentrazione di oligosaccaridi indicanu i mudelli di adsorbimentu di Langmuir per (A) XHE cù mAb è (B) A2XX cù mAb. L'epitopi currispondenti indicanu e strutture di l'oligosaccaridi cummerciali aduprati cum'è substrati in u test.
L'usu di anticorpi monoclonali mirati à i glicani (analisi glicomica o screening di mAb basatu annantu à ELISA) hè un strumentu putente per a caratterizazione approfondita di a maiò parte di i principali glicani di a parete cellulare chì custituiscenu a biomassa vegetale. Tuttavia, l'analisi classica di i glicani caratterizeghja solu i glicani di a parete cellulare più grandi, postu chì a maiò parte di l'oligosaccaridi ùn sò micca immobilizzati efficacemente nantu à e piastre ELISA. In questu studiu, a paglia di mais pretrattata cù AFEX hè stata idrolizzata enzimaticamente à un altu cuntenutu di solidi. L'analisi di u zuccheru hè stata aduprata per determinà a cumpusizione di i carboidrati recalcitranti di a parete cellulare in l'idrolizzatu. Tuttavia, l'analisi di mAb di oligosaccaridi più chjuchi in l'idrolizzati hè sottovalutata, è sò necessarii strumenti supplementari per immobilizzà efficacemente l'oligosaccaridi nantu à e piastre ELISA.
Riportemu quì un metudu novu è efficiente d'immobilizazione di oligosaccaridi per u screening di mAb cumbinendu a biotinilazione di oligosaccaridi seguita da u screening ELISA nantu à piastre rivestite di NeutrAvidin™. L'oligosaccaridi biotinilati immobilizzati anu mostratu una affinità sufficiente per l'anticorpu per permette una rilevazione rapida è efficiente di oligosaccaridi recalcitranti. L'analisi di a cumpusizione di questi oligosaccaridi testardi basata nantu à a spettrometria di massa hà cunfirmatu i risultati di questu novu approcciu à l'immunoscreening. Cusì, questi studii dimustranu chì a cumbinazione di biotinilazione di oligosaccaridi è screening ELISA cù anticorpi monoclonali mirati à i glicani pò esse aduprata per rilevà legami incruciati in oligosaccaridi è pò esse largamente applicata in altri studii biochimichi chì caratterizanu a struttura di l'oligosaccaridi.
Stu metudu di prufilatura di glicani basatu annantu à a biotina hè u primu rapportu capace di investigà i ligami di carboidrati recalcitranti di oligosaccaridi solubili in a biomassa vegetale. Questu aiuta à capisce perchè alcune parti di a biomassa sò cusì testarde quandu si tratta di pruduzzione di biocarburanti. Stu metudu riempie una lacuna impurtante in i metudi d'analisi di u glicomu è estende a so applicazione à una gamma più larga di sustrati oltre l'oligosaccaridi vegetali. In u futuru, pudemu aduprà a robotica per a biotinilazione è aduprà u metudu chì avemu sviluppatu per l'analisi à altu rendimentu di campioni utilizendu ELISA.
A paglia di granu (CS) cultivata da e sementi ibride Pioneer 33A14 hè stata racolta in u 2010 da Kramer Farms in Ray, Colorado. Cù u permessu di u pruprietariu terrieru, sta biomassa pò esse aduprata per a ricerca. I campioni sò stati cunservati à seccu cù una umidità inferiore à 6% in sacchetti cù chiusura a zip à temperatura ambiente. I campioni sò stati cunservati à seccu cù una umidità inferiore à 6% in sacchetti cù chiusura a zip à temperatura ambiente. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнах с застежкой-молнией при комтнатной I campioni sò stati cunservati à seccu à <6% d'umidità in sacchetti cù cerniera à temperatura ambiente.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. I campioni sò cunservati in sacchetti cù cerniera à temperatura ambiente cù umidità < 6%.U studiu hà rispettatu e linee guida lucali è naziunali. L'analisi cumposizionale hè stata realizata aduprendu u protocolu NREL. A cumpusizione cuntene 31,4% glucanu, 18,7% xilanu, 3,3% arabinanu, 1,2% galattanu, 2,2% acetile, 14,3% lignina, 1,7% proteine ​​è 13,4% cenere.
