Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku vykresľovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Nové imunologické a hmotnostné spektrometrické metódy pre komplexnú analýzu perzistentných oligosacharidov v kukuričných stenách predspracovaných AFEX. Lignocelulózová biomasa je udržateľnou alternatívou k fosílnym palivám a široko sa používa na vývoj biotechnológií na výrobu produktov, ako sú potraviny, krmivá, palivá a chemikálie. Kľúčom k týmto technológiám je vývoj cenovo konkurencieschopných procesov na premenu komplexných sacharidov prítomných v bunkových stenách rastlín na jednoduché cukry, ako je glukóza, xylóza a arabinóza. Keďže lignocelulózová biomasa je veľmi odolná, musí sa podrobiť termochemickým úpravám (napr. exfoliácia amoniakových vlákien (AFEX), zriedené kyseliny (DA), iónové kvapaliny (IL)) a biologickým úpravám (napr. enzymatická hydrolýza a mikrobiálna fermentácia) v kombinácii, aby sa získal požadovaný produkt. Avšak, keď sa v procese hydrolýzy použijú komerčné hubové enzýmy, iba 75 – 85 % vytvorených rozpustných cukrov tvoria monosacharidy a zvyšných 15 – 25 % tvoria rozpustné, nepoddajné oligosacharidy, ktoré nie sú vždy dostupné pre mikroorganizmy. Predtým sme úspešne izolovali a purifikovali rozpustné tvrdohlavé oligosacharidy pomocou kombinácie separácie uhlíka a kremeliny a vylučovacej chromatografie a tiež sme skúmali ich inhibičné vlastnosti voči enzýmom. Zistili sme, že oligosacharidy obsahujúce metylované urónové kyseliny s vyšším stupňom polymerizácie (DP) sa ťažšie spracovávajú komerčnými zmesami enzýmov ako oligosacharidy s nízkym DP a neutrálne oligosacharidy. V tejto práci uvádzame použitie niekoľkých ďalších metód, vrátane profilovania glykánov pomocou monoklonálnych protilátok (mAb) špecifických pre glykány rastlinnej biomasy na charakterizáciu glykánových väzieb v bunkových stenách rastlín a enzymatických hydrolyzátoch, matricovo asistovanej laserovej desorpčnej ionizácie a hmotnostnej spektrometrie s časom letu. MALDI-TOF-MS využíva diagnostické píky informatívne o štruktúre získané spektroskopiou po sekundárnom rozpade negatívnych iónov, plynovú chromatografiu a hmotnostnú spektrometriu (GC-MS) na charakterizáciu oligosacharidových väzieb s derivatizáciou a bez nej. Vzhľadom na malú veľkosť oligosacharidov (DP 4–20) je ťažké tieto molekuly použiť na väzbu a charakterizáciu mAb. Na prekonanie tohto problému sme použili novú metódu imobilizácie oligosacharidov založenú na konjugácii s biotínom, ktorá úspešne označila väčšinu oligosacharidov rozpustných s nízkym DP na povrchu mikroplatničky. Táto metóda bola následne použitá vo vysokokapacitnom systéme mAb na špecifickú ligačnú analýzu. Táto nová metóda v budúcnosti uľahčí vývoj pokročilejších vysokokapacitných glykomových testov, ktoré možno použiť na izoláciu a charakterizáciu oligosacharidov prítomných v biomarkeroch na diagnostické účely.
Lignocelulózová biomasa, zložená z poľnohospodárskych, lesných, trávnych a drevných materiálov, je potenciálnou surovinou na výrobu bioproduktov vrátane potravín, krmív, palív a chemických prekurzorov na výrobu produktov s vyššou hodnotou1. Sacharidy (ako je celulóza a hemicelulóza) prítomné v bunkových stenách rastlín sa depolymerizujú na monosacharidy chemickým spracovaním a biotransformáciou (ako je enzymatická hydrolýza a mikrobiálna fermentácia). Medzi bežné predúpravy patrí expanzia amoniakových vlákien (AFEX), zriedená kyselina (DA), iónová kvapalina (IL) a parná explózia (SE), ktoré využívajú kombináciu chemikálií a tepla na zníženie produkcie lignocelulózy otvorením bunkových stien rastlín3,4. odolnosť hmoty,5. Enzymatická hydrolýza sa vykonáva pri vysokom obsahu pevných látok s použitím komerčných enzýmov obsahujúcich aktívne sacharidy (CAZymes) a mikrobiálnej fermentácie s použitím transgénnych kvasiniek alebo baktérií na výrobu biopalív a chemikálií6.
CAZýmy v komerčných enzýmoch sa skladajú z komplexnej zmesi enzýmov, ktoré synergicky štiepia komplexné väzby sacharid-cukor za vzniku monosacharidov2,7. Ako sme už uviedli, komplexná sieť aromatických polymérov lignínu so sacharidmi ich robí vysoko nepoddajnými, čo vedie k neúplnej premene cukrov, pričom sa akumuluje 15 – 25 % pohlavných oligosacharidov, ktoré sa neprodukujú počas enzymatickej hydrolýzy predspracovanej biomasy. Toto je bežný problém pri rôznych metódach predspracovania biomasy. Medzi dôvody tohto úzkeho miesta patrí inhibícia enzýmov počas hydrolýzy alebo absencia alebo nízke hladiny esenciálnych enzýmov, ktoré sú potrebné na rozbitie cukrových väzieb v rastlinnej biomase. Pochopenie zloženia a štrukturálnych charakteristík cukrov, ako sú cukrové väzby v oligosacharidoch, nám pomôže zlepšiť premenu cukrov počas hydrolýzy, čím sa biotechnologické procesy stanú nákladovo konkurencieschopnými v porovnaní s produktmi získanými z ropy.