Cellic® CTec2 (138 mg di proteine/ml, lot VCNI 0001) hè una mistura cumplessa di cellulasi, β-glucosidasi è Cellic® HTec2 (157 mg di proteine/ml, lot VHN00001) da Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg di proteine/mL), una mistura cumplessa d'enzimi chì degradanu a pectina, hè stata donata da DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). E concentrazioni di proteine ​​enzimatiche sò state determinate stimendu u cuntenutu di proteine ​​(è sottraendu u cuntributu di l'azotu non proteicu) utilizendu l'analisi di l'azotu Kjeldahl (metodu AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). A terra di diatomee 545 hè stata acquistata da EMD Millipore (Billerica, MA). U carbone attivatu (DARCO, granuli di 100 mesh), Avicel (PH-101), xilanu di fagu, è tutti l'altri prudutti chimichi sò stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
U pretrattamentu AFEX hè statu realizatu à GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). U pretrattamentu hè statu realizatu à 140 °C per 15 minuti. 46 tempu di residenza à un rapportu 1:1 di ammonia anidra à biomassa à 60% (p/p) di carica in un reattore batch da banco in acciaio inox (Parr Instruments Company). Ci hè vulsutu 30 minuti. U reattore hè statu purtatu à 140 °C è l'ammoniaca hè stata liberata rapidamente, permettendu à a biomassa di vultà rapidamente à temperatura ambiente. A cumpusizione di a ragna di granu pretrattata cù AFEX (ACS) era simile à quella di a ragna di granu micca trattata (UT-CS).
ACSH à altu solidu 25% (p/p) (circa 8% di carica di destranu) hè statu preparatu cum'è materiale di partenza per a pruduzzione à grande scala di oligosaccaridi. L'idrolisi enzimatica di l'ACS hè stata realizata utilizendu una mistura di enzimi cummerciale chì include Cellic® Ctec2 10 mg di proteine/g di glucanu (in biomassa pretrattata), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg di proteine/g di glucanu è Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg di proteine/g di destranu. L'idrolisi enzimatica hè stata realizata in un bioreattore di 5 litri cù un vulume di travagliu di 3 litri, pH 4,8, 50 °C è 250 rpm. Dopu l'idrolisi per 96 ore, l'idrolizatu hè statu raccoltu per centrifugazione à 6000 rpm per 30 minuti è dopu à 14000 rpm per 30 minuti per rimuovere i solidi non idrolizzati. L'idrolizzatu hè statu tandu sottumessu à una filtrazione sterile attraversu un becher di filtru di 0,22 mm. L'idrolizzatu filtratu hè statu cunservatu in buttiglie sterili à 4° C è tandu frazziunatu nantu à u carbone.
Analisi di a cumpusizione di campioni di biomassa à basa d'estrattu secondu e procedure d'analisi di laburatoriu NREL: preparazione di campioni per l'analisi di a cumpusizione (NREL/TP-510-42620) è determinazione di carbuidrati strutturali è lignina in biomassa (NREL/TP-510 - 42618)47.
L'analisi di l'oligosaccharidi di u flussu d'idrolizzatu hè stata realizata à una scala di 2 ml utilizendu un metudu d'idrolisi acida basatu annantu à l'autoclave. Mischiate u campione d'idrolizzatu cù 69,7 µl d'acidu sulfuricu à 72% in un tubu di cultura cù tappu à vite di 10 ml è incubate per 1 ora nantu à un bancone à 121 °C, raffreddate nantu à u ghjacciu è filtrate in una fiala di cromatografia liquida à alte prestazioni (HPLC). A cuncentrazione di oligosaccaridi hè stata determinata sottraendu a cuncentrazione di monosaccaridi in u campione micca idrolizzatu da a cuncentrazione tutale di zuccheru in u campione idrolizzatu cù l'acidu.
E concentrazioni di glucosiu, xilosiu è arabinosiu in a biomassa idrolizzata à l'acidu sò state analizate cù un sistema HPLC Shimadzu equipatu cù un autocampionatore, un riscaldatore di colonna, una pompa isocratica è un rilevatore di indice di rifrazione nantu à una colonna Bio-Rad Aminex HPX-87H. A colonna hè stata mantenuta à 50 °C è eluita cù 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 in flussu d'acqua.