Určenie štruktúry sacharidov je náročné a vyžaduje si kombináciu metód, ako je kvapalinová chromatografia (LC)11,12, nukleárna magnetická rezonančná spektroskopia (NMR)13, kapilárna elektroforéza (CE)14,15,16 a hmotnostná spektrometria (MS)17. ,osemnásť. MS metódy, ako je hmotnostná spektrometria s časom letu s laserovou desorpciou a ionizáciou pomocou matrice (MALDI-TOF-MS), sú všestrannou metódou na identifikáciu sacharidových štruktúr. V poslednej dobe sa na identifikáciu odtlačkov prstov zodpovedajúcich polohám pripojenia oligosacharidov, anomérnym konfiguráciám, sekvenciám a polohám vetvenia najčastejšie používa tandemová MS s kolíziou indukovanou disociáciou (CID) aduktov sodíkových iónov 20, 21.
Analýza glykánov je vynikajúcim nástrojom na hĺbkovú identifikáciu sacharidových väzieb22. Táto metóda využíva monoklonálne protilátky (mAb) namierené proti glykánu v bunkovej stene rastlín ako sondy na pochopenie komplexných sacharidových väzieb. Na celom svete je dostupných viac ako 250 mAb, navrhnutých proti rôznym lineárnym a rozvetveným oligosacharidom s použitím rôznych sacharidov24. Niekoľko mAb sa široko používa na charakterizáciu štruktúry, zloženia a modifikácií bunkovej steny rastlín, pretože existujú významné rozdiely v závislosti od typu rastlinnej bunky, orgánu, veku, vývojového štádia a rastového prostredia25,26. V poslednej dobe sa táto metóda používa na pochopenie populácií vezikúl v rastlinných a živočíšnych systémoch a ich príslušných úloh v transporte glykánov, ako je určené subcelulárnymi markermi, vývojovými štádiami alebo environmentálnymi stimulmi, a na stanovenie enzymatickej aktivity. Medzi rôzne identifikované štruktúry glykánov a xylánov patrí pektín (P), xylán (X), manán (M), xyloglukány (XylG), glukány so zmiešanými väzbami (MLG), arabinoxylán (ArbX), galaktomanán (GalG), kyselina glukurónová-arabinoxylán (GArbX) a arabino-galaktán (ArbG)29.
Napriek všetkému tomuto výskumnému úsiliu sa však len niekoľko štúdií zameralo na povahu akumulácie oligosacharidov počas hydrolýzy s vysokým obsahom pevných látok (HSL), vrátane uvoľňovania oligosacharidov, zmien dĺžky oligomérneho reťazca počas hydrolýzy, rôznych polymérov s nízkym obsahom pevných látok a ich kriviek distribúcie 30,31,32. Hoci sa analýza glykánov ukázala ako užitočný nástroj na komplexnú analýzu štruktúry glykánov, je ťažké vyhodnotiť vo vode rozpustné oligosacharidy s nízkym obsahom pevných látok pomocou protilátkových metód. Menšie DP oligosacharidy s molekulovou hmotnosťou menšou ako 5 – 10 kDa sa neviažu na ELISA platne 33, 34 a pred pridaním protilátok sa vymyjú.
V tejto štúdii po prvýkrát demonštrujeme ELISA test na platniach potiahnutých avidínom s použitím monoklonálnych protilátok, kombinujúc jednokrokový biotinylačný postup pre rozpustné refraktérne oligosacharidy s analýzou glykómu. Náš prístup k analýze glykómu bol validovaný analýzou komplementárnych oligosacharidových väzieb založenou na MALDI-TOF-MS a GC-MS s použitím trimetylsilylovej (TMS) derivatizácie hydrolyzovaných cukorných zložení. Tento inovatívny prístup sa môže v budúcnosti rozvinúť ako vysokovýkonná metóda a nájsť širšie uplatnenie v biomedicínskom výskume35.
Posttranslačné modifikácie enzýmov a protilátok, ako je glykozylácia,36 ovplyvňujú ich biologickú aktivitu. Napríklad zmeny v glykozylácii sérových proteínov hrajú dôležitú úlohu pri zápalovej artritíde a zmeny v glykozylácii sa používajú ako diagnostické markery37. V literatúre sa uvádza, že rôzne glykány sa ľahko objavujú pri rôznych ochoreniach vrátane chronických zápalových ochorení gastrointestinálneho traktu a pečene, vírusových infekcií, rakoviny vaječníkov, prsníka a prostaty38,39,40. Pochopenie štruktúry glykánov pomocou metód ELISA na báze protilátok poskytne dodatočnú istotu v diagnostike ochorení bez použitia zložitých MS metód.
Naša predchádzajúca štúdia ukázala, že tvrdohlavé oligosacharidy zostali po predúprave a enzymatickej hydrolýze nehydrolyzované (obrázok 1). V našej predtým publikovanej práci sme vyvinuli metódu extrakcie na pevnej fáze aktívnym uhlím na izoláciu oligosacharidov z hydrolyzátu kukuričných stoniek (ACSH)8 predúpraveného AFEX. Po počiatočnej extrakcii a separácii boli oligosacharidy ďalej frakcionované pomocou vylučovacej chromatografie (SEC) a zozbierané podľa molekulovej hmotnosti. Cukrové monoméry a oligoméry uvoľnené z rôznych predúprav boli analyzované analýzou zloženia cukru. Pri porovnaní obsahu cukrových oligomérov získaných rôznymi metódami predúpravy je prítomnosť tvrdohlavých oligosacharidov bežným problémom pri premene biomasy na monosacharidy a môže viesť k zníženiu výťažku cukru o najmenej 10 – 15 % a dokonca až o 18 % v USA. Táto metóda sa používa na ďalšiu veľkovýrobu oligosacharidových frakcií. Výsledný ACH a jeho následné frakcie s rôznymi molekulovými hmotnosťami boli použité ako experimentálny materiál na charakterizáciu oligosacharidov v tejto práci.
Po predúprave a enzymatickej hydrolýze zostali perzistentné oligosacharidy nehydrolyzované. Tu (A) je metóda separácie oligosacharidov, pri ktorej sa oligosacharidy izolujú z hydrolyzátu kukuričných stonkov (ACSH) predúpraveného AFEX pomocou náplne z aktívneho uhlia a kremeliny; (B) Metóda separácie oligosacharidov. Oligosacharidy boli ďalej separované pomocou vylučovacej chromatografie (SEC); (C) Sacharidové monoméry a oligoméry uvoľnené z rôznych predúprav (zriedená kyselina: DA, iónová kvapalina: IL a AFEX). Podmienky enzymatickej hydrolýzy: vysoké zaťaženie pevnými látkami 25 % (hmotn./hmotn.) (približne 8 % zaťaženie glukánom), 96 hodín hydrolýzy, zaťaženie komerčným enzýmom 20 mg/g (pomer Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) a (D) Cukrové monoméry a oligoméry glukózy, xylózy a arabinózy uvoľnené z kukuričných stonkov predúpravených AFEX (ACS).
Analýza glykánov sa ukázala ako užitočný nástroj pre komplexnú štrukturálnu analýzu glykánov v extraktoch izolovaných zo zvyškov pevnej biomasy. Vo vode rozpustné sacharidy sú však pri použití tejto tradičnej metódy nedostatočne zastúpené41, pretože oligosacharidy s nízkou molekulovou hmotnosťou sa ťažko imobilizujú na ELISA platniach a pred pridaním protilátok sa vymyjú. Preto sa na väzbu a charakterizáciu protilátok použila jednokroková biotinylačná metóda na nanesenie rozpustných, nekompatibilných oligosacharidov na ELISA platne potiahnuté avidínom. Táto metóda bola testovaná s použitím nášho predtým vyrobeného ACSH a frakcie na základe jeho molekulovej hmotnosti (alebo stupňa polymerizácie, DP). Jednokroková biotinylacia sa použila na zvýšenie väzbovej afinity oligosacharidov pridaním biotín-LC-hydrazidu na redukujúci koniec sacharidu (Obr. 2). V roztoku reaguje hemiacetálová skupina na redukujúcom konci s hydrazidovou skupinou biotín-LC-hydrazidu za vzniku hydrazónovej väzby. V prítomnosti redukčného činidla NaCNBH3 sa hydrazónová väzba redukuje na stabilný biotinylovaný konečný produkt. Modifikáciou konca redukujúceho cukor sa umožnila väzba oligosacharidov s nízkym DP na ELISA platne a v našej štúdii sa to uskutočnilo na platniach potiahnutých avidínom s použitím glykán-cielených monoklonálnych protilátok.
Skríning monoklonálnych protilátok na biotinylované oligosacharidy metódou ELISA. Tu (A) ukazuje kombinovanú biotinylaciu oligosacharidov a následný skríning metódou ELISA s monoklonálnymi protilátkami zameranými na glykány na platniach potiahnutých NeutrAvidínom a (B) ukazuje jednokrokový postup biotinylacie reakčných produktov.
Platne potiahnuté avidínom s protilátkami konjugovanými s oligosacharidom boli potom pridané k primárnym a sekundárnym protilátkam a premyté v médiu citlivom na svetlo a čas. Po dokončení väzby protilátok bol pridaný substrát TMB na inkubáciu platne. Reakcia bola nakoniec zastavená kyselinou sírovou. Inkubované platne boli analyzované pomocou čítačky ELISA, aby sa stanovila väzbová sila každej protilátky a detekcia zosieťovania špecifického pre protilátku. Podrobnosti a parametre experimentu nájdete v príslušnej časti „Materiály a metódy“.