U surnatante di l'idrolizzatu hè statu diluitu è ​​analizatu per u cuntenutu di monomeri è oligosaccaridi. I zuccheri monomerichi ottenuti dopu l'idrolisi enzimatica sò stati analizati per HPLC equipaggiata cù una colonna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P è una colonna di guardia di cenere. A temperatura di a colonna hè stata mantenuta à 80 °C, l'acqua hè stata aduprata cum'è fase mobile cù una velocità di flussu di 0,6 ml / min. L'oligosaccaridi sò stati determinati per idrolisi in acidu diluitu à 121 °C secondu i metudi descritti in e ref. 41, 48, 49.
L'analisi di i saccaridi hè stata realizata nantu à i residui di biomassa cruda, pretrattata cù AFEX è tutti i residui di biomassa micca idrolizzati (cumprese a produzzione di estratti seriali di parete cellulare è u so screening di mAb) utilizendu e procedure descritte prima 27, 43, 50, 51. Per l'analisi di u glicomu, i residui insolubili in alcolu di u materiale di a parete cellulare vegetale sò preparati da residui di biomassa è sottumessi à estrazione seriale cù reagenti sempre più aggressivi cum'è l'ossalatu d'ammoniu (50 mM), u carbonatu di sodiu (50 mM è 0,5% p/v), CON. (1M è 4M, tramindui cù 1% p/v di boroidru di sodiu) è u cloritu acidu cum'è descrittu prima 52,53. L'estratti sò stati poi sottumessi à ELISA contr'à un pannellu cumplessu di mAb50 diretti à u glicanu di a parete cellulare, è e reazioni di legame di mAb sò state presentate cum'è una mappa di calore. I mAb chì miranu u glicanu di a parete cellulare vegetale sò stati acquistati da stock di laburatoriu (serie CCRC, JIM è MAC).
Biotinilazione in una sola tappa di oligosaccaridi. A cunjugazione di carbuidrati cù biotina-LC-idrazide hè stata realizata aduprendu a seguente prucedura. A biotina-LC-idrazide (4,6 mg/12 μmol) hè stata dissolta in dimetilsulfossido (DMSO, 70 μl) per agitazione vigorosa è riscaldamentu à 65° C per 1 minutu. L'acidu aceticu glaciale (30 µl) hè statu aghjuntu è a mistura hè stata versata nantu à cianoboroidruro di sodiu (6,4 mg/100 µmol) è cumpletamente dissolta dopu u riscaldamentu à 65° C per circa 1 minutu. Dopu, da 5 à 8 μl di a mistura di reazione hè stata aghjunta à l'oligosaccaride seccu (1-100 nmol) per ottene un eccessu molare di 10 volte o più di u marcatore sopra l'estremità riducente. A reazione hè stata realizata à 65°C per 2 ore, dopu à quale i campioni sò stati immediatamente purificati. Nisun cianoboroidruro di sodiu hè statu utilizatu in l'esperimenti di marcatura senza riduzione, è i campioni sò stati fatti reagisce à 65 ° C per 2,5 ore.
Rivestimentu ELISA è lavaggio di campioni di oligosaccaridi biotinilati. 25 μl di campioni biotinilati (100 μl di ogni campione concentratu diluitu in 5 ml di soluzione tampone Tris 0,1 M (TBS)) sò stati aghjunti à ogni pozzetto di a piastra rivestita di avidina. I pozzetti di cuntrollu sò stati rivestiti cù 50 μl di biotina à una concentrazione di 10 μg/ml in TBS 0,1 M. L'acqua deionizzata hè stata aduprata cum'è rivestimentu per e misurazioni in biancu. A compressa hè stata incubata per 2 ore à temperatura ambiente à u bughju. Lavate a piastra 3 volte cù latte scrematu à 0,1% in TBS 0,1 M aduprendu u prugramma n. 11 per Grenier flat 3A.
Aggiunta è lavaggio di anticorpi primari. Aggiungete 40 µl di anticorpo primario à ogni pozzetto. Incubate a micropiastra per 1 ora à temperatura ambiente in u bughju. E piastre sò state poi lavate 3 volte cù latte à 0,1% in TBS 0,1M utilizendu u prugramma di lavaggio #11 per Grenier Flat 3A.