Užitočnosť tejto novovyvinutej metódy pre špecifické aplikácie demonštrujeme charakterizáciou rozpustných oligosacharidov prítomných v ACSH, ako aj v surových a purifikovaných oligosacharidových frakciách izolovaných z lignocelulózových hydrolyzátov. Ako je znázornené na obrázku 3, najčastejšie epitopom substituované xylány identifikované v ACSH pomocou metód bioacylovaného glykomového testu sú zvyčajne urónová (U) alebo metylurónová (MeU) a pektínové arabinogalaktány. Väčšina z nich bola tiež nájdená v našej predchádzajúcej štúdii o analýze glykánov nehydrolyzovaných pevných látok (UHS)43.
Detekcia rekalcitrantných oligosacharidových epitopov pomocou monoklonálnej protilátky namierenej proti glykánu bunkovej steny. „Neutrálna“ frakcia je frakcia ACN a „kyslá“ frakcia je frakcia FA. Jasnejšie červené farby na tepelnej mape označujú vyšší obsah epitopov a jasnejšie modré farby označujú prázdne pozadie. Hodnoty farieb na stupnici sú založené na nespracovaných hodnotách optickej hustoty (OD) pre formulácie N=2. Hlavné epitopy rozpoznávané protilátkami sú zobrazené vpravo.
Tieto necelulózové štruktúry nedokázali byť štiepené najbežnejšími celulázami a hemicelulázami v testovanej komerčnej zmesi enzýmov, ktorá obsahuje najčastejšie používané komerčné enzýmy. Preto sú na ich hydrolýzu potrebné nové pomocné enzýmy. Bez potrebných necelulózových pomocných enzýmov tieto necelulózové väzby bránia úplnej premene na monosacharidy, a to aj v prípade, že ich materské cukrové polyméry sú extenzívne hydrolyzované na kratšie fragmenty a rozpustené pomocou komerčných zmesí enzýmov.
Ďalšia štúdia distribúcie signálu a jeho väzbovej sily ukázala, že väzbové epitopy boli nižšie vo frakciách cukrov s vysokým DP (A, B, C, DP až do 20+) ako vo frakciách s nízkym DP (D, E, F, DP) v diméroch) (Obr. 1). Kyslé fragmenty sú častejšie v necelulózových epitopoch ako v neutrálnych fragmentoch. Tieto javy sú v súlade so vzorom pozorovaným v našej predchádzajúcej štúdii, kde boli vysoké DP a kyslé zložky odolnejšie voči enzymatickej hydrolýze. Preto prítomnosť necelulózových glykánových epitopov a substitúcií U a MeU môže výrazne prispieť k stabilite oligosacharidov. Treba poznamenať, že účinnosť väzby a detekcie môže byť problematická pre oligosacharidy s nízkym DP, najmä ak je epitop dimérny alebo trimérny oligosacharid. Toto je možné testovať pomocou komerčných oligosacharidov rôznych dĺžok, z ktorých každý obsahuje iba jeden epitop, ktorý sa viaže na špecifickú monoklonálnu protilátku.
Použitie štrukturálne špecifických protilátok teda odhalilo určité typy odolných väzieb. V závislosti od typu použitej protilátky, vhodného ligačného vzoru a sily signálu, ktorý produkuje (najviac a najmenej zastúpený), je možné identifikovať nové enzýmy a semikvantitatívne ich pridať do zmesi enzýmov pre úplnejšiu glykokonverziu. Na príklade analýzy oligosacharidov ACSH môžeme vytvoriť databázu glykánových väzieb pre každý biomasový materiál. Treba tu poznamenať, že by sa mala zohľadniť rôzna afinita protilátok a ak ich afinita nie je známa, vytvorí to určité ťažkosti pri porovnávaní signálov rôznych protilátok. Okrem toho môže porovnanie glykánových väzieb fungovať najlepšie medzi vzorkami pre tú istú protilátku. Tieto odolné väzby je potom možné prepojiť s databázou CAZyme, z ktorej môžeme identifikovať enzýmy, vybrať kandidátske enzýmy a testovať enzýmy štiepiace väzby alebo vyvinúť mikrobiálne systémy na expresiu týchto enzýmov na použitie v biorafinériách44.
Aby sme vyhodnotili, ako imunologické metódy dopĺňajú alternatívne metódy charakterizácie oligosacharidov s nízkou molekulovou hmotnosťou prítomných v lignocelulózových hydrolyzátoch, vykonali sme MALDI (obr. 4, S1-S8) a analýzu sacharidov odvodených z TMS na základe GC-MS na tej istej časti panelu (obr. 5) oligosacharidovej časti. MALDI sa používa na porovnanie, či hmotnostné rozloženie molekúl oligosacharidov zodpovedá zamýšľanej štruktúre. Na obr. 4 je znázornená MS neutrálnych zložiek ACN-A a ACN-B. Analýza ACN-A potvrdila rozsah pentózových cukrov v rozsahu od DP 4–8 (obr. 4) do DP 22 (obr. S1), ktorých hmotnosti zodpovedajú MeU-xylánovým oligosacharidom. Analýza ACN-B potvrdila sériu pentóz a glukoxylánov s DP 8-15. V doplnkových materiáloch, ako napríklad na obrázku S3, mapy distribúcie hmotnosti kyslých zložiek FA-C ukazujú rozsah pentózových cukrov substituovaných (Me)U s DP 8 – 15, ktoré sú konzistentné so substituovanými xylánmi zistenými pri skríningu monoklonálnych protilátek na báze ELISA. Epitopy sú konzistentné.
MALDI-MS spektrum rozpustných nekompatibilných oligosacharidov prítomných v ACS. Tu (A) frakcie ACN-A s nízkou hmotnosťou obsahujúce glukuroxylánové oligosacharidy substituované metylovanou urónovou kyselinou (DP 4-8) a (B) xylán ACN-B a oligosacharidy metylovanej urónovej kyseliny substituované glukuroxylánom (DP 8-15).
Analýza zloženia glykánového zvyšku refraktérnych oligosacharidov. Tu (A) Zloženie sacharidov TMS rôznych oligosacharidových frakcií získaných pomocou GC-MS analýzy. (B) Štruktúry rôznych cukrov odvodených z TMS prítomných v oligosacharidoch. ACN – acetonitrilová frakcia obsahujúca neutrálne oligosacharidy a FA – frakcia kyseliny ferulovej obsahujúca kyslé oligosacharidy.
Ďalší zaujímavý záver bol vyvodený z LC-MS analýzy oligosacharidovej frakcie, ako je znázornené na obrázku S9 (metódy je možné vidieť v doplnkovom elektronickom materiáli). Fragmenty hexózových a -OAc skupín boli opakovane pozorované počas ligácie frakcie ACN-B. Toto zistenie nielen potvrdzuje fragmentáciu pozorovanú v glykome a MALDI-TOF analýze, ale poskytuje aj nové informácie o potenciálnych derivátoch sacharidov v predspracovanej lignocelulózovej biomase.
Taktiež sme vykonali analýzu zloženia glykánov oligosacharidových frakcií pomocou TMS derivatizácie glykánov. Pomocou GC-MS sme stanovili zloženie neurálnych (nederivátových) a kyslých cukrov (GluA a GalA) v oligosacharidovej frakcii (Obr. 5). Kyselina glukurónová sa nachádza v kyslých zložkách C a D, zatiaľ čo kyselina galakturónová sa nachádza v kyslých zložkách A a B, pričom obe sú zložkami kyslých cukrov s vysokým DP. Tieto výsledky nielen potvrdzujú naše údaje z ELISA a MALDI, ale sú aj v súlade s našimi predchádzajúcimi štúdiami akumulácie oligosacharidov. Preto sa domnievame, že moderné imunologické metódy využívajúce biotinyláciu oligosacharidov a následný ELISA skríning sú postačujúce na detekciu rozpustných rekalcitrantných oligosacharidov v rôznych biologických vzorkách.
Keďže metódy skríningu monoklonálnych protilátok založené na ELISA boli validované niekoľkými rôznymi metódami, chceli sme ďalej preskúmať potenciál tejto novej kvantitatívnej metódy. Boli zakúpené a testované dva komerčné oligosacharidy, xylohexasacharidový oligosacharid (XHE) a 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotrióza (A2XX) s použitím nového prístupu k monoklonálnym protilátkam zameraného na glykán bunkovej steny. Obrázok 6 ukazuje lineárnu koreláciu medzi biotinylovaným väzbovým signálom a logaritmickou koncentráciou oligosacharidu, čo naznačuje možný Langmuirov adsorpčný model. Spomedzi monoklonálnych protilátok korelovali s XHE CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 a CCRC-M151 a s A2XX v rozsahu od 1 nm do 100 nano. Vzhľadom na obmedzenú dostupnosť protilátok počas experimentu sa s každou koncentráciou oligosacharidu vykonal obmedzený počet experimentov. Treba poznamenať, že niektoré protilátky reagujú na rovnaký oligosacharid ako substrát veľmi odlišne, pravdepodobne preto, že sa viažu na mierne odlišné epitopy a môžu mať veľmi odlišnú väzbovú afinitu. Mechanizmy a dôsledky presnej identifikácie epitopov budú oveľa zložitejšie, keď sa nový prístup monoklonálnych protilátok aplikuje na skutočné vzorky.
Na stanovenie detekčného rozsahu rôznych monoklonálnych protilátok zameraných na glykány boli použité dva komerčné oligosacharidy. Lineárne korelácie s logaritmickou koncentráciou oligosacharidu tu naznačujú Langmuirove adsorpčné vzory pre (A) XHE s monoklonálnou protilátkou a (B) A2XX s monoklonálnou protilátkou. Zodpovedajúce epitopy označujú štruktúry komerčných oligosacharidov použitých ako substráty v teste.
Použitie monoklonálnych protilátok zameraných na glykány (glykogénna analýza alebo skríning monoklonálnych protilátok založený na ELISA) je účinným nástrojom na hĺbkovú charakterizáciu väčšiny hlavných glykánov bunkovej steny, ktoré tvoria rastlinnú biomasu. Klasická analýza glykánov však charakterizuje iba väčšie glykány bunkovej steny, pretože väčšina oligosacharidov nie je efektívne imobilizovaná na ELISA platniach. V tejto štúdii boli kukuričné ​​stonky predspracované AFEX enzymaticky hydrolyzované pri vysokom obsahu pevných látok. Na stanovenie zloženia odolných sacharidov bunkovej steny v hydrolyzáte sa použila analýza cukrov. Analýza monoklonálnych protilátok menších oligosacharidov v hydrolyzátoch je však podceňovaná a na účinnú imobilizáciu oligosacharidov na ELISA platniach sú potrebné ďalšie nástroje.