Aghjunghje l'anticorpu secundariu è lavà. Aghjunghje 50 µl d'anticorpu secundariu di topu/ratu (diluitu 1:5000 in latte à 0,1% in TBS 0,1 M) à ogni pozzettu. Incubà a micropiastra per 1 ora à temperatura ambiente à u bughju. E micropiastre sò state poi lavate 5 volte cù latte à 0,1% in TBS 0,1 M utilizendu u prugramma di lavaggio di piastre Grenier Flat 5A #12.
Aghjunghjendu un substratu. Aghjunghje 50 µl di 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) à u substratu di basa (aghjunghjendu 2 gocce di buffer, 3 gocce di TMB, 2 gocce di perossidu d'idrogenu à 15 ml d'acqua deionizzata). Preparate u substratu TMB. è vortexate prima di l'usu). Incubate a micropiastra à temperatura ambiente per 30 minuti. À u bughju.
Cumpiite u passu è leghjite a tableta. Aghjunghjite 50 µl d'acidu sulfuricu 1 N à ogni pozzettu è registrate l'assorbanza da 450 à 655 nm aduprendu un lettore ELISA.
Preparate suluzioni di 1 mg/ml di sti analiti in acqua deionizzata: arabinosu, ramnosu, fucosu, xilosu, acidu galacturonicu (GalA), acidu glucuronicu (GlcA), mannosu, glucosiu, galattosiu, lattosiu, N-acetilmannosamina (manNAc), N-acetilglucosamina (glcNAc), N-acetilgalattosammina (galNAc), inositolo (standard internu). Dui standard sò stati preparati aghjunghjendu e suluzioni di zuccheru di 1 mg/mL mostrate in a Tabella 1. I campioni sò congelati è liofilizzati à -80° C finu à chì tutta l'acqua sia eliminata (di solitu circa 12-18 ore).
Aghjunghjite 100–500 µg di campione à i tubi cù tappu à vite nantu à una bilancia analitica. Registrate a quantità aghjunta. Hè megliu scioglie u campione in una cuncentrazione specifica di solvente è aghjunghje lu à u tubu cum'è aliquota liquida. Aduprate 20 µl di 1 mg/ml di inositolo cum'è standard internu per ogni tubu di campione. A quantità di standard internu aghjunta à u campione deve esse a listessa chè a quantità di standard internu aghjunta à u tubu standard.
Aghjunghjite 8 ml di metanolu anidru à una fiala cù tappu à vite. Dopu, aghjunghjite 4 ml di suluzione di HCl metanolica 3 N, chjusa è scuzzulata. Stu prucessu ùn usa micca acqua.
Aghjunghjite 500 µl di suluzione di metanolu HCl 1 M à i campioni d'oligosaccharidi è à i tubi TMS standard. I campioni sò stati incubati durante a notte (168 ore) à 80° C. in un bloccu termicu. Asciugate u pruduttu di metanolisi à temperatura ambiente aduprendu un collettore di asciugatura. Aghjunghjite 200 µl di MeOH è asciugate di novu. Stu prucessu hè ripetutu duie volte. Aghjunghjite 200 µl di metanolu, 100 µl di piridina è 100 µl d'anidride acetica à u campione è mischiate bè. Incubate i campioni à temperatura ambiente per 30 minuti. è asciugate. Aghjunghjite 200 µl di metanolu è asciugate di novu.
Aghjunghjite 200 µl di Tri-Sil è scaldate u tubu cù u tappu per 20 minuti. 80°C, poi raffreddate à temperatura ambiente. Aduprate un collettore di asciugatura per asciugà ulteriormente u campione finu à un vulume di circa 50 µl. Hè impurtante nutà chì ùn avemu micca lasciatu i campioni asciugà cumpletamente.
Aghjunghjite 2 ml d'esanu è mischiate bè cù u vortex. Riempite i punte di e pipette Pasteur (5-8 mm) cù un pezzu di lana di vetru inserendu a lana di vetru sopra una pipetta di 5-3/4 pollici di diametru. I campioni sò stati centrifugati à 3000 g per 2 minuti. Ogni residuu insolubile hè precipitatu. Asciugate u campione à 100-150 µl. Un vulume di circa 1 μl hè statu iniettatu in u GC-MS à una temperatura iniziale di 80 °C è un tempu iniziale di 2,0 minuti (Tabella 2).