V tejto práci uvádzame novú a účinnú metódu imobilizácie oligosacharidov na skríning monoklonálnych protilátek kombináciou biotinylácie oligosacharidov a následného skríningu ELISA na platniach potiahnutých NeutrAvidin™. Imobilizované biotinylované oligosacharidy vykazovali dostatočnú afinitu k protilátke, aby umožnili rýchlu a účinnú detekciu odolných oligosacharidov. Analýza zloženia týchto odolných oligosacharidov na základe hmotnostnej spektrometrie potvrdila výsledky tohto nového prístupu k imunoskríningu. Tieto štúdie teda preukazujú, že kombinácia biotinylácie oligosacharidov a skríningu ELISA s monoklonálnymi protilátkami zameranými na glykány sa môže použiť na detekciu zosieťovania v oligosacharidoch a môže sa široko uplatňovať v iných biochemických štúdiách charakterizujúcich štruktúru oligosacharidov.
Táto metóda profilovania glykánov na báze biotínu je prvou správou, ktorá je schopná skúmať odolné sacharidové väzby rozpustných oligosacharidov v rastlinnej biomase. To pomáha pochopiť, prečo sú niektoré časti biomasy také odolné, pokiaľ ide o produkciu biopalív. Táto metóda vypĺňa dôležitú medzeru v metódach analýzy glykómov a rozširuje jej uplatnenie na širšiu škálu substrátov nad rámec rastlinných oligosacharidov. V budúcnosti môžeme na biotinyláciu použiť robotiku a metódu, ktorú sme vyvinuli, použiť na vysokovýkonnú analýzu vzoriek pomocou ELISA.
Kukuričná slama (CS) vypestovaná z hybridných semien Pioneer 33A14 bola zozbieraná v roku 2010 na farme Kramer Farms v Ray v štáte Colorado. S povolením vlastníka pôdy môže byť táto biomasa použitá na výskum. Vzorky boli skladované v suchom stave s vlhkosťou < 6 % vo vreckách so zipsom pri izbovej teplote. Vzorky boli skladované v suchom stave s vlhkosťou < 6 % vo vreckách so zipsom pri izbovej teplote. Образцы хранились сухими при влажности < 6 % v пакетах с застежкой-молнией приности температуре. Vzorky boli skladované v suchu pri vlhkosti <6 % vo vreckách so zipsom pri izbovej teplote.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре <6%. с влажно. Vzorky sa skladujú vo vreckách so zipsom pri izbovej teplote s vlhkosťou < 6 %.Štúdia bola v súlade s miestnymi a národnými smernicami. Analýza zloženia sa vykonala pomocou protokolu NREL. Zistilo sa, že zloženie obsahuje 31,4 % glukánu, 18,7 % xylánu, 3,3 % arabinánu, 1,2 % galaktánu, 2,2 % acetylu, 14,3 % lignínu, 1,7 % bielkovín a 13,4 % popola.
Cellic® CTec2 (138 mg bielkovín/ml, šarža VCNI 0001) je komplexná zmes celulázy, β-glukozidázy a Cellic® HTec2 (157 mg bielkovín/ml, šarža VHN00001) od spoločnosti Novozymes (Franklinton, NC, USA). Multifect Pectinase® (72 mg bielkovín/ml), komplexná zmes enzýmov degradujúcich pektín, bola darovaná spoločnosťou DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Koncentrácie enzýmových bielkovín boli stanovené odhadom obsahu bielkovín (a odpočítaním príspevku neproteínového dusíka) pomocou Kjeldahlovej analýzy dusíka (metóda AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Kremelina 545 bola zakúpená od spoločnosti EMD Millipore (Billerica, MA). Aktívne uhlie (DARCO, granule 100 mesh), Avicel (PH-101), bukový xylán a všetky ostatné chemikálie boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Predúprava AFEX sa uskutočnila v GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Predúprava sa uskutočnila pri teplote 140 °C počas 15 minút. Doba zdržania bola 46 minút pri pomere 1:1 bezvodého amoniaku k biomase a 60 % (hmotn./hmotn.) náplne v stolovom dávkovom reaktore z nehrdzavejúcej ocele (Parr Instruments Company). Trvalo 30 minút. Reaktor sa zahrial na 140 °C a amoniak sa rýchlo uvoľnil, čo umožnilo biomase rýchlo sa vrátiť na izbovú teplotu. Zloženie kukuričných stébel predúpravených AFEX (ACS) bolo podobné zloženiu neošetrených kukuričných stébel (UT-CS).
Ako východiskový materiál na veľkovýrobu oligosacharidov bol pripravený vysokopevnostný ACSH 25 % (hmotn./hmotn.) (s obsahom približne 8 % dextránu). Enzymatická hydrolýza ACS sa uskutočnila s použitím komerčnej zmesi enzýmov vrátane Cellic® Ctec2 10 mg proteínu/g glukánu (v predspracovanej biomase), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteínu/g glukánu a Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg proteínu/g dextránu. Enzymatická hydrolýza sa uskutočnila v 5-litrovom bioreaktore s pracovným objemom 3 litre, pH 4,8, teplotou 50 °C a 250 ot./min. Po 96 hodinách hydrolýzy sa hydrolyzát zozbieral centrifugáciou pri 6000 ot./min. počas 30 minút a potom pri 14000 ot./min. počas 30 minút, aby sa odstránili nehydrolyzované pevné látky. Hydrolyzát sa potom podrobil sterilnej filtrácii cez 0,22 mm filtračnú kadičku. Prefiltrovaný hydrolyzát sa skladoval v sterilných fľašiach pri teplote 4 °C a potom sa frakcionoval na aktívnom uhlí.
Analýza zloženia vzoriek biomasy na báze extraktu podľa laboratórnych analytických postupov NREL: príprava vzoriek na analýzu zloženia (NREL/TP-510-42620) a stanovenie štrukturálnych sacharidov a lignínu v biomase (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analýza oligosacharidov v hydrolyzátovom prúde sa uskutočnila v 2 ml mierke s použitím metódy kyslej hydrolýzy na báze autoklávu. Vzorka hydrolyzátu sa zmiešala so 69,7 µl 72 % kyseliny sírovej v 10 ml kultivačnej skúmavke so skrutkovacím uzáverom a inkubovala sa 1 hodinu na stole pri teplote 121 °C, ochladila sa na ľade a prefiltrovala sa do ampulky pre vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (HPLC). Koncentrácia oligosacharidov sa stanovila odčítaním koncentrácie monosacharidov v nehydrolyzovanej vzorke od celkovej koncentrácie cukrov v kyslo hydrolyzovanej vzorke.
Koncentrácie glukózy, xylózy a arabinózy v kyslo hydrolyzovanej biomase boli analyzované pomocou HPLC systému Shimadzu vybaveného automatickým vzorkovačom, ohrievačom kolóny, izokratickým čerpadlom a detektorom indexu lomu na kolóne Bio-Rad Aminex HPX-87H. Kolóna bola udržiavaná pri teplote 50 °C a eluovaná prietokom 5 mM H2SO4 vo vode s prietokom 0,6 ml/min.
Supernatant hydrolyzátu bol zriedený a analyzovaný na obsah monomérov a oligosacharidov. Monomérne cukry získané po enzymatickej hydrolýze boli analyzované pomocou HPLC vybavenej kolónou Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P a kolónou s ochranou proti popolu. Teplota kolóny bola udržiavaná na 80 °C, ako mobilná fáza bola použitá voda s prietokom 0,6 ml/min. Oligosacharidy boli stanovené hydrolýzou v zriedenej kyseline pri 121 °C podľa metód opísaných v odkazoch 41, 48, 49.
Analýza sacharidov sa vykonala na surových, AFEX-predspracovaných a všetkých nehydrolyzovaných zvyškoch biomasy (vrátane produkcie sériových extraktov bunkových stien a ich skríningu monoklonálnych protilátok) s použitím predtým opísaných postupov 27, 43, 50, 51. Na analýzu glykómu sa v alkohole nerozpustné zvyšky materiálu rastlinných bunkových stien pripravia zo zvyškov biomasy a podrobia sa sériovej extrakcii so stále agresívnejšími činidlami, ako je oxalát amónny (50 mM), uhličitan sodný (50 mM a 0,5 % hm./obj.), CON. (1M a 4M, oba s 1 % hm./obj. borohydridom sodným) a kyslý chlornan, ako bolo opísané predtým 52,53. Extrakty sa potom podrobili ELISA testu proti komplexnému panelu monoklonálnych protilátok 50 zameraných na glykán bunkovej steny a väzbové reakcie monoklonálnych protilátok sa prezentovali ako tepelná mapa. Monoklonálne protilátky zamerané na glykán rastlinných bunkových stien boli zakúpené z laboratórnych zásob (série CCRC, JIM a MAC).
Jednokroková biotinylacia oligosacharidov. Konjugácia sacharidov s biotín-LC-hydrazidom sa uskutočnila podľa nasledujúceho postupu. Biotín-LC-hydrazid (4,6 mg/12 μmol) sa rozpustil v dimetylsulfoxide (DMSO, 70 μl) za intenzívneho miešania a zahrievania na 65 °C počas 1 minúty. Pridala sa ľadová kyselina octová (30 µl) a zmes sa naliala na kyanoborohydrid sodný (6,4 mg/100 µmol) a po zahrievaní na 65 °C počas približne 1 minúty sa úplne rozpustila. Potom sa k sušenému oligosacharidu (1 – 100 nmol) pridalo 5 až 8 μl reakčnej zmesi, aby sa dosiahol 10-násobný alebo väčší molárny nadbytok značky nad redukujúcim koncom. Reakcia sa uskutočnila pri 65 °C počas 2 hodín, po čom sa vzorky okamžite purifikovali. V experimentoch so značením bez redukcie nebol použitý žiadny kyanoborohydrid sodný a vzorky reagovali pri teplote 65 °C počas 2,5 hodiny.
Povlakovanie a premytie vzoriek biotinylovaných oligosacharidov metódou ELISA. Do každej jamky platne potiahnutej avidínom sa pridalo 25 μl biotinylovaných vzoriek (100 μl každej koncentrovanej vzorky zriedenej v 5 ml 0,1 M Tris pufrovacieho roztoku (TBS)). Kontrolné jamky sa potiahli 50 μl biotínu s koncentráciou 10 μg/ml v 0,1 M TBS. Ako povlak sa pre slepé merania použila deionizovaná voda. Tableta sa inkubovala 2 hodiny pri izbovej teplote v tme. Platňu sa 3-krát premyla 0,1 % odstredeným mliekom v 0,1 M TBS s použitím programu č. 11 pre Grenier flat 3A.
Pridanie a premytie primárnych protilátok. Do každej jamky pridajte 40 µl primárnej protilátky. Mikroplatničku inkubujte 1 hodinu pri izbovej teplote v tme. Platničky boli potom 3-krát premyté 0,1 % mliekom v 0,1 M TBS s použitím premývacieho programu č. 11 pre Grenier Flat 3A.
Pridajte sekundárnu protilátku a premyte. Do každej jamky pridajte 50 µl sekundárnej protilátky myši/potkana (zriedenej 1:5000 v 0,1 % mlieku v 0,1 M TBS). Inkubujte mikroplatničku 1 hodinu pri izbovej teplote v tme. Mikroplatničky boli potom 5-krát premyté 0,1 % mliekom v 0,1 M TBS s použitím programu Grenier Flat 5A na premytie platní č. 12.
Pridanie substrátu. Pridajte 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametylbenzidínu (TMB) k základnému substrátu (pridaním 2 kvapiek pufru, 3 kvapiek TMB, 2 kvapiek peroxidu vodíka do 15 ml deionizovanej vody). Pripravte substrát TMB a pred použitím premiešajte na vortexovom miešadle. Inkubujte mikroplatničku pri izbovej teplote 30 minút. V tme.
Dokončite krok a odčítajte tabletu. Do každej jamky pridajte 50 µl 1 N kyseliny sírovej a pomocou ELISA čítačky zaznamenajte absorbanciu od 450 do 655 nm.
Pripravte 1 mg/ml roztoky týchto analytov v deionizovanej vode: arabinóza, ramnóza, fukóza, xylóza, kyselina galakturónová (GalA), kyselina glukurónová (GlcA), manóza, glukóza, galaktóza, laktóza, N-acetylmanózamín (manNAc), N-acetylglukozamín (glcNAc), N-acetylgalaktózamín (galNAc), inozitol (vnútorný štandard). Dva štandardy boli pripravené pridaním 1 mg/ml roztokov cukru uvedených v tabuľke 1. Vzorky sa zmrazia a lyofilizujú pri teplote -80 °C, kým sa neodstráni všetka voda (zvyčajne približne 12 – 18 hodín).
Do skúmaviek so skrutkovacím uzáverom na analytických váhach pridajte 100 – 500 µg vzorky. Zaznamenajte pridané množstvo. Najlepšie je rozpustiť vzorku v rozpúšťadle so špecifickou koncentráciou a pridať ju do skúmavky ako kvapalný alikvot. Ako vnútorný štandard pre každú skúmavku so vzorkou použite 20 µl inozitolu s koncentráciou 1 mg/ml. Množstvo vnútorného štandardu pridaného do vzorky musí byť rovnaké ako množstvo vnútorného štandardu pridaného do štandardnej skúmavky.
Do injekčnej liekovky so skrutkovacím uzáverom pridajte 8 ml bezvodého metanolu. Potom pridajte 4 ml 3 N roztoku metanolového HCl, uzavriete a pretrepáte. Tento postup nepoužíva vodu.
K vzorkám oligosacharidov a štandardným TMS skúmavkám pridajte 500 µl 1 M roztoku HCl v metanolu. Vzorky sa inkubovali cez noc (168 hodín) pri teplote 80 °C v tepelnom bloku. Produkt metanolýzy sa vysuší pri izbovej teplote pomocou sušiaceho potrubia. Pridajte 200 µl MeOH a znova sa vysuší. Tento postup sa dvakrát opakuje. K vzorke sa pridá 200 µl metanolu, 100 µl pyridínu a 100 µl acetanhydridu a dobre sa premieša. Vzorky sa inkubujú pri izbovej teplote 30 minút. Vzorky sa nechájú inkubovať pri izbovej teplote a vysušia sa. Pridajte 200 µl metanolu a znova sa vysuší.
Pridajte 200 µl Tri-Sil a skúmavku s uzáverom zahrievajte 20 minút. 80 °C, potom ochlaďte na izbovú teplotu. Na ďalšie sušenie vzorky na objem približne 50 µl použite sušiaci rozdeľovač. Je dôležité poznamenať, že vzorky sme nenechali úplne vyschnúť.
Pridajte 2 ml hexánu a dobre premiešajte vortexovaním. Naplňte hroty Pasteurových pipiet (5 – 8 mm) kúskom sklenenej vlny vložením sklenenej vlny na vrch pipety s priemerom 5 – 3/4 palca. Vzorky sa centrifugovali pri 3000 g počas 2 minút. Všetky nerozpustné zvyšky sa vyzrážali. Vzorku vysušte na 100 – 150 µl. Objem približne 1 μl sa vstrekol do GC-MS pri počiatočnej teplote 80 °C a počiatočnom čase 2,0 minúty (Tabuľka 2).